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D.L. Kolesnik1, O.N. Pyaskovskaya1, I.V. Boychuk1, O.I. Dasyukevich1, O.R. Melnikov1, A.S. Tarasov1, G.I. Soljanik1

1R.E. Kavetsky Institut fĂŒr experimentelle Pathologie, Onkologie und Radiobiologie, NAS der Ukraine, Kiew 03022, Ukraine.

Korrespondenz: D.L. Kolesnik, E-Mail: [email protected]

Eingereicht: 20. MĂ€rz 2015

Zusammenfassung

Ein Kennzeichen bösartiger Erkrankungen ist die ĂŒbermĂ€ĂŸige Glykolyse im Tumor, selbst in Gegenwart von Sauerstoff, die eine Laktazidose in der Mikroumgebung des Tumors verursacht und die Vermehrung und das Überleben der Tumorzellen begĂŒnstigt. Aus diesem Grund werden antimetabolische Wirkstoffe, die auf den Stoffwechsel der Tumorzellen abzielen, als vielversprechende Krebsmedikamente intensiv erforscht. Ziel: Untersuchung der Wirkung von Laktazidose auf das Überleben von Zellen des Lewis-Lungenkarzinoms (LLC) unter den Bedingungen eines NĂ€hrstoffmangels in vitro und Bewertung der antitumoralen und antimetastatischen AktivitĂ€t gegen LLC/R9 in vivo. Materialien und Methoden: Die LLC-Variante LLC/R9 wurde als experimentelles Tumormodell verwendet. Die LebensfĂ€higkeit der Tumorzellen wurde mittels Trypanblau-FĂ€rbung bestimmt. Das Apoptose-Niveau wurde mit Hilfe des Farbstoffs Hoechst 33258 ermittelt. Der Laktatgehalt im Tumorgewebe wurde mit der Enzymmethode unter Verwendung von Laktatdehydrogenase bestimmt. Reaktive Sauerstoffspezies wurden mit 2,7-Dichlorfluorescein-Diacetat bestimmt. Die Auswirkungen von Dichloracetat (DCA) auf das Wachstum und die Metastasierung von LLC/R9 wurden mit Routineverfahren analysiert. Die Bewertung der Wirkung von DCA auf die Komponenten der Elektronentransportkette (ETC) erfolgte mit Hilfe der EPR. Ergebnisse: Es wurde gezeigt, dass die LebensfĂ€higkeit von LLC/R9-Zellen in vitro unter den Bedingungen der Laktazidose und des Glukosemangels um 30 % höher (р < 0,05) und das Apoptose-Niveau um das Dreifache (р < 0,05) niedriger war als diese Indizes unter den Bedingungen des reinen Glukosemangels. Bei MĂ€usen mit transplantierten LLC/R9-Tumoren, die 3 Wochen lang per os mit DCA in einer Gesamtdosis von 1,5 g/kg Körpergewicht ab dem nĂ€chsten Tag nach der Tumortransplantation behandelt wurden, war das Volumen des PrimĂ€rtumors nur um 30% geringer als in der Kontrollgruppe. Gleichzeitig waren die Anzahl und das Volumen der Lungenmetastasen bei den mit DCA behandelten Tieren um 59% (р < 0,05) bzw. 94% (р < 0,05) geringer als diese Indizes in der Kontrollgruppe. Die DCA-Behandlung fĂŒhrte zu einem Anstieg des Laktatgehalts im Tumorgewebe um fast 30 % (р < 0,05) im Vergleich zu dem der Kontrollgruppe, hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf den Gehalt an HĂ€m-Eisen-Komplexen mit NO (bei gmed = 2,007) in mitochondrialen ETC-Proteinen und Fe-S-Cluster-Proteinen (bei g = 1,94) in Tumorzellen. Schlussfolgerungen: Es wurde gezeigt, dass Laktazidose das Überleben von LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen des Glukosemangels in vitro signifikant fördert. Wenn sich LLC/R9 in vivo entwickelte, unterdrĂŒckte DCA als Verbindung mit Antilaktazidose-AktivitĂ€t das Wachstum des PrimĂ€rtumors nicht signifikant, ĂŒbte aber eine signifikante antimetastatische AktivitĂ€t aus.


SchlĂŒsselwörter: Dichloracetat; hypoxische RadiosensitivitĂ€t; Brustkrebs; reaktive SauerstoffspeziesAbkĂŒrzungen
: DCA – Dichloracetat, ETC – Elektronentransportkette; LLC/R9 – Lewis-Lungenkarzinom-Variante; PDH – Pyruvatdehydrogenase; PDK – Pyruvatdehydrogenase-Kinase.


EINLEITUNG

Es ist bekannt, dass die Laktazidose, d. h. die starke AnhĂ€ufung von Laktat und die Abnahme von рН, die Hauptmerkmale der metabolischen Mikroumgebung von Tumorzellen in vitro und in vivo sind. FrĂŒher wurde die Laktazidose als ein Ballastprodukt des Tumorzellstoffwechsels betrachtet. KĂŒrzlich wurde jedoch gezeigt, dass sie von Tumorzellen als effektiver EnergietrĂ€ger genutzt werden könnte und zu den Faktoren gehört, die fĂŒr die Resistenz von Tumoren gegenĂŒber Glukosemangel verantwortlich sind [1-3]. Wie wir anhand von Lewis-Lungenkarzinom (LLC)/R9-Zellen gezeigt haben, ist die LLC-Variante empfindlich gegenĂŒber einer antiangiogenen Krebstherapie [4,5]gezeigt, dass Laktazidose das Überleben von Tumorzellen unter den Bedingungen eines NĂ€hrstoffmangels fördern kann. Solche Bedingungen wurden durch langfristige Inkubation von Tumorzellen ohne Austausch des Kulturmediums („unfed culture“-Modell) geschaffen [6]. Die Untersuchung der Kinetik des Tumorzellwachstums unter den Bedingungen der „Unfed Culture“ hat gezeigt, dass bei völligem Fehlen von Glukose im Inkubationsmedium an den Tagen 7 bis 8 des Zellwachstums die Zahl der lebensfĂ€higen Zellen nicht unter ein Drittel des an den Tagen 3 bis 4 registrierten Maximums fiel und praktisch bis zum10. Die hohe Überlebensrate der LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen der „ungefĂŒtterten Kultur“ hing insbesondere mit der FĂ€higkeit dieser Zellen zur Makroautophagie zusammen. Es konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die FĂ€higkeit der LLC/R9-Zellen zur Anpassung an den Mangel an NĂ€hrsubstraten durch die Laktazidose bestimmt wurde, die sich als Folge der langen Kultivierung der Tumorzellen ohne Austausch des Inkubationsmediums entwickelte.

Wenn Laktazidose in der Lage ist, das Überleben von Tumorzellen zu erhöhen, dann sollten die Verbindungen, die die Bildung von Laktazidose in der Mikroumgebung des Tumors unterdrĂŒcken, insbesondere Dichloracetat (DCA) als Verbindung mit Antilaktazidose-AktivitĂ€t, eine Antitumor-AktivitĂ€t aufweisen. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, diese Annahme zu ĂŒberprĂŒfen.

Es ist bekannt, dass DCA ein Inhibitor der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK) ist, weshalb es als negativer Regulator von Enzymen des mitochondrialen Pyruvat-Dehydrogenase (PDH)-Komplexes gilt, der eine SchlĂŒsselrolle bei der Regulierung der TricarbonsĂ€ure und der oxidativen Phosphorylierung spielt [7]. Wenn der PDH-Komplex phosphoryliert ist, wird der Eintritt von Pyruvat in den Krebszyklus gehemmt, so dass die Glykolyse aktiviert wird. Aufgrund der PDK-Hemmung ist DCA in der Lage, die Enzyme des PDH-Komplexes indirekt zu aktivieren, was zu einer Verschiebung des Energiegleichgewichts der Zelle von der Glykolyse zur Aktivierung der oxidativen Phosphorylierung fĂŒhrt. Daher wurde DCA hĂ€ufig zur Korrektur von LaktĂ€mie eingesetzt, die durch eine hohe IntensitĂ€t der Glykolyse oder eine gestörte Zellatmung verursacht wird.

Den Angaben in der Literatur zufolge liegt die FĂ€higkeit von DCA, die oxidative Phosphorylierung zu aktivieren, seiner AntitumoraktivitĂ€t zugrunde und wird insbesondere durch die Verringerung der Laktazidose und die Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) realisiert [8-12]. Ziel unserer Studie war es, den Einfluss der Laktazidose auf das Überleben von LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen des NĂ€hrstoffmangels in vitro zu analysieren und die antitumorale und antimetastatische AktivitĂ€t von DCA gegen LLC/R9 in vivo zu bewerten.

MATERIALIEN UND METHODEN

Versuchstiere, Tumorzellen
Die Studie wurde mit 2,0-2,5 Monate alten C57Bl/6-MĂ€usen mit einem Gewicht von 18-23 g durchgefĂŒhrt, die in der Tieranlage des R.E. Kavetsky-Instituts fĂŒr experimentelle Pathologie, Onkologie und Strahlenbiologie der NAS der Ukraine gezĂŒchtet wurden. Die Protokolle der Tierversuche und die Arbeitsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den wichtigsten Anforderungen an die Haltung von und die Arbeit mit Labortieren und den Regeln des örtlichen Bioethikausschusses durchgefĂŒhrt.

In der Studie wurde die LLC-Variante LLC/R9 verwendet, die aus dem Wildtyp-LLC-Stamm durch 9 sequenzielle Chemotherapien in vivo auf der Grundlage von cis-Diamminedichloroplatin (cis-DDP) abgeleitet wurde [13]. LLC/R9-Zellen wurden in RPMI-Kulturmedium (Sigma, USA), ergÀnzt mit 10 % fetalem KÀlberserum (FCS) (Sigma, USA) und 40 mg/ml Gentamycin, bei 37 °C in befeuchteter AtmosphÀre mit 5 %CO2 gehalten.

Experimente in vitro
Die Anzahl der Zellen in Suspension und ihre LebensfĂ€higkeit wurden routinemĂ€ĂŸig auf einem HĂ€mozytometer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusstests analysiert.

Zur Bewertung der Auswirkungen der Laktazidose auf die LebensfĂ€higkeit von LLC/R9-Zellen wurden 1,5-105 Zellen/Vertiefung in 24-Well-Platten in RPMI 1640-Medium (Sigma, USA) mit Standardglukosegehalt ausgesĂ€t. Nach der Inkubation ĂŒber Nacht wurde das Zellinkubationsmedium durch frisches Medium mit unterschiedlichem Glukose- und Laktatgehalt und mit unterschiedlichem pH-Wert ersetzt, um die Bedingungen des Glukosemangels, der Laktazidose vor dem Hintergrund des Glukosemangels sowie des Standards zu simulieren (Tabelle 1). Glukosemangelmedium wurde auf der Grundlage von RPMI 1640-Medium ohne Glukose (Sigma, USA) hergestellt. Die Laktazidose wurde durch Zugabe von reiner MilchsĂ€ure (Sigma, USA) zum Glukosemangelmedium bis zu einer Endkonzentration von 14 ± 0,7 mM und einem pH-Wert von 6,7 erzeugt.

MediumGlukosegehalt
,mM
Laktatgehalt, mMрН
Standard9.0 ± 0.51.6 ± 0.17.4 ± 0.01
Glukose-Mangel3.0 ± 0.11.6 ± 0.17.4 ± 0.01
Laktazidose3.0 ± 0.114.0 ± 0.76.7 ± 0.01
Tabelle 1. Der Gehalt an Glukose, Laktat und der pH-Wert der in der Studie verwendeten Kulturmedien

Die Auswirkungen der verschiedenen Inkubationsbedingungen auf das Überleben der Tumorzellen, die ROS-Produktion, den Glukoseverbrauch und die Laktatproduktion wurden amzweiten Tag der Tumorzellinkubation geschĂ€tzt.

Der Glukosegehalt in den Kulturmedien und in den Homogenaten des Tumorgewebes wurde mit der Enzym-Glukose-Oxidationsmittel-Methode unter Verwendung des Kits fĂŒr die Glukoseanalyse in biologischen FlĂŒssigkeiten (Sigma, USA) gemĂ€ĂŸ den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Der Laktatgehalt in den Inkubationsmedien und in den Tumorgewebehomogenaten wurde mit der enzymatischen Spektralphotometriemethode unter Verwendung von Laktatdehydrogenase (Sigma, USA) bestimmt [14]. Die Proben des Mediums und des Tumorgewebes wurden entnommen und bei -20 °Х oder in flĂŒssigem Stickstoff aufbewahrt, bis die Messung durchgefĂŒhrt wurde.

Das Apoptose-Niveau in den Tumorzellen wurde mit Hilfe des Farbstoffs Hoechst 33258 (Sigma, USA) und der Fluoreszenzmikroskopie nach der Standardmethode analysiert.

Die ROS-Produktion in den Tumorzellen wurde mit Hilfe von 2,7-Dichlorfluoresceindiacetat (Sigma, USA) durch Spektrofluorometrie (Anregung bei 495 nm, Emission bei 530 nm) gemĂ€ĂŸ folgender Formel bestimmt [15].

Alle Messungen wurden wiederholt.

Experimente in vivo
FĂŒr In-vivo-Experimente wurden LLC/R9-Zellen in vitro unter Standardbedingungen vermehrt und MĂ€usen i.m. (1,0-106 Zellen/Tier in 0,1 ml Hanks’scher Lösung) injiziert.

Nach der Inokulation von LLC/R9-Zellen wurden die Tiere in zwei Gruppen aufgeteilt: Gruppe 1 – MĂ€use, die mit DCA (Sigma, USA) in einer Gesamtdosis von 1,5 g/kg (LD50/3) behandelt wurden (n = 13); Gruppe 2 – MĂ€use, die mit Wasser in der gleichen Dosierung und in der gleichen Menge behandelt wurden (Kontrolle, n = 12).

Die Behandlung wurde am Folgetag nach der Tumorzelltransplantation mit einem metronomischen Schema eingeleitet, fĂŒnfmal pro Woche ĂŒber drei Wochen. DCA wurde ex tempore in Wasser zubereitet und per os in einem Volumen von 0,4 ml/Tier verabreicht.

Das Volumen des PrimÀrtumors wurde auf der Grundlage seines Durchmessers berechnet, der ab dem10. Tag nach der Tumorzellinokulation jeden3:

V = π (d)3/6,

wobei d – Durchmesser des Tumors (mm).

Das Metastasierungsniveau in den tumortragenden MĂ€usen wurde am 21. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen anhand der Anzahl und des Volumens der Lungenmetastasen unter Verwendung eines Binokularmikroskops und einer Millimeterskala bewertet.

Das Gesamtvolumen der Metastasen wurde nach der folgenden Formel berechnet:

V = ÎŁ niπ(di)3/6,

wobei V – Gesamtvolumen der Metastasen (mm3), ni – Anzahl der Metastasen mit einem Durchmesser vondi (mm).

Die Analyse der funktionellen AktivitĂ€t der Komponenten der mitochondrialen Atmungskette in den Tumorzellen wurde mit Hilfe der EPR am21. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen durchgefĂŒhrt. Das Tumorgewebe wurde in Proben besonderer GrĂ¶ĂŸe(d = 4,0 mm, l = 25-35 mm) geschnitten, eingefroren und bei -70 °C gelagert. Die EPR-Analyse der Proben wurde bei 77 К mit dem Spektralphotometer Е-109 Varian (USA) bei einer Potential-Sweep-Geschwindigkeit von 500 Е/min, einer Modulationsamplitude von 1,25×10 Е, einer SHF-Strahlungsleistung von 10,0 mW und einer konstanten GerĂ€tezeit von 1,0 s durchgefĂŒhrt. Die Gehalte an HĂ€m-Eisen-Komplexen mit NO (bei gmed = 2,007) in mitochondrialen ETC-Proteinen und Fe-S-Cluster-Proteinen (bei g = 1,94) in Tumorzellen wurden anhand der Daten der EPR-Spektren bestimmt.

Statistische Auswertung die Auswertung der erhaltenen Ergebnisse erfolgte mittels deskriptiver Methoden, nichtlinearer Regressionsanalyse und Student’s t-test unter Verwendung der Programme Microsoft Excel und Microcal Origin.

ERGEBNISSE

Es wurde gezeigt, dass die Laktazidose unter den Bedingungen des Glukosemangels das Überleben von LLC/R9-Zellen signifikant fördert. TatsĂ€chlich unterschied sich die Wachstumskinetik der Tumorzellen, die unter den Bedingungen der Laktazidose bei Glukosemangel inkubiert wurden, nicht signifikant von der der Zellen, die in einem Medium mit Standardglukosegehalt inkubiert wurden, zumindest in der Phase ihres exponentiellen Wachstums. Insbesondere war die Zahl der lebensfĂ€higen Zellen amzweiten Tag der Inkubation unter den Bedingungen der Laktazidose bei Glukosemangel praktisch die gleiche wie bei der Inkubation der Zellen in einem Medium mit Standardglukosegehalt. Gleichzeitig war die Zahl der lebensfĂ€higen Zellen in beiden FĂ€llen (Laktazidose und Standard) um fast 30 % höher (р < 0,05) als bei der ZellbebrĂŒtung unter den Bedingungen des Glukosemangels selbst (Abb. 1, a).

Außerdem unterschied sich die Zahl der apoptotischen Zellen unter den Bedingungen der Laktazidose statistisch nicht von dem Index bei der Zellinkubation im Medium mit Standardglukosegehalt und betrug amzweiten Tag 8,5 ± 0,9 %, wĂ€hrend die Zahl der apoptotischen Zellen unter den Bedingungen des Glukosemangels fast dreimal so hoch war (p < 0,05) wie unter den Bedingungen der Laktazidose (Abb. 1, b).

Abb. 1. Überleben von LLC/R9-Zellen amzweiten Tag ihrer Inkubation in Standard- (1), Glukosemangel- (2) und Laktazidose-Medien (3); a – Anzahl der lebensfĂ€higen Zellen; b – Apoptosegrad. *p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle

Interessanterweise war der Glukoseverbrauch von LLC/R9-Zellen unter Laktazidose-Bedingungen deutlich geringer. Die niedrige Rate des Glukoseverbrauchs der Tumorzellen bei Laktazidose, die nur amersten Tag ihrer Inkubation registriert wurde, wurde amzweiten Tag wiederhergestellt und war um 70 % niedriger (p < 0,05) als im Fall des Mediums mit Standardglukosegehalt (Tabelle 2). Bei Glukosemangel im Gegensatz zur Laktazidose sank der Glukosespiegel im Inkubationsmedium am2. Tag auf Null, was zusÀtzlich auf einen verringerten Glukoseverbrauch der LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen der Laktazidose hindeutet.

WĂ€hrend die Laktazidose zu einer verringerten Glukoseaufnahme durch LLC/R9-Zellen fĂŒhrte, stieg der Gehalt an intrazellulĂ€ren ROS in den Zellen, die unter diesen Bedingungen ĂŒberlebten, deutlich an. Diese Daten sind in Tabelle 2 dargestellt und zeigen, dass der ROS-Gehalt in den Zellen, die unter Laktazidose-Bedingungen bebrĂŒtet wurden, um fast 150 % (p < 0,05) bzw. 230 % (p < 0,05) höher war als die entsprechenden Werte fĂŒr die Zellen, die in Standard- bzw. Glukose-defizienten Medien bebrĂŒtet wurden.

Die gewonnenen Daten haben also gezeigt, dass die Laktazidose das Überleben der LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen des Glukosemangels in vitro erheblich fördert, was durch die hohe Anzahl der unter diesen ungĂŒnstigen Bedingungen ĂŒberlebenden Zellen und die niedrige Apoptoserate bestĂ€tigt wird. Das Überleben der Zellen war mit einem unerwarteten Anstieg des intrazellulĂ€ren ROS-Niveaus und einem verringerten Glukoseverbrauch in LLC/R9 verbunden.

MediumGlukoseverbrauch, %ROS, %
Standard100.0 ± 5.9100.0 ± 24.8
Glukose-Mangel0.0 ± 0.0*75.8 ± 10.7
Laktazidose29.8 ± 1.5*248.7 ± 53.2*
Tabelle 2. Die Wirkung der Laktazidose unter der Bedingung des Glukosemangels auf den Glukoseverbrauch und die ROS-Produktion durch Tumorzellen in vitro.

Anmerkung: *p < 0,05.

Diese Muster des Überlebens von LLC/R9-Zellen unter den Bedingungen der Laktazidose vor dem Hintergrund des Glukosemangels in vitro belegen, dass ein verringerter Laktatgehalt in der Mikroumgebung des Tumors das Überleben der Tumorzellen unter den Bedingungen des metabolischen Stresses verhindern kann und somit eine Antitumorwirkung ausĂŒbt. Diese Hypothese wurde von uns mit DCA als einer Verbindung getestet, die in der Lage ist, Laktazidose zu reduzieren.

Die Daten zum Einfluss von DCA auf die Wachstumskinetik und Metastasierung von LLC/R9 sind in Abb. 2 und Tabelle 3 dargestellt. Diesen Daten zufolge beeinflusste DCA das Wachstum von PrimĂ€rtumoren nicht signifikant, bewirkte aber eine deutliche UnterdrĂŒckung der Metastasierung. Die Wachstumskinetik der PrimĂ€rtumore in MĂ€usen mit LLC/R9, die mit DCA behandelt wurden, unterschied sich praktisch nicht von der der KontrollmĂ€use, und am21. Tag nach der Tumortransplantation war das Volumen der PrimĂ€rtumore in der Versuchsgruppe nur um 39 % geringer als in der Kontrollgruppe (siehe Abb. 2, Tabelle 3). Obwohl DCA keine nennenswerte UnterdrĂŒckung des PrimĂ€rtumorwachstums bewirkte, war seine antimetastatische AktivitĂ€t bei LLC/R9 auffĂ€llig. Die Anzahl und das Volumen der Lungenmetastasen in den mit DCA behandelten tumortragenden MĂ€usen waren um 59 % (р < 0,05) bzw. 94 % (р < 0,05) niedriger als diese Indizes in der Kontrollgruppe (siehe Tabelle 3).

Abb. 2. Die Wirkung von DCA auf die LLC/R9-Wachstumskinetik in vivo

Gruppe von MĂ€usenTumorvolumen,mm3Anzahl der MetastasenVolumen der Metastasen
, mm
3
Kontrolle (n = 13)1702.7 ± 333.910.9 ± 1.217.9 ± 5.6
DCA (n = 13)1046.0 ± 258.34.5 ± 1.6*1.1 ± 0.4*
Tabelle 3. Einfluss von DCA auf das Wachstum und die Metastasierung von LLC/R9.
Anmerkung: *р < 0,05, Unterschiede sind signifikant im Vergleich zum Wert der Kontrolle.

Eine Analyse des Laktatgehalts in Tumorgewebeproben hat gezeigt, dass DCA unerwartet einen signifikanten Anstieg des Laktatgehalts im Tumorgewebe verursacht, zumindest am21. Tag nach der Tumortransplantation einen signifikanten Anstieg des Laktatgehalts im Tumorgewebe verursachte. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, war der Laktatgehalt im Tumorgewebe der mit DCA behandelten MĂ€use um fast 30 % höher (р < 0,05) als der der Kontrollgruppe. In Anbetracht der FĂ€higkeit von DCA als PDH-Kinase-Inhibitor, den Energiestoffwechsel des malignen Tumors in Richtung oxidative Phosphorylierung zu reorganisieren, haben wir die Laktatproduktion der Tumorzellen als Surrogatmarker fĂŒr die Hemmung der Glykolyse unter DCA-Einfluss betrachtet. Der durch DCA verursachte Anstieg des Laktatspiegels im Tumor deutet darauf hin, dass seine Verabreichung an MĂ€use mit LLC/R9 in einer Gesamtdosis von 1,5 g/kg Körpergewicht des Tieres fĂŒr die Aktivierung der oxidativen Phosphorylierung in den Tumorzellen unzureichend sein könnte, was zum Teil seine geringe Wirksamkeit gegen PrimĂ€rtumore erklĂ€rt.

Gruppe von MÀusenLaktat (”mol/1 g Gewebe)
Kontrolle (n = 4)11.1 ± 0.6
DCA (n = 5)14.4 ± 1.5*
Tabelle 4. Einfluss von DCA auf den Laktatspiegel im Tumorgewebe von LLC/R9-tragenden MĂ€usen.
Anmerkung: р < 0,05, Unterschiede sind signifikant im Vergleich zum Wert der Kontrolle.

Die Analyse der EPR-Spektren von Tumorproben hat gezeigt, dass DCA den Funktionszustand der ETC-Komponenten in den Mitochondrien der Tumorzellen nicht signifikant beeinflusste (Tabelle 5). Zum Beispiel war bei MĂ€usen mit LLC/R9, die mit DCA behandelt wurden, die IntensitĂ€t der EPR-Signale, die den Nitrosyl-HĂ€m-Eisen-Protein-Komplexen(gсДр= 2,007) in den ETC-Proteinen der Tumorzellmitochondrien entsprechen, nicht signifikant höher als bei KontrollmĂ€usen. Es ist bekannt, dass die AnhĂ€ufung von NO-Komplexen aus HĂ€m-Eisen einerseits auf ein Redox-Ungleichgewicht hinweisen kann, bei dem freie Radikale dominieren, insbesondere auf eine NO-Überproduktion, und andererseits auf eine mögliche Hemmung der Zellatmung durch Nitrosylierung von HĂ€m-Proteinen. DCA, dessen Hauptmechanismus der Antitumorwirkung vermutlich mit der Induktion der ROS-Produktion durch die Mitochondrien zusammenhĂ€ngt [8, 10, 11]verursachte jedoch keine Erhöhung der HĂ€m-Eisen-Komplexe mit NO im Tumorgewebe. Die jĂŒngste Beobachtung könnte möglicherweise mit den Merkmalen der LLC/R9-Zellen zusammenhĂ€ngen, nĂ€mlich einem extrem hohen Gehalt an diesen Komplexen, der fĂŒr diesen Tumor charakteristisch ist und dessen fortschreitende AnhĂ€ufung wĂ€hrend der Tumorentwicklung in vivo von uns auch bei fehlender Behandlung registriert wurde [16].

Relative EPR-SignalintensitÀt Relative EPR-SignalintensitÀt
Gruppe von MĂ€usenNitrosyl-HĂ€m-Eisen-Protein-Komplexe (g = 2,007)Fe-S-Protein (g = 1,94)
Kontrolle54.3 ± 4.515.8 ± 0.5
DCA97.8 ± 30.117.8 ± 2.1
Tabelle 5. Einfluss von DCA auf die mitochondriale ETC-AktivitÀt von Tumorzellen

Das Fehlen einer signifikanten Wirkung von DCA auf die funktionelle AktivitĂ€t der mitochondrialen ETC-Komponenten in Tumorzellen wurde auch durch die Daten zur IntensitĂ€t der EPR-Signale bestĂ€tigt, die den Fe-S-Cluster-Proteinen(g = 1,94) entsprechen (Komplexe І, ІІ, ІІІ), die in beiden Tiergruppen praktisch gleich waren (siehe Tabelle 5).

Zusammenfassend haben die Ergebnisse unserer Studie gezeigt, dass die Laktazidose das Überleben der LLC-Variante LLC/R9 unter den Bedingungen des Glukosemangels erheblich fördert. Wenn sich LLC/R9 in vivo entwickelte, ĂŒbte DCA jedoch keine antitumorale Wirkung auf PrimĂ€rtumore aus. Die fehlende antitumorale Wirkung von DCA auf das Wachstum von LLC/R9 stand im Einklang mit dem Fehlen einer hemmenden Wirkung von DCA auf den Laktatgehalt im Tumor sowie mit dem Fehlen einer nennenswerten Wirkung von DCA auf die ROS-Produktion der Tumorzellen. Obwohl DCA das Wachstum von LLC/R9 nicht beeinflusste, hemmte es die Metastasierung drastisch; diese Beobachtung konnte nicht durch die DCA-Wirkung innerhalb des PrimĂ€rtumors erklĂ€rt werden, und weitere zusĂ€tzliche Studien ĂŒber seine antimetastatische Wirkung sind erforderlich.

REFERENZEN


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