📖 11 mins.

ТАЦУАКИ ИШИГУРО1,2, МИЮ ИШИГУРО1, РЮМЕЙ ИШИГУРО1 и САЮРИ ИВАИ1*

1 Отделение экспериментальной терапии, Kamui Medical Co., Ltd., Токио 1120002
2 Клиника Hibiya Uchisaiwaicho, Токио 1050004, Япония.

Переписка: Д-р Тацуаки Исигуро, Камуи Медикал Ко., Лтд., 2-20-13 Коисикава Бункё-ку, Токио 1120002, Япония
E-mail: [email protected]

Получено: 14 ноября 2011
Принято: 28 декабря 2011
DOI: 10.3892/ol.2012.552

Аннотация

Сообщалось, что обработка раковых клеток дихлорацетатом (ДХА), одобренным для лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает вспять эффект Варбурга и подавляет рост опухоли). Кроме того, омепразол (OMP) является хорошо известным агентом, усиливающим действие противораковых препаратов. Целью данного исследования было найти клинически используемые препараты, усиливающие действие DCA. Комбинация DCA и OMP проявила более мощную противоопухолевую активность, чем только DCA, в отношении клеток фибросаркомы HT1080 и клеток рака толстой кишки RKO, в то время как препараты не влияли на пролиферацию фибробластов человека WI-38. Ингибирующий эффект DCA в сочетании с OMP был отменен витамином Е и Z-VAD-FMK; поэтому в качестве механизма ингибирования было предложено обычное каспазозависимое ингибирование роста клеток через производство супероксида. Комбинация этих препаратов также оказывала действие на клетки фибросаркомы HT1080, инокулированные мышам. Поскольку OMP и DCA могут вводиться перорально и уже несколько лет используются в клинической практике без серьезных побочных эффектов, мы считаем, что эта комбинированная терапия может быть легко применена для лечения злокачественных опухолей.

Ключевые слова: фибросаркома, рак толстой кишки, дихлорацетат, омепразол
Сокращения: DCA — дихлорацетат; PPI — ингибитор протонной помпы; OMP — омепразол; SOD — супероксид; ROS — реактивные виды кислорода


Введение

Варбург впервые заметил, что даже в присутствии достаточного количества кислорода раковые клетки предпочитают метаболизировать глюкозу и вырабатывать молочную кислоту [1-4]. Сопутствующее увеличение поглощения глюкозы может быть использовано в клинических условиях для выявления большинства солидных злокачественных опухолей с помощью позитронно-эмиссионной томографии с фтордезоксиглюкозой (ФДГ-ПЭТ). Одной из возможных причин того, что раковые опухоли используют этот менее эффективный путь производства аденозинтрифосфата (АТФ) по сравнению с окислительным фосфорилированием, является его преимущество для выживания и пролиферации в уникальной гипоксической среде опухоли [5]. Это предпочтение анаэробного дыхания также считается причиной устойчивости раковых клеток к противораковым препаратам, которые вызывают апоптоз через митохондриальный путь. Bonnet и др. сообщили, что обработка раковых клеток дихлорацетатом (ДХА), одобренным для лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает эффект Варбурга и подавляет рост опухоли (3,4,6-8). DCA увеличивает поток пирувата в митохондрии путем ингибирования киназы пируватдегидрогеназы и стимулирует окисление глюкозы над гликолизом. В результате DCA снижает выработку молочной кислоты опухолью и повышает внутриклеточный рН. DCA вызывает апоптоз по двум путям: один в митохондриях, где деполяризация и выработка супероксида (SOD) активирует митохондрий-зависимый апоптоз, а другой — на уровне плазмалеммы, где активация/управление каналов Kv1.5 снижает (K+)i, активируя каспазы [6]. DCA является перспективным противораковым препаратом благодаря удобству перорального применения, низкой стоимости, небольшому количеству побочных эффектов и длительному опыту клинического использования [7,8]. Хотя он представляется перспективным средством для лечения злокачественных опухолей, его действие ограничено в продолжающихся отчетах о клинических испытаниях. Поэтому мы задались целью найти клинически используемые препараты, усиливающие действие DCA.
Омепразол (OMP) является ингибитором протонной помпы (PPI) и также известен тем, что усиливает действие противораковых препаратов [9]. ОМП ингибирует активность V-АТФазы, а также воздействует на кислотный насос желудка. Сообщалось, что он подавляет пролиферацию опухолевых клеток, возможно, за счет ощелачивания лизосом и пермеабилизации мембран лизосом с последующей продукцией реактивных форм кислорода (ROS) [10,11].
Как было описано, считается, что DCA и OMP подавляют рост опухолевых клеток через общий путь производства ROS путем воздействия на внутриклеточный уровень pH. Поскольку эти два препарата используются в клинической практике с незначительными побочными эффектами, мы считаем, что их комбинация является перспективным протоколом для лечения рака.

Материалы и методы

Химические вещества
DCA и витамин Е (токоферола ацетат) были приобретены у компании Wako Chemical Industries, Ltd

. (Токио, Япония).

(Токио, Япония). OMP был приобретен у компании Astra Zeneca Japan (Осака, Япония). Z-VAD-FMK был приобретен у Peptide Institute, Inc. (Осака, Япония).

Культура клеток
Клетки фибросаркомы человека HT1080, клетки фибробластов человека WI-38 и клетки рака толстой кишки RKO были посеяны и выращены в среде Дульбекко, модифицированной Орловой, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и поддерживались в инкубаторе при 37˚C и 5%CO2. Для экспериментов по пролиферации клеток их высевали в 12-луночные планшеты и инкубировали в тех же условиях. Через 7 дней клетки обрабатывали трипсином-ЭДТА и подсчитывали под микроскопом.

Эксперименты на животных
Клетки HT1080 (5×106 ) были подкожно привиты мышам nude (самки 8w). Препараты добавляли в питьевую воду для достижения суточной дозы, аналогичной клинической (DCA 50 мг/кг, OMP 2 мг/кг). Размер каждой опухоли измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали путем умножения трех диаметров.

Результаты

Комбинированное лечение DCA и OMP подавляло пролиферацию клеток
Клетки фибросаркомы человека HT1080 культивировали с возрастающими концентрациями DCA и OMP в течение 7 дней, что привело к дозозависимому подавлению пролиферации (рис. 1). Как показано на рис. 2А, комбинация DCA и OMP заметно блокировала пролиферацию клеток фибросаркомы HT1080, в то время как эта же комбинация не влияла на пролиферацию нормальных клеток фибробластов человека WI-38.

Рисунок 1. Дозозависимое ингибирование пролиферации клеток фибросаркомы HT1080 с помощью DCA и OMP. Клетки человека HT1080 (5×103) культивировали с возрастающими концентрациями DCA (0,45-1,35 мМ) и OMP (20-160 мкМ). Клетки собирали через 7 дней и подсчитывали под микроскопом. DCA — дихлорацетат; OMP — омепразол.


Рисунок 2. (A) Влияние комбинированной обработки DCA и OMP на клетки фибросаркомы HT1080 и нормальные фибробласты человека WI-38. Клетки фибросаркомы HT1080 (5×103) или нормальные фибробласты человека WI-38 культивировали с 0,9 мМ DCA и 40 мкМ OMP. Клетки собирали через 7 дней и подсчитывали под микроскопом. *P<0,05 по сравнению с контролем. (B) Влияние витамина Е и Z-VAD-FMK на ингибирующее действие ДКА и ОМР на рост клеток. Клетки фибросаркомы HT1080 (5×103) культивировали с 1,2 мМ DCA или 40 мкМ OMP. Добавляли витамин Е (10 мкМ) или Z-VAD-FMK (50 мкМ). Клетки собирали через 7 дней и подсчитывали под микроскопом. *P<0,05 по сравнению только с DCA, +p<0,05 по сравнению только с OMP. DCA — дихлорацетат; OMP — омепразол; Vit E — витамин Е.


Витамин Е ингибировал эффекты DCA и OMP
Хотя механизм каспазозависимого ингибирования роста клеток OMP [10,11] вызывает споры, сообщалось, что DCA и OMP подавляют рост опухолевых клеток за счет выработки СОД (6,10). Чтобы установить, действует ли тот же механизм в клетках фибросаркомы HT1080, мы использовали витамин Е в качестве ингибитора СОД. Витамин Е успешно ингибировал действие DCA и OMP, поэтому можно предположить, что выработка SOD участвует в ингибировании роста опухолевых клеток (рис. 2B). Пан-каспазный ингибитор Z-VAD-FMK также подавлял действие этих препаратов, поэтому можно предположить, что в этих процессах, по крайней мере частично, участвует каспазозависимый противоопухолевый механизм (рис. 2В). В целом, DCA и OMP ингибируют рост клеток фибросаркомы HT1080, возможно, через каспазозависимый путь посредством выработки SOD. В результате, при совместном применении эти препараты могут проявлять синергетический эффект. Этот синергетический эффект и ингибирующий эффект с витамином Е также наблюдался в клетках рака толстой кишки RKO (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние комбинированной обработки DCA и OMP на клетки рака толстой кишки RKO. Клетки рака толстой кишки RKO (5×103) культивировали с 0,9 мМ DCA, 40 мкМ OMP, 0,9 мМ DCA+40 мкМ OMP или 0,9 мМ DCA+40 мкМ OMP+10 мкМ витамина Е. Клетки собирали через 7 дней и подсчитывали под микроскопом. *P<0,05 по сравнению с контролем, +p<0,05 по сравнению с DCA+OMP. DCA — дихлорацетат; OMP — омепразол; Vit E — витамин E.


Мы провели эксперименты на животных, чтобы изучить эффекты DCA и OMP in vivo.
Как
показано на рис. 4, противоопухолевый эффект комбинации DCA и OMP также был выше, чем у одного из препаратов.

Рисунок 4. Клетки HT1080 (5×106) инокулировали подкожно мышам nude. Препараты добавляли в питьевую воду для достижения суточной дозы, аналогичной клинической (DCA 50 мг/кг, OMP 2 мг/кг). Размер каждой опухоли измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали путем умножения трех диаметров. *P<0,05 по сравнению с контролем. DCA — дихлорацетат; OMP — омепразол.

Обсуждение

Мы показали, что комбинированное лечение DCA и OMP более эффективно, чем лечение одним из препаратов в отдельности, в клетках фибросаркомы человека HT1080 и клетках рака толстой кишки RKO. Комбинированная терапия была также эффективна в экспериментах на животных.
DCA и OMP безопасно использовались в течение нескольких лет, но не классифицируются как противораковые препараты. DCA использовался для лечения врожденного метаболического ацидоза, а OMP — для лечения заболеваний, связанных с кислотой, причем оба препарата не имели серьезных побочных эффектов [7,8,12,13]. Ожидается, что сочетание DCA и OMP позволит снизить необходимую дозу каждого препарата и сопутствующие риски.
Сообщалось, что пероральная доза 20 мг OMP один раз в день приводит к максимальной концентрации в плазме крови пациентов ~2,5 мкг/мл (7 мкМ) через 2 часа после приема[14]. Доза 120 мг OMP три раза в день использовалась для лечения синдрома Золлингера-Эллисона, при этом даже при длительном применении наблюдались лишь редкие и слабые побочные эффекты [15,16]. Эта доза соответствует гипотетической пиковой концентрации in vivo ~15 мкг/мл (42 мкМ). Передозировки до 2 400 мг (гипотетическая пиковая концентрация в плазме 300 мкг/мл (840 мкМ)) переносятся с незначительными побочными эффектами [17]. ДКА уже зарекомендовал себя в клинической практике. Значение Cmax DCA у взрослых после 6 месяцев непрерывного лечения (пероральные дозы 25 мг/кг/день) составило 53±18 мкг/мл (0,35±0,12 мМ) [18]. Пациенты благополучно получали хроническое лечение ДКА в максимальной дозе 50 мг/кг/день [19]. Ряд детей с молочнокислым ацидозом получали ДКА в дозе >100 мг/кг в день в течение длительного периода [8]. На основании этих данных мы считаем, что необходимая доза этих двух препаратов является переносимой. Более того, были разработаны аналоги ДКА с меньшей токсичностью и лучшим сродством связывания [20]. Таким образом, комбинация DCA и OMP рассматривается как потенциальный вариант терапии злокачественных опухолей и может привести к разработке новой терапевтической стратегии.

ССЫЛКИ

1 Warburg O: Ueber den Stoffwechsel der Tumoren, Constable, London, 1930.
2 Warburg O: On the origin of cancer cells. Science 123: 309-314, 1956.
3 Hsu PP и Sabatini DM: Метаболизм раковых клеток: Варбург и не только. Cell 134: 703-707, 2008.
4 Michelakis ED, Webster L and Mackey LR: Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolic-targeting therapy for cancer. Br J Cancer 99: 989-994, 2008.
5 Plas DR и Thompson CB: Клеточный метаболизм в регуляции запрограммированной клеточной смерти. Trends Endocrinol Metab 13: 75-78, 2002.
6 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, et al: A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11: 37-51, 2007.
7 Stacpoole PW: The pharmacology of dichloroacetate. Метаболизм 38: 1124-1144, 2006.
8 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW and Shuster JJ: Evaluation of long-term treatment of children with congenital lactic acidosis with dichloroacetate. Педиатрия 121: 1223-1228, 2008.
9 Luciani F, Spada M, Milito AD, Molinari A, Rivoltini L, Montinaro A, Marra M, Lugini L, Logozzi M, Lozupone F, et al: Effect of proton pump inhibitor prereatment on resistance of solid tumors to cytotoxic drugs. J Natl Cancer Inst 96: 1702-1713, 2004.
10 Milito AD, Iessi E, Logozzi M, Lozupone F, Spada M, Marino ML, Federici C, Perdicchio M, Matarrese P, Lugini L, et al: Proton pump inhibitors induce apoptosis of human B-cell tumors through a caspase-independent mechanism involving reactive oxygen species. Cancer Res 67: 5408-5417, 2007.
11 De Milito A, Canese R, Marino ML, Borghi M, Iero M, Villa A, Venturi G, Lozupone F, Iessi E, Logozzi M, et al: pH-dependent antitumor activity of proton pump inhibitors against human melanoma is mediated by inhibition of tumor acidity. Int J Cancer 27: 207-219, 2010.
12 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, et al: Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Trasl Med 2: 31-34, 2010.
13 Shi S and Klotz U: Ингибиторы протонной помпы: обновленная информация об их клиническом применении и фармакокинетике. Eur J Clin Pharmacol 64: 935-951, 2008.
14 Katagiri F, Inoue S, Itoh H и Takayema M: Омепразол повышает уровень соматостатина и мотилина в плазме крови человека. Biol Pharm Bull 28: 370-372, 2005.
15 Frucht H, Maton PN и Jensen RT: Применение омепразола у пациентов с синдромом Золлингера-Эллисона. Dig Dis Sci 36: 394-404, 1991.
16 Thomson ABR, Sauve MD, Kassam N и Kamitakahara H: Safety of the long-term use of proton pump inhibitors. World J Gastroenterol 16: 2323-2330, 2010.
17 Udelnow A, Kreyes A, Ellinger S, Landfester K, Walther P, Klapperstueck T, Wohlrab J, Henne-Bruns D, Knippschild U and Würl P: Omeprazole inhibits proliferation and modulates autophagy in pancreatic cancer cells. PLoS One 6: e20143, 2011.
18 Shroads AL, Guo X, Dixit V, Liu HP, James MO and Stacpoole PW: Age-dependent kinetics and metabolism of dichloroacetate: possible relevance to toxicity. J Pharmacol Exp Ther 324: 1163-1171, 2008.
19 Stacpoole PW, Henderson GN, Yan Z, Cornett R and James MO: Фармакокинетика, метаболизм и токсикология дихлорацетата. Drug Metab Rev 30: 499-539, 1998.
20 Subramanian K and Ramaian AS: Development of a less toxic dichloroacetate analogue by docking and descriptor analysis. Биоинформация 5: 73-76, 2010.

Добавить комментарий