📖 34 mins.

Kasirajan Ayyanathan1,2,*,#, Shailaja Kesaraju1,#, Ken Dawson-Scully1,2, Herbert Weissbach1

1 Центр молекулярной биологии и биотехнологии, Научный колледж Чарльза Э. Шмидта, Атлантический университет Флориды, Юпитер, Флорида, Соединенные Штаты Америки,
2 Факультет биологических наук, Научный колледж Чарльза Э. Шмидта, Атлантический университет Флориды, Бока-Ратон, Флорида, Соединенные Штаты Америки

*E-mail

: [email protected]

#Все

авторы внесли равный вклад в эту работу.


Получено: 12 августа 2011
Принято: 4 июня 2012 г.
Опубликовано: 1 июля 2012 г

Аннотация

Сулиндак является нестероидным противовоспалительным препаратом, одобренным FDA и обладающим противораковой активностью. Наши недавние исследования показали, что сулиндак избирательно усиливает гибель раковых клеток под воздействием окислительных агентов за счет выработки реактивных форм кислорода (ROS), что приводит к дисфункции митохондрий. Этот эффект сулиндака и окислительного стресса на раковые клетки может быть связан с дефектом дыхания в раковых клетках, впервые описанным Варбургом 50 лет назад и известным как эффект Варбурга. Мы предположили, что сулиндак может усиливать селективную гибель раковых клеток в сочетании с любым соединением, которое изменяет митохондриальное дыхание. Для проверки этой гипотезы мы использовали дихлорацетат (ДХА), который, как известно, смещает метаболизм пирувата от образования молочной кислоты к дыханию. Можно ожидать, что ДХА, поскольку он стимулирует аэробный метаболизм, может вызвать стресс митохондриального дыхания в раковых клетках, что приведет к усилению их гибели в присутствии сулиндака. В данном исследовании мы показали, что комбинация сулиндака и DCA усиливает селективное убийство раковых клеток A549 и SCC25 в использованных условиях. Как и предполагалось, механизм гибели включает в себя производство ROS, дисфункцию митохондрий, сигнализацию JNK и смерть в результате апоптоза. Наши результаты позволяют предположить, что комбинация препаратов сулиндак-DCA может стать эффективным средством лечения рака.

Цитирование: Ayyanathan K, Kesaraju S, Dawson-Scully K, Weissbach H (2012) Combination of Sulindac and Dichloroacetate Kills Cancer Cells through Oxidative
Damage. PLoS ONE 7(7): e39949. doi:10.1371/journal.pone.0039949
Редактор: Джозеф Алан Бауэр, Исследовательский фонд Бауэра, Соединенные Штаты Америки

© 2012 Ayyanathan et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает
неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любой среде при условии указания автора и источника.

Финансирование: Выражаем благодарность за помощь в финансировании данной работы от Национальных институтов здравоохранения KA (грант 5K01CA95620) и HW (грант R15 CA122001) и от штата Флорида HW (грант SURECAG R94007). Финансирующие организации не принимали участия в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.


ВВЕДЕНИЕ

Сулиндак является нестероидным противовоспалительным препаратом (НПВП), одобренным FDA, который также обладает противораковой активностью [1-6]. Недавние исследования нашей лаборатории показали, что линии раковых клеток RKO, A549 и SCC25 проявили чувствительность к комбинации сулиндака и окислителя, такого как TBHP или H2O2 [7]. Данные показали, что эффект сулиндака не связан с его НПВС-активностью, но сулиндак делает раковые клетки более чувствительными к окислительному стрессу, что приводит к дисфункции митохондрий и потере жизнеспособности. В отличие от этого, нормальные клетки не демонстрировали повышенной гибели в аналогичных условиях [7]. За последние 10 лет появились разрозненные сообщения об усилении гибели раковых клеток при использовании сулиндака в сочетании с различными соединениями, включая триоксид мышьяка, бортезомиб, дифторметилорнитин (DFMO) и субероиланилид гидроксамовую кислоту (SAHA) [8-14]. Хотя эти соединения имеют разные участки действия, общий механизм усиления гибели от комбинации сулиндак/препарат может включать окислительное повреждение, что было четко продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях с использованием сулиндака и окислителя [7], [15]. В исследованиях, в которых сулиндак использовался в комбинации с триоксидом мышьяка, бортезомибом и SAHA [10], [12], [14], были указаны ROS.

Наши предыдущие результаты позволили предположить, что усиленное уничтожение раковых клеток комбинацией сулиндака и окислителя может быть связано с дефектом дыхания в раковых клетках, впервые описанным Варбургом более 50 лет назад [16], который отметил, что раковые клетки предпочитают гликолиз, а не дыхание, для получения энергии, в отличие от нормальных клеток. Некоторые раковые клетки получали до 50% энергии за счет гликолиза, в то время как на гликолиз в нормальных клетках приходится менее 5% требуемой энергии [16]. Чтобы получить дополнительные доказательства возможной роли измененного дыхания и ROS в гибели раковых клеток под действием сулиндака и окислительного стресса, мы начали исследования с дихлоруксусной кислотой натрия (DCA). DCA является идеальным кандидатом, поскольку известно, что она ингибирует киназу, которая снижает активность пируватдегидрогеназы, что приводит к сдвигу метаболизма пирувата от образования молочной кислоты в сторону дыхания [17], [18]. DCA использовался в клинической практике для лечения пациентов с молочнокислым ацидозом [19], а на основе его биохимических свойств DCA также был протестирован в качестве противоракового агента. Bonnet и др. 2007 показали, что DCA обращает вспять эффект Варбурга в раковых клетках, перенаправляя метаболизм раковых клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование. В этих предыдущих исследованиях было показано, что DCA увеличивает уровень ROS из комплекса I. Это, в свою очередь, вызывает «ремоделирование» митохондриального метаболизма (уменьшает ΔΨm, открывает митохондриальную переходную пору) в раковых клетках, подталкивая их к апоптозу. Более того, несколько недавних исследований подтвердили, что DCA может повышать уровень ROS в раковых клетках и деполяризовать мембрану митохондрий в клеточных линиях легких, эндометрия и глиобластомы, что приводит к апоптозу как in vitro, так и in vivo [18], [20-22]. Интерес представляет наблюдение, что в использованных условиях DCA не оказывает существенного влияния на митохондриальный метаболизм или жизнеспособность нормальных клеток [18], [23].

Основываясь на наших предыдущих наблюдениях за убивающим рак действием сулиндака и окислителя, влияющего на метаболизм митохондрий [7], мы предположили, что комбинация сулиндака и DCA может синергически усиливать убивающий рак эффект и иметь важное терапевтическое значение. В настоящем исследовании мы изучили влияние сулиндака в комбинации с DCA на жизнеспособность раковых клеточных линий A549 и SCC25. Мы также изучили роль митохондриальной функции и апоптоза в уничтожении рака, наблюдаемом при использовании этой комбинации препаратов.

Материалы и методы

Материалы
Сулиндак, N-ацетилцистеин и Тирон были приобретены у компании Sigma (St.Louis, MO). Натриевая соль DCA была получена от Acros Organics (Geel, Бельгия). H2DCFDA и JC-1 были приобретены у Molecular Probes (Юджин, ОР). Реактив для анализа MTS и набор Deadend Tunel Kit были получены от Promega (Madison, WI). Набор для фракционирования цитозоля/митохондрий и набор CBA077 InnoCyte™ Flow Cytometric Cytochrome c Release были получены от Calbiochem, Gibbstown, NJ. Все среды для культивирования клеток, фетальная бычья сыворотка и другие добавки, такие как пенициллин/стрептомицин, глютамин и т.д., были приобретены у American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

Культура клеток
Клеточная линия немелкоклеточной карциномы легких (NSCLC), A549, нормальная линия клеток легких человека, MRC-5, и линия плоскоклеточной карциномы языка, SCC25 были приобретены у ATCC (Rockville, MD) и поддерживались в среде F12-K, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном 5%CO2 инкубаторе при 37°C. Нормальные эпидермальные кератиноциты человека были получены от Promocell GmbH (Гейдельберг, Германия) и поддерживались в рекомендованной культуральной среде. Для экспериментов использовали неиммортализованные нормальные клетки ранних пассажей.

Анализ жизнеспособности клеток
Раковые клетки A549 и нормальные клетки легких были размещены в количестве 3×103 клеток на лунку, а раковые клетки SCC25 и нормальные кератиноциты были размещены в количестве 7,5×103 клеток на лунку в 96-луночном планшете. Клетки выращивали в течение 18-20 часов, среду удаляли в асептических условиях и заменяли свежей культуральной средой, содержащей указанные комбинации препаратов. Там, где указано, 500 мкМ сулиндака использовали с раковыми и нормальными клетками легкого A549, а 100 мкМ сулиндака — с раковыми и нормальными клетками кератиноцитов SCC25. Планшеты инкубировали в течение 48 часов при 37°C в инкубаторе с 5%CO2. Культуральную среду удаляли, а клетки тщательно промывали в 1× PBS. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter 96 Aqueous One Cell Proliferation Assay (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. В этом анализе используется соединение тетразолия, которое превращается в водорастворимый формазан под действием клеточных дегидрогеназ, присутствующих в метаболически активных клетках [24]. Количественное определение формазана проводилось путем измерения поглощения при 490 нм с помощью колориметрического микротитровального планшета (SpectraMax Plus; Molecular Devices). Фоновая абсорбция вычиталась из каждого образца.

Внутриклеточное измерение ROS
Клеточные линии раковых клеток A549 и SCC25 были высеяны, как указано выше. После 48-часовой обработки препаратами клетки инкубировали с 50 мкМ дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (H2DCFDA, Molecular Probes) в среде без индикатора в течение 30 мин при 37°C. Клетки промывали PBS и визуализировали уровни ROS с помощью флуоресцентной микроскопии. Изображения были получены с помощью программы Qcapture и обработаны в Adobe photoshop. Анализ изображений проводили с помощью программы slidebook. Данные, полученные из репрезентативного эксперимента, использовались для количественной оценки DCF-позитивных клеток, измеряемых по зеленой флуоресценции, обусловленной окисленным DCF.

Окрашивание JC-1 для мониторинга мембранного потенциала митохондрий
Мембранный потенциал митохондрий определяли с помощью красителя JC-1 (Molecular Probes). Клеточные линии раковых клеток A549 и SCC25 были посеяны, как указано выше. После 48-часовой обработки препаратами клетки инкубировали с 5 нг/мл красителя JC-1 в среде без индикатора в течение 30 мин при 37°C. Клетки промывали PBS и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Нормальные митохондрии активно поглощают краситель JC-1 потенциал-зависимым образом и образуют J-агрегаты, которые дают красную флуоресценцию. Нарушение и последующая потеря мембранного потенциала митохондрий приводит к увеличению зеленой флуоресценции в цитозоле из-за мономерного JC-1, что определяется по появлению зеленой флуоресценции с использованием фильтра FITC (инвертированный микроскоп Zeiss — Axiovert 40 CFL). Захват, обработка и анализ изображений проводились, как указано выше. Данные, полученные из репрезентативного эксперимента, использовались для количественной оценки JC-1-зеленых положительных клеток.

Влияние скавенджеров ROS на жизнеспособность клеток в присутствии сулиндака и DCA
Клеточные линии рака A549 и SCC25 высевали, как описано выше. Для уничтожения ROS добавляли 2 мМ N-ацетилцистеина (NAC) или 2 мМ Tiron (4,5-дигидрокси-1,3-бензендисульфоновой кислоты натриевая соль) вместе с сулиндаком и DCA на 48 часов при 37°C. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-теста, а статистический анализ проводили, как указано выше.

Окрашивание TUNEL для мониторинга апоптоза клеток
Анализ TUNEL проводили в 96-луночных планшетах с использованием набора для колориметрического анализа DeadEnd (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Клеточные линии раковых клеток A549 и SCC25 высевали, как указано выше, и обрабатывали в течение 48 ч без препарата, сулиндаком, DCA или комбинацией препаратов. После обработки препаратами клетки фиксировали формалином и пермеабилизировали 0,2% Triton X-100 в PBS. Клетки инкубировали с рекомбинантной терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) и биотинилированными нуклеотидами. Эндогенные пероксидазы блокировали 0,3% H2O2 перед инкубацией с пероксидазой хрена-стрептавидином (HRP-стрептавидин), который связывается с биотинилированными нуклеотидами, встроенными в зазубренные концы, присутствующие в клетках, подвергающихся апоптозу. Меченые HRP-стрептавидином клетки были обнаружены с помощью перекиси водорода и диаминобензидина (DAB). Клетки с темно-коричневым окрашиванием ядер свидетельствуют об апоптозе.

Вестерн-блот анализ
Клетки выращивали до 70% конфлюентности, обрабатывали указанными препаратами в течение указанных сроков, и цитозольные фракции выделяли с помощью набора для фракционирования цитозоля/митохондрий (Calbiochem, Gibbstown, NJ) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки собирали в разные моменты времени и затем центрифугировали при 600×g в течение 5 мин при 4°C. Осажденные клетки суспендировали в прилагаемом буфере и инкубировали в течение 10 мин на льду. Затем клетки гомогенизировали с помощью стеклянного дозатора и гомогенат центрифугировали при 700×g в течение 10 мин при 4°C для осаждения ядер и клеточного мусора. Надосадочную жидкость отжимали при 10 000×g в течение 30 мин при 4°C для получения митохондриальной гранулы, а надосадочную жидкость считали цитозольной фракцией. Концентрацию белка определяли с помощью стандартного анализа Брэдфорда.

Шестьдесят микрограммов общего белка загружали и разделяли на 4-12% гелях NuPage Bis-Tris (Invitrogen, Eugene, OR) и переносили на PVDF мембрану, которую зондировали первичными антителами. Первичные антитела, JNK, pJNK, цитохром c и PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), использовались в разведении 1∶1000. β-актин (Santa Cruz Biotechnologies, Санта-Круз, Калифорния) использовался в разведении 1∶4000. Использовали вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, и полосы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции (GE Healthcare, Piscataway, NJ).


Для подтверждения степени апоптоза проводили
анализ лигированиянуклеосомной ДНК наоснове ПЦР, как описано [25]. Линии раковых клеток A549 и SCC25 были высеяны в количестве 5×104 и 1×105 клеток на лунку в 35-миллиметровую посуду. Раковые клетки A549 обрабатывали в течение 48 часов а) без препарата, б) 500 мкМ сулиндака, в) 20 мМ DCA и г) 500 мкМ сулиндака плюс 20 мМ DCA. Аналогично, раковые клетки SCC25 обрабатывали вышеупомянутыми четырьмя различными комбинациями препаратов, за исключением того, что сулиндак и DCA использовались в концентрациях 100 мкМ и 10 мМ, соответственно. После лечения выделяли общую клеточную ДНК, лигировали ее к адаптеру, построенному из 27-мерного 5′-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3′ и 12-мерного 5′- AGTCGACACACGTGTAC-3′. После лигирования ДНК нагревали для высвобождения 12-мера, заполняли Taq-полимеразой, подвергали полуколичественной ПЦР и анализировали на 1,2% агарозном геле вместе с маркерами размера.

Локализация цитохрома cin situ методом иммунофлуоресценции
Внутриклеточное расположение цитохрома c отслеживали методом иммунофлуоресценции с помощью набора для проточной цитометрии CBA077 InnoCyte™ Flow Cytometric Cytochrome c Release Kit в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки SCC25 высевали в количестве 3,5×105 клеток на 35 мм блюдо со стеклянным дном и обрабатывали указанными препаратами в течение 15 ч. Клетки промывали в 5 мл 1× PBS и пермеабилизировали на льду в течение 10 мин в 300 мкл поставляемого буфера. Клетки фиксировали при комнатной температуре в течение 20 мин в 500 мкл 4% параформальдегида. После промывки и блокирования клетки инкубировали с 250 мкл антитела против цитохрома с (разведение 1∶500) в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки клетки инкубировали с 300 мкл FITC-IgG (разведение 1∶300) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки окрашивали 300 мкл DAPI (1 мг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus. Изображения получали и обрабатывали, как указано выше. Анализировали несколько полей и получали репрезентативные микрофотографии, показывающие характер локализации цитохрома c при каждом условии обработки. Количественные значения представлены в тексте.

Статистический анализ и определение комбинированных индексов
Данные представлены как среднее ± SEM для анализа жизнеспособности клеток. Для статистического анализа использовалось статистическое программное обеспечение Minitab для проведения t-теста Стьюдента, и значения p<0,05 считались статистически значимыми. Чтобы установить синергетический эффект сулиндака и DCA на раковые клеточные линии A549 и SCC25, был проведен количественный анализ зависимости «доза-эффект» для определения показателей комбинации [26]. Как сулиндак, так и DCA были протестированы отдельно на клетках A549 и SCC25 в указанных концентрациях. Для клеток A549 соотношение 1∶50 поддерживалось для комбинаций препаратов сулиндак:DCA в диапазоне от 0,2 мМ:10 мМ до 1 мМ:50 мМ, соответственно. Для клеток SCC25 соотношение 1∶100 поддерживалось для комбинаций сулиндак:DCA в диапазоне от 0,05 мМ:5 мМ до 0,3 мМ:30 мМ, соответственно. Наши экспериментальные результаты и определенные значения индекса комбинации включены в текст.

Результаты

Сулиндак и DCA вызывают усиленное уничтожение раковых клеток A549 и SCC25, но не нормальных клеток
Для этих исследований мы протестировали комбинацию сулиндака и DCA на раковых клетках A549 и SCC25. Клетки инкубировали с каждым соединением в отдельности или в комбинации в течение 48 часов перед анализом на жизнеспособность (см. раздел «Методы»). Кривая дозового ответа сулиндака в этих условиях показала, что раковые клетки A549 и SCC25 могут переносить максимальную концентрацию сулиндака 500 мкМ и 100 мкМ, соответственно, не проявляя значительной гибели (данные не показаны), и эти концентрации использовались во всех исследованиях. DCA, когда добавляли, использовали в концентрации 0-40 мМ, как указано. Мы использовали эти концентрации на основании предыдущих отчетов, в которых указывалось, что для того, чтобы вызвать дисфункцию митохондрий в экспериментах in vitro, требуется более 5 мМ [27]. Как показано на рисунке 1А, только DCA (без сулиндака) несколько токсичен для раковых клеток A549, особенно при концентрациях выше 20 мМ, но в присутствии сулиндака наблюдается усиленная гибель этих клеток при концентрациях DCA выше 5 мМ. В случае раковых клеток SCC25 наблюдалась некоторая потеря жизнеспособности клеток при использовании только DCA даже при концентрациях DCA ниже 10 мМ (рис. 1B). Однако в присутствии сулиндака вновь наблюдалось заметное увеличение гибели клеток, которое четко прослеживалось между концентрациями DCA 2-10 мМ. Ранее мы показали, что комбинация сулиндака и окислителя была селективной для раковых клеток и не усиливала гибель нормальных клеток [7]. Сулиндак и DCA также не усиливали гибель нормальных клеток легких и кожи в использованных экспериментальных условиях, как показано на рисунках 1C и D. Следует отметить, что клетки MRC-5 (нормальные клетки легких) особенно чувствительны к DCA, как сообщалось ранее [28], по неизвестным причинам.

Рисунок 1 Сулиндак в комбинации с DCA избирательно убивает раковые клетки. Раковые клетки A549 и SCC25, нормальные клетки легких и эпидермальные кератиноциты человека обрабатывали указанными концентрациями DCA в присутствии или отсутствии сулиндака (Sul) в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-теста, как указано в Методике. Жизнеспособность клеток выражена в % от контроля (клетки, не обработанные сулиндаком). Столбики ошибок — стандартная ошибка среднего (SEM), выраженная в % от среднего значения четырехкратных повторов репрезентативного эксперимента. Жизнеспособность клеток показана для раковых клеток A549 (A), раковых клеток SCC25 (B), нормальных клеток легких (C) и нормальных эпидермальных кератиноцитов человека (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * p<0,05, ** p<0,005, ***p<0,0005.

Чтобы убедиться в наличии синергического эффекта при использовании комбинации препаратов, мы определили индексы комбинации, проведя количественный анализ зависимости «доза-эффект» [26] на двух различных линиях раковых клеток (Рисунок S1). Индексы комбинации составили 0,84 для раковых клеток A549 и 0,73 для SCC25, соответственно. Значение менее 1,00 указывает на синергетический эффект уничтожения рака (Рисунок S2).

Эффект сулиндака не связан с его НПВС-активностью
В предыдущих исследованиях с использованием сулиндака и окислителя было показано, что усиленное и избирательное уничтожение раковых клеток сулиндаком и окислителем не связано с известной НПВС-способностью сулиндака. Для определения роли ингибирования ЦОГ можно использовать метаболит сулиндака, сулиндак сульфон, поскольку он не ингибирует ЦОГ 1 или 2 [7], [29]. Как показано на рисунке 2, при использовании раковых клеток A549 (A) и SCC25 (B) комбинация сулиндак сульфона и DCA показала такой же эффект уничтожения, как и сулиндак. Эти результаты показывают, что усиленный эффект сулиндака по уничтожению раковых клеток в присутствии DCA не связан с его известной противовоспалительной активностью.

Рисунок 2 Сулиндак сульфон в комбинации с DCA также убивает раковые клетки. Раковые клетки A549 и SCC25 обрабатывали указанными концентрациями DCA в присутствии или отсутствии сулиндак сульфона (SulS) в течение 48 часов. SulS использовали в конечной концентрации 250 мкМ для раковых клеток A549 и 75 мкМ для раковых клеток SCC25. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-теста, как описано в разделе «Методы». Жизнеспособность клеток выражена в % от контроля (клетки, не обработанные сулиндак сульфоном). Столбики ошибок — стандартная ошибка среднего (SEM), выраженная в % от среднего значения трех экземпляров из репрезентативного эксперимента. Жизнеспособность клеток показана для раковых клеток A549 (A) и SCC25 (B). ♦, -SulS; ▪, + SulS. * p<0,05, ** p<0,005, ***p<0,0005.

Комбинация сулиндака и DCA генерирует ROS
Синергетический эффект на жизнеспособность, наблюдаемый при использовании сулиндака и дихлорацетата на раковых клетках A549 и SCC25, поразительно похож на предыдущие исследования с использованием комбинации сулиндака и TBHP [7]. Чтобы определить, участвует ли производство ROS в селективной гибели, наблюдаемой в настоящих исследованиях, производство ROS, используя индикаторный краситель H2DCFDA(см. Методы), было определено в линиях раковых клеток, подвергшихся воздействию сулиндака и DCA. Результаты обобщены на рисунке 3. На рисунке 3А показаны результаты с раковыми клетками A549. Из результатов, представленных на рисунке 3A, видно, что необработанные раковые клетки A549 (панель A1), или клетки, обработанные только сулиндаком (панель A2), или только DCA (панель A3), показывают лишь несколько положительно окрашенных клеток. Однако, когда клетки подвергались воздействию и сулиндака, и DCA (панель A4), наблюдается значительное увеличение положительно окрашенных клеток ROS (зеленая флуоресценция), показывая, что присутствие и сулиндака, и DCA приводит к генерации значительных уровней ROS. Как показано на рисунке 3B, аналогичные результаты получены и для раковых клеток SCC25. Сулиндак или DCA по отдельности приводят к небольшому увеличению количества клеток, продуцирующих ROS (панели B2 и B3), но при добавлении обоих препаратов вновь наблюдается значительное увеличение производства ROS (панель B4). Количественная оценка с использованием клеток SCC25 показывает, что количество DCF-позитивных клеток (см. Методы) на 9-10× больше, когда клетки обрабатываются сулиндаком и DCA по сравнению с каждым из препаратов в отдельности (см. Рисунок S3A). Из этих результатов и более ранних исследований следует, что производство ROS может быть общей чертой в усилении гибели раковых клеток при использовании сулиндака в сочетании с соединениями, влияющими на функцию митохондрий.

Рисунок 3 Комбинация сулиндака и DCA повышает внутриклеточный уровень ROS в раковых клетках A549 и SCC25. Верхние панели (A) иллюстрируют результаты для раковых клеток A549, а нижние панели (B) — для раковых клеток SCC25. Клетки обрабатывали указанными концентрациями препаратов и обрабатывали для флуоресцентной микроскопии, как описано в Методике. Степень внутриклеточного уровня ROS показана как интенсивность зеленой флуоресценции, наблюдаемой в клетках, обработанных без лекарств (подпанели A1 и B1), только сулиндаком (подпанели A2 и B2), только DCA (подпанели A3 и B3), и комбинированной обработкой сулиндаком и DCA (подпанели A4 и B4). Несколько независимых полей были подвергнуты фотомикрографированию, и показаны репрезентативные поля для каждого состояния.

Сулиндак в комбинации с DCA приводит к потере мембранного потенциала митохондрий
Если производство ROS вовлечено в усиленный киллинговый эффект сулиндака/DCA, можно ожидать, что производство ROS комбинацией препаратов повлияет на функцию митохондрий. Чтобы определить это, мембранный потенциал митохондрий измеряли с помощью окрашивания JC-1, как описано в разделе «Методы». О потере мембранного потенциала свидетельствует увеличение зеленой флуоресценции, как описано в Методике. Типичный результат представлен на рисунке 4. Раковые клетки A549 и SCC25 подвергались воздействию сулиндака и DCA по отдельности или в комбинации в течение 48 часов и окрашивались JC-1 для мониторинга мембранного потенциала митохондрий. На рисунке 4А показаны результаты, полученные на линии раковых клеток A549. В отсутствие какого-либо препарата митохондрии выглядят неповрежденными и сохраняют свой мембранный потенциал, о чем свидетельствует слабая зеленая флуоресценция (панель A1). В присутствии только сулиндака (панель A2) или только DCA (панель A3) наблюдается небольшое увеличение зеленой флуоресценции, что указывает на некоторую потерю мембранного потенциала митохондрий. Однако, когда присутствуют и сулиндак, и DCA, происходит поразительная потеря мембранного потенциала митохондрий, о чем свидетельствует значительное увеличение зеленой флуоресценции (панель A4). Мы наблюдали ту же картину, когда несколько независимых полей были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. На рисунке 4B показаны аналогичные результаты с раковыми клетками SCC25. И снова значительная потеря мембранного потенциала митохондрий наблюдалась только тогда, когда клетки подвергались воздействию как сулиндака, так и DCA (панель B4). Количественная оценка эффекта показана на рисунке S3B. Видно, что процент JC1-зеленых позитивных клеток при использовании комбинации препаратов в 3-4 раза выше, чем при использовании одного из препаратов.

Рисунок 4 Комбинация сулиндака и DCA вызывает нарушение мембранного потенциала митохондрий в раковых клетках. Верхние панели (A) иллюстрируют результаты для раковых клеток A549, а нижние панели (B) — для раковых клеток SCC25. Потеря митохондриального мембранного потенциала была обнаружена по изменению распределения JC-1, что привело к увеличению зеленой флуоресценции (см. раздел «Методы»). Экспериментальные условия для окрашивания JC-1 и флуоресцентной микроскопии подробно описаны в разделе «Методы», а режимы лечения препаратами показаны под панелями. Необработанные клетки (подпанели A1 и B1), клетки, обработанные сулиндаком (подпанели A2 и B2), клетки, обработанные DCA (подпанели A3 и B3), и клетки, обработанные сулиндаком и DCA (подпанели A4 и B4). Несколько независимых полей были подвергнуты фотомикрографированию, и показаны репрезентативные поля для каждого состояния.

ROS участвуют в уничтожении раковых клеток комбинацией сулиндака и DCA
Для получения более прямых доказательств того, что образующиеся ROS участвуют в усиленном уничтожении раковых клеток сулиндаком и DCA, мы использовали два известных поглотителя ROS, N-ацетилцистеин (NAC) и тирон (см. раздел «Методы»). Результаты использования NAC показаны на рисунке 5. Рисунок 5, панель А, показывает, что при 20 и 30 мМ DCA усиленная гибель раковых клеток A549, наблюдаемая в присутствии сулиндака, в значительной степени предотвращается при наличии NAC (2 мМ) в течение 48 часов инкубации. Очень похожие результаты получены с раковыми клетками SCC25, как показано на Рисунке 5, панель B. Сопоставимые результаты были получены, когда вместо NAC использовался Tiron (Рисунок S4).

Рисунок 5 Растворитель ROS NAC отменяет уничтожение раковых клеток комбинацией сулиндака и DCA. Раковые клетки A549 и SCC25 обрабатывали указанными концентрациями DCA в отсутствие (серая полоса) или в присутствии сулиндака (черная полоса) или в присутствии сулиндака и N-ацетилцистеина (полосатая полоса) в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-теста, как указано в Методике. Жизнеспособность клеток выражена в % от контроля (клетки, не обработанные сулиндаком). Столбики ошибок — стандартная ошибка среднего (SEM), выраженная в % от среднего значения четырехкратных повторов репрезентативного эксперимента. Ингибирование роста раковых клеток происходило дозозависимым образом при комбинированной обработке DCA и сулиндака (черные полосы) как в раковых клетках A549 (A), так и в раковых клетках SCC25 (B). Однако это усиленное уничтожение предотвращалось, когда N-ацетилцистеин присутствовал при комбинированном лечении препаратами (полосатые полосы в A и B).

Убийство раковых клеток сулиндаком и DCA вовлекает апоптотическую смерть
Приведенные выше результаты (рис. 3, 4, 5) показывают, что усиленное убийство линий раковых клеток включает дисфункцию митохондрий, что позволяет предположить, что наблюдаемая гибель клеток происходит путем апоптоза. Предыдущие исследования показали, что сулиндак и его производные являются проапоптотическими препаратами [5], [6]. Есть также сообщения о том, что DCA может вызывать гибель клеток путем апоптоза [20], [23]. Чтобы определить, является ли гибель раковых клеток от комбинации этих двух препаратов, опосредованная ROS, апоптотической смертью, мы провели окрашивание TUNEL для измерения апоптоза (см. Методы). Для экспериментов по окрашиванию TUNEL проводились множественные повторы для сулиндака и DCA отдельно или в комбинации. Типичный результат показан на рисунке 6, где верхние панели (рисунок 6A, панели A1-A4) представляют результаты с раковыми клетками A549, а нижние панели (рисунок 6B, панели B1-B4) — результаты с раковыми клетками SCC25. Когда клетки обрабатывались без препарата, только сулиндаком или только DCA (Рисунок 6, панели A1-A3 и B1-B3), наблюдалось лишь несколько TUNEL-положительных клеток. Однако, когда клетки подвергались воздействию сулиндака и DCA, наблюдается значительное увеличение TUNEL-положительных апоптотических клеток (Рисунок 6, панели A4 и B4), что указывает на большую индукцию апоптоза. Чтобы проверить результаты TUNEL, для мониторинга апоптоза был также использован более чувствительный анализ ДНК-лигазы на основе ПЦР [25]. Результаты также показали наличие обогащенной сильной нуклеосомной лестницы только при совместном использовании сулиндака и DCA (Рисунок S5; полосы 4 и 8), что убедительно подтверждает данные анализа TUNEL.

Рисунок 6. Сулиндак в комбинации с DCA индуцирует апоптоз в раковых клетках. Верхние панели (A) иллюстрируют результаты для раковых клеток A549, а нижние панели (B) показывают результаты для раковых клеток SCC25. Степень апоптоза клеток отслеживалась по окрашиванию TUNEL клеток, обработанных без препаратов (подпанели A1 и B1), только сулиндаком (подпанели A2 и B2), только DCA (подпанели A3 и B3), а также сулиндаком и DCA (подпанели A4 и B4). Клетки обрабатывали указанными препаратами, как указано на панелях, подвергали окрашиванию TUNEL и обрабатывали для флуоресцентной микроскопии, как описано в Методах. Несколько независимых полей были сфотомикрографированы, и показаны репрезентативные поля для каждого состояния. Клетки, окрашенные в коричневый цвет, указывают на клетки, подвергшиеся апоптозу.

Сулиндак и DCA вовлекают проапоптотический JNK-сигналинг
Из известных митоген-активируемых протеинкиназ (MAP-киназ) киназа, индуцируемая стрессом, c-Jun N-концевая киназа (JNK/SAPK) непосредственно вовлечена в апоптотическую гибель клеток [11]. Поэтому мы исследовали роль JNK-сигнализации в апоптозе, опосредованном сулиндак-DCA, с помощью SP600125, специфического JNK-ингибитора (JNKI), и результаты представлены на рисунке 7A. Как показано выше, клетки SCC25, обработанные сулиндаком, демонстрировали повышенную гибель в присутствии возрастающих концентраций DCA. Однако, когда эти клетки инкубировали с сулиндаком вместе с SP600125, опосредованная сулиндаком-DCA гибель клеток в значительной степени предотвращалась. Эти результаты указывают на участие JNK-опосредованной проапоптотической сигнализации в клеточной гибели, опосредованной сулиндак-DCA.

Рисунок 7. Комбинация сулиндака и DCA индуцирует апоптоз при участии активации JNK. А. Клетки SCC25 обрабатывали в течение 48 ч сулиндаком (100 мкМ) и указанными концентрациями DCA и, где указано, 20 мкМ ингибитора JNK, SP600125. ♦ — без препарата; ▪ — сулиндак; ▴ — сулиндак и SP600125. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-анализа, как указано в Методике. Столбики ошибок — стандартная ошибка среднего (SEM), выраженная в % от среднего значения четырехкратных повторов репрезентативного эксперимента. Подробности см. в тексте. Статистический анализ между ♦, Без добавления и ▪, Sul; *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005. Статистический анализ между ▪, Sul и ▴, сулиндак и JNKI; $p<0.05, $$p<0.005, $$p<0.0005. B. Репрезентативные вестерн-блоты, отражающие влияние сулиндака и DCA на уровни общего JNK, phopsho-p46JNK и phopsho-p54JNK. уровень β-актина использовался в качестве внутреннего контроля. Цитозольные фракции клеток SCC25 были выделены через 12 часов, и уровни JNK и фосфо-JNK были определены методом вестерн-блоттинга. В клеточной линии SCC25 общий JNK показал две отдельные полосы на 46 и 54 кДа.

С помощью вестерн-блоттинга мы также определили, что комбинация сулиндака и DCA значительно увеличивала уровни фосфо-JNK в цитозольных фракциях через 12 ч после воздействия на клетки сулиндака и DCA (Рисунок 7B). Увеличение уровня общего JNK (белковые полосы на 46 и 54 кДа) наблюдалось как при обработке клеток только DCA, так и при обработке клеток комбинацией сулиндака и DCA. Следует отметить, что как фосфо-p46JNK, так и фосфо-p54JNK изоформы индуцировались при обработке комбинацией сулиндака и ДКА, хотя увеличение фосфо-p46JNK было более значительным (Рисунок 7B).

Существует множество доказательств того, что JNK инициирует высвобождение из митохондрий факторов, вызывающих апоптоз, таких как цитохром c, что приводит к расщеплению каспаз и PARP (поли(АДФ-рибоза) полимеразы) [30], [31]. Исследования также показали, что во время апоптоза цитохром c, высвобождаемый из митохондрий в цитоплазму, в конечном итоге попадает в ядро [32]. Наши результаты показали, что максимальная активация JNK происходит примерно через 12 часов после воздействия сулиндака и DCA. Это, по-видимому, приводит к транслокации цитохрома c в цитоплазму и расщеплению PARP через 18 ч после первоначальной обработки сулиндаком и DCA (Рисунок S6A). В качестве положительного контроля для этих экспериментов мы обрабатывали клетки 100 мкМ этопозида, агента, индуцирующего апоптоз. При комбинированном лечении сулиндаком и DCA в большинстве клеток, активно подвергающихся апоптозу, наблюдается усиление ядерной флуоресценции (Рисунок S6B).

Детальный анализ экспериментальных данных иммунофлуоресценции целых клеток показал, что ∼94% клеток, не обработанных ни сулиндаком, ни DCA, демонстрировали точечную, митохондриальную флуоресценцию цитохрома c с незначительным диффузным окрашиванием в цитоплазме или в ядрах. Напротив, после обработки сулиндаком в 81% клеток наблюдалась диффузная, отчетливая цитоплазматическая флуоресценция и очень слабая ядерная флуоресценция. После обработки DCA ∼83% клеток показали диффузную, отчетливую цитоплазматическую флуоресценцию, и <5% клеток показали сильную ядерную флуоресценцию. Однако, когда клетки обрабатывали и сулиндаком, и DCA, ∼72% клеток показали как ядерную, так и цитоплазматическую флуоресценцию, а ∼11% клеток показали сильную ядерную флуоресценцию. Эти результаты позволяют предположить, что высвобожденный цитохром c из митохондрий может инициировать внутренний апоптотический путь, действующий на раковые клетки под действием сулиндака и DCA.

Обсуждение

Настоящее исследование является продолжением нашей предыдущей работы, в которой было показано, что сулиндак делает раковые клетки, но не нормальные клетки, более чувствительными к окислительному стрессу [7]. В этих предыдущих экспериментах сулиндак предварительно инкубировали с клетками в течение 24-48 часов, а затем сулиндак удаляли перед тем, как клетки подвергали воздействию TBHP или H2O2 в течение 2 часов. Из предыдущих экспериментов было очевидно, что предварительная обработка сулиндаком сделала раковые клетки гораздо более чувствительными к окислительному агенту, что привело к значительному увеличению ROS и потере митохондриальной функции [7].

На основании этих результатов казалось разумным, что сулиндак в сочетании с соединениями, влияющими на митохондриальное дыхание, приведет к избирательному усиленному уничтожению раковых клеток, но не нормальных клеток. В настоящем исследовании с использованием линий раковых клеток A549 и SCC25 комбинация сулиндака и DCA усиливала гибель этих линий раковых клеток, но не нормальных клеток легких или кожи. Наши результаты по количеству DCA, необходимому в целых клетках, согласуются с данными, полученными ранее [28], [33], [34]. В нашей системе IC50 для DCA с клетками SCC25 составляет 23 мМ, а для клеток A549 — 35 мМ. IC50 для нормальных кератиноцитов составляет >50 мМ, а для нормальных клеток легких (MRC5) — ∼40 мМ. Результаты также показали, что наблюдаемая гибель раковых клеток включает производство ROS, активацию JNK и апоптоз, инициированный митохондриями. Что касается отсутствия эффекта на нормальные клетки, было показано, что сулиндак защищает нормальные клетки легких от окислительного повреждения в результате воздействия TBHP [7], и недавно мы также сообщили, что сулиндак может защищать клетки сердца от окислительного повреждения в результате ишемии/реперфузии через механизм прекондиционирования [35].

Насколько нам известно, в настоящее время существует по крайней мере 8 соединений, включая наши исследования с TBHP, H2O2 и DCA, которые показали усиленную и селективную гибель рака в присутствии сулиндака [7][9], [12][15]. Хотя их метаболические мишени в клетке известны и различны, вполне вероятно, что все они, прямо или косвенно, вызывают гибель клеток в присутствии сулиндака через механизм, включающий изменение митохондриального дыхания и производство ROS [10], [12], [14]. Представляется вероятным, что если найден препарат, который в сочетании с сулиндаком избирательно убивает раковые клетки, но не нормальные клетки, то механизм гибели включает окислительный стресс, приводящий к дисфункции митохондрий. Измененное дыхание может быть общим фактором в этих экспериментах с использованием комбинации сулиндака и лекарств, и настоящие результаты с использованием DCA подтверждают эту точку зрения. Вполне возможно, что эффект сулиндака может быть связан с наблюдениями, сделанными более 50 лет назад Варбургом, который отметил, что нормальные клетки предпочитают дыхание для получения энергии, тогда как раковые клетки предпочитают гликолиз из-за дефекта в дыхательной цепи [16]. Это основное различие в митохондриальном дыхании между нормальными и раковыми клетками может сделать раковые клетки более чувствительными к окислительному стрессу [36], [37]. Похоже, что сулиндак может усиливать это фундаментальное различие в биохимии нормальных и раковых клеток. Хотя то, как сулиндак сенсибилизирует раковые клетки к препаратам, влияющим на митохондриальное дыхание, до сих пор не ясно, но это активно исследуется. Spitz и соавторы [38] в исследованиях по лишению раковых клеток глюкозы пришли к аналогичному выводу относительно различий в метаболизме между нормальными и раковыми клетками. В соответствии с этими результатами, другое недавнее исследование показало, что фармакологическое ингибирование лактатдегидрогеназы может привести к избирательной гибели раковых клеток [39]. В последнем исследовании было показано, что усиленное избирательное уничтожение раковых клеток также связано с производством ROS, а наблюдаемый эффект был объяснен изменением дыхательных процессов в раковых клетках.

Следует отметить, что комбинация сулиндака с окислителем или препаратами, которые могут влиять на функцию митохондрий, уже прошла клинические испытания. Meyskens et al. 2008 показали, что комбинация сулиндака с DFMO оказала значительное влияние на рецидив полипов толстой кишки и возникновение рака толстой кишки в 3-летнем клиническом исследовании [13]. Недавно мы сообщили об использовании сулиндака с H2O2 в клиническом исследовании по доказательству концепции для местного лечения актинического кератоза [15]. Одним из недостатков использования этой комбинации была необходимость в двух препаратах для местного применения, поскольку соединения не могли храниться в течение длительного времени без разрушения сулиндака под действием H2O2. Кроме того, нельзя использовать H2O2 для лечения внутренних опухолей, поскольку его нельзя принимать перорально. Однако комбинация сулиндака и DCA может быть доставлена в виде единого состава, пригодного для местного применения, и эти два соединения могут быть использованы перорально. На самом деле, в течение нескольких лет DCA использовался в клинической практике для снижения уровня молочной кислоты у пациентов, страдающих молочнокислым ацидозом [40][42]. DCA также используется как противораковое средство in vitro и in vivo с использованием нескольких различных линий раковых клеток, что указывает на то, что митохондриальный метаболизм в раковых клетках может быть новой терапевтической мишенью [18], [20], [22]. Michelakis и др. (2010) показали, что лечение DCA «ремоделирует» митохондриальный метаболизм у пациентов с глиобластомой с обратимыми токсическими эффектами. Следует отметить, что и сулиндак, и DCA доступны по цене, относительно нетоксичны и могут приниматься перорально. Если комбинация окажется успешной in vivo, это добавит новое измерение в лечении рака, поскольку оба препарата нацелены на митохондриальный метаболизм во многих видах рака [22].

В целом, наши исследования с использованием комбинации сулиндака и DCA показывают, что сулиндак избирательно делает раковые клетки более чувствительными к агентам, влияющим на митохондриальное дыхание, что приводит к окислительному стрессу и митохондриальной дисфункции. Эти результаты могут быть связаны с дефектом дыхания в раковых клетках, первоначально замеченным Варбургом [16]. В настоящее время проводятся исследования, направленные на понимание фундаментальных различий между тем, как раковые и нормальные клетки реагируют на сулиндак и агенты, влияющие на функцию митохондрий.

Вспомогательная информация

Рисунок S1 Цитотоксичность сулиндака, DCA или комбинации препаратов на раковых клетках A549 и SCC25
Раковые клетки A549 и SCC25 обрабатывали указанными концентрациями сулиндака (панели 1 и 4) или DCA (панели 2 и 5). В экспериментах с комбинацией препаратов сулиндак/DCA соотношение 1:50 (сулиндак:DCA) поддерживалось для клеток A549 при комбинациях препаратов от 0,2 мМ:10 мМ до 1 мМ:50 мМ (панель 3), а соотношение 1:100 (сулиндак:DCA) поддерживалось для клеток SCC25 при комбинациях препаратов от 0,05 мМ:5 мМ до 0,3 мМ:30 мМ (панель 6). (TIF) Рисунок S2 Определение индексов комбинации для раковых клеток A549 и SCC25. Индексы комбинации препаратов были определены путем включения полученных выше значений жизнеспособности клеток в уравнения Чоу и Талалая [26]. Более подробную информацию см. в тексте. (TIF) Рисунок S3 Количественная оценка DCF и JC-1 положительных зеленых флуоресцирующих клеток. Клетки SCC25 обрабатывали сулиндаком, DCA или комбинацией препаратов в течение 48 ч и окрашивали красителями H2DCFDA (рис. S3A) или JC-1 (рис. S3B), как указано в Методах. Для положительного контроля клетки обрабатывали 200 мМ TBHP в течение 2 ч и окрашивали, как указано выше. Клетки анализировали под большим увеличением с использованием объектива 1006 в инвертированном флуоресцентном микроскопе Olympus. Для каждого условия визуализировали не менее 100 отдельных клеток, а процентное содержание DCF-позитивных и JC1-позитивных зеленых флуоресцирующих клеток представлено в табличном и графическом форматах. (TIF) Рисунок S4 ROS-скавенджер Tiron отменяет уничтожение раковых клеток комбинацией сулиндака и DCA. Раковые клетки A549 и SCC25 обрабатывали указанными концентрациями DCA в отсутствие (серая полоса), в присутствии сулиндака (черная полоса) или в присутствии сулиндака и Тирона (полосатая полоса) в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью MTS-теста, как указано в Методике. Жизнеспособность клеток выражена в % от контроля (клетки, не обработанные сулиндаком). Столбики ошибок — стандартная ошибка среднего (SEM), выраженная в % от среднего значения четырехкратных повторений репрезентативного эксперимента. Ингибирование роста раковых клеток происходило дозозависимым образом при комбинированной обработке DCA и сулиндака (черные полосы) как в раковых клетках A549 (A), так и в раковых клетках SCC25 (B). Однако эта усиленная гибель предотвращалась, когда наряду с комбинированным лечением препаратами присутствовал Тирон (полосатые полосы в A и B). (TIF) Рисунок S5 Выраженное выстраивание нуклеосомной ДНК происходит во время гибели раковых клеток под действием комбинации сулиндака и DCA. Раковые клетки A549 и SCC25 обрабатывали указанными препаратами в течение 48 часов. Нуклеосомную ДНК выделяли, подвергали лигирующей ПЦР, как описано в разделе «Методы», и анализировали на 1,2% агарозном геле вместе с маркерами размера. Полоса ‘M’ обозначает маркеры размера молекул. На полосах 1-4 и 5-8 показаны результаты, полученные с раковыми клетками A549 и SCC25 соответственно. Результаты показаны на полосах 1 и 5 (без препарата), полосах 2 и 6 (только сулиндак), полосах 3 и 7 (только DCA) и полосах 4 и 8 (сулиндак и DCA). Усиленное связывание нуклеосомной ДНК наблюдалось только при комбинированном лечении сулиндаком и DCA (полосы 4 и 8). (TIF)

Рисунок S6 Комбинация сулиндака и DCA приводит к высвобождению цитохрома c из митохондрий и расщеплению PARP
Клетки SCC25 обрабатывали сулиндаком, DCA, комбинацией препаратов или этопозидом для анализа внутриклеточного расположения цитохрома c с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. А. Цитозольные фракции выделяли через 18 ч и определяли присутствие цитохрома c в цитоплазме и расщепление PARP методом вестерн-блоттинга. Репрезентативные вестерн-блоты показывают количество цитохрома c и расщепленного PARP. Уровень b-актина использовался в качестве внутреннего контроля. B. Иммунофлуоресценция проводилась с использованием набора для проточной цитометрии CBA077 InnoCyteTM Flow Cytometric Cytochrome c Release Kit в соответствии с инструкциями производителя. Было проанализировано несколько независимых полей, и на репрезентативных микрофотографиях показаны схемы локализации цитохрома с при воздействии на клетки сулиндака и/или DCA. Количественные значения представлены в тексте. (TIF)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Дэвиду Брунеллу за помощь в определении индексов комбинации и Эдне Гамлиел за помощь в работе с культурой клеток.

Авторские взносы

Замысел и дизайн экспериментов: KA SK KDS HW. Проводил эксперименты: KA SK. Проанализировал данные: KA SK HW. Внесла реагенты/материалы/инструменты для анализа: KDS. Написал статью: KA SK HW.

ССЫЛКИ


1 Boolbol SK, Dannenberg AJ, Chadburn A, Martucci C, Guo XJ, et al. (1996) Сверхэкспрессия циклооксигеназы-2 и образование опухолей блокируются сулиндаком в мышиной модели семейного аденоматозного полипоза. Cancer Res 56: 2556-2560.
2 Taketo MM (1998) Cyclooxygenase-2 inhibitors in tumorigenesis (Part II). J Natl
3 Taketo MM (1998) Cyclooxygenase-2 inhibitors in tumorigenesis (part I). J Natl Cancer Inst 90: 1529-1536.
4 Rao CV, Rivenson A, Simi B, Zang E, Kelloff G, et al. (1995) Chemoprevention of colon carcinogenesis by sulindac, a nonsteroidal anti-inflammatory agent. Cancer Res 55: 1464-1472.
5 Vogt T, McClelland M, Jung B, Popova S, Bogenrieder T, et al. (2001) Progression and NSAID-induced apoptosis in malignant melanomas are independent of cyclooxygenase II. Melanoma Res 11: 587-599.
6 Richter M, Weiss M, Weinberger I, Furstenberger G, Marian B (2001) Ингибирование роста и индукция апоптоза в клетках колоректальных опухолей ингибиторами циклооксигеназы. Канцерогенез 22: 17-25.
7 Marchetti M, Resnick L, Gamliel E, Kesaraju S, Weissbach H, et al. (2009) Sulindac усиливает уничтожение раковых клеток, подвергшихся окислительному стрессу. PLoS One 4: e5804.
8 Soriano AF, Helfrich B, Chan DC, Heasley LE, Bunn PA Jr, et al. (1999) Синергетический эффект новых химиопревентивных агентов и обычных цитотоксических агентов против клеточных линий рака легких человека. Cancer Res 59: 6178-6184.
9 Jiang TT, Brown SL, Kim JH (2004) Комбинированный эффект триоксида мышьяка и сулиндак сульфида на клетки рака легких человека A549 in vitro. J Exp Clin Cancer Res 23: 259-262.
10 Jin HO, Yoon SI, Seo SK, Lee HC, Woo SH, et al. (2006) Синергическая индукция апоптоза сулиндаком и триоксидом мышьяка в клетках рака легких человека A549 через зависимое от реактивных видов кислорода снижение регуляции сурвивина. Biochem Pharmacol 72: 1228-1236.
11 Jin HO, Seo SK, Woo SH, Lee HC, Kim ES, et al. (2008) Комбинация сулиндака и триоксида мышьяка синергично индуцирует апоптоз в клетках рака легких человека H1299 через c-Jun NH2-терминальный киназа-зависимое фосфорилирование Bcl-xL. Рак легких 61: 317-327.
12 Minami T, Adachi M, Kawamura R, Zhang Y, Shinomura Y, et al. (2005) Сулиндак усиливает ингибитор протеасомы бортезомиб, опосредованный окислительным стрессом и противораковой активностью. Clin Cancer Res 11: 5248-5256.
13 Meyskens FL Jr, McLaren CE, Pelot D, Fujikawa-Brooks S, Carpenter PM, et al. (2008) Difluoromethylornithine plus sulindac for the prevention of sporadic colorectal adenomas: a randomized placebo-controlled, double-blind trial. Cancer Prev Res (Phila Pa) 1: 32-38.
14 Seo SK, Jin HO, Lee HC, Woo SH, Kim ES, et al. (2008) Комбинированное воздействие сулиндака и субероиланилид гидроксамовой кислоты на индукцию апоптоза в клетках рака легких человека. Mol Pharmacol 73: 1005-1012.
15 Resnick L, Rabinovitz H, Binninger D, Marchetti M, Weissbach H (2009) Местный сулиндак в сочетании с перекисью водорода в лечении актинических кератозов. J Drugs Dermatol 8: 29-32.
16 Варбург О (1956) О происхождении раковых клеток. Science 123: 309-314.
17 Whitehouse S, Cooper RH, Randle PJ (1974) Механизм активации пируватдегидрогеназы дихлорацетатом и другими галогенированными карбоновыми кислотами. Biochem J 141: 761-774.
18 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, et al. (2007) A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11: 37-51.
19 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T (2008) Role of dichloroacetate in the treatment of genetic mitochondrial diseases. Adv Drug Deliv Rev 60: 1478-1487.
20 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I (2008) Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells. Gynecol Oncol 109: 394-402.
21 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, et al. (2008) Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate 68: 1223-1231.
<span id=»22″ class=»referencess blue-text «22 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, et al. (2010) Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med 2: 31ra34.
23 Michelakis ED, Webster L, Mackey JR (2008) Дихлорацетат (DCA) как потенциальная метаболическая таргетная терапия рака. Br J Cancer 99: 989-994.
24 Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (1991) Использование водно-растворимого тетразолия/формазана для анализа роста клеток в культуре. Cancer Commun 3: 207-212.
<span id=»25″ class=»referencess blue-text «25 Staley K, Blaschke AJ, Chun J (1997) Apoptotic DNA fragmentation is detected by a semi-quantitative ligation-mediated PCR of blunt DNA ends. Cell Death Differ 4: 66-75.
26 Chou TC, Talalay P (1984) Количественный анализ зависимости «доза-эффект»: комбинированное воздействие нескольких лекарств или ингибиторов ферментов. Adv Enzyme Regul 22: 27-55.
<span id=»27″ class=»referencess blue-text «27 Papandreou I, Goliasova T, Denko NC (2010) Anticancer drugs that target metabolism: Is dichloroacetate the new paradigm? Int J Cancer 128: 1001-1008.
28 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, et al. (2010) Sodium dichloroacetate selectively target cells with defects in the mitochondrial ETC. Int J Cancer 127: 2510-2519.
29 Babbar N, Ignatenko NA, Casero RA Jr, Gerner EW (2003) Cyclooxygenase-independent induction of apoptosis by sulindac sulfone is mediated by polyamines in colon cancer. J Biol Chem 278: 47762-47775.
30 Selimovic D, Ahmad M, El-Khattouti A, Hannig M, Haikel Y, et al. (2011) Apoptosis-related protein-2 запускает гибель клеток меланомы посредством механизма, включающего стресс эндоплазматического ретикулума и дисрегуляцию митохондрий. Канцерогенез 32: 1268-1278.
31 Zhang S, Lin Y, Kim YS, Hande MP, Liu ZG, et al. (2007) c-Jun N-terminal kinase mediates hydrogen peroxide-induced cell death through sustained poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation. Cell Death Differ 14: 1001-1010.
<span id=»32″ class=»referencess blue-text «32 Nur EKA, Gross SR, Pan Z, Balklava Z, Ma J, et al. (2004) Nuclear translocation of cytochrome c during apoptosis. J Biol Chem 279: 24911-24914.
33 Heshe D, Hoogestraat S, Brauckmann C, Karst U, Boos J, et al. (2011) Метаболически направленная терапия дихлорацетатом побеждает цитотоксичность стандартных противораковых препаратов. Cancer Chemother Pharmacol 67: 647-655.
34 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA, Jayne DG (2010) Дихлорацетат индуцирует апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака. Br J Cancer 102: 1746-1752.
35 Moench I, Prentice H, Rickaway Z, Weissbach H (2009) Sulindac обеспечивает высокий уровень ишемической защиты сердца через механизмы позднего прекондиционирования. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 19611-19616.
<span id=»36″ class=»referencess blue-text «36 Deberardinis RJ, Sayed N, Ditsworth D, Thompson CB (2008) Brick by brick: metabolism and tumor cell growth. Curr Opin Genet Dev 18: 54-61.
37 Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324: 1029-1033.
<span id=»38″ class=»referencess blue-text «38 Ahmad IM, Aykin-Burns N, Sim JE, Walsh SA, Higashikubo R, et al. (2005) Mitochondrial O2*- and H2O2 mediate glucose deprivation-induced stress in human cancer cells. J Biol Chem 280: 4254-4263.
<span id=»39″ class=»referencess blue-text «39 Le A, Cooper CR, Gouw AM, Dinavahi R, Maitra A, et al. (2010) Inhibition of lactate dehydrogenase A induces oxidative stress and inhibits tumor progression. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 2037-2042.
<span id=»40″ class=»referencess blue-text «49 Stacpoole PW, Harman EM, Curry SH, Baumgartner TG, Misbin RI (1983) Treatment of lactic acidosis with dichloroacetate. N Engl J Med 309: 390-396.
41 Stacpoole PW, Barnes CL, Hurbanis MD, Cannon SL, Kerr DS (1997) Treatment of congenital lactic acidosis with dichloroacetate. Arch Dis Child 77: 535-541.
42 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, et al. (2008) Evaluation of long-term treatment of children with congenital lactic acidosis with dichloroacetate. Pediatrics 121: e1223-1228.

Связанный контент:

Добавить комментарий