📖 29 mins.

Сесили Абильдгаард1, Кристина Даль1, Астрид Л Бассе2, Тао Ма2 и Пер Гульдберг1*

1 Исследовательский центр Датского онкологического общества, Копенгаген, Дания
2 Факультет биологии, Университет Копенгагена, Копенгаген, Дания.

Переписка: [email protected]

Получено: 14 сентября 2020 г.
Принято: 4 декабря 2020 г.
Опубликовано: 9 декабря 2020 г

Аннотация

История вопроса: Успехи в лечении меланомы путем направленного ингибирования онкогенного BRAF ограничены из-за развития приобретенной резистентности. Участие BRAFV600E в метаболическом перепрограммировании клеток меланомы дает основание для совместного воздействия на метаболизм в качестве терапевтического подхода.

Методы: Мы изучили влияние дихлорацетата (ДХА), ингибитора киназы пируватдегидрогеназы, на рост и метаболическую активность клеточных линий меланомы человека. Совместное действие DCA и ингибитора BRAF вемурафениба было исследовано на клеточных линиях меланомы с мутацией BRAFV600E. Клеточные линии, устойчивые к вемурафенибу, были созданы in vitro, и была проверена их чувствительность к DCA.

Результаты: DCA вызывал снижение гликолитической активности и внутриклеточного уровня АТФ, а также ингибировал рост клеток. Совместное лечение клеток меланомы с мутантом BRAFV600E с помощью DCA и вемурафениба вызвало большее снижение уровня внутриклеточного АТФ и клеточного роста, чем лечение одним из соединений. Кроме того, клетки меланомы с приобретенной in vitro устойчивостью к вемурафенибу сохраняли чувствительность к DCA.

Выводы: Эти результаты позволяют предположить, что DCA потенцирует действие вемурафениба за счет совместного ослабления выработки энергии. Кроме того, демонстрация сохранения чувствительности к DCA в клетках меланомы с приобретенной устойчивостью к вемурафенибу может иметь значение для лечения меланомы.


Ключевые слова: Дихлорацетат, меланома, BRAF, биоэнергетика, метаболизм, АТФ
Сокращения: (Ацетил-КоА): Ацетил коэнзим А, (AMPK): AMP-активируемая протеинкиназа, (DCA): Дихлорацетат, (ECAR): Скорость внеклеточного закисления, (HEMn-LP): эпидермальные меланоциты человека,(IC50): половина максимальной ингибирующей концентрации, (LKB1): Печеночная киназа B1, (MITF): Микрофтальмия-ассоциированный транскрипционный фактор, (OCR): Скорость потребления кислорода, (PDH): Пируватдегидрогеназа, (PDK): Пируватдегидрогеназа киназа

© 2014 Abildgaard et al.; лицензиат BioMed Central Ltd.


Справочная информация

Отличительной чертой рака является перепрограммирование клеточного метаболизма в сторону аэробного гликолиза. Этот метаболический паттерн характеризуется повышенным поглощением глюкозы и высокой регуляцией гликолитической активности с ферментацией глюкозы в молочную кислоту вместо полного аэробного распада в митохондриях. Аэробный гликолиз, также называемый эффектом Варбурга, напоминает анаэробный метаболизм нормальных клеток, но происходит в условиях адекватного снабжения кислородом [1]. Перепрограммирование метаболизма в раковых клетках — очень сложный и гетерогенный процесс, который обусловлен широким разнообразием генетических и негенетических стратегий преодоления энергетических ограничений [2][4].

Онкоген BRAF V600E, присутствующий в более чем 50% меланом [5], был непосредственно вовлечен в перепрограммирование клеточного метаболизма. Конститутивная активность мутантного BRAF снижает экспрессию окислительных ферментов и количество митохондрий, увеличивая при этом экспрессию гликолитических ферментов и производство молочной кислоты [6], [7]. Кроме того, была обнаружена молекулярная связь между RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK-путем и контрольным пунктом энергетического стресса, опосредованным путем печеночной киназы B1 (LKB1)-AMP активированной протеинкиназы (AMPK), что предполагает роль BRAFV600E в опосредовании устойчивости к энергетическому стрессу [8],[9]. BRAF влияет на окислительный метаболизм через микрофтальмия-ассоциированный фактор транскрипции (MITF)-зависимый контроль митохондриального главного регулятора PGC1α [7]. Предыдущие исследования показали, что меланомы, экспрессирующие PGC1α, имеют более окислительный фенотип, чем PGC1α-отрицательные меланомы [4],[7]. Кроме того, было показано, что BRAFV600E опосредует индуцированную онкогенами старение через метаболическую регуляцию. Этот механизм включает увеличение активности пируватдегидрогеназы (PDH) через подавление киназы пируватдегидрогеназы (PDK) [10]. PDH контролирует связь между гликолизом и митохондриальным дыханием, облегчая приток пирувата в митохондрии, что способствует полной утилизации глюкозы. Ось PDK-PDH часто дисрегулируется при раке, где сверхэкспрессия PDK уменьшает связь между двумя энергетическими системами и тем самым способствует эффекту Варбурга [11], [12]. На основании этих данных целевое ингибирование PDK было предложено в качестве терапевтического метода лечения меланомы с возможным синергетическим эффектом химических ингибиторов BRAFV600E, таких как вемурафениб [10],[13].

Дихлорацетат (ДХА) является ингибитором четырех изоформ PDK и ранее использовался для лечения молочнокислого ацидоза [14],[15], с низкой токсичностью при эффективных уровнях доз [16],[17]. Несколько исследований показали, что DCA обращает вспять эффект Варбурга в раковых клетках и негативно влияет на их рост и выживание [13],[18][21]. Этот эффект был связан с нормализацией мембранного потенциала митохондрий из гиперполяризованного состояния, характерного для раковых клеток. Изменения мембранного потенциала приводят к повторному открытию анионных каналов, связанных с напряжением, и, как было показано, вызывают повторную чувствительность к апоптозу из-за восстановления способности высвобождать проапоптотические медиаторы [18]. Здесь мы исследовали влияние DCA на клетки меланомы. В частности, мы проанализировали клеточные реакции в отношении метаболизма, биоэнергетики, роста, пролиферации и гибели клеток в клеточных линиях меланомы, первичных человеческих меланоцитах и BRAFV600E-мутантных клетках меланомы с приобретенной устойчивостью к вемурафенибу.

Методы

Химические соединения
DCA (дихлорацетат натрия) и 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG) были приобретены у Sigma-Aldrich и растворены в dH2Oдо рабочей концентрации 1 М. Вемурафениб (PLX4032) был приобретен у Selleck Chemicals и растворен в DMSO до рабочей концентрации 0,05 М.

Культура клеток
Клеточные линии меланомы ED-007, ED-013, ED-024, ED-027, ED-029, ED-034, ED-050, ED-070, ED-071, ED-117, ED-140, ED-179 и ED-196 были получены из Европейской поисковой базы данных опухолевых линий (ESTDAB, ED) [22]. Клеточная линия меланомы SK-MEL-28 была приобретена у ATCC. Первичные эпидермальные меланоциты человека (неонатальные) из слабопигментированной ткани (HEMn-LP) были приобретены у компании Invitrogen. Клеточные линии меланомы культивировали при 37°C при 5%CO2 в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Клетки HEMn-LP культивировали в тех же условиях в среде 254CF, дополненной 1% добавкой для роста меланоцитов человека (HMGS-2) и 12-O-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом(TPA; 10 нг/мл). Все среды и добавки были приобретены у компании Invitrogen.

Метаболический анализ
Метаболическую характеристику проводили на клеточных линиях меланомы и первичных меланоцитах человека с помощью анализатора внеклеточных потоков Seahorse XF96 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA), который выполняет измерения скорости внеклеточного окисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) в режиме реального времени. Анализ был разработан для изучения возможностей митохондриальной и гликолитической энергетических систем. ECAR и OCR измеряли в базальных условиях и при последовательном добавлении пяти метаболических модуляторов: Ингибитор АТФ-синтазы, олигомицин (1 мкМ); пермеабилизатор мембран митохондрий, карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) (1 мкМ); ингибиторы митохондриального дыхания, ротенон (1 мкМ) и антимицин А (1 мкМ); и гликолитический ингибитор, 2-ДГ (100 мМ). Набор XF Cell Mito Stress Kit, содержащий олигомицин, FCCP, ротенон и антимицин А, был приобретен у Seahorse Bioscience.

Измерения АТФ
Уровень внутриклеточного АТФ измеряли с помощью ATPlite, 1 step Luminescence Assay System (Perkin Elmer), метод, основанный на реакции АТФ с люциферазой и D-люциферином. Клетки высевали в трех экземплярах по 10 000 клеток на лунку и обрабатывали указанными соединениями и контролем транспортного средства в течение 2 или 24 часов. Люминесценцию измеряли с помощью люминесцентного микропланшетного ридера Spectra Max Gemini EM (Molecular Devices) и нормировали на фоновый уровень.

Анализ на кристаллический фиолетовый цвет
Для оценки влияния исследуемых соединений на рост клеток применяли анализ на кристаллический фиолетовый цвет. Клетки высевали в двух экземплярах при соответствующей плотности, затем обрабатывали DCA, вемурафенибом, двумя соединениями вместе и контролем с использованием транспортного средства. Среду и лечебные соединения заменяли каждые 48 часов. Эксперимент повторяли три раза независимо друг от друга. Для завершения эксперимента среду и неприкрепившиеся клетки удаляли, а оставшиеся клетки промывали в PBS и фиксировали глутаральдегидом в течение 15 минут. Фиксированные клетки инкубировали с раствором кристаллического фиолетового (0,1% кристаллического фиолетового, 20% CH3OH) в течение 1 часа. Количество красителя, поглощенного монослоем, пропорциональное количеству жизнеспособных клеток, прикрепившихся к дну лунки, определяли количественно путем экстракции цвета 10% уксусной кислотой и измерения абсорбции при длине волны 595 нм. Линейная корреляция между абсорбцией и количеством клеток была проверена путем построения стандартной кривой. Относительный рост клеток определяли путем нормализации к необработанному контролю после вычитания фона (без клеток).

Анализ пролиферации клеток
Клетки меланомы высевали в трех экземплярах по 500-1000 клеток на лунку и обрабатывали ДКА в указанных концентрациях и контролем на основе транспортного средства в течение 96 часов. Затем пролиферацию измеряли путем обнаружения BrdU после 12 часов встраивания в клеточную ДНК. Процедура проводилась в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору BrdU Cell Proliferation Assay Kit (Cell Signaling Technology®).

Обнаружение апоптоза с помощью Annexin V-FITC
Обнаружение апоптоза проводили с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC (BD Bioscience), согласно предоставленному протоколу. Клетки собирали и дважды промывали в холодном PBS. Затем клетки переносили в другую пробирку, отжимали и ресуспендировали в буфере для связывания. Из ресуспензии 5 ×105 клеток переносили в пробирки FACS и окрашивали аннексином V-FITC и йодистым пропидием (PI). После 30 минут инкубации проводили проточную цитометрию на приборе Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter). Неокрашенные клетки были включены в качестве контроля.

Индукция in vitro приобретенной устойчивости к вемурафенибу
Приобретенная устойчивость к вемурафенибу была индуцирована в семи культурах, полученных из четырех BRAFV600E-мутантных, чувствительных к вемурафенибу клеточных линий меланомы (ED-013, ED-071, ED-196 и SK-MEL-28). Клетки культивировали в возрастающих концентрациях вемурафениба до устойчивого роста в концентрации выше IC50, а затем поддерживали в среде, содержащей вемурафениб.

Пиросеквенирование
Пиросеквенирование очагов мутаций в BRAF и NRAS проводилось на платформе PyroMark Q24 (Qiagen) с использованием реагентов PyroMark Gold Q24 (Qiagen). Последовательности праймеров приведены в Дополнительном файле 1: Таблица S1.

Целевой сайтНазвание праймераПоследовательность праймера (5′-3′)
BRAF V600EBRAF-F1[Btn]-TTCATGAAGAGACCTCACAGTAAAA
BRAF-R1GGCCAAAAATTTAATCAGTGGAA
BRAF-S1CCACTCCATCATCGAGATTT
NRAS Q61K,L,RNRAS-F1[Btn]-ACCCCCAGGATTCTTACAGAAA
NRAS-R1CGCAAATGACTTGCTATTATTGA
NRAS-S1TCATGGCACTGTACTCTT
Дополнительная таблица S1

Анализ экспрессии PGC1α
Общая РНК была выделена с помощью набора RNeasy mini kit (Qiagen), а кДНК синтезирована с помощью набора SuperScript™ III Reverse Transcriptase kit (Invitrogen). В качестве праймеров для синтеза кДНК использовали олиго dT24 и случайные гексамеры. Экспрессию гена PGC1α определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени на Roche LightCycler 2.0 с использованием набора LigthCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche). Последовательности праймеров были следующими: PPARGC1A_2241F: 5′-GCTGTACTTTTTGTGGACGCA-3′ и PPARGC1A_2306R: 5′-GGAAGCAGGGTCAAAGTCAT-3′. Экспрессия была нормализована к экспрессии гена домашнего хозяйства RPLP0. Последовательности праймеров были следующими: RPLP0_433F: 5′-ACTAAAATCTCCAGGGGCACC-3′ и RPLP0_547R: 5′-ATGACCAGCCCAAAGGAGAA-3′. Две клеточные линии меланомы ED-050 и SK-MEL-28 были включены в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно [4].

Статистический анализ
Различия между независимыми наборами данных определяли с помощью t-теста Стьюдента. Для статистического анализа дисперсии между различными методами лечения (контроль транспортного средства, DCA, вемурафениб и комбинация DCA и вемурафениба) использовали односторонний ANOVA с сопоставленными выборками. Для определения статистической значимости использовался тест Тьюки на честное различие значимости (HSD). Коэффициент корреляции Пирсона использовался для определения корреляции между чувствительностью к ДКА и метаболическими параметрами. Значение 1 указывало на положительную корреляцию, 0 — на отсутствие корреляции, а -1 — на отрицательную корреляцию.

Эксперименты, проведенные в данном исследовании, включали только коммерчески доступные клеточные линии и поэтому не требовали одобрения этического комитета.

Результаты

Метаболическая характеристика клеточных линий меланомы и первичных меланоцитов
Метаболическое профилирование 12 клеточных линий меланомы и первичных меланоцитов человека (HEMn-LP) проводилось с помощью анализатора Seahorse FX96. Этот прибор выполняет измерения скорости внеклеточного окисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) в режиме реального времени, которые являются косвенными показателями гликолитической активности и митохондриального дыхания, соответственно [23]. Измерения проводили в базальных условиях и при последовательном добавлении пяти метаболических модуляторов (рис. 1А). По сравнению с нормальными меланоцитами, 11 из 12 клеточных линий показали более высокую скорость гликолиза, на что указывают более высокие базальные гликолитические ECAR, показывая, что эффект Варбурга является общей характеристикой клеток меланомы. Более того, девять клеточных линий продемонстрировали более высокие максимальные гликолитические способности по сравнению с меланоцитами (рис. 1B). За редким исключением, не было значительных различий в базальном и максимальном митохондриальном дыхании между меланоцитами и клетками меланомы (Дополнительный файл 2: Рисунок S2). Согласно соотношению OCR иECAR (OCR/ECAR; Рисунок ), относительный вклад митохондриального дыхания в производство АТФ был ниже в 10 клеточных линиях меланомы по сравнению с меланоцитами.

Рисунок S2

.

.

Рисунок 1. Метаболическая характеристика клеточных линий меланомы и первичных меланоцитов. A, Метаболические профили двух клеточных линий меланомы (ED-013 и ED-179) и эпидермальных меланоцитов человека (HEMn-LP), основанные на измерениях Seahorse XF96. Изображены измерения ECAR (левая панель) и OCR (правая панель) при последовательном добавлении олигомицина (1 мкМ), FCCP (1 мкМ), ротенона/антимицина (1 мкМ/1 мкМ) и 2-DG (100 мМ). Данные представляют собой 6 параллельных измерений и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. B, Базальные и максимальные значения гликолитического ECAR для клеточных линий меланомы и первичных меланоцитов человека (HEMn-LP). Из всех значений вычитали ECAR, измеренный после добавления 2-ДГ (негликолитический ECAR). Пунктирная линия указывает на базальный ECAR HEMn-LP. C, Соотношения между базальным митохондриальным OCR и базальным гликолитическим ECAR. D, АТФ-связь, представляющая долю базального OCR, используемого для производства АТФ (доля ингибируется олигомицином). E. Коэффициент контроля дыхания, обозначающий отношение между максимальным митохондриальным OCR и утечкой протонов (OCR после добавления олигомицина).(BE), Значения представляют собой среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Для определения различий между HEMn-LP и клеточными линиями меланомы использовался t-тест Стьюдента (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Митохондриальная эффективность (связь АТФ) и производительность (коэффициент контроля дыхания) оценивались по результатам измерений двух параметров митохондриальной функции: утечки протонов и максимального митохондриального OCR [24]. Утечку протонов определяли после добавления ингибитора АТФ-синтазы олигомицина, а максимальный митохондриальный OCR — после добавления митохондриального разобщителя FCCP. Этот анализ показал значительно более низкую АТФ-связь в клетках меланомы по сравнению с меланоцитами (p < 0,05; ED-007: p = 0,07), что свидетельствует о более высокой утечке протонов и менее эффективном производстве АТФ по сравнению с уровнем потребления кислорода (рис. 1D). Более того, шесть клеточных линий меланомы также имели значительно более низкие коэффициенты дыхательного контроля, чем меланоциты (p?<?0.01, Рисунок 1E), что свидетельствует о плохой работе митохондрий.

DCA смещает метаболизм в сторону митохондриального дыхания и снижает уровень АТФ
Чтобы определить влияние DCA на метаболизм клеток меланомы, мы проанализировали панель из 12 клеточных линий с помощью анализатора Seahorse XF96. После обработки 10 мМ DCA в течение 2 часов все клеточные линии ответили снижением ECAR и увеличением OCR (рис. ), что указывает на сдвиг в сторону митохондриального дыхания. Реакция ECAR была сходной среди клеточных линий, в то время как реакция OCR сильно различалась (Рисунок 2А). Относительные изменения ECAR, OCR и OCR/ECAR в ответ на DCA зависели от концентрации (Дополнительный файл 3: Рисунок S3).

Рисунок 2. Влияние DCA на метаболизм и уровень АТФ. А, Относительные изменения базального митохондриального OCR и гликолитического ECAR, вызванные обработкой 10 мМ DCA в течение 2 часов. Б. Относительные уровни АТФ после обработки ДКА (10 или 20 мМ) в течение 24 часов. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA с подобранными выборками, а для определения статистической значимости применялся тест Тьюки HSD (*p < 0,05; **p < 0,01).

Чтобы определить, нарушает ли сдвиг в метаболизме энергетический гомеостаз, мы измерили уровень АТФ в клетках меланомы после обработки 0,1, 1 или 10 мМ DCA в течение 2 часов. Все три протестированные линии клеток были способны поддерживать уровень АТФ после обработки низкими концентрациями DCA (0,1-1 мМ), тогда как в культурах, обработанных 10 мМ DCA, наблюдалась тенденция к снижению АТФ (Дополнительный файл 3: Рисунок S3). Когда клетки обрабатывали ДКА (10 или 20 мМ) в течение 24 часов, наблюдалось значительное концентрационно-зависимое снижение АТФ (Рисунок 2B), что указывает на постепенное истощение метаболической системы.

Рисунок S3

DCA снижает рост клеток меланомы независимо от генетического драйвера и статуса экспрессии PGC1α
Чтобы оценить возможное клиническое применение DCA для лечения меланомы, мы изучили его влияние на различные параметры клеточного роста. Все клеточные линии и первичные меланоциты обрабатывали различными концентрациями DCA (0,5-100 мМ) в течение 96 часов (репрезентативные результаты представлены на рисунке 3А). Все клеточные линии показали концентрационно-зависимое снижение роста, со значениями IC50 в диапазоне 9-38 мМ (Таблица 1), по сравнению со значением IC50 в 70 мМ для первичных меланоцитов (p < 0,001). Не было обнаружено корреляции между ответом на DCA и статусом мутации BRAF/NRAS или уровнем экспрессии PGC1α (Таблица 1).

Клеточная линияIC50 DCA (мМ)4СтатусBRAF/ NRAS1Экспрессия PGC1α2,4
ED-0708.9 ± 0.6***NRASQ61L1.0 ± 0.2
ED-00712.2 ± 2.2***WT30.6 ± 0.0
ED-07112.3 ± 3.6***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-03412.7 ± 1.7***BRAFL597S1.0 ± 0.2
ED-01314.4 ± 2.0***BRAFV600E1.9 ± 0.3
ED-02717.7 ± 2.1***BRAFV600E0.5 ± 0.1
СК-МЭЛ-2820.0 ± 4.5***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-17920.6 ± 1.8***NRASQ61R0.3 ± 0.0
ED-02421.9 ± 1.6***NRASQ61L0.0 ± 0.0
ED-14023.9 ± 2.0***WT0.4 ± 0.1
ED-05024.1 ± 3.1***WT2.7 ± 0.5
ED-02929.7 ± 5.1***BRAFV600K1.3 ± 0.2
ED-19635.8 ± 3.2***BRAFV600E1.5 ± 0.5
ED-11737.6 ± 2.2***BRAFV600E1.2 ± 0.1
HEMn-LP69.1 ± 6.4WT1
ED-013-R112.6 ± 3.0***BRAFV600E
ED-013-R213.6 ± 2.4***BRAFV600E
ED-071-R112.2 ± 0.9***BRAFV600E
ED-071-R213.8 ± 3.7***BRAFV600E
SK-MEL-28-R123.1 ± 4.6***BRAFV600E
SK-MEL-28-R226.2 ± 8.0**BRAFV600E
Таблица 1 Значения IC 50 DCA, статус BRAF/NRAS и экспрессия PGC1α
**p < 0,01; ***p < 0,001 по сравнению с HEMn-LP.
1BRAF/NRAS статус соответствуют опубликованным результатам[25].
2Относительно экспрессии PGC1α в нормальных меланоцитах.
3дикий тип.
4 Значения IC 50 DCA и экспрессия PGC1α представляют собой среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение.
Рисунок 3. Влияние DCA на рост, пролиферацию и апоптоз. A, Репрезентативная выборка окрашивания кристаллическим фиолетовым четырех клеточных линий меланомы (ED-007, ED-070, ED-179 и ED-196), обработанных возрастающими концентрациями DCA (1-50 мМ) в течение 96 часов. B, Пролиферация, определенная по включению BrdU после обработки DCA (1 и 10 мМ) в течение 96 часов. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA с подобранными выборками, а для определения статистической значимости — тест Тьюки HSD (*p < 0,05; **p < 0,01). C. Проточная цитометрия на основе аннексина V и PI выявила апоптоз в клетках ED-179 и ED-196 после обработки DCA в концентрациях ниже (10 мМ) и выше (100 мМ) IC50 в течение 96 часов.

Для дальнейшей характеристики влияния DCA на клеточный рост мы измерили включение BrdU в клетки, обработанные 1 или 10 мМ DCA в течение 96 часов. Как показано на рисунке 3B, все четыре протестированные клеточные линии ответили снижением пролиферации в диапазоне 11-30% при 1 мМ и 42-88% при 10 мМ. Мы также измерили апоптотический ответ на DCA с помощью проточно-цитометрического анализа уровня аннексина V. При концентрации DCA ниже IC50 количество аннексин V-позитивных клеток не увеличивалось через 96 часов и до 3 недель. Напротив, обработка концентрациями выше IC50 увеличивала количество клеток, позитивных как по аннексину V, так и по PI, что указывает на индукцию гибели клеток уже через 96 часов (Рисунок 3C).

DCA потенцирует действие вемурафениба на BRAFV600E-мутантные клетки меланомы
Чтобы выяснить, можно ли использовать DCA для повышения эффективности химических ингибиторов BRAF для лечения меланомы, мы протестировали различные комбинации DCA и вемурафениба на рост клеток. Лечение четырех BRAFV600E-мутантных клеточных линий вемурафенибом (0,05-5 мкМ) в течение 96 часов выявило значения IC50 от 0,5 до 4,5 мкМ, что согласуется с данными предыдущих исследований [26]. При воздействии на первичные меланоциты мы не достигли значения IC50 для этих клеток даже при самой высокой концентрации (5 мкМ), что подтверждает специфичность соединения.

Когда клетки обрабатывали 1 мМ DCA в сочетании с низкими концентрациями вемурафениба (<IC50), снижение клеточного роста было более выраженным, чем при использовании только DCA или вемурафениба (p < 0,05; Рисунок 4A, B). DCA не потенцировал эффект вемурафениба в клетках ED-117, что может быть связано с присущей этим клеткам устойчивостью к DCA (IC50 38 мМ; Таблица 1). При концентрации IC50 и DCA, и вемурафениб вызывали снижение внутриклеточного уровня АТФ при использовании в качестве отдельных агентов и дальнейшее снижение при использовании в комбинации, хотя и не статистически значимое для всех клеточных линий (рис. 4C).

Рисунок 4. Эффекты комбинированного лечения DCA и вемурафенибом. A, B, Четыре клеточные линии меланомы (ED-013, ED-071, ED-117 и ED-196) обрабатывались DCA (1 мМ), вемурафенибом (50 нМ для ED-071 и ED-117; 100 нМ для ED-013 и ED-196) или комбинацией в течение 2 недель. A, Результаты окрашивания кристаллическим фиолетовым представлены в трех независимых экспериментах. B, Количественная оценка данных, представленных в A. C, Относительные уровни АТФ в клетках, обработанных DCA (IC50), вемурафенибом (IC50) или комбинацией в течение 24 часов. B, C. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех независимых измерений. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA с подобранными выборками, а для определения статистической значимости применялся тест Тьюки HSD (*p < 0,05; **p < 0,01).

Устойчивые к вемурафенибу клеточные линии имеют улучшенную окислительную способность и сохраняют чувствительность к DCA
Семь культур устойчивых к вемурафенибу клеток были получены из четырех BRAFV600E-мутантных клеточных линий путем воздействия на клетки возрастающими концентрациями вемурафениба. Клетки считались устойчивыми, если они могли непрерывно размножаться при концентрации вемурафениба выше IC50. ДНК была выделена из всех семи культур и проверена на увеличение числа копий BRAF и вторичные мутации NRAS, которые являются двумя хорошо описанными механизмами приобретенной устойчивости к вемурафенибу [27],[28]. Пиросеквенирование выявило увеличение отношения BRAF V600E к BRAF WT в одной из устойчивых клеточных линий (ED-013-R2) по сравнению с родительской клеточной линией (Дополнительный файл 4: Рисунок S4). В остальных резистентных клеточных линиях изменений BRAF и NRAS обнаружено не было.

Рисунок S4

Метаболическая характеристика двух устойчивых клеточных линий (ED-013-R1 и ED-196-R) с помощью анализатора Seahorse XF96 показала, что обе устойчивые клеточные линии имели измененный метаболический профиль со значительно увеличенной максимальной дыхательной способностью (Рисунок 5A), но без изменений в базальной дыхательной OCR, связи АТФ или немитохондриальной OCR. Интересно, что при тестировании на чувствительность к DCA клеточные линии, устойчивые к вемурафенибу, имели значения IC50, аналогичные значениям для родительских клеточных линий (Таблица 1).

Рисунок 5. Реакцияклеточных линий меланомы, устойчивых к вемурафенибу, наDCA. A. Метаболические профили двух клеточных линий меланомы, устойчивых к вемурафенибу (ED-013-R1 и ED-196-R), в сравнении с родительскими клеточными линиями (ED-013 и ED-196). На панелях показан базальный OCR и изменения при последовательном добавлении олигомицина (1 мкМ), FCCP (1 мкМ), ротенона/антимицина (1 мкМ/1 мкМ) и 2-DG (100 мМ). Данные представляют собой 6 параллельных измерений и являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. B, Относительный рост клеток чувствительных к вемурафенибу клеточных линий (ED-013, ED-071 и SK-MEL-28) и их субкультур, устойчивых к вемурафенибу (обозначены R1 и R2) после обработки DCA (10 мМ), вемурафенибом (1 мкМ) или комбинацией в течение 96 часов. C, Относительные уровни АТФ после обработки DCA (IC50), вемурафенибом (IC50) или комбинацией в течение 24 часов.

Рисунок 5Bиллюстрирует чувствительность устойчивых к вемурафенибу клеточных линий к DCA и вемурафенибу, как отдельным агентам или в комбинации, по сравнению с родительскими клеточными линиями. Рост резистентных клеточных линий незначительно снижался, не влиял или даже усиливался в присутствии вемурафениба через 96 часов, тогда как чувствительность к DCA была аналогична родительским клеткам, как в присутствии, так и в отсутствие вемурафениба (Рисунок 5B). Аналогичные результаты были получены при измерении изменений уровня АТФ после обработки теми же препаратами в течение 24 часов (Рисунок 5C). Все вместе эти данные показывают, что клетки меланомы, устойчивые к вемурафенибу, сохранили чувствительность к DCA, несмотря на изменение их метаболического профиля.

Обсуждение

Метаболическая таргетная терапия рака в основном была направлена на борьбу с энергообеспечением путем ингибирования гликолиза. Однако признание того, что митохондрии могут быть активными участниками прогрессирования меланомы, повысило внимание к окислительному метаболизму как потенциальной терапевтической мишени [10],[13],[29]. DCA способствует PDK-зависимой активации PDH, обращая производство лактата в пользу притока пирувата в митохондрии [15],[18]. Благодаря этому механизму DCA улучшает связь между гликолизом и митохондриальным дыханием, что будет иметь большее влияние на клетки с недостаточной связью, такие как раковые клетки [18]. Все клеточные линии меланомы, изученные в нашем исследовании, ответили на DCA снижением выработки лактата и увеличением OCR. Ожидалось, что этот сдвиг в сторону митохондриального дыхания оптимизирует использование субстратов и приведет к более эффективному выходу энергии, но вместо этого он привел к значительному падению уровня АТФ, несмотря на отсутствие влияния или даже увеличение митохондриального сопряжения АТФ. Наблюдаемое снижение ECAR в ответ на DCA предполагает, что ингибирование гликолиза может быть основным фактором энергетического голодания. Механизм ингибирования гликолиза ДКА ранее не был описан. Однако было показано, что пируваткиназа, последний АТФ-продуцирующий участок гликолитического пути, негативно регулируется ацетил-коэнзимом А (ацетил-КоА) [30]. Поскольку активация PDH напрямую увеличивает образование ацетил-КоА [31], это может объяснить ингибирование гликолиза под действием DCA. Структурное сходство между ДКА и пируватом [32] также может предполагать прямое ингибирование гликолиза ДКА, возможно, через механизм аллостерической обратной связи.

Метаболический ответ на DCA сопровождался снижением пролиферации клеток меланомы, независимо от статуса генетического драйвера и метаболических профилей этих клеток. Несколько предыдущих исследований продемонстрировали апоптотический эффект DCA на раковые клетки [13],[18],[19],[32][34]. Однако, в соответствии с нашими результатами, апоптотический ответ вызывался только при слишком высоких концентрациях, чтобы быть клинически значимым [32]. Для дальнейшего изучения клинической значимости DCA для лечения меланомы мы исследовали эффективность этого препарата в комбинации с ингибитором BRAF вемурафенибом. Эти эксперименты продемонстрировали потенцирующий эффект DCA на ингибирование роста BRAFV600E-мутантных клеток меланомы. При низких концентрациях DCA, которые сами по себе не влияли на рост клеток, комбинация с низкими концентрациями вемурафениба оказывала значительно более сильный эффект снижения роста, чем только вемурафениб. Этот потенцирующий эффект DCA также отражался в снижении уровня АТФ. Биохимический анализ продемонстрировал способность BRAFV600E размыкать энергетический путь LKB1-AMPK, способствуя устойчивости к энергетической недостаточности и предотвращая апоптотический ответ [8],[9]. Лечение ингибиторами BRAF восстанавливает этот путь [35] и, следовательно, может потенцировать ответ на соединения, снижающие выработку АТФ. DCA и вемурафениб подавляют гликолитическую активность в клетках меланомы и таким образом делают их более зависимыми от митохондриального дыхания [6]. Поскольку на гликолиз приходится большая часть общего производства энергии в этих клетках, ингибирование этого процесса приведет к повышению нагрузки на окислительную систему для производства АТФ. Более низкая производительность митохондрий в клетках меланомы может объяснить неспособность этих клеток поддерживать уровень АТФ в присутствии DCA и вемурафениба. Совместный эффект этих соединений в снижении уровня АТФ предполагает, что энергетический порог, способствующий остановке роста или гибели клеток меланомы, может быть достигнут при более низких концентрациях вемурафениба в присутствии DCA.

В предыдущих исследованиях изучалась способность метаболических модуляторов улучшать терапевтический эффект ингибиторов BRAF для лечения меланомы. Комбинация PLX4720 (аналог вемурафениба) с одним из двух противодиабетических бигуанидов, метформином и фенформином, показала синергическое ингибирование жизнеспособности клеток меланомы [35], [36]. Оба препарата нарушают синтез АТФ путем ингибирования активности митохондриального комплекса I, что приводит к снижению соотношения АТФ и АДФ и активации пути LKB1-AMPK для подавления роста [35],[36]. В отличие от DCA, метформин и фенформин стимулируют гликолиз и производство молочной кислоты [37],[38], что может объяснить ростостимулирующее действие метформина на некоторые клеточные линии меланомы при использовании в качестве единственного агента. Кроме того, концентрации, при которых метформин был эффективен, были выше терапевтически значимого уровня [35]. Фенформин был значительно мощнее метформина [36], но был связан с высоким риском развития молочнокислого ацидоза [39] и был снят с продажи для лечения диабета 2 типа во многих странах. С другой стороны, DCA потенцирует действие вемурафениба при концентрациях до 1 мМ, а ранее было показано, что он не оказывает негативного воздействия при приеме пациентами [17], [19], [40]. Эти результаты указывают на терапевтический потенциал DCA как сопутствующего препарата для лечения вемурафенибом меланомы с мутантом BRAFV600E. Это было подкреплено демонстрацией того, что чувствительность к DCA сохраняется в клеточных линиях меланомы с приобретенной устойчивостью к вемурафенибу. Хотя устойчивые клетки демонстрировали измененный метаболический профиль со значительно увеличенным максимальным митохондриальным дыханием, как также было показано Коразао-Розас и другими [41], они были так же чувствительны к DCA, как и родительские клетки, чувствительные к вемурафенибу. Таким образом, DCA может стать стратегией, позволяющей предотвратить появление субпопуляций, толерантных к вемурафенибу, во время начального лечения и тем самым отсрочить или предотвратить развитие резистентности.

Выводы

Мы представили более глубокое понимание влияния DCA на метаболизм и рост клеток меланомы. Способность DCA снижать уровень АТФ и рост меланомы, по-видимому, потенцирует действие вемурафениба, препарата, который уже используется в клинике для лечения метастатических меланом с BRAFV600E-мутантом. Важно отметить, что клетки меланомы с приобретенной устойчивостью к вемурафенибу сохраняли чувствительность к DCA. Эти результаты должны стимулировать дальнейшее изучение этой комбинации препаратов и применение DCA in vivo.

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: Таблица S1.(33K, doc)
Праймеры для пиросеквенирования для амплификации и секвенирования горячих точек мутаций BRAF и NRAS. Прямые, обратные и секвенирующие праймеры обозначены как F, R и S, соответственно.

Дополнительный файл 2:Рисунок S2.(8.5M, tiff)
Базальные и максимальные значения митохондриального OCR для клеточных линий меланомы и эпидермальных меланоцитов человека (HEMn-LP). Из всех значений вычиталось значение OCR, измеренное после добавления ротенона/антимицина А (немитохондриальное OCR). Пунктирная линия указывает на базальный OCR HEMn-LP. Указанные значения представляют собой среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Для определения различий между HEMn-LP и клеточными линиями меланомы использовался t-тест Стьюдента (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Максимальный митохондриальный OCR для ED-034 не был указан из-за очень большого разброса в четырех независимых экспериментах, варьирующего от 6,19 до 58,36 пмоль/мин/1 000 клеток.

Дополнительный файл 3: Рисунок S3.(12M, tiff)
Метаболический ответ клеток меланомы на DCA Относительный ответ в уровнях ECAR, OCR, OCR/ECAR и АТФ после обработки DCA (0,1, 1 и 10 мМ) в течение 2 ч. Полосы ошибок в первых трех панелях представляют собой стандартные отклонения трех повторных измерений шести параллельных образцов. Столбики ошибок на нижней панели представляют собой стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA с подобранными выборками, а для определения статистической значимости применялся тест Тьюки HSD (*p < 0,05; **p < 0,01).

Дополнительный файл 4: Рисунок S4.(5.6M, tiff)
Аллельный статус BRAF. Пиросеквенирование сайта мутации BRAF c.1799 T > A в ED-013 и производном ED-013-R2, устойчивом к вемурафенибу. Увеличение отношения BRAF V600E к BRAF WT в ED-013-R2 указывает на увеличение числа копий, что может объяснить устойчивость к вемурафенибу.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

PG и CA спланировали и организовали исследование. CA выполнил большинство экспериментов и обработку данных. CD спланировал и провел анализ клеточной пролиферации и помог интерпретировать результаты. AB и TM помогли подготовить и оптимизировать дизайн для метаболического анализа на приборе Seahorse XF. CA, AB и TM обсудили и интерпретировали результаты метаболического анализа. CA и PG написали рукопись при участии и редактировании CD, AB и TM. Окончательный вариант рукописи был прочитан и одобрен всеми авторами.

Благодарности

Мы благодарим профессора Карстена Кристиансена (факультет биологии, Университет Копенгагена) и доцента Якоба Б. Хансена (факультет биомедицинских наук, Университет Копенгагена) за предоставленное оборудование и техническую экспертизу в отношении анализа Seahorse XF. Данное исследование было поддержано грантами Датского онкологического общества и Датского фонда исследования рака.

ССЫЛКИ

1 Warburg O, Wind F, Negelein E: Метаболизм опухолей в организме. J Gen Physiol. 1927, 8: 519-530. 10.1085/jgp.8.6.519.
2 Gatenby RA, Gillies RJ: Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer. 2004, 4: 891-899. 10.1038/nrc1478.
3 Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB: Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009, 324: 1029-1033. 10.1126/science.1160809.
4 Vazquez F, Lim JH, Chim H, Bhalla K, Girnun G, Pierce K, Clish CB, Granter SR, Widlund HR, Spiegelman BM, Puigserver P: PGC1alpha expression definines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 2013, 23: 287-301. 10.1016/j.ccr.2012.11.020.
5 vDavies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J, Woffendin H, Garnett MJ, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R, Floyd Y, Gray K, Hall S, Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A, Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S, Hooper S, Wilson R, Jayatilake H, Gusterson BA, Cooper C, Shipley J: Мутации гена BRAF в раке человека. Nature. 2002, 417: 949-954. 10.1038/nature00766.
6 Hall A, Meyle KD, Lange MK, Klima M, Sanderhoff M, Dahl C, Abildgaard C, Thorup K, Moghimi SM, Jensen PB, Bartek J, Guldberg P, Christensen C: Дисфункциональное окислительное фосфорилирование делает клетки злокачественной меланомы зависимыми от гликолиза, управляемого онкогеном (V600E)BRAF. Oncotarget. 2013, 4: 584-599.
7 Haq R, Shoag J, Andreu-Perez P, Yokoyama S, Edelman H, Rowe GC, Frederick DT, Hurley AD, Nellore A, Kung AL, Wargo JA, Song JS, Fisher DE, Arany Z, Widlund HR: Онкогенный BRAF регулирует окислительный метаболизм через PGC1alpha и MITF. Cancer Cell. 2013, 23: 302-315. 10.1016/j.ccr.2013.02.003.
8 Esteve-Puig R, Canals F, Colome N, Merlino G, Recio JA: Uncoupling of the LKB1-AMPKalpha energy sensor pathway by growth factors and oncogenic BRAF.PLoS One 2009, 4:e4771…,
9 Zheng B, Jeong JH, Asara JM, Yuan YY, Granter SR, Chin L, Cantley LC: Oncogenic B-RAF negatively regulates the tumor suppressor LKB1 to promote melanoma cell proliferation. Mol Cell. 2009, 33: 237-247. 10.1016/j.molcel.2008.12.026.
10 Kaplon J, Zheng L, Meissl K, Chaneton B, Selivanov VA, Mackay G, van der Burg SH, Verdegaal EM, Cascante M, Shlomi T, Gottlieb E, Peeper DS: A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 2013, 498: 109-112. 10.1038/nature12154.
11 Baumunk D, Reichelt U, Hildebrandt J, Krause H, Ebbing J, Cash H, Miller K, Schostak M, Weikert S: Expression parameters of the metabolic pathway genes pyruvate dehydrogenase kinase-1 (PDK-1) and DJ-1/PARK7 in renal cell carcinoma (RCC). World J Urol. 2013, 31: 1191-1196. 10.1007/s00345-012-0874-5.
12 Hur H, Xuan Y, Kim YB, Lee G, Shim W, Yun J, Ham IH, Han SU: Экспрессия киназы-1 пируватдегидрогеназы при раке желудка как потенциальная терапевтическая мишень. Int J Oncol. 2013, 42: 44-54.
13 Kluza J, Corazao-Rozas P, Touil Y, Jendoubi M, Maire C, Guerreschi P, Jonneaux A, Ballot C, Balayssac S, Valable S, Corroyer-Dulmont A, Bernaudin M, Malet-Martino M, de Lassalle EM, Maboudou P, Formstecher P, Polakowska R, Mortier L, Marchetti P: Инактивация сигнальной оси HIF-1alpha/PDK3 направляет меланому в сторону митохондриального окислительного метаболизма и потенцирует терапевтическую активность про-оксидантов. Cancer Res. 2012, 72: 5035-5047. 10.1158/0008-5472.CAN-12-0979.
14 Stacpoole PW, Lorenz AC, Thomas RG, Harman EM: Dichloroacetate in the treatment of lactic acidosis. Ann Intern Med. 1988, 108: 58-63. 10.7326/0003-4819-108-1-58.
15 Stacpoole PW: The pharmacology of dichloroacetate. Metabolism. 1989, 38: 1124-1144. 10.1016/0026-0495(89)90051-6.
16 Michelakis ED, Webster L, Mackey JR: Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolic-targeting therapy for cancer. Br J Cancer. 2008, 99: 989-994. 10.1038/sj.bjc.6604554.
17 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, Hutson AD, Neiberger RE, O’Brien RG, Perkins LA, Quisling RG, Shroads AL, Shuster JJ, Silverstein JH, Theriaque DW, Valenstein E: Контролируемое клиническое испытание дихлорацетата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей. Педиатрия. 2006, 117: 1519-1531. 10.1542/peds.2005-1226.
18 Bonnet S, Archer SL, lalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED: Ось митохондрий-K+ каналов подавляется при раке, и ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell. 2007, 11: 37-51. 10.1016/j.ccr.2006.10.020.
19 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, Abdulkarim B, McMurtry MS, Petruk KC: Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med. 2010, 2: 31-34. 10.1126/scitranslmed.3000677.
20 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De VI: Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия. Gynecol Oncol. 2008, 109: 394-402. 10.1016/j.ygyno.2008.01.038.
21 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, Porvasnik S, Urbanek C, Rosser CJ: Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate. 2008, 68: 1223-1231. 10.1002/pros.20788.
22 Robinson J, Roberts CH, Dodi IA, Madrigal JA, Pawelec G, Wedel L, Marsh SG: The European searchable tumour line database. Cancer Immunol Immunother. 2009, 58: 1501-1506. 10.1007/s00262-008-0656-5.
23 Wu M, Neilson A, Swift AL, Moran R, Tamagnine J, Parslow D, Armistead S, Lemire K, Orrell J, Teich J, Chomicz S, Ferrick DA: Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2007, 292: C125-C136. 10.1152/ajpcell.00247.2006.
24 Brand MD, Nicholls DG: Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 2011, 435: 297-312. 10.1042/BJ20110162.
25 Dahl C, Christensen C, Jonsson G, Lorentzen A, Skjodt ML, Borg A, Pawelec G, Guldberg P: Mutual Exclusivity Analysis of Genetic and Epigenetic Drivers in Melanoma Identifies a Link Between p14ARF and RARbeta Signaling. Mol Cancer Res. 2013, 11: 1166-1178. 10.1158/1541-7786.MCR-13-0006.
26 Sondergaard JN, Nazarian R, Wang Q, Guo D, Hsueh T, Mok S, Sazegar H, MacConaill LE, Barretina JG, Kehoe SM, Attar N, von EE, Zuckerman JE, Chmielowski B, Comin-Anduix B, Koya RC, Mischel PS, Lo RS, Ribas A: Differential sensitivity of melanoma cell lines with BRAFV600E mutation to the specific Raf inhibitor PLX4032.J Transl Med 2010, 8:39,
27 Nazarian R, Shi H, Wang Q, Kong X, Koya RC, Lee H, Chen Z, Lee MK, Attar N, Sazegar H, Chodon T, Nelson SF, McArthur G, Sosman JA, Ribas A, Lo RS: Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E) inhibition by RTK or N-RAS upregulation. Nature. 2010, 468: 973-977. 10.1038/nature09626.
28 Shi H, Moriceau G, Kong X, Lee MK, Lee H, Koya RC, Ng C, Chodon T, Scolyer RA, Dahlman KB, Sosman JA, Kefford RF, Long GV, Nelson SF, Ribas A, Lo RS: Melanoma whole-exome sequencing identifies (V600E)B-RAF amplification-mediated acquired B-RAF inhibitor resistance.Nat Commun 2012, 3:724…,
29 de Barbi MM, Vincent G, Fayewicz SL, Bateman NW, Hood BL, Sun M, Suhan J, Duensing S, Yin Y, Sander C, Kirkwood JM, Becker D, Conrads TP, Van HB, Moschos SJ: Mitochondrial respiration-an important therapeutic target in melanoma.PLoS One 2012, 7:e40690…,
30 Gilbert RJ, Klein RA: Pyruvate kinase: a carnitine-regulated site of ATP production in Trypanosoma brucei brucei. Comp Biochem Physiol B. 1984, 78: 595-599.
31 Kobayashi K, Neely JR: Механизм активации пируватдегидрогеназы при увеличении работы сердца. J Mol Cell Cardiol. 1983, 15: 369-382. 10.1016/0022-2828(83)90321-8.
32 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL:Sodium dichloroacetate selectively target cells with defects in the mitochondrial ETC. Int J Cancer. 2010, 127: 2510-2519. 10.1002/ijc.25499.
33 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA, Jayne DG:Dichloroacetate induces apoptosis and cell-cycle arrest in colorectal cancer cells. Br J Cancer. 2010, 102: 1746-1752. 10.1038/sj.bjc.6605701.
34 Tong J, Xie G, He J, Li J, Pan F, Liang H: Synergistic antitumor effect of dichloroacetate in combination with 5-fluorouracil in colorectal cancer.J Biomed Biotechnol 2011, 2011:740564…,
35 Niehr F, Von EE, Attar N, Guo D, Matsunaga D, Sazegar H, Ng C, Glaspy JA, Recio JA, Lo RS, Mischel PS, Comin-Anduix B, Ribas A: Combination therapy with vemurafenib (PLX4032/RG7204) and metformin in melanoma cell lines with distinct driver mutations.J Transl Med 2011, 9:76…,
36 Yuan P, Ito K, Perez-Lorenzo R, Del GC, Lee JH, Shen CH, Bosenberg MW, McMahon M, Cantley LC, Zheng B:Phenformin enhances therapeutic benefit of BRAFV600E inhibition in melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110: 18226-18231. 10.1073/pnas.1317577110.
37 Buzzai M, Jones RG, Amaravadi RK, Lum JJ, DeBerardinis RJ, Zhao F, Viollet B, Thompson CB:Systemic treatment with the antidiabetic drug metformin selectively impairs p53-deficient tumor cell growth. Cancer Res. 2007, 67: 6745-6752. 10.1158/0008-5472.CAN-06-4447.
38 Choi YW, Lim IK:Sensitization of metformin-cytotoxicity by dichloroacetate through reprogramming glucose metabolism in cancer cells. Cancer Lett. 2014, 346: 300-8. 10.1016/j.canlet.2014.01.015.
39 Bergman U, Boman G, Wiholm BE:Epidemiology of adverse drug reactions to phenformin and metformin. Br Med J. 1978, 2: 464-466. 10.1136/bmj.2.6135.464.
40DunbarEM, Coats BS, Shroads AL, Langaee T, Lew A, Forder JR, Shuster JJ, Wagner DA, Stacpoole PW:Phase 1 trial of dichloroacetate (DCA) in adults with recurrent malignant brain tumors. Invest New Drugs. 2013, 32: 452-64. 10.1007/s10637-013-0047-4.
41 Corazao-Rozas P, Guerreschi P, Jendoubi M, Andre F, Jonneaux A, Scalbert C, Garcon G, Malet-Martino M, Balayssac S, Rocchi S, Savina A, Formstecher P, Mortier L, Kluza J, Marchetti P:Mitochondrial oxidative stress is the Achille’s heel of melanoma cells resistant to Braf-mutant inhibitor. Oncotarget. 2013, 4: 1986-1998.

Добавить комментарий