📖 38 mins.

Рамон С Сан1,2, Филипп Г Борд1 и Аннеке С Блэкберн1*

1 Группа молекулярной генетики, Департамент трансляционных бионаук, Школа медицинских исследований Джона Куртина, здание 131, Австралийский национальный университет, абонентский ящик 334, Канберра ACT 0200, АВСТРАЛИЯ

2

Департамент радиационной онкологии, Стэнфордская школа медицины, Стэнфорд CA 94305 США.

1* Переписка

: [email protected]

© 2011 Sun et al; лицензиат BioMed Central Ltd. Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любых средствах массовой информации при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.


Получено: 3 мая 2011 г.
Принято: 18 ноября 2011 г.
Опубликовано: 18 ноября 2011 г


Аннотация

Справочная информация
Раковые клетки имеют иной метаболический профиль по сравнению с нормальными клетками. Эффект Варбурга (повышенный аэробный гликолиз) и глутаминолиз (повышенная активность митохондрий в результате катаболизма глутамина) являются хорошо известными отличительными признаками рака и сопровождаются повышенной продукцией лактата, гиперполяризацией митохондриальной мембраны и повышенной продукцией реактивных форм кислорода.
Методы
В этом исследовании мы нацелились на эффект Варбурга с помощью дихлорацетата (DCA) и на повышенную митохондриальную активность глутаминолиза с помощью триоксида мышьяка (ATO) в клетках рака молочной железы, измеряя пролиферацию, гибель клеток и характеристики митохондрий.
Результаты
Комбинация DCA и ATO более эффективно подавляла пролиферацию клеток и вызывала их гибель, чем любой из препаратов в отдельности. Мы изучили влияние этих препаратов на мембранный потенциал митохондрий, продукцию реактивных форм кислорода и уровень АТФ и выявили новые молекулярные механизмы в митохондриях для ATO и DCA: ATO снижает функцию митохондрий через ингибирование оксидазы цитохрома С (комплекс IV электронно-транспортной цепи), а DCA повышает экспрессию субъединицы b синтазы АТФ. Потенцирование цитотоксичности ATO с помощью DCA коррелирует с сильным подавлением экспрессии c-Myc и HIF-1a и снижением экспрессии белка выживания Bcl-2. Заключение
Данное исследование является первым, демонстрирующим, что воздействие на два ключевых метаболических признака рака является эффективной противораковой стратегией с терапевтическим потенциалом.
Ключевые слова
Дихлорацетат, рак молочной железы, электронно-транспортная цепь, митохондрии, триоксид мышьяка

Введение

Триоксид мышьяка (ATO) используется в качестве терапевтического средства уже более 2000 лет. Происходя из Китая [1], в настоящее время он используется против острого промиелоидного лейкоза (APL) у пациентов, у которых произошел рецидив после терапии алтранс-ретиноевой кислотой/антрациклином, и продвигается в качестве первой линии терапии de novo APL [2-4]. ATO известен как гиперреактивная молекула и потенциально может связываться с тиоловыми группами во многих белках [2,5]. Его способность связываться с богатым тиолом мутантным белком PML-RAR-α, образующимся в результате транслокации хромосомы при АПЛ, сделала его эффективным препаратом для лечения АПЛ [2,5,6]. Было показано, что ATO индуцирует апоптоз в различных линиях раковых клеток in vitro и in vivo [7,8], но было трудно рассматривать ATO для клинического применения в других типах опухолей, кроме АПЛ, из-за отсутствия знаний о молекулярных мишенях, которые приводят к его цитотоксичности. За последние 10 лет физиологические изменения в раковых клетках в ответ на лечение ATO были хорошо охарактеризованы, и в настоящее время проводится множество клинических испытаний для нового применения ATO [5]. ATO был предложен в качестве митохондриального токсина [9]. ATO может деполяризовать мембранный потенциал митохондрий (ММП) [10], увеличивать внутриклеточное производство реактивных форм кислорода (ROS) [8] и вызывать апоптоз [8]. Предполагаемой мишенью для ATO, которая может достичь этих фенотипических изменений, является митохондриальная переходная пора (MTP) [11]. Было показано, что ATO вызывает открытие MTP, что индуцирует высвобождение цитохрома c и, как предполагается, рассеивает MMP и увеличивает высвобождение ROS из митохондрий [12]. Совсем недавно система тиоредоксина, в частности тиоредоксин-редуктаза, также была идентифицирована как мишень ATO, которая может способствовать увеличению окислительного стресса и изменению редокс-сигнализации после лечения раковых клеток ATO [9,13].
Эффект Варбурга — это широко распространенное явление, которое было выявлено более чем в 90% всех форм опухолей. Клетки, проявляющие эффект Варбурга, используют альтернативные пути энергетического гомеостаза для поддержания своего пролиферативного фенотипа [14]. Нобелевский лауреат д-р Отто Варбург заявил, что раковые клетки полагаются на гликолиз или субстратное фосфорилирование для выработки АТФ и подавляют свою митохондриальную активность [15]. С помощью более совершенных технологий последние исследования подтвердили аспект производства АТФ в гипотезе Варбурга, но показали, что митохондриальная активность не подавляется в раковых клетках. Наоборот, митохондрии играют жизненно важную роль в обеспечении субстратами для поддержания клеточного деления [16].
Противораковый эффект от изменения эффекта Варбурга был описан недавно, и старый препарат дихлорацетат (ДХА), который может перенаправить синтез АТФ с гликолиза на окислительное фосфорилирование, продемонстрировал хорошую противораковую активность как in vitro [17-19], так и in vivo [20-23]. DCA является ингибитором киназы пируватдегидрогеназы и приводит к повышению активности пируватдегидрогеназы [19]. Это приводит к увеличению преобразования пирувата в ацетил-КоА, а не в молочную кислоту, что описывается эффектом Варбурга, и стимулирует митохондриальное дыхание за счет увеличения поступления ацетил-КоА. Следовательно, после обработки DCA раковые клетки демонстрировали повышенный уровень ROS, деполяризацию ММП in vitro и повышенный апоптоз как in vitro, так и in vivo [17,20].
Поскольку DCA может перенаправлять субстраты в митохондриальное дыхание и производство АТФ, он может обладать синергической активностью с противораковыми препаратами, которые нарушают митохондриальную активность. Мы предполагаем, что, обращая гликолитический фенотип с помощью DCA и направляя больше пирувата на митохондриальное окислительное фосфорилирование, одновременно воздействуя на митохондрии с помощью ATO, в раковых клетках произойдет серьезное нарушение энергетического гомеостаза. В данном исследовании мы показали, что в комбинации DCA и ATO совместно подавляют рост клеточных линий рака молочной железы in vitro. Кроме того, мы выявили новые молекулярные механизмы в митохондриях, которые могут способствовать цитотоксичности ATO, что дает дополнительную поддержку для использования ATO против солидных опухолей.


Материалы и методы

Реактивы
JC-1, CFSE и H2DCFDA были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), наборы для анализа CellTiter-Glo и Caspase-Glo были приобретены у Promega Co (Сан-Луис, Калифорния, США). Остальные химические вещества были приобретены у Sigma Co (Сент-Луис, МО, США).
Культура клеток
Клеточные линии были получены из следующих источников в указанные годы. Д-р Анна ДеФазио, Институт Вестмид Миллениум, Сидней, Австралия: T-47D (2003), BT-20 (2003), MCF-10A (2005) и MCF-10AT1 (2005); проф. Крис Пэриш, Австралийский национальный университет, Канберра, Австралия: 13762 MAT (2007), MDA-MB-468 (2003) и MDA-MB-231 (2003). Внешний вид этих клеточных линий соответствует опубликованным морфологиям, но в последнее время они не были аутентифицированы. Клетки эпителиальной карциномы молочной железы человека (T-47D) выращивали в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой в присутствии 0,1% PSN (3% пенициллина, 5% стрептомицина и 5% неомицина). Клеточные линии BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468 и 13762 MAT поддерживались в среде DMEM/F12, дополненной 10% FBS и 2 мМ L-глутамина. Среда DMEM/F-12 с 25% лошадиной сыворотки, 0,01% EGF, 0,28 МЕ/мл инсулина, 0,01% холерного токсина и 0,5 мкг/мл гидрокортизона использовалась для клеток MCF-10A и MCF-10AT1. Все клеточные линии поддерживались при 37°C в 5% CO2.
Жизнеспособность клеток
Для оценки жизнеспособности клеток, клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 3000 клеток на лунку и 8 лунок на группу. После воздействия DCA и ATO в течение 24-72 часов, клетки инкубировали в течение 3 часов с нейтральным красным (30 мкг/мл) в свежей среде, затем промывали PBS, после чего добавляли буфер для лизиса (уксусная кислота/метанол, 80%/20%) и регистрировали поглощение при 540 нм. Результаты выражены как среднее ± S.D., расчеты проводились с использованием программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, данные представлены для одного репрезентативного эксперимента.
Пролиферация клеток
Клетки T-47D собирали и ресуспендировали в 1 мл среды RPMI. Клетки были помечены добавлением 1 мл PBS, содержащего 5 мкМ карбоксифлуоресцеин сукцинимидилового эфира (CFSE), с последующей инкубацией в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем меченые клетки дважды промывали, подсчитывали и высевали по105 клеток/лунку в 12-луночный планшет. В день анализа клетки T-47D собирали и дважды промывали PBS, а затем интенсивность CFSE исследовали с помощью FACS. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 3), расчеты проводились с помощью программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и данные представлены для одного репрезентативного эксперимента.
Гибель клеток Апоптоз оценивали методом проточной цитометрии после окрашивания клеток меченым FITC аннексином-V (АВ) (Invitrogen Co.) и йодистым пропидием (PI). После обработки препаратом клетки T-47D собирали и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин; гранулы дважды промывали PBS и затем ресуспендировали в 100 мкл буфера для связывания аннексина-V (0,14 М NaCl, 2,5 мМ CaCl2, 0,01 М HEPES pH 7,4). Аннексин-V (1 мкл) и 5 мкл PI (50 мкг/мл) добавляли к образцам и инкубировали в темноте в течение 15 мин. После инкубации образцы хранили на льду до проведения анализа FACS. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 3), расчеты проводились с использованием программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и представленные данные относятся к одному репрезентативному эксперименту.
Генерация ROS
Для оценки внутриклеточного уровня ROS клетки высевали в 12-луночные планшеты с плотностью клеток 1 ×105 клеток на лунку и обрабатывали препаратами в течение 12 часов. 2′, 7′-дигидрохлорфлуроресцеинацетат (H2DCFDA) добавляли в среду в конечной концентрации 10 мкМ и давали клеткам окрашиваться в течение 1 часа в темноте. После окрашивания H2DCFDAклетки трипсинизировали, дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Интенсивность H2DCFDAисследовали с помощью FACS. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 3), расчеты проводились с помощью программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и представленные данные относятся к одному репрезентативному эксперименту.
Концентрация АТФ и активность каспазы
Внутренний уровень АТФ и активность каспазы в клетках T-47D оценивали с помощью наборов CellTiter-Glo и Caspase-Glo 3/7 assay (Promega Corp., Madison, WI) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки T-47D культивировали в отсутствие и в присутствии препаратов в течение 12 часов в белых непрозрачных 96-луночных планшетах (4 лунки на группу). Добавляли равные объемы реагентов CellTiter-Glo, после чего образцы инкубировали в течение 15 мин на шейкере при комнатной температуре. Люминесценцию регистрировали с помощью микропланшетного люминометра Glomax (Promega Co., Madison, WI) по заданному протоколу CellTiter. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 4), расчеты проводились с помощью программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и представленные данные относятся к одному репрезентативному эксперименту.
Мембранный потенциал митохондрий
Аналогично измерению ROS, клетки высевали в 12-луночные планшеты с плотностью клеток 1 ×105 клеток на лунку и обрабатывали препаратами в течение 12 часов. 5, 5′, 6, 6′-тетрахлор-1, 1′, 3, 3′-тетраэтилбензимидазол-карбоцианин йодид (JC-1) добавляли в среду в конечной концентрации 0,2 мкМ и давали клеткам окрашиваться в течение 30 мин в темноте. После окрашивания JC-1 клетки трипсинизировали, дважды промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Интенсивность JC-1 исследовали с помощью FACS. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 3), расчеты проводились с помощью программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и представленные данные относятся к одному репрезентативному эксперименту.
Активность оксидазы цитохрома С
Анализ оксидазы цитохрома С оценивали по методу, опубликованному ранее [24]. Вкратце, после обработки препаратом в 96-луночных планшетах (8 лунок на группу) клетки T-47D пермеабилизировали 50 мкл 0,01% сапонина, затем добавляли 100 мкл субстратной среды (4 мМ 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB), 100 мкМ восстановленного цитохрома С, 2 мкг/мл каталазы в 0,1 М Na-фосфате, pH 7,0). Абсорбция при 450 нм измерялась сразу после добавления субстратной среды и отслеживалась в течение 30 мин. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 8), расчеты проводились с помощью программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводились не менее трех раз, и представленные данные относятся к одному репрезентативному эксперименту.
Активность PDH
Активность PDH измеряли с помощью набора для микропланшетного анализа активности фермента MitoSciences PDH (#MSP18, MitoSciences, Орегон, США). Для измерения влияния лекарств на активность PDH в клетках, клетки T-47D обрабатывали лекарствами в среде в течение 3 часов, после чего их промывали и ресуспендировали в PBS. Клеточные экстракты готовили и анализировали на активность PDH в концентрации 15 мг белка/мл в соответствии с инструкциями набора. Для измерения прямого ингибирования PDH под действием ATO, PDH выделяли из необработанных клеток T-47D путем нанесения клеточных экстрактов на пластину для захвата антител. После промывки планшета в лунки добавляли пробирный раствор, содержащий препарат, и сразу же проводили анализ на активность PDH. Результаты выражены как среднее ± S.D (n = 4), расчеты проводились с использованием программного пакета Prism, применялся ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считалось P < 0,05. Эксперименты проводили не менее трех раз, данные представлены для одного репрезентативного эксперимента.
Иммуноблоттинг и денситометрический анализ
Клетки (1 ×106 ) высевали в колбы для культуры ткани T25 и обрабатывали ATO или DCA в течение 12 часов. Лизаты клеток готовили путем добавления 500 мкл реагента для выделения белков млекопитающих MPER® (Thermo Scientific, IL, USA). Иммуноблоттинг проводили, как описано ранее [25], с использованием антител к c-Myc (Roche, IN, USA, клон 9E10), HIF-1α (Abcam, Cambridge, UK, #ab82832), Bcl-2 (Abcam #ab692), β-субъединице АТФ-синтазы (Abcam #ab14730) и β-актину (Abcam #ab8227). Вестерн-блоты детектировали с помощью хемилюминесценции и экспонирования рентгеновской пленки. Изображения получали с помощью планшетного сканера CanoScan 8600F, количественно оценивали с помощью программы ImageJ (версия 1.4, NIH, США) и стандартизировали по β-актину в каждой полосе. Результаты объединяли из 3 отдельных экспериментов и выражали как среднее ± S.D (n = 3), расчеты проводили с помощью программного пакета Prism, применяли ANOVA с посттестом Тьюки, статистически значимым считали P < 0,05.

Результаты

DCA и ATO вместе эффективнее снижают пролиферацию клеток и вызывают их гибель
Для изучения совместного действия ATO и DCA на подавление роста клеток, клеточные линии рака молочной железы обрабатывались в течение нескольких дней обоими препаратами, а общее количество клеток оценивалось с помощью анализа жизнеспособности нейтральных красных клеток. Панель клеточных линий представляет основные подтипы рака молочной железы человека (люминальный (T-47D), базальный A (MDAMB-468, BT-20), базальный B (MDA-MB-231)), или имеют другое значение в качестве экспериментальных моделей (13762MAT — аденокарцинома молочной железы крысы, чувствительная к DCA in vivo [22], MCF10AT1 — злокачественная производная иммортализованных клеток MCF-10A). Клетки MDA-MB-468, MDA-MB-231 и T-47D показали значительное снижение от 10% до 40% общего числа клеток после 72 часов обработки 5 мМ DCA (Рисунок 1A), в то время как клетки 13762 MAT, BT-20 и MCF-10AT1 не реагировали в течение периода лечения. Все протестированные линии раковых клеток были чувствительны к ATO, но в разных концентрациях. Уменьшение общего числа клеток наблюдалось в BT-20, T-47D, MCF-10AT1 и MDA-MB-468 при обработке всего 5 мкМ ATO, однако для достижения такой же эффективности в клеточных линиях MDA-MB-231 и 13726 MAT требовалось 15 мкМ ATO. Примечательно, что DCA и ATO в комбинации показали больший эффект, чем любой из препаратов в отдельности, во всех протестированных линиях раковых клеток. Там, где ATO и DCA были эффективны как отдельные агенты для снижения числа клеток, эффект комбинированного лечения был приблизительно равен сумме эффектов отдельных препаратов (T-47D, MDA-MB-468 и MDA-MB-231). В тех случаях, когда DCA сам по себе не показал снижения числа клеток, он все же смог усилить ингибирование роста ATO в 2-3 раза (13762 MAT, BT-20 и MCF10AT1) (Рисунок 1A). Нераковая клеточная линия MCF-10A не показала снижения числа клеток после ATO (15 мкМ), DCA (5 мМ) или комбинированного лечения.
Эффект ATO и DCA был дополнительно изучен на клетках T-47D, одной из клеточных линий, более чувствительных к одному только DCA. Реакция клеток T-47D на DCA была дозозависимой, и через 72 часа в клетках, обработанных 5 мМ DCA, было на 42 ± 6% меньше клеток, чем в контрольной культуре (рис. 1B). Только ATO (5 мкМ) снизил общее количество клеток на 56 ± 4%, а клетки, обработанные и DCA, и ATO, показали дальнейшее снижение по сравнению с группой, обработанной только ATO (рис. 1С). Кривая дозового ответа показала, что комбинированная обработка DCA (5 мМ) и ATO может снизить IC50 до 0,25 раза по сравнению с ATO (рис. 1С). Этот эффект происходит в диапазоне концентраций, достигнутых клинически для ATO (до 5-7 мкМ [26]).
Анализ пролиферации CFSE показал, что клетки, обработанные ATO (5 мкМ) или DCA (5 мМ), излучали значительно более высокую флуоресценцию CFSE (2,1-кратную и 2,2-кратную соответственно) после 72 часов лечения, что указывает на ингибирование роста. Клетки, обработанные ATO и DCA, показали 3,4-кратное увеличение интенсивности CFSE по сравнению с необработанными клетками, что указывает на совместную работу препаратов по ингибированию пролиферации клеток (Рисунок 1D).
Влияние ATO и DCA на гибель клеток T-47D оценивали с помощью двойного окрашивания AV и PI, а клетки анализировали с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Только DCA (5 мМ) не вызывал гибели клеток T-47D (рис. 1E), что аналогично эффекту DCA на клетки 13762 MAT, о котором сообщалось ранее [22]. ATO (5 мкМ) также не вызвал гибели клеток после 12 часов лечения, однако клетки, обработанные как 5 мкМ ATO, так и 5 мМ DCA, показали небольшое (15%) увеличение популяции AV+/PI+ (13,2 ± 0,6% апоптотических клеток по сравнению с 11,5 ± 1,0% для ATO/DCA по сравнению с необработанными соответственно, p = 0,07), предполагая, что DCA может усиливать апоптотическое действие ATO. При более высоких концентрациях и 48-часовой обработке ATO (20 мкМ) увеличивал количество погибших клеток на 35 ± 8% (P = 0,029) по сравнению с необработанной культурой (рис. 1E). Сочетание 5 мМ DCA с 20 мкМ ATO привело к 4-кратному увеличению популяции AV+/PI+ по сравнению только с ATO, что указывает на то, что DCA может усиливать гибель клеток, индуцированную ATO в клетках рака молочной железы T-47D (рис. 1E).

Рисунок 1 Ингибирование роста раковых клеток с помощью ATO и DCA. (A) Совместное воздействие ATO (5 или 15 мкМ) и DCA (5 мМ) на рост клеток рака молочной железы, измеренный с помощью анализа жизнеспособности с нейтральным красным после 3 дней лечения. Клетки BT-20, T-47D, MDA-MB-468 и MCF-10AT1 обрабатывали 5 мкМ ATO. Клетки MDA-MB-231, MAT и MCF-10A обрабатывали 15 мкМ ATO. (B) Дозовый ответ клеток T-47D на воздействие DCA (t = 72 часа). (C) Дозовый ответ клеток T-47D на лечение ATO и ATO/DCA (5 мМ) (t = 72 часа). (D) Пролиферация T-47D, измеренная как средняя интенсивность CFSE после лечения 5 мкМ ATO и/или 5 мМ DCA (t = 72 часа) (более высокая интенсивность CFSE указывает на меньшую пролиферацию). (E) Гибель клеток (AV +/PI+), выраженная в процентах от общего числа клеток после 48 часов лечения 20 мкМ ATO и/или 5 мМ DCA. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS — несущественно (обработанные по сравнению с необработанными). ## P ≤ 0,001, ### P ≤ 0,0001 (ATO/DCA против ATO).


ATO и DCA действуют совместно на деполяризацию ММП, но оказывают противоположные эффекты на индуцирование выработки АТФ и РОС
Было показано, что ATO и DCA изменяют функцию митохондрий, деполяризуя ММП и увеличивая выработку РОС [20]. Поэтому эти параметры наряду с уровнем АТФ были изучены в попытке определить, вносят ли они вклад в усиление противоракового эффекта комбинированного лечения ATO/DCA. Измеренное с помощью окрашивания JC-1 количество клеток T-47D с гиперполяризованной ММП (правый верхний квадрант) значительно уменьшилось при лечении DCA (5 мМ) или ATO (5 мкМ и 20 мкМ) (t = 12 часов) (28 ± 6%, 38 ± 4% и 69 ± 7% соответственно по сравнению с необработанными контрольными клетками), что соответствует ранее опубликованным данным [20,27]. Сочетание ATO (5 мкМ или 20 мкМ) с 5 мМ DCA привело к еще большему снижению (53 ± 9% и 77 ± 12% соответственно) по сравнению с необработанными клетками (рис. 2А), демонстрируя, что DCA и ATO могут работать вместе в деполяризации ММП. Уровень АТФ снижался под действием как низкой, так и высокой дозы ATO (14 ± 3% и 32 ± 5% соответственно) после 12 часов лечения, в то время как клетки, обработанные DCA, показали увеличение уровня АТФ на 6 ± 1% (Рисунок 2B и 2C). При высокой дозе ATO DCA не смог увеличить выработку АТФ (Рисунок 2B), в то время как при низкой дозе ATO клетки, обработанные DCA и ATO вместе, показали небольшое увеличение выработки АТФ по сравнению с обработкой только ATO (Рисунок 2C). Эти данные указывают на то, что DCA и ATO влияют на производство АТФ через отдельные мишени внутри клеток.

Рисунок 2 Внутриклеточные реакции клеток T-47D на лечение ATO и DCA. (A) Окрашивание JC-1, показывающее совместное действие DCA и ATO на деполяризацию ММП (t = 12 часов). (B и C) Влияние ATO (20 мкМ (B) или 5 мкМ (C)) и DCA (5 мМ) на уровень АТФ. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, NS — не существенно (обработанные по сравнению с необработанными).


Увеличение внутриклеточного уровня ROS было предложено в качестве причины цитотоксичности ATO [2,9]. Совместное влияние ATO и DCA на ROS было исследовано с помощью флуоресцентного красителя H2DCFDA. Клетки, обработанные 20 мкМ ATO или 5 мМ DCA, показали повышенный внутриклеточный уровень ROS (в 2,8 и 1,9 раза соответственно) (Рисунок 3A), что соответствует ранее опубликованным результатам [27], а клетки, обработанные и ATO, и DCA, показали дальнейшее увеличение (в 5,2 раза) продукции ROS (Рисунок 3A). Напротив, ATO в низкой концентрации (5 мкМ) вызвал 0,5-кратное снижение продукции ROS (Рисунок 3B). Это противоречило предыдущим сообщениям о производстве ROS и обработке ATO, поэтому была проанализирована дозозависимая реакция и временной ход производства ROS после обработки ATO. Это показало, что низкие концентрации ATO снижали внутриклеточное производство ROS, в то время как высокие концентрации ATO индуцировали производство ROS (Рисунок 3C). Аналогично, обработка 10 мкМ ATO привела к заметному снижению продукции ROS в первые 4 часа, а через 8 часов уровень ROS увеличился до уровня, о котором сообщали другие исследователи (Рисунок 3D). Совместная обработка клеток 5 мМ DCA и 5 мкМ ATO привела к промежуточной продукции ROS (Рисунок 3B), аналогичной необработанным клеткам.

Рисунок 3 Влияние ATO и DCA на продукцию ROS. (A и B) Влияние ATO и DCA на уровень ROS в клетках T-47D после обработки 20 мкМ (A) или 5 мкМ (B) ATO, отдельно и в сочетании с 5 мМ DCA. (C) Дозовый ответ уровней ROS на различные концентрации ATO (t = 12 часов). (D) Временной ход продукции ROS после обработки 10 мкМ ATO. ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS — несущественно (обработанные по сравнению с необработанными).


Промежуточные эффекты комбинированного лечения DCA/ATO на уровни АТФ и ROS могут быть объяснены конкурирующим воздействием на активность PDH. DCA нацелен на PDK и поэтому должен повышать активность PDH, в то время как ATO, как сообщается, ингибирует PDH либо непосредственно путем реакции с вицинальными тиолами PDH, либо опосредованно через повышенное производство перекиси водорода [28]. Чтобы изучить влияние ATO и/или DCA на активность PDH, интактные клетки или PDH, выделенные из клеток T-47D, обрабатывали препаратами и определяли активность PDH. Как и предполагалось, 3-часовая обработка интактных клеток DCA привела к повышению активности PDH, тогда как ATO (до 20 мкМ) не изменил активность PDH интактных клеток (рис. 4A). Напротив, DCA не изменял активность изолированной PDH, но высокие концентрации ATO были способны ингибировать активность PDH (Рисунок 4b). Таким образом, в клетках T-47D ATO не снижал активность PDH в концентрациях, использованных в данном исследовании.

Рисунок 4 Влияние ATO и DCA на активность PDH. (А) Влияние на активность PDH в клетках T-47D после 3 ч обработки ATO и DCA. (B) Влияние лечения ATO на активность PDH изолированной PDH (взятие антител из клеток T-47D). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS — несущественно (обработанные по сравнению с необработанными).


ATO является ингибитором комплекса IV электронтранспортной цепи
Электронтранспортная цепь (ЭТЦ) расположена во внутренней мембране митохондрий и играет жизненно важную роль в производстве энергии. ЭТЦ отвечает за создание протонного градиента во внутреннем мембранном пространстве митохондрий для поддержания ММП для производства АТФ [29]. ETC также является основным местом производства ROS в клетках в результате утечки электронов из комплексов I и III [30]. Благодаря его способности одновременно снижать уровень ROS, деполяризировать ММП и уменьшать выработку АТФ, мы предположили, что ATO действует как ингибитор ЭТЦ. Группа ингибиторов ETC была сравнена с ATO (5 мкМ), чтобы определить, вызывают ли они те же фенотипические изменения, что и ATO в клетках T-47D. Ротенон (0,1 мкМ, комплекс I), тонолитрифторацетон (TTFA) (10 мкМ, комплекс II), антимицин (0,1 мкМ, комплекс III) и NaCN (10 мМ, комплекс IV) были использованы для обработки клеток T-47D, а уровни ROS, MMP и ATP сравнивались с клетками, обработанными ATO. Все ингибиторы продемонстрировали способность деполяризовать ММП (Рисунок 5A) и снижать уровень АТФ (Рисунок 5B) аналогично ATO. Однако, в отличие от ATO, ротенон, антимицин и TTFA не смогли снизить производство ROS в клетках, вместо этого увеличив ROS в 3-6 раз после 12 часов обработки (Рисунок 5C). Однако клетки, обработанные NaCN (10 мМ), показали 52%-ное снижение продукции ROS (Рисунок 5C), аналогичное лечению ATO. На основании этих данных мы пришли к выводу, что в клетках рака молочной железы T47D ингибирование комплекса IV ЭТЦ, но не комплексов I-III, приводит к снижению ROS, и поэтому вполне вероятно, что фенотипические изменения, вызванные ATO, обусловлены ингибированием комплекса IV (цитохром С оксидазы) ЭТЦ. Чтобы подтвердить это, активность оксидазы цитохрома С в клетках T-47D была измерена спектрофотометрически. Цитохром С оксидазный анализ ясно показал, что в то время как DCA не влияет на активность комплекса IV, ATO (5 мкМ, 5 мин) может ингибировать активность комплекса IV, подтверждая нашу гипотезу (рис. 5D). Аналогичные результаты были получены после 10 мин, 3 ч и 12 ч обработки препаратами. Комбинация ATO и DCA показала такое же ингибирование фермента, как и ATO.

Рисунок 5 Ингибирование ЭТЦ с помощью ATO. (A — C) Эффекты ряда ингибиторов ETC сравнивались с 5 мкМ ATO (t = 12 часов): (A) ММП путем окрашивания JC-1; (B) уровень АТФ; (C) уровень РОС. (D) Активность оксидазы цитохрома С после обработки (5 мин) DCA (5 мМ) и/или ATO (5 мкМ). ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS — не значимо (обработанные по сравнению с необработанными).


Ингибиторы переходной поры митохондрий частично блокировали активацию каспаз, вызванную ATO, но не влияли на ROS, ATP и MMP
Одним из механизмов, который ранее был описан как ключ к цитотоксичности ATO, является открытие переходной поры митохондрий (MTP). Было показано, что ATO вызывает открытие MTP в изолированных митохондриях и может увеличить высвобождение цитохрома С [11] и вызвать ядерный апоптоз в бесклеточных системах [31]. Было предположено, что открытие ССП под действием ATO вызывает пермеабилизацию митохондрий, диссипацию ММП и увеличение внутриклеточного ROS. Чтобы проверить, имеет ли ССП значение для токсичности ATO в клетках T-47D, бонгкрековую кислоту (BA) и циклоспорин A (CsA), оба мощных блокатора пор ССП [32], объединили с ATO, чтобы выяснить, могут ли они ингибировать внутриклеточные изменения, вызванные ATO. Добавление 5 мкМ CsA или 50 мкМ BA к клеткам, обработанным ATO (5 мкМ), не повлияло на способность ATO снижать продукцию ROS после 12 часов лечения, уменьшать продукцию АТФ или деполяризировать ММП (P > 0,05) (Рисунок 6B, C и 6D). Аналогичные данные наблюдаются при обработке NaCN и CsA/BA (P > 0,05) (Рисунок 6B, C и 6D). Для подтверждения активности CsA и BA в наших экспериментальных условиях, активность каспазы 3/7, маркера апоптоза, расположенного ниже по течению открытия ССП, активируемого высвобождением цитохрома С, оценивали после обработки высокой концентрацией ATO (Рисунок 6A). Обработка ATO (20 мкМ) удвоила активность каспазы 3/7 по сравнению с необработанными клетками (в 2,1 раза, Рисунок 6A), и этот эффект был снижен БА и CsA (в 1,7 раза и 1,4 раза, соответственно), что указывает на то, что CsA или БА могут блокировать открытие MTP в клетках T-47D. Эти данные ясно показывают, что хотя ATO (20 мкМ) может вызывать открытие MTP, этот механизм не может объяснить изменения ROS, MMP и ATP, происходящие при обработке 5 мкМ ATO. Мы пришли к выводу, что эти изменения, скорее всего, связаны с ингибированием комплекса IV ЭТЦ.

Рисунок 6 Влияние блокаторов ССП CsA и BA на клетки, обработанные ATO. (A) CsA и BA могут частично блокировать активацию каспазы 3/7, вызванную 20 мкМ ATO. (B — D) В отличие от этого, CsA и BA не блокировали NaCN или 5 мкМ ATO индуцированное снижение ROS (B), снижение уровня АТФ (C) и деполяризацию ММП (D). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001 (обработанные по сравнению с необработанными). # P ≤ 0,05, ## P ≤ 0,001 (по сравнению только с ATO). NS — не значимо по сравнению с ATO или NaCN.


DCA и ATO оказывают противоположное влияние на экспрессию β-субъединицыАТФ-синтазы и Bcl-2, но при этом совместно снижают уровень белков c-Myc и HIF-1α
Мы исследовали влияние обработки 5 мМ DCA и 5

мкМ

ATO (12 часов) на экспрессию c-Myc и HIF1α, двух основных транскрипционных факторов, которые, как известно, регулируют эффект Варбурга [33] и митохондриальную активность [34], а также на экспрессию митохондриальных белков АТФ-синтазы β субъединицы (АТФβ) и Bcl-2. Иммуноблотинг на c-Myc не показал изменений после лечения DCA, в то время как ATO вызывал ап-регуляцию c-Myc (Рисунок 7A и 7B), однако ATO в комбинации с DCA снижал уровень c-Myc по сравнению с необработанным контролем. Уровень HIF-1α, напротив, снижался после обработки DCA и ATO. Комбинация ATO и DCA показала еще более низкую регуляцию HIF-1α по сравнению с группами контроля и лечения одним агентом (Рисунок 7A и 7C). Bcl-2 является членом семейства белков BH3, который связывается непосредственно с Bad и Bax и предотвращает апоптоз [35]. Иммуноблоттинг ATPβ показал, что лечение DCA повышает уровень ATPβ, в то время как ATO продемонстрировал противоположный эффект, снижая уровень ATPβ (Рисунок 7A и 7D), а комбинированное лечение ATO и DCA показало промежуточный ответ по сравнению с группами, обработанными ATO или DCA. Иммуноблоттинг для про-суицидального белка Bcl-2 показал повышение регуляции после DCA, снижение регуляции при лечении ATO, и промежуточный ответ от комбинации двух препаратов (Рисунок 7A и 7E). Эти результаты также очень похожи на уровни АТФ и продукцию ROS, где DCA и ATO оказывали противоположные эффекты (Рисунок 2C и 3B). Результаты по Bcl-2 и ATPβ напрямую коррелируют со способностью DCA и ATO влиять на производство ROS и уровень ATP.

Рисунок 7 Изменения экспрессии белков после лечения ATO и DCA. (A) Иммуноблоттинг клеток T-47D, обработанных ATO и/или DCA. (B-E) Денсиометрический анализ для c-Myc (B), HIF-1α (C), ATPβ (D), Bcl-2 (E) и β-актина (контроль) проводился на блоттинге лизатов целых клеток, приготовленных из клеток T-47D, обработанных 5 мМ DCA и/или 5 мкМ ATO в течение 12 часов. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS — не значимо (обработанные по сравнению с необработанными). # P ≤ 0,05, ## P ≤ 0,001, ### P ≤ 0,0001 (DCA/ATO vs ATO).



Обсуждение

В течение последнего десятилетия ATO эффективно использовался для лечения как вновь диагностированных, так и рецидивировавших пациентов с APL, причем у пациентов наблюдалась полная ремиссия после лечения низкими дозами ATO [4]. Противораковая способность ATO не ограничивается АПЛ [36] , и многие другие опухоли на животных моделях оказались чувствительными к лечению ATO [37,38]. Однако отсутствие информации о местах действия цитотоксичности ATO в других типах опухолей, кроме APL, ограничивало его применение для лечения других видов рака до последних лет [5].
В данном исследовании мы продемонстрировали, что комплекс IV ЭТЦ является мишенью для ATO. Из группы ингибиторов ЭТЦ снижение уровня РОС, уменьшение выработки АТФ и деполяризация ММП, вызванные обработкой низкой дозой ATO клеток T-47D, были воспроизведены только цианидом, хорошо охарактеризованным ингибитором комплекса IV (рис. 5). Прямое измерение активности оксидазы цитохрома С в целых клетках, обработанных ATO, подтвердило способность ATO ингибировать активность этого фермента напрямую. Известно, что цитохром С оксидазный комплекс ЭТЦ имеет близко расположенные цистеиновые остатки [39], и они, вероятно, вступают в реакцию с ATO.
Большинство раковых клеток имеют повышенный уровень ROS по сравнению с нормальнымиклетками[40] , а ЭТЦ считается основным источником внутриклеточных ROS. Снижение ROS до 60% под действием NaCN или ATO показало, что комплекс IV отвечает за большую часть производства ROS в клетках T-47D. Окислительный стресс, вызванный повышенным производством ROS, был описан как обоюдоострый меч. Было показано, что умеренное увеличение ROS ассоциируется с повышенным пролиферативным потенциалом [41], увеличением антиоксидантных ферментов, таких как глутатионтрансфераза [42], супероксиддисмутаза и каталаза [43] , увеличение просурвитальных белков, таких как Bcl-2 [42] и сурвивин [44]. Однако непереносимое количество ROS в конечном итоге приводит к гибели клеток [45]. Снижение уровня ROS после 12 часов лечения 5 мкМ ATO также напрямую коррелировало со снижением уровня Bcl-2 (Рисунок 7E), что говорит о том, что клетки T-47D находятся в состоянии устойчивости к апоптозу из-за повышенного уровня ROS. Продолжающееся ингибирование комплекса IV ЭТЦ приведет к деполяризации ММП и ингибированию выработки АТФ. Клеточная гибель, которая следует из этой дисрегуляции митохондрий, приведет к повышенному уровню ROS, наблюдаемому через 4 часа или при более высокой концентрации ATO (Рисунок 3C и 3D), как сообщалось другими авторами [46] [46] после обработки ATO. Таким образом, повышенный уровень ROS является следствием, а не причиной гибели клеток, вызванной ATO.
Ранее предложенной митохондриальной мишенью для ATO является ССП. Чжэн и др. продемонстрировали, что ATO вызывает открытие ССП в изолированных митохондриях печени крысы [11], что привело к предположению, что ССП отвечает за высвобождение ROS и деполяризацию ММП, наблюдаемые при лечении мышьяком, и последующий апоптоз [47]. Наше исследование не исключает возможность использования ССП в качестве мишени для ATO. Наши данные показывают, что ингибирование ССП с помощью CsA и BA может частично блокировать активацию каспазы 3/7, вызванную высокой концентрацией ATO, однако блокаторы ССП не смогли подавить деполяризацию ММП и снижение уровня ROS и АТФ, вызванное низкой концентрацией ATO. Таким образом, хотя ATO может открывать MTP, для объяснения действия ATO в низких концентрациях необходимы альтернативные мишени. Было показано, что ингибирование системы тиоредоксина происходит в клетках MCF-7 после обработки 2-5 мкМ ATO и может опосредовать некоторые клеточные эффекты ATO в низких концентрациях [13], однако этот механизм привел бы к увеличению окислительного стресса и не может объяснить снижение ROS, наблюдаемое в текущем исследовании.
DCA, как ингибитор киназы пируватдегидрогеназы, может обратить гликолитический эффект и продемонстрировал значительные противораковые свойства как in vitro, так и in vivo [17-23]. Некоторые исследования показывают увеличение апоптоза при использовании DCA [17,18,20]. Однако наши исследования рака молочной железы и исследования Stockwin et al. показывают, что DCA действует как цитостатический, а не цитотоксический агент на ряд клеточных линий, за исключением очень высоких концентраций [22,48]. Микелакис недавно сообщил, что уровень ДКА в сыворотке крови составляет 0,5 мМ у пациентов с глиобластомой, принимающих 6,25 мг/кг перорально дважды в день [23], таким образом, клинически значимые концентрации, вероятно, находятся в диапазоне 0,5-5 мМ. Было показано, что DCA вызывает небольшое, но значительное увеличение активности каспазы 3/7, даже когда апоптоз не наблюдался, и было выдвинуто предположение, что DCA может сенсибилизировать раковые клетки к цитотоксическим агентам [22]. Текущее исследование подтвердило эту гипотезу, показав, что DCA сенсибилизировал клетки T-47D к лечению ATO, как видно из двойного окрашивания AV+/PI+ (Рисунок 1E и текст). ATO был выбран в качестве препарата для тестирования из-за его антимитохондриальных свойств, так как мы предположили, что, обращая гликолитический фенотип с помощью DCA и направляя больше пирувата на митохондриальное окислительное фосфорилирование, одновременно воздействуя на митохондрии с помощью ATO, мы увидим кооперативный эффект от этой комбинации препаратов. Принцип этой стратегии двойного нацеливания подтверждается результатами двух недавних публикаций, которые показали, что клетки с дефектами митохондрий (например, rho (0) или после лечения немедикаментозными ингибиторами митохондрий, такими как ротенон) демонстрируют более высокую чувствительность к ингибирующему рост действию DCA [48,49]. Хотя эффективность этой двойной стратегии таргетинга еще предстоит продемонстрировать in vivo, усиленный эффект комбинации ATO/DCA наблюдался как в отношении ингибирования роста, так и апоптоза при концентрациях препарата в клинически значимых диапазонах. Некоторые эффекты в нижнем пределе диапазона концентраций были незначительными (например, 15% увеличение апоптотических клеток), однако воздействие in vivo в течение недель, а не часов лечения требует дальнейшего изучения.
Хорошо известно, что DCA может изменять поведение митохондрий, т.е. деполяризовать ММП [18,20]. Однако это явление не получило должного объяснения. Мы наблюдали, что DCA может увеличивать АТФ при деполяризации ММП в клетках T-47D (рис. 2). На основании этих данных мы предположили, что DCA изменяет функцию митохондрий через комплекс V ЭТЦ, АТФ-синтазу. АТФ-синтаза является последней ступенью ЭТЦ и использует ММП, генерируемый ЭТЦ, для производства АТФ. Уровень ATPb снижен при раке легких, мозга, молочной железы и желудка [50] [50], что может объяснить гиперполяризованную митохондриальную мембрану, которую можно обнаружить во многих раковых клетках [51]. Мы предположили, что DCA может повышать активность АТФ-синтазы либо через аллостерическую регуляцию благодаря своей гомологии с пируватом, либо через повышение уровня белка АТФ-синтазы после отмены эффекта Варбурга и снижения уровня HIF-1α. Иммуноблоттинг ясно показал, что АТФβ повышается после обработки ДКА (Рисунок 7D), предполагая, что ДКА может повышать активность АТФ-синтазы, что, в свою очередь, способствует увеличению производства АТФ и истощению ММП.
HIF-1α и c-Myc — два основных онкогенных транскрипционных фактора, которые, как известно, регулируют метаболизм в раковых клетках. HIF-1α может повышать регуляцию ферментов гликолитического пути и дегидрогеназы молочной кислоты, поддерживая эффект Варбурга в раковых клетках [33]. Это не только повышает производство АТФ, но и увеличивает поступление таких предшественников, как глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат для производства нуклеиновых кислот по пентозофосфатному пути [16]c-Myc, с другой стороны, не только играет центральную роль в продвижении перехода клеточного цикла из фазы G1 в фазу S путем регулирования циклинов и их киназ и ингибиторов, но также повышает регуляцию белковых компонентов ЭТЦ, таких как COXI-IV, и способствует увеличению митохондриальной активности [52]. Таким образом, комбинация сверхэкспрессии c-Myc и HIF-1α важна для индуцирования эффекта Варбурга и повышения митохондриальной активности, поддерживая глутамин-TCA-концентратор, который необходим для анаболизма аминокислот и жирных кислот, необходимых для деления клеток [16] [16]. Эта метаболическая сигнатура способствует канцерогенезу и злокачественному фенотипу многих опухолей [33,34]. И ATO, и DCA могут значительно снизить уровень HIF-1α, что свидетельствует о снижении эффекта Варбурга (Рисунок 7C). В то время как DCA не оказывает никакого влияния на уровень c-Myc, ATO, к удивлению, значительно повышает уровень c-Myc (Рисунок 7B). Это может быть положительной обратной связью, когда клетки пытаются увеличить активность ETC после ингибирования комплекса IV. Примечательно, что DCA отменяет эффект ATO на c-Myc, а комбинация ATO/ DCA сильно подавляет экспрессию c-Myc, что коррелирует со способностью этих агентов работать вместе для снижения клеточной пролиферации и индуцирования клеточной смерти (Рисунок 1).
Эффективность ATO против ПМЛ объясняется несколькими особенностями этой злокачественной опухоли — дифференцировкой за счет инактивации PML-RARα, низкой антиоксидантной способностью клеток ПМЛ для защиты от повышенного уровня ROS и накоплением препарата из-за нарушения осморегуляции [5] [5]. В настоящее время проводится множество испытаний по применению ATO при различных солидных злокачественных опухолях, хотя до сих пор опубликовано мало результатов. Имеющиеся результаты показывают, что ATO не очень эффективен как единственный агент у пациентов с прогрессирующим раком поджелудочной железы, печени или меланомой <a href=»#5″> [5]</a></sup>. Исследователи выступают за оценку ATO в комбинации с другими противораковыми препаратами<sup><a href=»#53″> [53,54]</a></sup>, некоторые испытания I фазы уже завершены <sup><a href=»#55″> [55]</a></sup>. По мере углубления понимания механизмов действия ATO, особенно его влияния на метаболизм рака, мы сможем лучше использовать его противораковый потенциал in vivo в новых лекарственных комбинациях</p&gt <h2>Выводы</h2&gt

<p>Два недавних отчета показали, что DCA наиболее эффективен против клеток с дефектами митохондрий <sup><a href=»#48″>[48,49].</a></sup> Данный отчет является первым, демонстрирующим, что воздействие на два аспекта метаболизма — обращение вспять эффекта Варбурга с помощью DCA и ингибирование окислительного фосфорилирования с помощью ATO — явно является эффективной противораковой стратегией in vitro против клеточных линий рака молочной железы. Идентификация оксидазы цитохрома С в качестве митохондриальной мишени для ATO предоставляет новую механистическую информацию для применения ATO для лечения других типов опухолей, кроме APL. Способность DCA увеличивать экспрессию субъединицы b синтазы АТФ, обращая вспять другой широко распространенный метаболический фенотип рака, также предполагает, что DCA может быть применим к широкому спектру типов опухолей. Способность DCA усиливать цитотоксическое действие других химиотерапевтических агентов, кроме ATO, in vitro и in vivo также заслуживает дальнейшего изучения. Отсутствие чувствительности нераковой клеточной линии MCF-10A к клинически значимым концентрациям ATO/DCA также обнадеживает и позволяет предположить, что данная стратегия лечения должна быть дополнительно протестирована против солидных опухолей in vivo.</p>

<h2>Список сокращений</h2&gt <p>APL: острый промиелоидный лейкоз; ATO: триоксид мышьяка; ATPβ: АТФ-синтаза β субъединица; AV: аннексин V; BA: бонгкрековая кислота; CFSE: карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир; CsA: циклоспорин A; DCA: дихлорацетат; ETC: цепь переноса электронов; H2DCFDA: 2′, 7′-дигидрохлорфлуроресцеинацетат; JC-1: 5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′, 3,3′-тетраэтилбензимидазол-карбоцианин йодид; MMP: митохондриальный мембранный потенциал; MTP: митохондриальная переходная пора; NaCN: цианид натрия; PI: пропидий йодид; ROS: Реактивные виды кислорода; TTFA: тонолитрифторацетон.</p&gt <h2>Благодарности</h2&gt <p>Это исследование было поддержано грантом Национального фонда рака молочной железы Австралии (AB) и NHMRC 366787 R.D. Wright Career Development Award (AB). PB поддерживается NHRMC и Австралийским национальным университетом. RS получил поддержку в виде стипендии для аспирантов Австралийского национального университета</p&gt <h2>Авторские данные</h2&gt <p>1 Группа молекулярной генетики, Департамент трансляционных биологических наук, Школа медицинских исследований Джона Куртина, здание 131, Австралийский национальный университет, абонентский ящик 334, Канберра ACT 0200, АВСТРАЛИЯ. 2 Отделение радиационной онкологии, Стэнфордская школа медицины, Стэнфорд, Калифорния, 94305 США.</p&gt <h2>Вклад авторов</h2&gt <p>RS разработал и провел эксперименты, а также подготовил рукопись. PB участвовал в анализе данных и подготовке рукописи. AB участвовал в разработке и анализе данных и подготовил рукопись к публикации. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.</p&gt <h2>Конкурентные интересы</h2&gt <p>Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.<br></p&gt <p>Получено: 3 мая 2011 Принято: 18 ноября 2011<br> Опубликовано: 18 ноября 2011</p&gt <h2>REFERENCES</h2&gt <br><span id=»1″ class=»referencess blue-text»>1</span> Antman KH: Introduction: the history of arsenic trioxide in cancer therapy. Онколог 2001, 6(Suppl 2):1-2. <br><span id=»2″ class=»referencess blue-text»>2</span> Emadi A, Gore SD: Arsenic trioxide — An old drug rediscovered. Blood Rev 2010, 24:191-199. <br><span id=»3″ class=»referencess blue-text»>3</span> Powell BL, Moser B, Stock W, Gallagher RE, Willman CL, Stone RM, Rowe JM, Coutre S, Feusner JH, Gregory J, et al: Arsenic trioxide improves event-free and overall survival for adults with acute promyelocytic leukemia: North American Leukemia Intergroup Study C9710. Blood 2010, 116:3751-3757. <br><span id=»4″ class=»referencess blue-text»>4</span> Wang ZY, Chen Z: Acute promyelocytic leukemia: from highly fatal to highly curable. Blood 2008, 111:2505-2515. <br><span id=»5″ class=»referencess blue-text»>5</span> Dilda PJ, Hogg PJ: Arsenical-based cancer drugs. Cancer Treat Rev 2007, 33:542-564. <br><span id=»6″ class=»referencess blue-text»>6</span> Chen GQ, Zhu J, Shi XG, Ni JH, Zhong HJ, Si GY, Jin XL, Tang W, Li XS, Xong SM, et al: In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 индуцирует апоптоз клеток NB4 с понижением экспрессии Bcl2 и модуляцией белков PML-RAR альфа/PML. 1996, 88:1052-1061. <br><span id=»7″ class=»referencess blue-text»>7</span> Kanzawa T, Kondo Y, Ito H, Kondo S, Germano I: Индукция аутофагической клеточной смерти в злокачественных клетках глиомы триоксидом мышьяка. Cancer Res 2003, 63:2103-2108. <br><span id=»8″ class=»referencess blue-text»>8</span> Nakagawa Y, Akao Y, Morikawa H, Hirata I, Katsu K, Naoe T, Ohishi N, Yagi K: Arsenic trioxide-induced apoptosis through oxidative stress in cells of colon cancer cell lines. Life Sciences 2002, 70:2253-2269. <br><span id=»9″ class=»referencess blue-text»>9</span> Ralph SJ: Arsenic-based antineoplastic drugs and their mechanisms of action. Met Based Drugs 2008, 2008:260146. <br><span id=»10″ class=»referencess blue-text»>10</span> Cai X, Shen YL, Zhu Q, Jia PM, Yu Y, Zhou L, Huang Y, Zhang JW, Xiong SM, Chen SJ, et al: Arsenic trioxide-induced apoptosis and differentiation are associated respectively with mitochondrial transmembrane potential collapse and retinoic acid signaling pathways in acute promyelocytic leukemia. Leukemia 2000, 14:262-270. <br><span id=»11″ class=»referencess blue-text»>11</span> Zheng Y, Shi Y, Tian C, Jiang C, Jin H, Chen J, Almasan A, Tang H, Chen Q: Essential role of the voltage-dependent anion channel (VDAC) in mitochondrial permeability transition pore opening and cytochrome c release induced by arsenic trioxide. Oncogene 2004, 23:1239-1247. <br><span id=»12″ class=»referencess blue-text»>12</span> Tian X, Ma X, Qiao D, Ma A, Yan F, Huang X: mCICR необходим для As2O3- индуцированного открытия поры перехода проницаемости и высвобождения цитохрома c из митохондрий. Mol Cell Biochem 2005, 277:33-42. <br><span id=»13″ class=»referencess blue-text»>13</span> Lu J, Chew EH, Holmgren A: Targeting thioredoxin reductase is a basis for cancer therapy by arsenic trioxide. Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104:12288-12293. <br><span id=»14″ class=»referencess blue-text»>14</span> Kim JW, Dang CV: Молекулярная сладость рака и эффект Варбурга. Cancer Res 2006, 66:8927-8930. <br><span id=»15″ class=»referencess blue-text»>15</span> Warburg O, Wind F, Negelein E: Ueber den Stoffwechsel von Tumoren im körper. Klinische Wochenschrift 1926, 5:829-832. <br><span id=»16″ class=»referencess blue-text»>16</span> DeBerardinis RJ, Mancuso A, Daikhin E, Nissim I, Yudkoff M, Wehrli S, Thompson CB: Beyond aerobic glycolysis: Трансформированные клетки могут участвовать в метаболизме глутамина, превышающем потребности синтеза белков и нуклеотидов. Proc Natl Acad Sci 2007, 104:19345-19350. <br><span id=»17″ class=»referencess blue-text»>17</span> Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I: Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия. Gynecol Oncol 2008, 109:394-402. <br><span id=»18″ class=»referencess blue-text»>18</span> Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, Porvasnik S, Urbanek C, Rosser CJ: Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate 2008, 68:1223-1231. <br><span id=»19″ class=»referencess blue-text»>19</span> Papandreou I, Goliasova T, Denko NC: Противораковые препараты, направленные на метаболизм: является ли дихлорацетат новой парадигмой? Int J Cancer 2011, 128:1001-1008. <br><span id=»20″ class=»referencess blue-text»>20</span> Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, et al: A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 2007, 11:37-51. <br><span id=»21″ class=»referencess blue-text»>21</span> Chen Y, Cairns R, Papandreou I, Koong A, Denko NC: Потребление кислорода может регулировать рост опухолей, новый взгляд на эффект Варбурга. PLoS One 2009, 4:e7033. <br><span id=»22″ class=»referencess blue-text»>22</span> Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC: Reversal of the glycolytic phenotype by dichloroacetate inhibits metastatic breast cancer cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat 2010, 120:253-260. <br><span id=»23″ class=»referencess blue-text»>23</span> Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, et al: Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med 2010, 2:31ra34. <br><span id=»24″ class=»referencess blue-text»>24</span> Chrzanowska-Lightowlers ZMA, Turnbull DM, Lightowlers RN: Анализ цитохром с оксидазы в пермеабилизированных цельных клетках в микротитровальных планшетах. Аналитическая биохимия 1993, 214:45-49. <br><span id=»25″ class=»referencess blue-text»>25</span> Theodoratos A, Tu WJ, Cappello J, Blackburn AC, Matthaei K, Board PG: Phenylalanine-induced leucopenia in genetic and dichloroacetic acid generated deficiency of glutathione transferase Zeta. Biochem Pharmacol 2009, 77:1358-1363. <br><span id=»26″ class=»referencess blue-text»>26</span> Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, Li XS, Xiong SM, Qiu QY, Zhu J, Tang W, Sun GL, Yang KQ, et al: Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): II. Клиническая эффективность и фармакокинетика у пациентов с рецидивом. Кровь 1997, 89:3354-3360. <br><span id=»27″ class=»referencess blue-text»>27</span> Maeda H, Hori S, Nishitoh H, Ichijo H, Ogawa O, Kakehi Y, Kakizuka A: Tumor Growth Inhibition by Arsenic Trioxide (As2O3) in the Orthotopic Metastasis Model of Androgen-independent Prostate Cancer. Cancer Res 2001, , 61: 5432-5440. <br><span id=»28″ class=»referencess blue-text»>28</span> Samikkannu T, Chen CH, Yih LH, Wang AS, Lin SY, Chen TC, Jan KY: Reactive oxygen species are involved in arsenic trioxide inhibition of pyruvate dehydrogenase activity. Chem Res Toxicol 2003, 16:409-414. <br><span id=»29″ class=»referencess blue-text»>29</span> Campbell MK, Farrell SO: Биохимия. 4 edition. Thomson learning, Inc; 2003. <br><span id=»30″ class=»referencess blue-text»>30</span> Liu Y, Fiskum G, Schubert D: Генерация реактивных видов кислорода митохондриальной электронно-транспортной цепью. J Neurochem 2002, 80:780-787. <br><span id=»31″ class=»referencess blue-text»>31</span> Larochette N, Decaudin D, Jacotot E, Brenner C, Marzo I, Susin SA, Zamzami N, Xie Z, Reed J, Kroemer G: Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore. Exp Cell Res 1999, 249:413-421. <br><span id=»32″ class=»referencess blue-text»>32</span> Marzo I, Brenner C, Zamzami N, Jurgensmeier JM, Susin SA, Vieira HL, Prevost MC, Xie Z, Matsuyama S, Reed JC, Kroemer G: Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis. Science 1998, 281:2027-2031. <br><span id=»33″ class=»referencess blue-text»>33</span> Semenza GL: Regulation of cancer cell metabolism by hypoxia-inducible factor 1. Semin Cancer Biol 2009, 19:12-16. <br><span id=»34″ class=»referencess blue-text»>34</span> Dang CV, O’Donnell KA, Zeller KI, Nguyen T, Osthus RC, Li F: The c-Myc target gene network. Seminars in Cancer Biology 2006, 16:253-264. Sun et al. Molecular Cancer 2011, 10:142 http://www.molecular-cancer.com/content/10/1/142 Страница 14 из 15 <br><span id=»35″ class=»referencess blue-text»>35</span> Yang J, Liu X, Bhalla K, Kim CN, Ibrado AM, Cai J, Peng TI, Jones DP, Wang X: Предотвращение апоптоза с помощью Bcl-2: блокируется высвобождение цитохрома c из митохондрий. Science 1997, 275:1129-1132. <br><span id=»36″ class=»referencess blue-text»>36</span> Carney DA: Arsenic trioxide mechanisms of action-looking beyond acute promyelocytic leukemia. Leuk Lymphoma 2008, 49:1846-1851. <br><span id=»37″ class=»referencess blue-text»>37</span> Kito M, Matsumoto K, Wada N, Sera K, Futatsugawa S, Naoe T, Nozawa Y, Akao Y: Antitumor effect of arsenic trioxide in murine xenograft model. Cancer Sci 2003, 94:1010-1014. <br><span id=»38″ class=»referencess blue-text»>38</span> Xu HY, Yang YL, Liu SM, Bi L, Chen SX: Effect of arsenic trioxide on human hepatocarcinoma in nude mice. World J Gastroenterol 2004, 10:3677-3679. <br><span id=»39″ class=»referencess blue-text»>39</span> Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, Tomizaki T, Yamaguchi H, ShinzawaItoh K, Nakashima R, Yaono R, Yoshikawa S: The whole structure of the 13- subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science 1996, 272:1136-1144. <br><span id=»40″ class=»referencess blue-text»>40</span> Pelicano H, Carney D, Huang P: ROS stress in cancer cells and therapeutic implications. Drug Resist Updat 2004, 7:97-110. <br><span id=»41″ class=»referencess blue-text»>41</span> Kamata H, Hirata H: Redox regulation of cellular signalling. Cellular Signalling 1999, 11:1-14. <br><span id=»42″ class=»referencess blue-text»>42</span> Hayes JD, McLellan LI: Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic Res 1999, 31:273-300. <br><span id=»43″ class=»referencess blue-text»>43</span> Nordberg J, Arner ESJ: Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radical Biology and Medicine 2001, 31:1287-1312. <br><span id=»44″ class=»referencess blue-text»>44</span> Yao LL, Wang YG, Cai WJ, Yao T, Zhu YC: Survivin опосредует антиапоптотический эффект стимуляции δ-опиоидных рецепторов в кардиомиоцитах. Journal of Cell Science 2007, 120:895-907. <br><span id=»45″ class=»referencess blue-text»>45</span> Martindale JL, Holbrook NJ: Клеточный ответ на окислительный стресс: Сигнализация для самоубийства и выживания. J Cell Physiol 2002, 192:1-15. <br><span id=»46″ class=»referencess blue-text»>46</span> Perkins C, Kim CN, Fang G, Bhalla KN: Arsenic induces apoptosis of multidrug-resistant human myeloid leukemia cells that express Bcr-Abl or overexpress MDR, MRP, Bcl-2, or Bcl-x(L). Blood 2000, 95:1014-1022. <br><span id=»47″ class=»referencess blue-text»>47</span> Ma XD, Qiao DF, Tian XM, Yan F, Ma AD: Механизм открытия митохондриальной поры перехода проницаемости, индуцированного триоксидом мышьяка. Ai Zheng 2006, 25:17-21. <br><span id=»48″ class=»referencess blue-text»>48</span> Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL: Дихлорацетат натрия (DCA) избирательно нацелен на клетки с дефектами митохондриального ЭТЦ. Int J Cancer 2010. <br><span id=»49″ class=»referencess blue-text»>49</span> Sanchez-Arago M, Chamorro M, Cuezva JM: Отбор раковых клеток с подавленными митохондриями запускает прогрессирование рака толстой кишки. Carcinogenesis 2010, 31:567-576. <br><span id=»50″ class=»referencess blue-text»>50</span> Isidoro A, Martinez M, Fernandez PL, Ortega AD, Santamaria G, Chamorro M, Reed JC, Cuezva JM: Alteration of the bioenergetic phenotype of mitochondria is a hallmark of breast, gastric, lung and oesophageal cancer. Биохимический журнал 2004, 378:17-20. <br><span id=»51″ class=»referencess blue-text»>51</span> Susin SA, Zamzami N, Kroemer G: Mitochondria as regulators of apoptosis: Сомнений больше нет. Biochimica et Biophysica Acta — Bioenergetics 1998, 1366:151-165. <br><span id=»52″ class=»referencess blue-text»>52</span> Shim H, Dolde C, Lewis BC, Wu CS, Dang G, Jungmann RA, Dalla-Favera R, Dang CV: c-Myc transactivation of LDH-A: Implications for tumor metabolism and growth. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:6658-6663. <br><span id=»53″ class=»referencess blue-text»>53</span> Kim KB, Bedikian AY, Camacho LH, Papadopoulos NE, McCullough C: A phase II trial of arsenic trioxide in patients with metastatic melanoma. Cancer 2005, 104:1687-1692. <br><span id=»54″ class=»referencess blue-text»>54</span> Subbarayan PR, Lima M, Ardalan B: Arsenic trioxide/ascorbic acid therapy in patients with refractory metastatic colorectal carcinoma: a clinical experience. Acta Oncol 2007, 46:557-561. <br><span id=»55″ class=»referencess blue-text»>55</span> Ardalan B, Subbarayan PR, Ramos Y, Gonzalez M, Fernandez A, Mezentsev D, Reis I, Duncan R, Podolsky L, Lee K, et al: A phase I study of 5-fluorouracil/leucovorin and arsenic trioxide for patients with refractory/relapsed colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 2010, 16:3019-3027. <p></p&gt <p>Сопутствующий контент:</p&gt <figure class=»wp-block-embed is-type-wp-embed is-provider-dca-guide wp-block-embed-dca-guide»><div class=»wp-block-embed__wrapper»> </div></figure&gt <figure class=»wp-block-embed is-type-wp-embed is-provider-dca-guide wp-block-embed-dca-guide»><div class=»wp-block-embed__wrapper»> </div></figure&gt

Добавить комментарий