E. D. Michelakis^{,1 *} G. Sutendra^,1 P. Dromparis^,1 L. Webster^,1 A. Haromy^,1 E. Niven,2 C. Maguire^,2 T.-L. Gammer^,1 J. R. Mackey^,3 D. Fulton^,3 B. Abdulkarim^,3 M. S. McMurtry^,1 K. C. ^Petruk4

^{1Медицинский факультет}, Университет Альберты, Эдмонтон, Альберта, Канада T6G 2B7.
^{2Департамент}биомедицинской инженерии и диагностической визуализации, Университет Альберты, Эдмонтон, Альберта, Канада T6G 2B7.
^{3Департамент}онкологии, Университет Альберты, Эдмонтон, Альберта, Канада T6G 2B7.
^{4Кафедра}нейрохирургии, Университет Альберты, Эдмонтон, Альберта, Канада T6G 2B7.
*Кому следует адресовать корреспонденцию. E-mail: [email protected]

Том 2 Выпуск 31 31ra34

Подано: 11 ноября 2009
Принято: 23 апреля 2010
Опубликовано: 12 мая 2010 г

Солидные опухоли, включая агрессивный первичный рак мозга глиобластома мультиформ, развивают устойчивость к гибели клеток, отчасти в результате перехода от митохондриального окислительного фосфорилирования к цитоплазматическому гликолизу. Эта метаболическая перестройка сопровождается гиперполяризацией митохондрий. Мы проверили, может ли малая молекула и сиротский препарат дихлорацетат (ДХА) обратить вспять это специфическое для рака метаболическое и митохондриальное ремоделирование в глиобластоме. Свежевыделенные глиобластомы 49 пациентов показали митохондриальную гиперполяризацию, которая была быстро обращена вспять DCA. В отдельном эксперименте с пятью пациентами, страдавшими глиобластомой, мы проспективно зафиксировали исходную и серийную опухолевую ткань, создали специфические для пациента клеточные линии глиобластомы и предполагаемых стволовых клеток глиобластомы (^CD133+, ^nestin+ клетки) и лечили каждого пациента пероральным приемом DCA в течение 15 месяцев. DCA деполяризовал митохондрии, увеличил митохондриальные реактивные формы кислорода и вызвал апоптоз в клетках GBM, а также в предполагаемых стволовых клетках GBM, как in vitro, так и in vivo. Терапия DCA также ингибировала гипоксия-индуцибельный фактор-1α, способствовала активации p53 и подавляла ангиогенез как in vivo, так и in vitro. Ограничивающей дозу токсичностью была дозозависимая, обратимая периферическая нейропатия, а гематологическая, печеночная, почечная или сердечная токсичность отсутствовала. Показатели клинической эффективности присутствовали при дозе, которая не вызывала периферической невропатии, и при сывороточных концентрациях DCA, достаточных для ингибирования целевого фермента DCA, киназы II пируватдегидрогеназы, которая была высоко экспрессирована во всех глиобластомах. Метаболическая модуляция может быть жизнеспособным терапевтическим подходом в лечении глиобластомы.

---

ВВЕДЕНИЕ

Глиобластома мультиформная (ГБМ) — агрессивная первичная опухоль головного мозга, которая крайне плохо реагирует на утвержденные методы лечения ⁽¹⁾. Химиотерапия темозоломидом (TMZ) плюс лучевая терапия (ЛТ), назначаемая после деструктивной операции, увеличивает среднюю выживаемость с 12,1 месяца при использовании только ЛТ до 14,6 месяца ⁽¹⁾. Медиана времени до прогрессирования опухоли после РТ и ТМЗ составляет всего 6,9 месяца ⁽¹⁾. При рецидивирующих глиомах выживаемость без прогрессирования и ответ на ТМЗ намного хуже ⁽²⁾. ГБМ — очень сосудистые опухоли с замечательной молекулярной и генетической гетерогенностью ⁽¹⁾. Идеальная терапия должна увеличивать апоптоз ГБМ, преодолевать молекулярную гетерогенность, подавлять ангиогенез и преодолевать гематоэнцефалический барьер, обладая при этом минимальной системной токсичностью. На основании наших недавних результатов, полученных на животных моделях ^{(3, 4)}, мы предположили, что сиротская малая молекула дихлорацетат (DCA) отвечает этим критериям и может быть эффективна в лечении ГБМ у людей.
DCA ингибирует митохондриальный фермент киназу пируватдегидрогеназы (PDK) ⁽⁵⁾. Ингибируя PDK, DCA активирует пируватдегидрогеназу (PDH), фермент-привратник, который регулирует поток углеводов (пирувата) в митохондрии, увеличивая соотношение окисления глюкозы и гликолиза ^(3-5). Если пируват остается в цитоплазме, он может завершить гликолиз с образованием молочной кислоты и выработкой 2 моль АТФ на молекулу глюкозы. В качестве альтернативы пируват может вступить в несколько анаплеротических и аминокислотных биосинтетических путей. Однако при активации PDH пируват может декарбоксилироваться до ацетил-коэнзима А, входить в цикл Кребса и завершать окисление глюкозы в митохондриальном матриксе, производя до 36 молей АТФ на молекулу глюкозы в присутствии кислорода. Окисление глюкозы не происходит, когда пируват не поступает в митохондрии (например, в больных митохондриях или при ингибировании PDH) или в отсутствие кислорода.
Варбург ⁽⁶⁾ впервые показал, что метаболизм раковых клеток даже в условиях нормоксии характеризуется увеличением соотношения цитоплазматического гликолиза и митохондриального окисления глюкозы. Хотя механизм этого «эффекта Варбурга» неизвестен и этиологическая связь его с канцерогенезом остается недоказанной ⁽⁷⁾, растет интерес к метаболизму как мишени для терапии рака ^(8-11). Энергетический переход от митохондриального окисления глюкозы к цитоплазматическому гликолизу может дать пролиферативное преимущество раковым клеткам ⁽¹¹⁾. Например, большинство гликолитических ферментов также обладают прямым антиапоптотическим действием ⁽¹²⁾; молочная кислота способствует ангиогенезу и разрушению интерстициального матрикса, способствуя метастазированию ⁽¹¹⁾; снижение функции митохондрий связано с ингибированием митохондриально-зависимого апоптоза ⁽³⁾. ГБМ имеет сильный гликолитический фенотип, и известно, что ряд молекулярных аномалий, встречающихся в ГБМ, подавляет митохондриальное окисление глюкозы и способствует цитоплазматическому гликолизу ⁽¹⁾, включая активацию фосфатидилинозитол-3-киназы-AKT или myc-пути или подавление p53-пути ^{(9, 10)}.
Митохондрии раковых клеток гиперполяризованы по сравнению с митохондриями нераковых клеток ^{(3, 13)}, что связано с подавлением функции митохондрий. Хотя это спорно [обзор в ⁽¹⁴⁾], отток проапоптотических медиаторов через митохондриальную переходную пору (MTP) частично зависит от мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm), и поэтому гиперполяризация митохондрий может обозначать состояние устойчивости к апоптозу ^{(3, 15)}. Мы показали, что это состояние можно изменить в раковых клетках с помощью DCA, который, ингибируя PDK, способствует поступлению пирувата в митохондрии, обращая вспять увеличение соотношения гликолиза и окисления глюкозы, улучшая функцию митохондрий и обращая вспять гиперполяризацию митохондрий ⁽³⁾. Поэтому DCA уменьшает рост опухоли in vitro и in vivo, не влияя на митохондрии и ткани нераковых опухолей ^{(3, 16-20)}. Увеличение митохондриального дыхания связано с увеличением продукции митохондриальных реактивных форм кислорода (mROS), преимущественно супероксида. Супероксид может быть расщеплен до _H2O2, относительно стабильного mROS, который может достигать других клеточных структур за пределами митохондрий. Например, _H2O2 может активировать редокс-чувствительные вольтаж-зависимые калиевые каналы в плазматической мембране и, по крайней мере в некоторых тканях, способствовать снижению внутриклеточного кальция ^{(3, 4)}. К другим редокс-чувствительным мишеням можно отнести р53, который активируется при окислении ^{(21, 22)}. В ГБМ ось р53 ингибирована, что способствует повышению пролиферативного состояния клеток ГБМ ⁽¹⁾. р53 также подавляет стимулированную гипоксией транскрипцию фактора-1α (HIF-1α), поскольку р53 и HIF-1α конкурируют за один и тот же фактор котранскрипции ^{(23, 24)}. HIF-1α увеличивает экспрессию транспортеров глюкозы и нескольких гликолитических ферментов, а также PDK, поддерживая тем самым гликолитический фенотип ^{(25, 26)}. Кроме того, HIF-1α увеличивает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), усиливая ангиогенез. Ангиогенез также может усиливаться при нормоксической активации HIF-1α. Поскольку митохондрии являются важными датчиками кислорода ⁽²⁷⁾, ингибированные митохондрии могут передавать псевдогипоксические редокс-сигналы и активировать HIF-1α даже при нормоксии ^(28-30). Кроме того, снижение уровня α-кетоглутарата, прямого продукта цикла Кребса, также может способствовать активации HIF, поскольку он является кофактором для реакции пролилгидроксилирования, которая разрушает HIF-1α ⁽³⁰⁾.
Мы предположили, что перорально введенный DCA, который преодолевает гематоэнцефалический барьер, уменьшит рост ГБМ in vivo. Далее мы предположили, что это может произойти за счет (i) изменения гликолитического фенотипа и нормализации ΔΨm, что будет способствовать митохондрий-зависимому апоптозу; (ii) увеличения mROS и активации p53; и (iii) увеличения концентрации α-кетоглутарата. Последние два эффекта приведут к ингибированию HIF-1α, снижению VEGF и ингибированию ангиогенеза.

Результаты

Влияние ДКА на митохондрии из 49 свежевыделенных опухолей ГБМ
Чтобы определить, может ли ГБМ человека быть мишенью для метаболической терапии с помощью ДКА, мы исследовали 49 свежевыделенных последовательных первичных ГБМ (60% мужчин, 48 ± 11 лет). В дополнение к клиническим и невропатологическим данным мы подтвердили идентичность ГБМ с помощью иммуногистохимии, которая показала экспрессию глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), но без bIII-тубулина или маркеров олигодендроцитов (рис. S1). ΔΨm был повышен в свежевыделенных ГБМ по сравнению с неопухолевыми тканями мозга, полученными при операции по поводу эпилепсии (n = 3) (рис. 1A). DCA, но не транспортное средство (обычный физраствор), вызывал деполяризацию митохондрий в ГБМ, но не в нормальной ткани мозга. DCA также увеличивал mROS ГБМ (рис. 1А). Это позволило предположить, что метаболическое и митохондриальное ремоделирование в ГБМ является частично обратимым и что это ремоделирование, по крайней мере, частично регулируется PDK. Реакция на ДКА согласуется с более высокой концентрацией PDKII [наиболее повсеместно экспрессируемой изоформы и изоформы с самым низким _Ki для ДКА ⁽³¹⁾] в ГБМ, чем в неопухолевой ткани мозга, как видно из иммуногистохимии и иммуноблотов (рис. 1, B и C). Клетки, в которых наблюдалась самая высокая концентрация PDKII, также содержали ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), что свидетельствует о пролиферации этих клеток (рис. 1B). Эти данные, собранные за двухлетний период, укрепили обоснование для последующего назначения DCA пациентам с ГБМ ⁽⁴⁾.

Клинические эффекты DCA у пяти пациентов с ГБМ
Затем мы провели лечение DCA пяти последовательных пациентов с первичной ГБМ, направленных из нашей программы по лечению рака мозга, у которых была доступна ткань после последней операции по удалению опухоли. У трех пациентов (пациенты 1-3) был рецидивирующий ГБМ с прогрессированием заболевания после нескольких химиотерапий (в дополнение к стандартному лечению с помощью операции, РТ и ТМЗ), и они считались подходящими для паллиативной терапии. Еще двум пациентам (пациенты 4 и 5) диагноз был поставлен недавно, и после первоначальной операции по удалению опухоли в дополнение к стандартному лечению РТ и ТМЗ был назначен DCA. У пациента 4 предварительная 3-месячная терапия DCA сопровождалась добавлением RT и TMZ, в то время как у пациента 5 DCA была начата одновременно с RT и TMZ после операции по удалению опухоли. Если пациентам требовалась повторная операция или аутопсия, ткани, полученные в ходе последней операции по удалению опухоли (до введения ДКА), сравнивались с тканями, полученными после лечения ДКА. Их клиническая информация обобщена в таблице S1. DCA назначается пациентам уже более 30 лет, в основном для лечения врожденных ошибок митохондриального метаболизма, и имеются фармакокинетические и фармакодинамические данные ^{(5, 32-34)}. Мы лечили пациентов в начальной дозе 12,5 мг/кг перорально дважды в день в течение 1 месяца, после чего доза была увеличена до 25 мг/кг перорально дважды в день. Затем мы следовали протоколу деэскалации дозы, снижая дозу на 50% при появлении токсичности, ограничивающей дозу. Клиническое наблюдение за пациентами продолжалось до 15 месяцев. Ни у одного из пациентов не было гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности (таблица S1). Периферическая нейропатия была единственной явной токсичностью. У пациентов наблюдалась различная дозозависимая степень периферической нейропатии, которая была обратимой, что подтверждает результаты предыдущих исследований ^(35-37). Когда доза была снижена до 6,25 мг/кг перорально два раза в день, ни у одного из пациентов не было клинически значимой периферической невропатии (таблица S1). Первоначально период полураспада ДКА составляет <1 часа. ДКА ингибирует собственный метаболизм, и концентрация в сыворотке крови повышается, в конечном итоге достигая плато ⁽³⁴⁾. У наших пациентов концентрация DCA в плазме крови оставалась необнаружимой в течение первых 2-3 месяцев, но затем достигла терапевтических концентраций. При дозе 6,25 мг/кг перорально дважды в день в течение не менее 3 месяцев концентрация ДКА в плазме составляла 0,44 ± 0,16 мМ (среднее ± SD; n = 4) (таблица S1). Эти значения аналогичны тем, которые наблюдаются при хроническом лечении ДКА взрослых с митохондриальными дефектами ⁽³⁴⁾, и находятся в том же диапазоне, что и _Ki ДКА для PDKII (0,2 мМ) ⁽³¹⁾. У пациентов 1, 4 и 5 наблюдались некоторые признаки рентгенологической регрессии на магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 2А и рис. S2-S4). Пациент 3 имел очень большую опухоль с отеком мозга на исходном уровне (рис. S5), несмотря на высокие дозы стероидов, и низкую оценку по шкале Карнофски, и его состояние продолжало ухудшаться. Он умер от осложнений отека мозга через 3 месяца после начала терапии DCA. Пациенту 2 потребовалось дренирование кисты и дебулькация на 11-м месяце терапии ДКА. У пациента 4 на 3-м месяце терапии ДКА выявлено рентгенологическое прогрессирование, после чего была проведена дальнейшая дебулькация, и в дополнение к ДКА была проведена РТ плюс TMZ. Все пациенты, за исключением пациента 3, были клинически стабильны на 15-м месяце терапии DCA и живы на 18-м месяце (наблюдение по телефону). Дальнейшие клинические подробности описаны в Дополнительном материале.

Влияние ДКА на опухоли GBM in vivo, первичные клеточные линии GBM и предполагаемые GBM-SC, полученные от пациентов, получавших ДКА
Мы провели эксперименты на тканях, полученных от этих пяти пациентов, и смогли провести сравнение тканей до и после лечения ДКА у пациентов 2-4; у пациентов 1 и 5 у нас были только ткани «до». По сравнению с тканями до лечения ДКА, ткани ГБМ после лечения ДКА у всех трех пациентов показали уменьшение количества клеток на единицу объема, снижение пролиферации и увеличение апоптоза (рис. 2В), а также увеличение тканевой ферментативной активности PDH, что свидетельствует об эффективном ингибировании PDK in vivo (рис. 2С). Предполагаемые стволовые клетки рака ГБМ (GBM-SCs) могут быть ответственны за устойчивость и рецидивы ГБМ после лечения ^(38-43). Эти клетки характеризуются как ^CD133+ / ^nestin+ GBM-SC и образуют ниши вокруг капилляров ⁽⁴¹⁾. В таких сосудистых узлах GBM-SC могут индуцировать ангиогенез, в то время как их молекулярный фенотип стволовых клеток поддерживается благодаря их доступности к циркулирующим факторам роста ⁽⁴⁴⁾. Пролиферация GBM-SC ассоциируется с особенно плохим клиническим исходом ⁽⁴²⁾. ^{CD133+ /nestin+} GBM-SC экспрессировали PCNA in vivo во всех опухолях до ДКА, что указывает на их деление, но процент ^{CD133+ /nestin+} клеток, экспрессирующих PCNA, значительно снизился после терапии ДКА у пациентов 2-4 (рис. 3А). Одновременное окрашивание антителом CD133 и тетраметил родамин метиловым эфиром (TMRM) показало, что ^CD133+ клетки имели самый высокий ΔΨm по сравнению с соседними не-GBM-SC in vivo (рис. S6). В первичных клеточных линиях, полученных из опухоли, ~10% клеток экспрессировали и CD133, и нестин, в то время как >90% клеток экспрессировали зрелый маркер GFAP (но не bIII-тубулин или олигодендроциты) (рис. S7), что сходно с гистопатологией ГБМ (рис. S1). Мы выделили предполагаемые GBM-SC из опухолей GBM и культивировали их с соответствующими факторами роста (человеческий фактор роста фибробластов, 20 нг/мл; человеческий эпидермальный фактор роста, 20 нг/мл). Эти клетки имели очень высокую экспрессию CD133 и нестина, очень низкую экспрессию зрелых глиальных маркеров (рис. S7) и формировали характерные нейросферы (рис. 4 и рис. S7), что является независимым предиктором плохого клинического исхода ⁽⁴³⁾. Мы измерили DYm в свежевырезанных опухолях, в первичных клеточных линиях и в GBM-SC, выделенных из этих опухолей, а также в дифференцированных клетках, полученных из GBM-SC (рис. 3B). Самый высокий потенциал был обнаружен в предполагаемой ГБМ-СК. Как первичные, так и полученные из GBM-SC вторичные клетки GBM (15-дневная дифференцировка) имели митохондриальные потенциалы, сходные с потенциалами родительских опухолей. DCA (0,5 мМ в течение 24 часов) снижал потенциал во всех группах клеток. Хотя причина повышения ΔΨm при раке ^{(3, 13)} еще не до конца определена, было предложено, что оно частично вызвано транслокацией гексокиназы II (HXKII), ключевого гликолитического фермента, из цитоплазмы во внешнюю мембрану митохондрий ^{(45, 46)}. Там HXKII может связываться с вольтаж-зависимым анионным каналом (компонентом ССП) и ингибировать его, увеличивая ΔΨm и апоптотический порог. Ингибирование этой транслокации снижает ΔΨm рака и обращает вспять устойчивость к апоптозу ^{(45, 46)}. Наши первичные клеточные линии, полученные из опухолей до ДКА, показали устойчивую митохондриальную транслокацию HXKII, что потенциально объясняет увеличение ΔΨm. Транслокация HXKII отсутствовала в первичных клеточных линиях из опухолей после лечения ДКА (рис. S8), что согласуется с предположением о том, что ДКА индуцировал подавление гликолиза и снижение ΔΨm. Как и в опухолях, PDKII присутствовал в высоких концентрациях в клеточных линиях ГБМ, полученных от пациентов 2-4, хотя другие известные изоферменты также экспрессировались (рис. S9A). Когда ГБМ-СК позволили дифференцироваться во вторичные клеточные линии ГБМ, доля клеток с маркерами ГБМ-СК снизилась до значения, аналогичного первичной клеточной линии (~10%). Однако, когда им позволяли дифференцироваться в присутствии DCA (0,5 мМ), доля клеток с маркерами GBM-SC снижалась еще больше — до ~5% (рис. S7). Действительно, DCA индуцировал апоптоз в GBM-SC in vitro (рис. 4 и рис. S9B), а также в первичных клеточных линиях GBM (рис. S9C). Апоптоз еще больше усиливался в GBM-SCs при комбинации DCA плюс TMZ (рис. 4 и рис. S9B), что дает основание для комбинированной терапии. Апоптоз ГБМ-СК также происходил in vivo в опухолях после лечения ДКА, о чем свидетельствует колокализация нестина, CD133 и окрашивание терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, опосредованное дезоксиуридиновой трифосфатной меткой (TUNEL) (рис. 4 и рис. S9D).

Влияние ДКА на микрососуды ГБМ-СК и ангиогенез in vivo и in vitro
В необработанных тканях до обработки ДКА были обнаружены ниши ГБМ-СК вокруг микрососудов [окрашивание фактором фон Виллебранда (vWF)], как сообщалось ⁽⁴¹⁾. Эта единица микрососудов ГБМ-СК ⁽⁴⁴⁾ была разрушена при лечении ДКА, поскольку, помимо ГБМ-СК, апоптоз также усилился в эндотелиальных клетках микрососудов (рис. 4 и рис. S9D), что указывает на потенциальное ингибирование ангиогенеза. Действительно, снижение окрашивания vWF в опухолях после лечения ДКА свидетельствовало о снижении сосудистости (рис. 5A). HIF-1α был высоко экспрессирован или активирован (ядерная локализация) в опухолевых тканях до ДКА и подавлен в опухолях после ДКА (рис. 5В). Опухоли пациентов 2-4 после лечения ДКА показали значительное увеличение mROS in vivo (супероксид, измеренный по mitoSOX) по сравнению с опухолями тех же пациентов до ДКА (рис. 5C). В опухолях до ДКА острый ДКА увеличил mROS до значений, наблюдаемых в опухолях после лечения ДКА. Напротив, в опухолях после ДКА острый ДКА лишь минимально увеличивал mROS, что свидетельствует о почти максимальном эффекте in vivo. ДКА увеличивал mROS и в GBM-SC (рис. 5C). Низкая концентрация ROS в стволовых клетках рака может отражать устойчивость к апоптозу, а терапия, повышающая ROS стволовых клеток рака, считается более эффективной ⁽⁴⁷⁾. Хотя мы изучали mROS (митохондриальный супероксид), существуют разногласия по поводу того, связана ли активация HIF-1α в раке с общим увеличением или уменьшением ROS [рассмотрено в ⁽²⁸⁾]. Используя другую методику, мы также измерили H2O2 в целых клетках. DCA увеличил _H2O2 в клетках GBM дозозависимым образом (рис. 6). Кроме того, DCA также увеличивал внутриклеточную концентрацию α-кетоглутарата в дозозависимой манере (рис. 6). Это совместимо с увеличением окисления глюкозы, которое следует за активацией PDH ⁽³⁾ , поскольку α-кетоглутарат является продуктом цикла Кребса. Цикл Кребса производит доноры электронов, которые поступают в электронно-транспортную цепь во время дыхания. Соответственно, DCA увеличил скорость дыхания на 44 ± 4% в клетках GBM (среднее ± SEM; n = 3; P < 0,05), что подтверждает общее увеличение активности митохондрий. Увеличение _H2O2 и α-кетоглутарата может объяснить снижение активности HIF-1α (рис. 5B), что также подтверждается дозозависимым снижением продукции VEGF клетками ГБМ (рис. 6). Эти данные согласуются со снижением ангиогенеза in vivo (рис. 4 и 5) и предполагают, что клетки ГБМ подают сигнал эндотелиальным клеткам паракринным образом. Для изучения того, может ли DCA непосредственно подавлять ангиогенез, мы использовали стандартную методику формирования трубок эндотелиальных клеток человека в Матригеле. В условиях физиологической умеренной гипоксии ДКА вызывал дозозависимое прямое подавление ангиогенеза in vitro (рис. S10). Опухоли пациентов 2-4 после лечения ДКА показали повышенную активность mROS-чувствительного p53 (ядерная транслокация), что также подтверждается повышенной активностью и численностью его нижележащей мишени p21 (рис. S11). Эти эффекты на p53 или p21 могут также объяснить снижение транскрипции, вызванной HIF, и согласуются с антипролиферативным, в дополнение к проапоптотическому, эффектом DCA в ГБМ (рис. S12).

ДИСКУССИЯ

Метаболический модулятор DCA оказывает противораковое действие в культивируемых клетках и у грызунов ^{(3, 16-20)}. Теперь мы показали, что DCA может быть использован у пациентов, страдающих ГБМ. У некоторых пациентов с ГБМ лечение DCA сопровождалось длительной рентгенологической стабилизацией или регрессией опухоли и в целом характеризовалось хорошим профилем безопасности. Этот ранний, первый в истории человечества отчет дает основание для проведения расширенных исследований с использованием этой генерической малой молекулы у пациентов с ГБМ. Наши результаты показывают, что ГБМ является хорошим кандидатом для метаболического вмешательства. Мишень DCA, PDKII, высоко экспрессируется в опухолях и клеточных линиях ГБМ, и DCA может ингибировать ее активность in vivo. Для ГБМ характерна гиперполяризация митохондрий, что соответствует метаболической перестройке (эффект Варбурга) и связанной с ней устойчивости к апоптозу, характерной для ГБМ и большинства солидных опухолей ⁽¹¹⁾. Мутации в генах цитоплазматических и митохондриальных изоцитратдегидрогеназ были описаны в ГБМ, возникающих из глиомы более низкого уровня (вторичные ГБМ) ⁽⁴⁸⁾, но механизм, посредством которого эти мутации связаны с канцерогенезом, остается неясным ^{(49, 50)}. У наших пациентов были первичные ГБМ, и митохондриальное ремоделирование было, по крайней мере, частично обратимым с помощью DCA, что позволяет предположить, что оно не было вызвано необратимой дисфункцией. Более того, мы показали, что предполагаемые ГБМ-СК могут подвергаться такому же метаболическому и митохондриальному ремоделированию, но в более высокой степени, поскольку ГБМ-СК имели наиболее гиперполяризованные митохондрии как in vivo, так и in vitro. Обратное изменение этого митохондриального ремоделирования с помощью DCA индуцировало апоптоз в GBM-SC как in vitro, так и in vivo. Хотя величина индукции апоптоза под действием DCA невелика (по сравнению с цитотоксическими агентами), она относительно избирательна, щадит нераковые клетки ⁽³⁾, и, поскольку она затрагивает GBM-SC, может привести к более устойчивому клиническому эффекту. Пациент 3 умер, а у пациента 4 произошел рецидив в течение первых 3 месяцев, когда DCA не достиг устойчивых терапевтических значений (о чем свидетельствует тот факт, что вязкие концентрации в плазме не обнаруживались). Таким образом, пациенты могут недолечиваться при первоначальном приеме DCA и подвергаться риску начального прогрессирования заболевания. Снижая устойчивость к митохондриально-зависимому апоптозу, DCA может усиливать действие стандартных методов лечения. Действительно, влияние DCA плюс TMZ на апоптоз ГБМСК может лежать в основе долгосрочных положительных результатов, полученных пациентом 5. Действие DCA на раковые клетки имитируется малой интерферирующей РНК PDKII, при этом DCA не оказывает никакого эффекта сверх того, который наблюдается после нокдауна PDKII ⁽³⁾. Это позволяет предположить, что механизм противоракового действия DCA заключается в ингибировании PDKII, фермента, который содержится в повышенных концентрациях в ГБМ. Ингибируя PDKII, DCA нормализует повышенное соотношение гликолиза и окисления глюкозы в раковых клетках, повышая функцию митохондрий ⁽³⁾. Этот механизм подтверждается нашими текущими результатами, согласно которым DCA увеличивает как дыхание клеток GBM, так и концентрацию а-кетоглутарата. Однако, в отличие от контролируемых условий клеточной культуры, дополнительные механизмы могут способствовать воздействию DCA на метаболизм раковых клеток и апоптоз in vivo. Помимо ранее описанных эффектов ДКА на раковые клетки ⁽³⁾, наши данные по HXKII, mROS, HIF-1α, p53 и p21 согласуются с ингибированием ангиогенеза, индукцией апоптоза и подавлением пролиферации в GBM и GBM-SC под влиянием ДКА, как показано в Дополнительном материале и на рис. S12. S12. DCA не обладал очевидной токсичностью, за исключением ранее описанной дозозависимой, обратимой нейротоксичности немиелинизирующего характера ^{(32, 34)}, которая была минимальной или отсутствовала в дозе 6,25 мг/кг при пероральном приеме дважды в день. Эта доза показала биологическую и клиническую эффективность и достигла концентрации в плазме крови, необходимой для ингибирования PDK ⁽³¹⁾. Учитывая небольшое количество пациентов, прошедших лечение в нашем исследовании, нельзя сделать однозначных выводов относительно DCA в качестве терапии ГБМ. Наша работа подтверждает необходимость проведения дальнейших исследований с использованием DCA при ГБМ с акцентом на протоколы комбинированной терапии. ГБМ также может быть уязвима к другим препаратам из нового семейства метаболических модуляторов, что указывает на новый подход к лечению этого неизлечимого рака.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

www.sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/2/31/31ra34/DC1
Материалы и методы
Результаты
Обсуждение
Рис. S1. Молекулярная характеристика опухолей ГБМ.
Рис. S2. Эволюция опухолевого ответа у пациента 1.
Рис. S3. Эволюция опухолевого ответа у пациента 4.
Рис. S4. Эволюция опухолевого ответа у пациента 5.
Рис. S5. МРТ ГБМ у пациента 3.
Рис. S6. Мембранный потенциал митохондрий в GBM-SC из свежевырезанной ткани ГБМ.
Рис. S7. Характеристика первичных клеток ГБМ и ГБМ-СК.
Рис. S8. HXKII в клетках ГБМ, полученных от пациентов до и после хронического лечения ДКА.
Рис. S9. Влияние терапии ДКА на апоптоз ГБМ-СК и сосудов.
Рис. S10. Влияние ДКА на ангиогенез in vitro.
Рис. S11. Влияние терапии DCA на активность p53 и p21 in vivo.
Рис. S12. Предполагаемый комплексный механизм противоракового действия DCA в ГБМ (см.
Дополнительное обсуждение).
Таблица S1. Лабораторные и клинические параметры пяти пациентов с ГБМ до и после лечения ДКА.
Ссылки

ССЫЛКИ

1 1. P. Y. Wen, S. Kesari, Malignant gliomas in adults. N. Engl. J. Med. 359, 492-507 (2008).
2 В. К. Юнг, Р. Э. Олбрайт, Дж. Олсон, Р. Фредерикс, К. Финк, М. Д. Прадос, М. Бреда, А. Спенс, Р. Дж. Хохл, В. Шапиро, М. Гланц, Г. Гринберг, Р. Г. Селкер, Н. А. Вик, Р. Рэмплинг, Х. Friedman, P. Phillips, J. Bruner, N. Yue, D. Osoba, S. Zaknoen, V. A. Levin, A phase II study of temozolomide vs. procarbazine in patients with glioblastoma multiforme at first relapse. Br. J. Cancer 83, 588-593 (2000).
3 S. Bonnet, S. L. Archer, J. Allalunis-Turner, A. Haromy, C. Beaulieu, R. Thompson, C. T. Lee, G. D. Lopaschuk, L. Puttagunta, S. Bonnet, G. Harry, K. Hashimoto, C. J. Porter, M. A. Andrade, B. Thebaud, E. D. Michelakis, A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11, 37-51 (2007).
4 E. D. Michelakis, L. Webster, J. R. Mackey, Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolictargeting therapy for cancer. Br. J. Cancer 99, 989-994 (2008).
5 P. W. Stacpoole, The pharmacology of dichloroacetate. Метаболизм 38, 1124-1144 (1989).
6 O. Warburg, Ueber den Stoffwechsel der Tumoren (Constable, London, 1930).
7 С. Вайнхаус, Гипотеза Варбурга пятьдесят лет спустя. Z. Krebsforsch. Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87, 115-126 (1976).
8 M. G. Vander Heiden, L. C. Cantley, C. B. Thompson, Understanding the Warburg effect: Метаболические требования клеточной пролиферации. Science 324, 1029-1033 (2009).
9 J. G. Pan, T. W. Mak, Metabolic targeting as an anticancer strategy: Рассвет новой эры? Sci. STKE 2007, pe14 (2007).
10 J. W. Kim, C. V. Dang, Молекулярный сладкоежка рака и эффект Варбурга. Cancer Res. 66, 8927-8930 (2006).
11 R. A. Gatenby, R. J. Gillies, Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat. Rev. Cancer 4, 891-899 (2004).
12 J. W. Kim, C. V. Dang, Многогранная роль гликолитических ферментов. Trends Biochem. Sci. 30, 142-150 (2005).
13 Л. Б. Чен, Мембранный потенциал митохондрий в живых клетках. Annu. Rev. Cell Biol. 4, 155-181 (1988).
14 G. Kroemer, L. Galluzzi, C. Brenner, Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
15. Н. Замзами, Г. Кромер, Митохондрия в апоптозе: как открывается ящик Пандоры. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 67-71 (2001).
16 R. A. Cairns, I. Papandreou, P. D. Sutphin, N. C. Denko, Metabolic targeting of hypoxia and HIF1 in solid tumors can enhance cytotoxic chemotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9445-9450 (2007).
17 W. Cao, S. Yacoub, K. T. Shiverick, K. Namiki, Y. Sakai, S. Porvasnik, C. Urbanek, C. J. Rosser, Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate 68, 1223-1231 (2008).
18 S. Dhar, S. J. Lippard, Mitaplatin, мощное соединение цисплатина и сиротского препарата дихлорацетата. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22199-22204 (2009).
19 R. C. Sun, M. Fadia, J. E. Dahlstrom, C. R. Parish, P. G. Board, A. C. Blackburn, Reversal of the glycolytic phenotype by dichloroacetate inhibits metastatic breast cancer cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res. Treat. 120, 253-260 (2010).
20 J. Y. Wong, G. S. Huggins, M. Debidda, N. C. Munshi, I. De Vivo, Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells. Gynecol. Oncol. 109, 394-402 (2008).
21 S. Wang, S. S. Leonard, J. Ye, M. Ding, X. Shi, The role of hydroxyl radical as a messenger in Cr(VI)-induced p53 activation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 279, C868-C875 (2000).
22 C. Huang, Z. Zhang, M. Ding, J. Li, J. Ye, S. S. Leonard, H. M. Shen, L. Butterworth, Y. Lu, M. Costa, Y. Rojanasakul, V. Castranova, V. Vallyathan, X. Shi, Vanadate induces p53 transactivation through hydrogen peroxide and causes apoptosis. J. Biol. Chem. 275, 32516-32522 (2000).
23 T. Schmid, J. Zhou, R. Köhl, B. Brüne, p300 ослабляет вызванную p53 транскрипционную репрессию гипоксия-индуцибельного фактора-1 (HIF-1). Biochem. J. 380, 289-295 (2004).
24 М.В. Благосклонный, В.Г. Ан, Л.Ю. Романова, Ж. Трепель, Т. Фоджо, Л. Некерс, р53 ингибирует стимулированную фактором гипоксии транскрипцию. J. Biol. Chem. 273, 11995-11998 (1998).
25 J. W. Kim, I. Tchernyshyov, G. L. Semenza, C. V. Dang, HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: Метаболический переключатель, необходимый для клеточной адаптации к гипоксии. Cell Metab. 3, 177-185 (2006).
26 Г. Л. Семенза, Д. Артемов, А. Беди, З. Бхуджвала, К. Чайлз, Д. Фельдсер, Э. Лафнер, Р. Рави, Дж. Симонс, П. Тагави, Х. Чжун, «Метаболизм опухолей»: 70 лет спустя. Novartis Found. Symp. 240, 251-260 (2001).
27 E. K. Weir, J. López-Barneo, K. J. Buckler, S. L. Archer, Acute oxygen-sensing mechanisms. N. Engl. J. Med. 353, 2042-2055 (2005).
28 Н. К. Денко, Гипоксия, HIF1 и метаболизм глюкозы в солидной опухоли. Nat. Rev. Cancer 8, 705-713 (2008).
29 G. L. Semenza, Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 3, 721-732 (2003).
30 E. D. MacKenzie, M. A. Selak, D. A. Tennant, L. J. Payne, S. Crosby, C. M. Frederiksen, D. G. Watson, E. Gottlieb, Cell-permeating a-ketoglutarate derivatives alleviate pseudohypoxia in succinate dehydrogenase-deficient cells. Мол. Cell. Biol. 27, 3282-3289 (2007).
31 M. M. Bowker-Kinley, W. I. Davis, P. Wu, R. A. Harris, K. M. Popov, Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex. Biochem. J. 329 (Pt 1), 191-196 (1998).
32 P. W. Stacpoole, D. S. Kerr, C. Barnes, S. T. Bunch, P. R. Carney, E. M. Fennell, N. M. Felitsyn, R. L. Gilmore, M. Greer, G. N. Henderson, A. D. Hutson, R. E. Neiberger, R. G. O’Brien, L. A. Perkins, R. G. Quisling, A. L. Shroads, J. J. Shuster, J. H. Silverstein, D. W. Theriaque, E. Valenstein, Controlled clinical trial of dichloroacetate for treatment of congenital lactic acidosis in children. Педиатрия 117, 1519-1531 (2006).
33 P. W. Stacpoole, A. C. Lorenz, R. G. Thomas, E. M. Harman, Dichloroacetate in the treatment of lactic acidosis. Ann. Intern. Med. 108, 58-63 (1988).
34 P. W. Stacpoole, T. L. Kurtz, Z. Han, T. Langaee, Role of dichloroacetate in the treatment of genetic mitochondrial diseases. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1478-1487 (2008).
35 P. Kaufmann, K. Engelstad, Y. Wei, S. Jhung, M. C. Sano, D. C. Shungu, W. S. Millar, X. Hong, C. L. Gooch, X. Mao, J. M. Pascual, M. Hirano, P. W. Stacpoole, S. DiMauro, D. C. De Vivo, Dichloroacetate causes toxic neuropathy in MELAS: A randomized, controlled clinical trial. Неврология 66, 324-330 (2006).
36 P. W. Stacpoole, L. R. Gilbert, R. E. Neiberger, P. R. Carney, E. Valenstein, D. W. Theriaque, J. J. Shuster, Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным молочнокислым ацидозом дихлорацетатом. Педиатрия 121, e1223-e1228 (2008).
37 P. W. Stacpoole, G. N. Henderson, Z. Yan, M. O. James, Clinical pharmacology and toxicology of dichloroacetate. Environ. Health Perspect. 106 (Suppl. 4), 989-994 (1998).
38 N. Sanai, A. Alvarez-Buylla, M. S. Berger, Neural stem cells and the origin of gliomas. N. Engl. J. Med. 353, 811-822 (2005).
39 F. Zindy, T. Uziel, O. Ayrault, C. Calabrese, M. Valentine, J. E. Rehg, R. J. Gilbertson, C. J. Sherr, M. F. Roussel, Genetic alterations in mouse medulloblastomas and generation of tumors de novo from primary cerebellar granule neuron precursors. Cancer Res. 67, 2676-2684 (2007).
40 T. Hide, T. Takezaki, H. Nakamura, J. Kuratsu, T. Kondo, Brain tumor stem cells as research and treatment targets. Brain Tumor Pathol. 25, 67-72 (2008).
41 C. Calabrese, H. Poppleton, M. Kocak, T. L. Hogg, C. Fuller, B. Hamner, E. Y. Oh, M. W. Gaber, D. Finklestein, M. Allen, A. Frank, I. T. Bayazitov, S. S. Zakharenko, A. Gajjar, A. Davidoff, R. J. Gilbertson, A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell 11, 69-82 (2007).
42 R. Pallini, L. Ricci-Vitiani, G. L. Banna, M. Signore, D. Lombardi, M. Todaro, G. Stassi, M. Martini, G. Maira, L. M. Larocca, R. De Maria, Cancer stem cell analysis and clinical outcome in patients with glioblastoma multiforme. Clin. Cancer Res. 14, 8205-8212 (2008).
43 D. R. Laks, M. Masterman-Smith, K. Visnyei, B. Angenieux, N. M. Orozco, I. Foran, W. H. Yong, H. V. Vinters, L. M. Liau, J. A. Lazareff, P. S. Mischel, T. F. Cloughesy, S. Horvath, H. I. Kornblum, Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Стволовые клетки 27, 980-987 (2009).
44 R. J. Gilbertson, J. N. Rich, Making a tumour’s bed: Стволовые клетки глиобластомы и сосудистая ниша. Nat. Rev. Cancer 7, 733-736 (2007).
45 J. G. Pastorino, J. B. Hoek, Гексокиназа II: интеграция энергетического метаболизма и контроля апоптоза. Curr. Med. Chem. 10, 1535-1551 (2003).
46 J. G. Pastorino, J. B. Hoek, N. Shulga, Activation of glycogen synthase kinase 3b disrupts the binding of hexokinase II to mitochondria by phosphorylating voltage-dependent anion channel and potentiates chemotherapy-induced cytotoxicity. Cancer Res. 65, 10545-10554 (2005).
47M.Diehn, R. W. Cho, N. A. Lobo, T. Kalisky, M. J. Dorie, A. N. Kulp, D. Qian, J. S. Lam, L. E. Ailles, M. Wong, B. Joshua, M. J. Kaplan, I. Wapnir, F. M. Dirbas, G. Somlo, C. Гарбероглио, Б. Паз, Дж. Шен, С. К. Лау, С. Р. Квейк, Дж. М. Браун, И. Л. Вайсман, М. Ф. Кларк, Ассоциация уровней реактивных форм кислорода и радиорезистентности в раковых стволовых клетках. Nature 458, 780-783 (2009).
48 H. Yan, D. W. Parsons, G. Jin, R. McLendon, B. A. Rasheed, W. Yuan, I. Kos, I. Batinic-Haberle, S. Jones, G. J. Riggins, H. Friedman, A. Friedman, D. Reardon, J. Herndon, K. W. Kinzler, V. E. Velculescu, B. Vogelstein, D. D. Bigner, IDH1 и IDH2 мутации в глиомах. N. Engl. J. Med. 360, 765-773 (2009).
49 C. B. Thompson, Metabolic enzymes as oncogenes or tumor suppressors. N. Engl. J. Med. 360, 813-815 (2009).
50 L. Dang, D. W. White, S. Gross, B. D. Bennett, M. A. Bittinger, E. M. Driggers, V. R. Fantin, H. G. Jang, S. Jin, M. C. Keenan, K. M. Marks, R. M. Prins, P. S. Ward, K. E. Yen, L. M. Liau, J. D. Rabinowitz, L. C. Cantley, C. B. Thompson, M. G. Vander Heiden, S. M. Su, Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature 462, 739-744 (2009).
51 Финансирование: Данное исследование финансировалось Фондом Хехта (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада; E.D.M.), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения и Канадской программой исследовательских кафедр (E.D.M.), а также общественными пожертвованиями на программу DCA (полученными и управляемыми регентами Университета Альберты и медицинского факультета). Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Службы здравоохранения Альберты (Д. Гордон, старший вице-президент, основные третичные больницы). Вклад авторов: E.D.M. разработал дизайн исследований, руководил механистическими исследованиями, обеспечил финансирование, проанализировал данные и написал рукопись. K.C.P. участвовал в разработке дизайна исследований, руководил всеми клиническими исследованиями и был соавтором рукописи. G.S. и P.D. провели все механистические исследования и отредактировали рукопись. L.W. координировал все исследования, участвовал в сборе данных, анализировал клинические данные и редактировал рукопись. A.H., E.N., C.M., T.-L.G. и M.S.M. внесли вклад в сбор и анализ данных и отредактировали рукопись. J.R.M., D.F. и B.A. совместно разработали дизайн клинических исследований, внесли вклад в сбор данных и отредактировали рукопись. Конкурирующие интересы: E.D.M. является совладельцем находящегося на рассмотрении патента на использование DCA в качестве противораковой терапии. Активной или планируемой коммерциализации этого патента не было.