📖 22 mins.

BM Madhok*,1, S Yeluri1, SL Perry1, TA Hughes2 и DG Jayne1

1 Секция трансляционной анестезии и хирургии, Университет Лидса, 7-й уровень здания клинических наук, Университетская больница Сент-Джеймс, Лидс, Великобритания

2

Институт молекулярной медицины Лидса, Университет Лидса, Университетская больница Сент-Джеймс, Лидс, Великобритания

Переписка: Д-р BM Madhok; E-mail: [email protected]

Пересмотрено: 23 марта 2010 г.
Принято: 26 апреля 2010 г.
Опубликовано: 18 мая 2010 г

Аннотация

История вопроса
Раковые клетки сильно зависят от гликолиза. Нашей целью было определить, приведет ли переключение метаболизма с гликолиза на митохондриальное дыхание к преимущественному снижению роста клеток колоректального рака по сравнению с нормальными клетками, и изучить лежащие в основе этого механизмы.

Методы
Репрезентативные линии колоректального рака и нераковых клеток обрабатывали дихлорацетатом (DCA), ингибитором киназы пируватдегидрогеназы.

Результаты
Дихлорацетат (20 мМ) не снижал рост нераковых клеток, но вызывал значительное снижение пролиферации раковых клеток (P=0,009), что было связано с апоптозом и остановкой клеточного цикла в фазе G2. Наибольший апоптотический эффект проявился в метастатических клетках LoVo, в которых DCA вызвал десятикратное увеличение количества апоптотических клеток через 48 ч. Наиболее яркий G2-арест проявился в хорошо дифференцированных клетках HT29, в которых DCA вызвал восьмикратное увеличение клеток в фазе G2 через 48 ч. Дихлорацетат снижал уровень лактата в ростовой среде и вызывал дефосфорилирование субъединицы E1α пируватдегидрогеназного комплекса во всех клеточных линиях, но внутренний мембранный потенциал митохондрий был снижен только в раковых клетках (P=0,04).

Выводы
Ингибирование киназы пируватдегидрогеназы ослабляет гликолиз и облегчает митохондриальное окислительное фосфорилирование, что приводит к снижению роста клеток колоректального рака, но не раковых клеток.


Ключевые слова: дихлорацетат, колоректальный рак, пируватдегидрогеназа, киназа пируватдегидрогеназы
British Journal of Cancer (2010) 102, 1746 — 1752, www.bjcancer.com
doi: 10.1038/sj.bjc.6605701

© 2010 Cancer Research UK


ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является третьим по распространенности раком в мире и четвертой ведущей причиной смерти от рака (Shike et al, 1990). В 2007 году на колоректальный рак приходилось 17,1 случаев смерти на 100 000 человек в Великобритании (UK Bowel Cancer Statistics, 2009). Несмотря на последние достижения, прогноз для пациентов с распространенным и метастатическим колоректальным раком остается плохим. Направление метаболизма опухоли на лечение рака является быстро развивающейся областью (Pan and Mak, 2007). Первые наблюдения, касающиеся метаболических различий между раковыми и нормальными клетками, были сделаны Отто Варбургом, который показал, что раковые клетки по своей природе зависят от гликолиза для производства химической энергии (Warburg, 1956). В настоящее время появляется все больше доказательств того, что усиленный гликолиз является результатом влияния множества молекулярных путей, включая адаптивные реакции на гипоксическое микроокружение опухоли, онкогенную сигнализацию и дисфункцию митохондрий (Gatenby and Gillies, 2004; Gillies and Gatenby, 2007; Wu et al, 2007). Гликолитический фенотип дает раковым клеткам преимущества роста, противостоя апоптозу и способствуя распространению опухоли и метастазированию (Yeluri et al, 2009).

Ключевым регулятором клеточного метаболизма является пируватдегидрогеназа (ПДГ). Пируватдегидрогеназа превращает пируват, образующийся в результате гликолиза, в ацетил-КоА, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот в митохондриях. Активность пируватдегидрогеназы жестко регулируется ингибирующим фосфорилированием киназой пируватдегидрогеназы (PDK). Фосфорилирование происходит на субъединице E1α PDH (PDHE1α) в трех местах: Ser232, Ser293 и Ser300 (Rardin et al, 2009). Дихлорацетат (DCA) является ингибитором всех четырех изоферментов PDK(1-4) (Stacpoole, 1989), и недавно было показано, что он снижает рост клеточных линий рака легких, эндометрия и молочной железы (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Сообщается, что он снижает рост этих раковых клеток в основном за счет снижения ингибиторного фосфорилирования PDH, тем самым стимулируя митохондриальное окислительное фосфорилирование и вызывая апоптоз через митохондриальный, NFAT-Kv 1.5 и p53 upregulated modulator of apoptosis (PUMA) — опосредованные пути.

Было установлено, что клетки колоректального рака подвергаются повышенному гликолизу (Bi et al, 2006), а микроокружение опухоли является гипоксическим и ацидотическим, в основном из-за плохо развитого кровоснабжения (Dewhirst et al, 1989; Milosevic et al, 2004). Ранее мы показали, что это особенно верно для более агрессивного фенотипа (Thorn et al, 2009), а экспрессия важных маркеров гипоксии повышена при колоректальном раке, особенно на инвазивном крае (Rajaganeshan et al, 2008, 2009). Целью данного исследования было изучить влияние DCA на рост клеток колоректального рака в попытке рассмотреть ингибирование PDK в качестве новой терапевтической стратегии против колоректального рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры
Все клеточные линии были приобретены у American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) или European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Wiltshire, UK): HB2 (эпителиальные клетки молочной железы неракового происхождения), 293 (эпителиальные клетки из почки эмбриона человека), HT29 (хорошо дифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома), SW480 (плохо дифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома) и LoVo (метастатический левый надключичный лимфатический узел от колоректальной аденокарциномы). клетки 293 и HB2 поддерживали в среде DMEM, HT29 и SW480 — в среде RPMI 1640, а LoVo — в среде F12 (все от Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, в увлажненном инкубаторе при 37°C, 5%CO2. Для экспериментов в гипоксических условиях мы инкубировали клетки в увлажненном гипоксическом инкубаторе (1% O2, 5%CO2, 94% N2, 37°C). Дихлорацетат натрия (Specials Lab, Прудхо, Великобритания) был предоставлен аптечным отделом Университетской больницы Сент-Джеймс, Лидс, Великобритания.

МТТ-анализ
Клетки (1 ×104) на лунку высевали в 96-луночные планшеты для культуры ткани. После ночной инкубации среду заменяли свежей средой, содержащей возрастающие дозы DCA (0, 10, 15, 20, 30, 50 и 100 мМ). После 24 и 48 ч инкубации проводили МТТ-анализ, заменяя среду 50 мкл1 мг мл-1 раствора МТТ и инкубируя в темноте в течение 3 ч. Затем раствор МТТ удаляли, а темно-синий осадок формазана растворяли в 100 мклпропан-1-ола. Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера (Opsys MR; Dynex Technologies Ltd, Уортинг, Западный Сассекс, Великобритания) при 570 нм.

Анализ аннексина V и 7-AAD
Клетки высевали в колбы для культуры ткани площадью 25 см2 и инкубировали в течение ночи в стандартных условиях. Среду заменяли свежей средой, содержащей различные дозы DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Проточно-цитометрический анализ проводили через 24 и 48 ч инкубации. Клетки дважды промывали холодным PBS и ресуспендировали в 1 × буфере для связывания (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, США) из расчета 5 ×106 клеток на мл. 100 мклраствора (5 ×105 клеток) переносили в культуральные пробирки объемом 5 мл. Эти клетки окрашивали 5 мкланнексина V-FITC и 10 мкл7-AAD (BD Bioscience), осторожно вихревым методом и инкубировали при температуре окружающей среды в течение 15 мин в темноте. После этого в каждую пробирку добавляли 400 мкл1 × связывающего буфера и анализировали в течение часа на проточном цитометре LSR II (BD Bioscience).

Анализ с использованием йодистого пропидия
Клетки размножали, как указано для анализа апоптоза. Использовали дихлорацетат (50 мМ) и сравнивали с автомобильным контролем. После сбора урожая ресуспендировали клетки в 350 мклPBS в концентрации 0,5-1,0 ×106 клеток на мл. 100 мкл0,25 мг мл-1 йодистого пропидия (PI)/5% Тритона (Sigma, St Louis, MO, USA) добавляли к клеточной суспензии. затем добавили 50 мкл1 мг мл-1 рибонуклеазы А (Sigma). Пробирки с образцами тщательно перемешивали вихрем и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре LSR II (BD Bioscience) и анализировали данные с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, USA).

Измерения лактата
Измерения лактата в ростовых средах проводились отделением химической патологии в General Infirmary, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Клетки инкубировали в колбах площадью 25 см2 в течение ночи в нормоксии. На следующий день среду заменяли различными дозами DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). После 48 ч инкубации мы собрали 2 мл среды во фторированные пробирки и немедленно передали в лабораторию химической патологии. Во время переноса пробирки держали на льду. Уровень лактата измеряли с помощью автоматического анализатора (Advia 1200 Chemistry system; Siemens Healthcare Diagnostics, Camberley, Surrey, UK).

Анализы ТМРМ
Клетки обрабатывали DCA, как описано для анализа апоптоза. После 24 и 48 ч инкубации клетки промывали в PBS и суспендировали 1 ×106 клеток на мл в забуференном солевом растворе Хэнка с 50 нМ тетраметилродамин метилового эфира (ТМРМ) (Invitrogen). 100 мклклеточной суспензии (1 ×105 клеток на лунку) переносили в непрозрачные 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 30 мин и измеряли флуоресценцию при 530/620 нм при 37°C с помощью планшетного ридера (Mithras LB 40; Berthold Technologies, Bad, Wildbad, Germany).

Вестерн-блоттинг
Клетки обрабатывали DCA, как описано выше. Через 8 ч после обработки из клеток выделяли белки в буфере Лаеммли (2% SDS, 10% глицерина, 0,7% 2-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего и 0,5 М Трис-HCl). Лизаты разрешали электрофорезом на 12%-ных бис-трисовых гелях NuPAGE Novex (Invitrogen) в буфере MOPS-SDS (Invitrogen). Белки переносили на поливинилиденфторидную мембрану (GE Healthcare, Chalford St Giles, Bucks, UK). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке в TBS-T (Трис-буферный солевой раствор с 0,1% Tween). Затем мембрану зондировали первичными антителами в 1% обезжиренном молоке в TBS-T в течение 90 мин, промывали в TBS-T, а затем зондировали соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), в течение 60 мин. Первичные антитела кроличьи поликлональные фосфодетектирующие анти-PDH-E1α (pSer293), 1 :500 (AP1062; EMD Chemicals, Дармштадт, Германия), и мышиное моноклональное анти-PDHE1α, 1 :500 (459400; Invitrogen). Вторичные антитела анти-кроличьи или анти-мышиные HRP-конъюгаты, 1 :1000 (Dako, Глоструп, Дания). Белки визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Supersignal West Pico или Femto (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) и системы Chemidoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). в качестве контроля загрузки использовался β-актин.

Статистический анализ
Данные проточной цитометрии были получены с использованием специального программного обеспечения, BD FACSDiva 6.0 и FlowJo. Статистический анализ проводили с помощью SPSS for Windows (SPSS версия 15.0, Чикаго, ИЛ, США). Различия между группами, обработанными DCA, и контрольной группой с использованием транспортных средств оценивали с помощью U-теста Манна-Уитни и 95% доверительных интервалов разницы средних между двумя группами. Р-значение менее 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены как среднее значение по крайней мере трех независимых экспериментов, а столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение среднего значения.

Результаты

DCA снижает пролиферацию раковых клеток, и эффект сходен в нормоксии и гипоксии
Сначала мы хотели определить, подавляет ли лечение DCA пролиферацию клеток и будет ли различаться реакция раковых и нераковых клеток в нормоксических и гипоксических условиях. Что касается гипоксии, наша гипотеза заключалась в том, что влияние DCA будет особенно сильным при уровне кислорода, недостаточном для поддержания дополнительного окислительного фосфорилирования. Все клеточные линии (HB2, 293, HT29, SW480 и LoVo) обрабатывали различными дозами DCA в течение 24-48 ч в нормоксических и гипоксических условиях. Относительное количество клеток оценивали с помощью МТТ-теста.

Лечение возрастающими дозами DCA снижало клеточную пролиферацию в дозозависимой манере (рис. 1A-D). Вопреки нашим ожиданиям, профили снижения роста клеток были схожи в условиях гипоксии и нормоксии. Через 24 и 48 часов до 20 мМ DCA не влияло на рост культур нераковых клеток HB2 и 293. Однако 20 мМ DCA значительно снижал рост культур всех трех линий клеток колоректального рака (P⩽0,009). Эффект DCA был сильнее на плохо дифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo, чем на хорошо дифференцированные клетки HT29. Рост культур клеток LoVo, обработанных 20 мМ DCA, снижался на 40% по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. Поскольку разница в снижении роста культур, обработанных DCA в гипоксических и нормоксических условиях, была относительно небольшой, дальнейшие эксперименты проводились только в нормоксии.

Рисунок 1. Дихлорацетат (20 мМ) существенно не снижал рост культур нераковых клеток 293 и HB2, но вызывал значительное снижение роста культур всех клеток колоректального рака(*P⩽0.009). Клетки обрабатывали различными дозами DCA или транспортным средством в нормоксии(A и C) или гипоксии(B и D), и относительное количество жизнеспособных клеток оценивали через 24 ч(A и B) и 48 ч(C и D) с помощью МТТ-теста. Данные выражены в процентах от контроля (доза 0 мМ)(* — значительная разница относительно контроля — белая полоса (0 мМ)).

DCA способствует апоптозу в раковых клетках, щадя нераковые клетки
Далее мы хотели выяснить, связано ли снижение роста культур при обработке DCA с индукцией апоптоза. Клетки обрабатывали различными дозами DCA (0, 10, 20 и 50 мМ) в течение 24 и 48 часов, и долю клеток, подвергшихся апоптозу, оценивали путем обнаружения мембранного фосфатидилсерина с помощью аннексина V-FITC. Клетки окрашивали аннексином V-FITC и витальным красителем 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Наблюдалась дозозависимая индукция апоптоза в линиях раковых клеток после 24 и 48 часов лечения, при этом в нераковых клетках апоптоз индуцировался слабо (если вообще индуцировался) (Рисунок 2A и B). Наибольший эффект наблюдался в метастатических клетках LoVo; 50 мМ DCA вызывал десятикратное увеличение доли апоптотических клеток через 48 ч, в то время как в клетках HT29 и SW480 наблюдалось семи- и пятикратное увеличение, соответственно. Увеличение среднего процента общего количества апоптотических клеток при использовании 50 мМ DCA составило: 2,8 (95% ДИ: 2-3) в клетках HT29, 3,5 (95% ДИ: 2-5) в клетках SW480 и 21 (95% ДИ: 8-34) в клетках LoVo. В клетках 293 апоптоз индуцировался минимально даже при использовании 50 мМ DCA — 0,2 (95% ДИ: от -0,2 до 0,6). В клетках HB2 наблюдалось незначительное снижение процента апоптотических клеток при обработке 50 мМ DCA, -0,9 (95% ДИ: от -2,2 до 0,4).

Рисунок 2. Дихлорацетат вызывал дозозависимое увеличение процента апоптотической популяции в раковых клетках при минимальном апоптозе в нераковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч(A) и 48 ч(B), окрашивали аннексином V-FITC и 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точки данных представляют собой среднее значение (±s.d.) трех независимых экспериментов для 0 и 50 мМ DCA(* — значительная разница по сравнению с контролем).

DCA индуцирует остановку фазы G2 в клетках колоректального рака, но не влияет на профиль клеточного цикла нераковых клеток 293
Мы также хотели выяснить, связано ли снижение роста культур при обработке DCA с индукцией остановки роста. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA в течение 24 или 48 ч, а профили клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрии, оценивая содержание ДНК после окрашивания PI. Обработка дихлорацетатом вызвала изменения в профиле клеточного цикла всех раковых клеток, но не повлияла на нераковые клетки. Изменения в профиле клеточного цикла были заметны через 24 часа после обработки и сохранялись в течение 48 часов (Рисунок 3A и B).

Рисунок 3. Дихлорацетат индуцировал остановку фазы G2 в клетках колоректального рака, не влияя на профиль клеточного цикла нераковых клеток; 293 и HB2. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA или транспортным средством в течение 24 ч) и 48 ч), окрашивали PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Для анализа статистической значимости сравнивали среднюю долю клеток в каждой фазе клеточного цикла (G1, S и G2) в клетках, обработанных DCA, со средней долей клеток в соответствующих фазах в необработанных клетках(* — значительная разница по сравнению с контролем).

После 48 ч обработки 50 мМ DCA наблюдалось восьмикратное увеличение клеток в фазе G2 в клетках HT29 и SW480 и трехкратное увеличение в клетках LoVo. Увеличение среднего процента всех раковых клеток в фазе G2 составило: 21 (95% CI: 13-30) для HT29, 19 (95% CI: 13-24) для клеток SW480 и 14 (95% CI: 10-21) для клеток LoVo; в то время как для клеток 293, 1 (95% CI: от -4 до 7), и клеток HB2, -0,3 (95% CI: от -9 до 9) различий не было. Во всех линиях раковых клеток наблюдалось соответствующее снижение количества клеток в фазе G0/G1. Интересно, что в клетках HT29 наблюдалось небольшое снижение, а в клетках SW480 и LoVo — значительное увеличение доли клеток, находящихся в фазе S (см. раздел «Обсуждение»). Профиль клеточного цикла клеток 293 и HB2 при обработке DCA изменился минимально.

DCA снижает уровень внеклеточного лактата в ростовой среде

Чтобы установить, коррелируют ли изменения в росте и апоптозе, индуцированные DCA, со снижением гликолиза, мы измерили уровень лактата в ростовой среде. Молочная кислота является конечным продуктом гликолиза. Если DCA индуцирует окислительное фосфорилирование митохондрий, пируват будет декарбоксилироваться до ацетил-КоА, а не восстанавливаться до лактата, следовательно, уровень лактата в ростовой среде будет снижаться. Уровни лактата в ростовой среде всех клеточных линий были измерены после 48 ч обработки различными дозами DCA (рис. 4). Уровень лактата определяли с помощью автоанализатора, который обычно используется для биохимического измерения уровня лактата; анализ основан на колориметрической реакции, катализируемой лактат-оксидазой. Обработка DCA снижала внеклеточный уровень лактата в ростовой среде дозозависимым образом во всех линиях раковых и нераковых клеток.

Рисунок 4. Дихлорацетат снижал уровень лактата в ростовой среде дозозависимым образом в раковых и нераковых клетках. Клетки обрабатывали различными дозами ДХА в течение 48 ч, а уровень внеклеточного лактата измеряли в ростовой среде с помощью автоанализатора. Результаты выражены относительно контроля.

DCA деполяризует внутреннюю мембрану митохондрий в клетках колоректального рака, но не в нераковых клетках
Чтобы проверить, связана ли индукция апоптоза в раковых клетках при лечении DCA с промоцией митохондриального окислительного фосфорилирования, мы измерили внутренний мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm). Ускорение митохондриального дыхания могло бы реактивировать цепь переноса электронов и снизить гиперполяризованный ΔΨm в раковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 и 48 ч и окрашивали красителем TMRM, который позволяет флуоресцентно измерить ΔΨm.

Как и в предыдущих экспериментах, эффект DCA проявлялся через 24 ч лечения и сохранялся в течение 48 ч (рис. 5A и B). Обработка дихлорацетатом снижала гиперполяризованный ΔΨm во всех раковых клетках дозозависимым образом. Дихлорацетат не оказывал никакого влияния на ΔΨm нераковых клеток HB2, тогда как, к удивлению, ΔΨm нераковых клеток 293 увеличивался дозозависимым образом. Через 24 часа лечения 50 мМ DCA значительно снижали ΔΨm во всех раковых клетках; однако в клетках LoVo значительное снижение наблюдалось даже при использовании 20 мМ DCA (Рисунок 5A, P=0,02). В нераковых клетках 293 наблюдалась тенденция к увеличению ΔΨm при обработке ДКА, хотя это не было статистически значимым (P=0,08). Через 48 часов лечения наблюдалось значительное снижение ΔΨm во всех раковых клетках и увеличение в клетках 293 при обработке 20-50 мМ ДКА (Рисунок 5B, P⩽0.04).

Рисунок 5. Обработка дихлорацетатом снижала внутренний мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) во всех раковых клетках, увеличивала ΔΨm в нераковых клетках 293 и не влияла на ΔΨm в нераковых клетках HB2. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч(A) и 48 ч(B), окрашивали TMRM и измеряли флуоресценцию при 530/620 нм при 37°C(* — значительная разница по сравнению с контролем).

Обработка ДКА приводит к дефосфорилированию субъединицы PDHE1α
Считается, что ДКА ингибирует все четыре изофермента PDK и, следовательно, снижает фосфорилирование субъединицы PDHE1α, что, в свою очередь, приводит к активации комплекса PDH. Чтобы проверить, происходит ли дефосфорилирование PDHE1α при обработке ДКА в используемых клеточных линиях, мы использовали вестерн-блот анализ лизатов клеток, обработанных ДКА и не обработанных. Во всех клеточных линиях обработка 20 мМ DCA в течение 8 ч вызвала резкое снижение сигнала фосфорилирования на сайте pSer293, но не было обнаружено изменений в уровнях общего PDHE1α (рис. 6). Фосфо-специфические антитела для двух других сайтов фосфорилирования, Ser232 и Ser300, пока не доступны в продаже.

Рисунок 6. Обработка дихлорацетатом снижает фосфорилирование PDHE1α по сайту pSer293, не влияя на уровень общего PDHE1α во всех исследованных клеточных линиях. Лизаты целых клеток готовили после обработки клеток 20 мМ DCA в течение 8 ч и из необработанных клеток, после чего проводили вестерн-блот-анализ.

Обсуждение

Мы показали, что DCA вызывает дозозависимое снижение роста in vitro культур клеток колоректального рака и нераковых клеток. Однако раковые клетки оказались более чувствительными к ДКА, причем доза 20 мМ вызывала значительное подавление роста раковых клеток, но практически не влияла на нераковые клетки. Мы показали, что компоненты этого дифференцированного эффекта следующие: мощная индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в раковых клетках, но не в нераковых клетках.

Эти выводы подтверждают простую модель дифференциальной чувствительности к DCA. Однако некоторые данные требуют дальнейшего обсуждения. Во-первых, 50 мМ DCA снижал рост культур нераковых клеток 293 и HB2, однако не наблюдалось увеличения количества апоптотических клеток или изменения профиля клеточного цикла этих клеток. Возможным объяснением этих результатов может быть то, что эта доза DCA привела к более медленному прохождению этих нераковых клеток через все стадии клеточного цикла, не изменяя относительных пропорций внутри каждой стадии. Во-вторых, наши результаты показывают, что ДКА индуцировал G2-арест в клетках колоректального рака. Это противоречит предыдущим исследованиям, которые показали G1-арест или отсутствие изменений в профиле клеточного цикла при лечении DCA (Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Вонг и другие (2008) показали повышенную экспрессию PUMA во всех клеточных линиях рака эндометрия, которые имели апоптотический ответ на DCA, и заключили, что эта активация p53 привела к G1-аресту. Однако клетки колоректального рака в нашем исследовании были арестованы в фазе G2 при лечении ДКА, и мы не обнаружили индукции р53 под действием ДКА в наших клеточных линиях колоректального рака (данные не показаны). Интересно, что Cao et al. (2008) обнаружили, что комбинация DCA и радиотерапии арестовывает клетки рака простаты в фазе G2, хотя сам по себе DCA не влияет на профиль клеточного цикла. В-третьих, в клетках SW480 и LoVo лечение DCA приводило к увеличению доли клеток, находящихся в S-фазе. Это указывает на увеличение пролиферации, а также индукцию апоптоза. Аналогичные результаты были получены Wong et al. (2008) в одной из нескольких протестированных клеток рака эндометрия. Альтернативное объяснение заключается в том, что часть клеток, находящихся в «фазе S» после обработки DCA раковых клеточных линий, на самом деле представляют собой апоптотические клетки в области «sub-G2«, о чем сообщалось ранее в клетках лимфомы (Klucar and Al-Rubeai, 1997).

Изменения в клеточном метаболизме при обработке DCA
DCA подавлял производство молочной кислоты из пирувата как в раковых, так и в нераковых клетках. Кроме того, обработка ДКА приводила к дефосфорилированию PDHE1α и, следовательно, к активации PDH во всех исследованных клеточных линиях. Следовательно, основа дифференцированного воздействия ДКА на раковые и нераковые клетки может заключаться в его влиянии на функцию митохондрий. Лечение DCA снизило высокий уровень ΔΨm у всех раковых клеток, но не у нераковых. Это позволяет предположить, что DCA, ингибируя PDK и, следовательно, активируя PDH, способствует митохондриальному дыханию, что приводит к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны и индуцирует апоптоз по проксимальному митохондриальному пути, как описано в предыдущих исследованиях (Bonnet et al, 2007; Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Индукция апоптоза и изменения в функции митохондрий были наиболее выражены в высокоинвазивных и метастатических клетках LoVo, чем в менее инвазивных клетках HT29 и SW480. Это может иметь клиническое значение для лечения метастатического колоректального рака, поскольку обычно именно высокоинвазивные метастатические раковые опухоли наиболее устойчивы к обычной химиотерапии и могут быть наиболее чувствительны к ингибированию PDK. В подтверждение этого в недавнем исследовании сообщалось, что колоректальные опухоли, устойчивые к 5-фторурацилу, чаще всего имеют повышенный гликолиз и, следовательно, лучше поддаются терапии, направленной на метаболизм рака (Shin et al, 2009). В этом отношении наши результаты контрастируют с данными Вонг и др. (2008), которые обнаружили, что клетки высокоинвазивного рака эндометрия наиболее устойчивы к лечению ДКА.

Ингибирование PDK в качестве противораковой терапии колоректального рака
Мы обнаружили, что дозы 20-50 мМ DCA дают дифференциальный ответ между раковыми и нераковыми клетками. Таким образом, потенциальные терапевтические дозы DCA могут составлять от 20 до 50 мМ. Кроме того, в недавнем исследовании сообщалось, что IC50 DCA для клеток рака молочной железы составляет от 20 до 30 мМ (Ko and Allalunis-Turner, 2009). Это противоречит предыдущим исследованиям, в которых сообщалось, что DCA снижает пролиферацию и вызывает апоптоз в раковых клетках при дозах 0,5-10 мМ (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Было установлено, что дихлорацетат относительно безопасен для человека при использовании для лечения молочнокислого ацидоза (Stacpoole et al, 2003). Основные побочные эффекты при использовании до 100 мг кг-1 ДХА проявляются со стороны нервной системы и печени, вызывая легкую седацию или сонливость, обратимую периферическую нейропатию и легкое бессимптомное повышение сывороточных трансаминаз, отражающее гепатоцеллюлярное повреждение (Stacpoole et al, 1998). Кроме того, недавние исследования показали, что DCA эффективно снижает рост опухолей в клинически достижимых дозах как in vitro, так и in vivo (Bonnet et al, 2007; Sun et al, 2009). Было высказано предположение, что DCA может быстро перейти к клиническим испытаниям на ранних стадиях рака (Michelakis et al, 2008). Однако доза DCA, необходимая для ингибирования роста клеток колоректального рака в нашем исследовании, вряд ли может быть достигнута клинически, не вызывая значительных побочных эффектов. Доза DCA, необходимая для достижения эквивалентных концентраций в плазме крови in vivo, примерно в пять-десять раз превышает дозу, используемую в клинических испытаниях против молочнокислого ацидоза. Похоже, что клетки колоректального рака, использованные в нашем исследовании, более устойчивы к DCA, чем клетки рака легких, эндометрия и молочной железы. Интересно, что Sun et al. (2009) в своем исследовании на клетках рака молочной железы обнаружили, что DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не вызывает апоптоз или гибель клеток. Эти результаты заметно отличались от эффектов DCA, наблюдаемых на клетках рака легких (Bonnet et al, 2007), эндометрия (Wong et al, 2008) и колоректального рака в нашем исследовании. Таким образом, хотя DCA подавляет рост различных раковых клеток, эффект и лежащие в его основе механизмы, по-видимому, зависят от типа клеток. Вероятным объяснением этих различных эффектов может быть разница в экспрессии изоферментов PDK в исследованных раковых клетках. Дихлорацетат является неспецифическим ингибитором PDK (Whitehouse and Randle, 1973) и имеет различный Ki для каждого из четырех изоферментов PDK (Bowker-Kinley et al, 1998). Кроме того, известно, что четыре изофермента PDK по-разному экспрессируются в различных тканях. Таким образом, существует необходимость в разработке ингибиторов отдельных изоферментов PDK, которые позволят осуществлять метаболические манипуляции в зависимости от типа раковых клеток.

ССЫЛКИ


1 Bi X, Lin Q, Foo TW, Joshi S, You T, Shen HM, Ong CN, Cheah PY, Eu KW, Hew CL (2006) Proteomic analysis of colorectal cancer reveals alterations in metabolic pathways: mechanism of tumorigenesis. Mol Cell Proteomics 5: 1119-1130
2 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED (2007) A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Раковая клетка 11: 37-51
3 Bowker-Kinley MM, Davis WI, Wu P, Harris RA, Popov KM (1998) Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex. Biochem J 329 (Part 1): 191-196
4 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, Porvasnik S, Urbanek C, Rosser CJ (2008) Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate 68: 1223-1231
4 Dewhirst MW, Tso CY, Oliver R, Gustafson CS, Secomb TW, Gross JF (1989) Morphologic and hemodynamic comparison of tumor and healing normal tissue microvasculature. Int J Radiat Oncol Biol Phys 17: 91-99
5 Gatenby RA, Gillies RJ (2004) Почему раковые опухоли имеют высокий аэробный гликолиз? Nat Rev Cancer 4: 891-899
6 Gillies RJ, Gatenby RA (2007) Adaptive landscapes and emergent phenotypes: why do cancers have high glycolysis? J Bioenerg Biomembr 39: 251-257
7 Klucar J, Al-Rubeai M (1997) Арест клеточного цикла G2 и апоптоз индуцируются в клетках лимфомы Беркитта противораковым агентом орацином. FEBS Lett 400: 127-130
8 Ko L, Allalunis-Turner J (2009) Исследование механизма дихлорацетата (DCA) индуцированного апоптоза при раке молочной железы. J Clin Oncol 27 (Suppl 15): e14637
9 Michelakis ED, Webster L, Mackey JR (2008) Дихлорацетат (DCA) как потенциальная метаболическая таргетная терапия рака. Br J Cancer 99: 989-994
10 Milosevic M, Fyles A, Hedley D, Hill R (2004) Микроокружение опухоли человека: инвазивное (игольчатое) измерение давления кислорода и интерстициальной жидкости. Semin Radiat Oncol 14: 249-258
11 Pan JG, Mak TW (2007) Метаболический таргетинг как противораковая стратегия: рассвет новой эры? Sci STKE 2007: e14
12 Rajaganeshan R, Prasad R, Guillou PJ, Poston G, Scott N, Jayne DG (2008) The role of hypoxia in recurrence after resection of Dukes’ B colorectal cancer. Int J Colorectal Dis 23: 1049-1055
13 Rajaganeshan R, Prasad R, Guillou PJ, Scott N, Poston G, Jayne DG (2009) Expression patterns of hypoxic markers at the invasive margin of colorectal cancers and liver metastases. Eur J Surg Oncol 35 (12): 1286-1294
14 Rardin MJ, Wiley SE, Naviaux RK, Murphy AN, Dixon JE (2009) Monitoring phosphorylation of the pyruvate dehydrogenase complex. Anal Biochem 389: 157-164
15 Shike M, Winawer SJ, Greenwald PH, Bloch A, Hill MJ, Swaroop SV (1990) Primary prevention of colorectal cancer. Сотрудничающий центр ВОЗ по профилактике колоректального рака. Bull World Health Organ 68: 377-385
16 Shin YK, Yoo BC, Hong YS, Chang HJ, Jung KH, Jeong SY, Park JG (2009) Upregulation of glycolytic enzymes in proteins secreted from human colon cancer cells with 5-fluorouracil resistance. Электрофорез 30: 2182-2192
17 Stacpoole PW (1989) Фармакология дихлорацетата. Метаболизм 38: 1124-1144
18 Stacpoole PW, Henderson GN, Yan Z, James MO (1998) Clinical pharmacology and toxicology of dichloroacetate. Environ Health Perspect 106 (Suppl 4): 989-994
19 Stacpoole PW, Nagaraja NV, Hutson AD (2003) Efficacy of dichloroacetate as a lactate-lowering drug. J Clin Pharmacol 43: 683-691
20SunRC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC (2009) Обращение гликолитического фенотипа дихлорацетатом подавляет рост метастатических клеток рака молочной железы in vitro и in vivo. Breast Cancer Res Treat 120 (1): 253-260
21 Thorn CC, Freeman TC, Scott N, Guillou PJ, Jayne DG (2009) Laser microdissection expression profiling of marginal edges of colorectal tumours reveals evidence of increased lactate metabolism in the aggressive phenotype. Gut 58: 404-412
22 Статистика рака кишечника в Великобритании (2009) http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/bowel/
23 Варбург О (1956) О происхождении раковых клеток. Science 123: 309-314
24 Whitehouse S, Randle PJ (1973) Активация пируватдегидрогеназы в перфузированном сердце крысы дихлорацетатом. Biochem J 134: 651-653
25 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I (2008) Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells. Gynecol Oncol 109: 394-402
26 Wu M, Neilson A, Swift AL, Moran R, Tamagnine J, Parslow D, Armistead S, Lemire K, Orrell J, Teich J, Chomicz S, Ferrick DA (2007) Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol 292: C125-C136
27 Yeluri S, Madhok B, Prasad KR, Quirke P, Jayne DG (2009) Пристрастие рака к сахару: возможность для клинического использования. J Cancer Res Clin Oncol 135: 867-877

Добавить комментарий