📖 21 mins.

Jingtao Tong, Ganfeng Xie, Jinxia He, Jianjun Li, Feng Pan en Houjie Liang

Afdeling Oncologie, Zuidwest Ziekenhuis, Derde Militaire Medische Universiteit, 29 Gaotanyan Street, Chongqing 400038, China

Correspondentie dient te worden gericht aan Houjie Liang, [email protected] Ontvangen 27 mei 2010; Herzien 29 december 2010; Aanvaard 13 januari 2011

Academische redacteur: Miguel A. Andrade

Copyright © 2011 Jingtao Tong et al. Dit is een open access artikel verspreid onder de Creative Commons Naamsvermelding Licentie, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie toestaat in elk medium op voorwaarde dat het originele werk correct wordt geciteerd.

Dichlooracetaat (DCA), een remmer van pyruvaatdehydrogenase kinase (PDK), is onlangs aangetoond als een veelbelovend niet-toxisch antineoplastisch middel dat apoptose van kankercellen bevordert. In deze studie onderzochten wij het antitumoreffect van DCA in combinatie met 5-fluorouracil (5-FU) op colorectale kanker (CRC). Vier menselijke CRC-cellijnen werden behandeld met DCA of 5-FU, of een combinatie van DCA en 5-FU. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-difenyltetrazoliumbromide-test. De interactie tussen DCA en 5-FU werd geëvalueerd met het mediaan effectprincipe. Immunocytochemie met broomodeoxyuridine (BrdU) werd uitgevoerd om de proliferatie van CRC-cellen te bepalen. Celcyclus en apoptose werden gemeten met flowcytometrie, en de expressie van apoptose-gerelateerde moleculen werd beoordeeld met western blot. Onze resultaten toonden aan dat DCA de levensvatbaarheid van CRC-cellen remde en in combinatie met 5-FU synergetische anti-proliferatie had. Bovendien werd, vergeleken met 5-FU alleen, de apoptose van CRC-cellen behandeld met DCA en 5-FU versterkt en aangetoond met de veranderingen van Bcl-2, Bax en caspase-3 eiwitten. Onze resultaten suggereren dat DCA een synergetisch antitumoreffect heeft met 5-FU op CRC-cellijnen in vitro.

1. Inleiding

Dikkedarmkanker is een van de meest voorkomende maligniteiten wereldwijd [1]. Naast chirurgie berust de behandeling van CRC-patiënten voornamelijk op chemotherapie, vooral bij patiënten met gevorderd CRC. Van de chemotherapeutische middelen voor CRC is 5-Fluorouracil (5-FU), een klassiek chemotherapeutisch middel, al tientallen jaren de eerstelijnsbehandeling voor de behandeling van CRC [2, 3]. 5-FU alleen is echter slecht selectief voor de tumor en zeer toxisch voor beenmerg, maagdarmkanaal en huid bij gebruik in de therapeutische dosis [4].

Metabole afwijkingen zijn een van de belangrijkste kenmerken van kanker [5]. Al in de jaren 1920 stelde Otto Warburg vast dat kankercellen voor hun energie over het algemeen eerder gebruik maken van glycolyse dan van oxidatieve fosforylering [6]. Zo wordt de metabole omschakeling naar anaërobe ademhaling door glycolyse uit pyruvaat, in plaats van pyruvaatomzetting in acetyl-CoA door de werking van pyruvaatdehydrogenase (PDH) in het aërobe glucosemetabolisme, een preferentieel fenotype van de voortgang van kanker. PDH kan worden geïnactiveerd door pyruvaat dehydrogenase kinase (PDK) in vele glycolytische fenotypen, waaronder kanker, terwijl remming van PDK het metabolisme overschakelt op aërobe oxidatie, hetgeen nadelig blijkt te zijn voor de groei van tumoren [7].

Dichlooracetaat (DCA) is een prototypische remmer van de mitochondriale PDK. Door het enzym te blokkeren vermindert DCA de lactaatproductie door het metabolisme van pyruvaat te verschuiven van glycolyse naar oxidatie in de mitochondriën. Deze eigenschap heeft geleid tot proeven met DCA voor de behandeling van melkzuurstoornissen [8]. Onlangs hebben studies aangetoond dat DCA de groei van tumoren onderdrukt via remming van PDK [9-11]. Michelakis en zijn collega’s ontdekten dat DCA de mitochondriale functie herstelt, waardoor apoptose optreedt, kankercellen in vitro worden gedood en de tumoren bij de ratten krimpen [12].

Combinatiechemotherapie is op grote schaal toegepast. 5-FU wordt gewoonlijk gecombineerd met andere antineoplastische middelen en bestraling om het antitumoreffect te versterken. De klinische insufficiëntie lijkt te worden veroorzaakt door de resistentie van 5-FU en ernstige bijwerkingen. De sterke en selectieve inductie van apoptose suggereert dat de PDK-remmer DCA het remmende effect van antikankergeneesmiddelen kan versterken en zo de efficiëntie van de huidige behandeling kan overtreffen. Wij onderzochten hier de gecombineerde antitumoreffecten van DCA met 5-FU op CRC-cellen, in de hoop een relatief effectief en veilig gepotentieerd regime voor de behandeling van CRC te beoordelen.


2. Materiaal en methoden

2.1. Cellen en Regenten. De menselijke colonkanker cellijnen LS174T, LoVo, SW620, en HT29 werden gekocht van American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celcultuurreagentia werden gekocht van Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). De cellijnen werden onderhouden in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium of Leibovitz L-15 medium met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 ug/mL streptomycine in een 37◦C, 5% CO2 bevochtigde incubator. 5-FU en DCA werden gekocht van Sigma-Aldrich Co. Ltd. (St. Louis, MO, USA), opgelost in gedeïoniseerd water tot een werkoplossing van 1 mol/L, gefilterd en vervolgens verdund in groeimedium voor behandeling.

2.2. Analyse van de levensvatbaarheid van de cellen. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide-test (MTT) (Sigma-Aldrich). De cellen werden uitgezaaid in 96-wellsplaten (5 × 104 cellen per well) en onder standaardgroeicondities overnacht geïncubeerd van 60% tot 70% confluentie. De cellen werden vervolgens behandeld met alleen DCA (eindconcentratie 0-90 mM) of met DCA in combinatie met 5-FU (5-200 μM). Na een behandeling van 48 uur werden de cellen nog eens 4 uur bij 37◦Cgeïncubeerd met MTT (20 μLper well) en de absorptie bij 490 nm werd gemeten in een BioRad Model 550 plate reader (Hercules, CA, USA).

2.3. Analyse van de interactie tussen geneesmiddelen. De interactie tussen DCA en 5-FU werd geanalyseerd met behulp van het mediane effectprincipe dat is beschreven door Chou en Talalay [13, 14]. Met het programma kunnen combinatie-indices (CI’s) worden berekend die, indien kleiner dan 1, gelijk aan 1 of groter dan 1, duiden op respectievelijk synergisme, additiviteit of antagonisme tussen twee geneesmiddelen. De CI’s werden berekend door waarbij (Dx)1 en (Dx)2 de concentraties zijn van DCA alleen of 5-FU alleen, die x% groeiremming geven, en (D)1 en (D)2 de geneesmiddelconcentraties in combinatie die ook x% celgroei remmen.

(Dx)1 en (Dx)2 werden berekend met de mediaan-effect-vergelijking:


waarbij Dm de mediaan-effectdosis is, fa de geabsorbeerde fractie en m de helling van de mediaan-effectplot.

2.4. Celdelingstests. Immunocytochemie werd uitgevoerd met broomodeoxyuridine (BrdU) (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) in vitro. De cellen werden vermeerderd op dekglaasjes in 12-wellsplaten onder standaardgroeiomstandigheden. Na 24 uur werden verschillende concentraties DCA, 5-FU of een combinatie van twee geneesmiddelen toegevoegd. De cellen werden gedurende 12 uur van serum ontdaan in groeimedia met 0,5% FBS om de celcyclus terug te zetten naar de G0-fase, en vervolgens werden de cellen gedurende 2 uur gepulst met 10 μmol/LBrdU in groeimedia. Vervolgens werden de cellen gefixeerd, gewassen en gekleurd volgens de instructies van de fabrikant.

Celcyclusanalyse werd indirect bepaald met propidiumjodide (PI, BD Bioscience) kleuring door flowcytometrie (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). De cellen werden uitgezaaid in 6-well platen en gekweekt met of zonder 10 mM DCA of 20 uM5-FU. Na incubatie gedurende 48 uur werden de cellen geoogst met 0,25% trypsine-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 70% alcohol gedurende 24 uur bij 4◦Cen tweemaal gewassen met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). RNAase (100 ul; 1 mg/ml) (BD Bioscience) werd toegevoegd en de cellen werden gedurende 30 minuten geïncubeerd in een waterbad van 37◦C. Na kleuring met 200 piPI (50 μg/mL) werden de cellen gedurende 30 minuten bij 4◦Cgehouden. Ten slotte werden de cellen geanalyseerd door middel van flowcytometrie.

2.5. Apoptosetest. Apoptose werd gedetecteerd door flowcytometrie met annexine-V-FITC (BD Bioscience) en PI. De cellen werden uitgezaaid in platen met 6 putjes. Na een incubatie van 48 uur met of zonder geneesmiddelen werden de cellen gewassen en geresuspendeerd in 0,5 ml PBS buffer. Na kleuring met annexine-V-FITC en PI werden de cellen in drie onafhankelijke experimenten geanalyseerd met flowcytometrie.

2.6. Western Blot. De cellen werden geoogst en de totale eiwitten werden geëxtraheerd met RIPA buffer die proteaseremmers bevatte. Totaal eiwit (50 μg) werd onderworpen aan 10% of 12% SDS/PAGE, en de opgeloste eiwitten werden elektroforetisch overgebracht op PVDF-membranen (Millipore, Bedford, MA, USA). De membranen werden gedurende 2 uur geblokkeerd met 5% vetvrije melk in TBS buffer met 0,05% Tween-20 (TBST) bij 4◦C. De membranen werden vervolgens geïncubeerd met antilichamen tegen Bax, Bcl-2, Caspase-3 en GADPH gedurende één nacht bij 4◦C. Na wassen in TBST werden de membranen gedurende 1 uur geïncubeerd met hun respectieve secundaire antilichamen.

De membranen werden vervolgens gedurende 1 minuut geïncubeerd met SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA) en afgebeeld met een Gel Doc XR-systeem (Bio-Rad). Alle antilichamen werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

2.7. Statistieken. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde van de standaarddeviatie (SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met de software SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). De verschillen tussen de twee groepen werden bepaald met de gepaarde steekproef t-test of de onafhankelijke steekproef t-test(met twee staarten), zoals aangegeven. De verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd met een eenzijdige variantieanalyse (ANOVA). P < .05 werd als statistisch significant beschouwd.

3. Resultaten

3.1. Levensvatbaarheid van CRC-cellen behandeld met DCA alleen of in combinatie met 5-FU. Om het effect van DCA op CRC-cellen te bepalen, werden de cellen gedurende 48 uur blootgesteld aan DCA (0-90 mM). Het resultaat toonde aan dat het remmende effect dosisafhankelijk was. Zoals blijkt uit figuur 1, was de remming van de levensvatbaarheid van kankercellijnen die met 50 mM DCA werden behandeld

als volgt: SW620 (46,73% ± 5 ,21%), LoVo (30,94% ± 3,57%), LS174t (54,59% ± 3 ,93%), en HT29 (55,31% ± 3,35%). Wij behandelden cellen met 5-FU (20-100 uM) en ontdekten dat de levensvatbaarheid van SW620, LoVo, LS174t aanzienlijk werd geremd, behalve die van HT29, waarvan de levensvatbaarheid niet duidelijk werd geremd onder 80 uM5-FU. Bij gelijktijdige behandeling met deze twee geneesmiddelen werd de levensvatbaarheid van de bovengenoemde CRC-cellen aanzienlijk verminderd in vergelijking met DCA of 5-FU alleen (de IC50-waarden staan in tabel 1).

3.2. Synergetische effecten van DCA gecombineerd met 5-FU in CRC-cellijnen. De levensvatbaarheid van CRC-cellen werd verminderd in aanwezigheid van 5-FU en DCA. DCA versterkte de remmende effecten van 5-FU op CRC-cellen, en de invloed van DCA op de effecten van 5-FU was dosisafhankelijk (figuur 1). De interactie tussen 5-FU en DCA werd geanalyseerd met de mediane effectenmethode. De combinatie van DCA en 5-FU produceerde synergetische of additieve effecten, afhankelijk van het bereik van het celdodingsniveau (Fa). Alle vier CRC-cellijnen vertoonden een synergetisch effect met 5-FU en DCA. Het synergisme was statistisch significant in LS174t bij remmingsniveaus van 50% en 80%, met CI-waarden tussen 0,46 en 0,61, en in HT-29 cellijn bij remmingsniveaus van 50 en 80%, met CI-waarden tussen 0,42 en 0,52. In SW620- en LoVo-cellen waren de CI-waarden bij een remmingsniveau van 50% en 80% respectievelijk 0,64-0,75 en 0,75-0,94 (figuur 2).

3.3. DCA verhoogde de Efficiëntie van het antiproliferatieve Effect van 5-FU. Om te bevestigen dat de verminderde levensvatbaarheid van de cellen het gevolg was van verminderde proliferatie, werden immunocytochemie en flowcytometrie toegepast. De cellen werden behandeld met 10 mM DCA in combinatie met 20 μM 5-FU. Zoals verwacht vertoonden de met DCA behandelde cellen een verminderde proliferatie in vergelijking met onbehandelde cellen. Het aantal BrdU-positieve cellen op vier CRC-cellijnen na behandeling met 5-FU en DCA was respectievelijk 11,4 ± 2,12, 13,55 ± 3,10, 12,84 ± 1,34, en 18,83 ± 1,45, hetgeen lager was dan bij behandeling met 5-FU of DCA alleen (P < .01, zie Tabel 2). Bovendien versterkte de behandeling met DCA de celcyclusstilstand in de G1-fase. Bij behandeling met DCA en 5-FU werden de cellen in de G1/S-fase meer geblokkeerd dan bij behandeling met DCA of 5-FU alleen (figuur 3).

3.4. Verhoogde apoptose geïnduceerd door DCA gecombineerd met 5-FU in CRC-cellen. Om de verminderde levensvatbaarheid van CRC-cellen behandeld met een combinatietherapie verder te onderzoeken, werd apoptose bepaald door flowcytometrie. Zoals blijkt uit figuur 4, verhoogde DCA alleen het percentage apoptose bij CRC-cellen. Bij behandeling met 10 mM DCA bedroeg het apoptosepercentage van vier CRC-cellijnen respectievelijk 15,72 ± 1 ,63%, 11,32 ± 0 ,74%, 9,77 ± 0 ,53% en 14,52 ± 1 ,00%, terwijl de apoptosepercentages Tabel 1: IC50-waarden (concentraties die nodig zijn om de levensvatbaarheid van cellen met 50% te verminderen ten opzichte van de controlecellen) werden berekend met behulp van lineaire of niet-lineaire regressie (drie parametrische Hill-functie) (R2> 0 ,9). Zij worden weergegeven als gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. IC50-waarden van de bestudeerde geneesmiddelen voor remming van de groei van verschillende cellijnen (de cellen werden gedurende 48 uur met de geneesmiddelen geïncubeerd).

Tabel 2: SW620, LoVo, LS174t, HT29-cellen, en 293T niet-kankerachtige controles werden behandeld met 10 mM DCA en 20 μM 5-FU alleen of in combinatie gedurende 48 uur, en vervolgens gepulst met BrdU. De cellen werden vervolgens geoogst en gekleurd, en de aantallen BrdU+-cellen werden berekend als het gemiddelde aantal positieve cellen in acht verschillende gezichtsvelden in één beeld (vergroting 400X). Deze berekening werd driemaal herhaald. ∗P< .05, vergeleken met de controle. BrdU+ cellen in differente medicijnbehandeling (%, gemiddelde ± SD).

waren 9,14 ± 119%, 8,82 ± 0 ,41%, 10,31 ± 0 ,71%, en 7,27 ±0 ,96% met 5-FU. Wanneer een combinatie van DCA en 5-FU werd toegepast, was het apoptosepercentage veel hoger dan bij 5-FU of DCA alleen (P < .05), wat aangaf dat het apoptose-effect via de combinatie DCA en 5-FU werd verhoogd (figuur 4).

3.5. Veranderingen in apoptose-geassocieerde moleculen gestimuleerd door DCA en 5-FU. Om te bevestigen dat de verhoogde apoptose door combinatietherapie het gevolg was van gewijzigde expressies van apoptose-geassocieerde moleculen, werd een western blot test uitgevoerd. In figuur 5 gaven de resultaten aan dat 5-FU of DCA de expressie van Bcl-2 in vier CRC-cellijnen verminderde in vergelijking met PBS-controles, en dat de combinatie van DCA en 5-FU de expressie van Bcl-2 aanzienlijk verminderde in vergelijking met DCA of 5-FU alleen. Omgekeerd werd de expressie van Bax en caspase-3 significant verhoogd in de vier CRC-cellijnen die werden behandeld met een combinatie van DCA en 5-FU in vergelijking met hun afzonderlijk gebruik. De duidelijkste toename van Bax-expressie werd waargenomen in LS174t-cellen, terwijl in LoVo bleek dat de caspase-3-expressie het meest toenam (figuur 5).

4. Bespreking

In de huidige studie tonen wij aan dat DCA niet alleen de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen verminderde, maar ook de synergetische antitumorwerking met chemotherapeutisch middel 5-FU in vitro in CRC-cellen heeft.

Figuur 1: Levensvatbaarheid van vier CRC-cellijnen in reactie op behandeling met dichlooracetaat (DCA) en 5-fluorouracil (5-FU). De levensvatbaarheid van SW620, LoVo, LS174t en HT29 werd significant verminderd met differdere concentratie van 5-FU en DCA alleen of in combinatie. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd; ∗P < .05.

Ondertussen heeft DCA geen significant effect op niet-kankercellen. Verder toonden wij aan dat door DCA geïnduceerde apoptose bijdraagt aan het synergetische antitumoreffect. Vergeleken met DCA of 5-FU alleen, bevordert de combinatie van deze twee geneesmiddelen de apoptose van CRC-cellen. 5-FU is een chemotherapie die wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende soorten kanker, waaronder colorectale kanker, borstkanker, slokdarmkanker en maagkanker [15]. Aan 5-FU gerelateerde toxiciteit is echter een ernstig en veel voorkomend probleem voor veel kankerpatiënten, waarbij myelosuppressie en gastro-intestinale toxiciteit de meest waargenomen bijwerkingen zijn [16]. De klinische activiteit van 5-FU is bescheiden bij standaarddoses, en in het algemeen wordt de dosering beperkt door het veiligheidsprofiel. Bijgevolg staan wij gewoonlijk voor het dilemma beslissingen te nemen over de therapeutische dosis van 5-FU. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om de klinische activiteit van 5-FU te verbeteren, zoals biochemische modulatie [17], wijzigingen in het toedieningsschema [18] en het gebruik van combinatietherapie [19-22]. DCA is een geurloze, kleurloze, goedkope, relatief niet-giftige, kleine molecule. Het wordt sinds 1969 klinisch gebruikt voor de behandeling van melkzuursyndroom door het vermogen van de mitochondriën om energie te genereren te stimuleren en de ophoping van melkzuur te verminderen [23].

Figuur 2: Gemiddelde waarden van de combinatie-index bij de affecties van 50% (IC50) en 80% (IC80) wanneer 5-fluoruracil (5-FU) werd gecombineerd met dichlooracetaat (DCA) in HT-29, LoVo, LS174t en SW620-cellen. De gemiddelde IC50 en IC80 ±SD(n=3) worden getoond. Een CI-waarde significant lager dan 1 wijst op synergisme, een CI niet significant diff anders dan 1 wijst op toevoeging, en een CI significant hoger dan 1 wijst op antagonisme; ∗P< .05.
Figuur 3: Veranderingen in het verloop van de celcyclus in SW620-, LoVo-, LS174t- en HT29-cellen na 48 uur behandeling met 5-fluorouracil (5-FU) en dichlooracetaat (DCA), alleen of in combinatie toegepast. Elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD(n = 3 ). De uit FACS verkregen gegevens werden geanalyseerd met SPSS13.0; ∗P< .05.

DCA wordt beschouwd als een potentiële kankertherapie sinds een Canadese groep ontdekte dat het regressie veroorzaakte bij verschillende kankers, waaronder long-, borst- en hersentumoren [24, 25]. Bij toediening aan kankercellen schakelden de cellen over van glycolyse naar mitochondriale energieproductie. Bovendien helpen functionele mitochondriën de cellen functionele afwijkingen te herkennen en de celdood op gang te brengen doordat zij de tumorgroei afremmen en apoptose induceren bij bepaalde vormen van kanker. In de huidige studie vonden wij hetzelfde levensvatbaarheidsremmende effect in CRC’s, dat dosisafhankelijk was en varieerde met verschillende graden van tumordifferentiatie.

Figuur 4: Inductie van apoptose in SW620-, LoVo-, LS174t- en HT29-cellen na 48 uur behandeling met 5-fluoruracil (5-FU) en dichlooracetaat (DCA) alleen of in combinatie. Elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD(n = 3 ); ∗P< .05.

De resultaten wezen er ook op dat een lage dosis DCA een synergetisch effect uitoefent met chemotherapeutisch middel 5-FU bij het stoppen van de groei van CRC-cellen, hetgeen kwantitatief werd geanalyseerd volgens de Chou-Talalay-methode.

De resultaten van de celproliferatie toonden ook aan dat DCA het antiproliferatie-effect van 5-FU versterkte. Het aantal BrdU-positieve cellen nam af bij behandeling met 5-FU of DCA, terwijl het aantal met BrdU gevlekte cellen aanzienlijk afnam bij behandeling met een combinatie van 5-FU en DCA in vergelijking met hun afzonderlijk gebruik. Ondertussen ging de groeiremming van CRC-cellen gepaard met celcyclusstilstand. De combinatie van DCA en 5-FU induceerde celcyclusarrest in de G1/S-fase in CRC-cellijnen, terwijl de door 5-FU geïnduceerde arrestatie in de G1-fase niet duidelijk was. De inductie van celcyclusstilstand kan het gevolg zijn van een remmend vermogen om DNA te synthetiseren of te repareren, hetgeen kan leiden tot celapoptose.

DCA bleek biochemische effecten uit te oefenen die consistent zijn met het omkeren van het Warburg effect en het doden van kankercellen. Wij vonden dat DCA CRC-cellen apoptose induceerde, wat overeenkomt met de eerdere DCA-studies. Belangrijk is dat de combinatie van DCA met 5-FU het aantal apoptotische cellen verhoogde in vergelijking met 5-FU alleen, wat aantoont dat DCA de celgroei remde via apoptose.

Vele factoren die apoptose mediëren komen samen om de kritische effector caspase-3 te activeren, die wordt beschouwd als het belangrijkste protease van de caspase-familie in de apoptose van zoogdiercellen [26]. Het bestaat altijd als een 23 kD inactieve precursor in het cytoplasma, die wordt geactiveerd tijdens apoptose en deelneemt aan apoptose geïnduceerd door meerdere factoren. Caspase-afhankelijke apoptose pathway omvat voornamelijk mitochondria pathway, death receptor pathway, en endoplasmic reticulum pathway [27].

Figuur 5: Effecten van 5-fluorouracil (5-FU) en dichlooracetaat (DCA) op de expressie van apoptose-geassocieerde moleculen. Bcl-2 expressie werd significant verlaagd door DCA in SW620, LoVo, en LS174t en HT29 cellen. De expressieniveaus van Bax en caspase-3 waren hoger na blootstelling aan 5-FU en DCA in vergelijking met controle

En de mitochondria pathway wordt gecontroleerd en gereguleerd door de Bcl-2 familie van eiwitten [28, 29], die verdeeld zijn in twee delen, de anti-apoptotische leden (Bcl-2) en pro-apoptotische leden (Bax) [30]. Recente studie geeft aan dat Bcl-2 apoptose remt via remming van Bax verwijdering naar mitochondriale buitenmembraan [31]. Wij onderzochten de expressie van caspase-3, Bcl-2 en Bax op eiwitniveau en het resultaat van western blot toonde aan dat de expressie van caspase-3 en Bax was toegenomen, terwijl de expressie van Bcl-2 was afgenomen in de combinatie van DCA met 5-FU behandeling, vergeleken met de afzonderlijke behandelingen. Deze resultaten wijzen erop dat de door de combinatie van DCA en 5-FU geïnduceerde apoptose mogelijk verband houdt met de caspase-afhankelijke mitochondriënroute. Eerdere onderzoeken suggereerden dat de inductie van apoptose door DCA het gevolg was van de terugkeer van het disfunctioneren van de mitochondriën en de NFAT-Kv1.5 route [9, 12], die op hetzelfde punt waren gericht als de huidige studie, namelijk mitochondria-gemedieerde apoptose.

Erkenning

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr. 30873015). J. Tong en G. Xie hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.

Referenties

[1] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, Y. Hao, J. Xu, en M. J. Thun, “Cancer statistics, 2009,” CA Cancer Journal for Clinicians, vol. 59, no. 4, pp. 225-249, 2009.
[2] J. A. Meyerhardt en R. J. Mayer, “Drug therapy: systemic therapy for colorectal cancer,” The New England Journal of Medicine, vol. 352, no. 5, pp. 476-487, 2005.
[3] N. C. Tebbutt, E. Cattell, R. Midgley, D. Cunningham, and D. Kerr, “Systemic treatment of colorectal cancer,” European Journal of Cancer, vol. 38, no. 7, pp. 1000-1015, 2002.
[4] M. Gusella, A. C. Frigo, C. Bolzonella et al., “Predictors of survival and toxicity in patients on adjuvant therapy with 5- fluorouracil for colorectal cancer,” British Journal of Cancer, vol. 100, no. 10, pp. 1549-1557, 2009.
[5] D. Hanahan en R. A. Weinberg, “The hallmarks of cancer,” Cell, vol. 100, no. 1, pp. 57-70, 2000.
[6] Z. Chen,W. Lu, C. Garcia-Prieto, and P.Huang, “The Warburg effect and its cancer therapeutic implications,” Journal of Bioenergetics and Biomembranes, vol. 39, no. 3, pp. 267-274, 2007.
[7] Y. Chen, R. Cairns, I. Papandreou, A. Koong, andN. C. Denko, “Oxygen consumption can regulate the growth of tumors, a new perspective on theWarburg effect,” PLoS ONE, vol. 4, no. 9, Article ID e7033, 2009.
[8] A. Aynsley Green, A. M. Weindling, G. Soltesz, and P. A. Jenkins, “Transient lactic acidosis and hyperalaninaemia associated with neonatal hyperinsulinaemic hypoglycaemia: the effects of dichloroacetate (DCA),” European Journal of Pediatrics, vol. 141, no. 2, pp. 114-117, 1983.
[9] J. Y. Y. Wong,G. S. Huggins,M. Debidda, N. C.Munshi, and I. De Vivo, “Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells,” Gynecologic Oncology, vol. 109, no. 3, pp. 394- 402, 2008.
[10] W. Cao, S. Yacoub, K. T. Shiverick et al., “Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation,” Prostate, vol. 68, no. 11, pp. 1223-1231, 2008.
[11] E. D. Michelakis, L. Webster, and J. R. Mackey, “Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolic-targeting therapy for cancer,” British Journal of Cancer, vol. 99, no. 7, pp. 989-994, 2008.
[12] S. Bonnet, S. L. Archer, J. Allalunis-Turner et al., “A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth,” Cancer Cell, vol. 11, no. 1, pp. 37-51, 2007.
[13] T. C. Chou en P. Talalay, “Analysis of combined drug effects: a new look at a very old problem,” Trends in Pharmacological Sciences, vol. 4, pp. 450-454, 1983.
[14] T. C. Chou en P. Talalay, “Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors,” Advances in Enzyme Regulation, vol. 22, pp. 27-55, 1984.
[15] D. B. Longley, D. P. Harkin, and P. G. Johnston, “5- Fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies,” Nature Reviews Cancer, vol. 3, no. 5, pp. 330-338, 2003.
[16] M. W. Saif, A. Choma, S. J. Salamone, and E. Chu, “Pharmacokinetically guided dose adjustment of 5-fluorouracil: a rational approach to improving therapeutic outcomes,” Journal of the National Cancer Institute, vol. 101, no. 22, pp. 1543-1552, 2009.
[17] C.G. Leichman, K. Chansky, J. S. Macdonaldet al., “Biochemical modulation of 5-fluorouacil through dihydropyrimidine dehydrogenase inhibition: a Southwest OncologyGroup phase II trial of eniluracil and 5-fluorouracil in advanced resistant colorectal cancer,” Investigational New Drugs, vol. 20, no. 4, pp. 419-424, 2002.
[18] F. A. Levi, R. Zidani, J. M. Vannetzel et al., “Chronomodulated versus fixed-infusion-rate delivery of ambulatory chemotherapy with oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid (leucovorin) in patients with colorectal cancer metastases: a randomized multi-institutional trial,” Journal of the National Cancer Institute, vol. 86, no. 21, pp. 1608-1617, 1994.
[19] G. Melen-Mucha, E. Balcerczak, S. Mucha, M. Panczyk, S. Lipa, and M. Mirowski, “Expression of p65 gene in experimental colon cancer under the influence of 5-fluorouracil given alone and in combination with hormonal modulation,” Neoplasma, vol. 51, no. 4, pp. 319-324, 2004.
[20] F. Richards II, L. D. Case, and D. R. White, “Combination chemotherapy (5-fluorouracil, methyl-CCNU, mitomycin C) versus 5-fluorouracil alone for advanced previously untreated colorectal carcinoma. A phase III study of the piedmont oncology association,” Journal of Clinical Oncology, vol. 4, no. 4, pp. 565-570, 1986.
[21] A. Aquino, S. P. Prete, J. W. Greiner et al., “Effect of the combined treatment with 5-fluorouracil, γ-interferon or folinic acid on carcinoembryonic antigen expression in colon cancer cells,” Clinical Cancer Research, vol. 4, no. 10, pp. 2473- 2481, 1998.
[22] S. Obi, H. Yoshida, R. Toune et al., “Combination therapy of intraarterial 5-fluorouracil and systemic interferon-alpha for advanced hepatocellular carcinoma with portal venous invasion,” Cancer, vol. 106, no. 9, pp. 1990-1997, 2006.
[23] P. W. Stacpoole, “Review of the pharmacologic and therapeutic effects of diisopropylammonium dichloroacetate (DIPA),” The Journal of Clinical Pharmacology, vol. 9, no. 5, pp. 282- 291, 1969.
[24] S. Bonnet, S. L. Archer, J. Allalunis-Turner et al., “A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth,” Cancer Cell, vol. 11, no. 1, pp. 37-51, 2007.
[25] E. D.Michelakis, G. Sutendra, P.Dromparis et al., “Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate,” Science Translational Medicine, vol. 2, no. 31, pp. 31-ra34, 2010.
[26] T. Fernandes-Alnemri, G. Litwack, and E. S. Alnemri, “CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1β-converting enzyme,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 269, no. 49, pp. 30761-30764, 1994.
[27] H. Mehmet, “Caspases find a new place to hide,” Nature, vol. 403, no. 6765, pp. 29-30, 2000.
[28] E. Yang en S. J. Korsmeyer, “Molecular thanatopsis: a discourse on the BCL2 family and cell death,” Blood, vol. 88, no. 2, pp. 386-401, 1996.
[29] D. R. Green en J. C. Reed, “Mitochondria and apoptosis,” Science, vol. 281, no. 5381, pp. 1309-1312, 1998.
[30] J. C. Reed, “Double identity for proteins of the Bcl-2 family,” Nature, vol. 387, no. 6635, pp. 773-776, 1997.
[31] B. Antonsson, S. Montessuit, B. Sanchez, and J. C. Martinou, “Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 276, no. 15, pp. 11615- 11623, 2001.

Geef een reactie