Listen to this article
­čôľ 30 mins.

Tatjana Harting1, Mandy Stubbendorff 2, Saskia Willenbrock1, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek3, Anaclet Ngezahayo3, Hugo Murua Escobar1, Ingo Nolte1

1 Kliniek voor Kleine Dieren, Universiteit voor Diergeneeskunde Hannover, Stichting, D-30559 Hannover
2 Afdeling Geneeskunde Kliniek III, Hematologie, Oncologie en Palliatieve Geneeskunde, Universiteit van Rostock, D-18057 Rostock
3 Evotec AG, D-22419 Hamburg
4 Instituut voor Biofysica, Universiteit Leibniz, D-30419 Hannover, Duitsland


Correspondentie: Professor Ingo Nolte, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, B├╝nteweg 9, D-30559 Hannover, Duitsland; E-mail: [email protected]

Ontvangen: 12 juli 2016
Geaccepteerd: 5 september 2016
Online gepubliceerd: 5 oktober 2016

Abstract

Het Warburg-effect beschrijft het vermogen van kankercellen om energie te produceren via aerobe glycolyse in plaats van oxidatieve fosforylering van pyruvaat. Deze afwijking in mitochondriaal metabolisme remt apoptose, waardoor verhoogde proliferatie onder omstandigheden van verlaagde zuurstofniveaus mogelijk is. Dichlooracetaat (DCA) werd met succes gebruikt in verschillende menselijke kankercellijnen om de oxidatieve fosforylering in mitochondri├źn te reactiveren. Het doel van deze studie was de karakterisering en respons van kankercellijnen van honden na blootstelling aan DCA. Het effect van 10 mM DCA werd in vitro gekarakteriseerd op zes van prostaat-adenocarcinoom en overgangscelcarcinoom (TCC) afgeleide cellijnen. Celtellingen, lactaatniveaus, apoptose, expressie van apoptotische eiwitten, overlevingsfactoren en verschillende miRNA’s werden geanalyseerd. Daarnaast werden metabolische activiteit, mitochondriale activiteit en proliferatie onderzocht. DCA verminderde significant het aantal cellen van alle gebruikte cellijnen, op ├ę├ęn na, en leidde tot een significante vermindering van de lactaatafgifte. Verminderde survivin niveaus werden gevonden in alle cellijnen, waarvan er twee een significante vermindering in metabolische activiteit vertoonden. Verhoogde miR-375-niveaus werden gemeten in alle TCC-cellijnen. Reactivering van pyruvaatdehydrogenase en een verhoogde mitochondriale activiteit lijken de overgang van a├źrobe glycolyse naar oxidatieve fosforylering te induceren. Verder blijkt uit deze resultaten dat DCA-behandeling een onderdrukkend effect heeft op de proliferatie van kankercellen bij de hond.


Trefwoorden: dichlooracetaat, canine prostaat adenocarcinoom, canine transitiecelcarcinoom, Warburg effect
DOI: 10.3892/ijo.2016.3720


INLEIDING

In de afgelopen jaren werden kankerbehandelingen zoals chemotherapie, bestraling en chirurgie, zoals ze worden gebruikt bij de behandeling van kanker bij de mens, belangrijker in de diergeneeskunde. Conventionele chemotherapeutische middelen richten zich op delende cellen, zowel kankercellen als niet-neoplastische cellen, en veroorzaken verschillende bijwerkingen zoals myelosuppressie, diarree, braken en anorexia [1]. Bovendien is de behandeling moeilijk en vaak geassocieerd met een slechte prognose vanwege het gevorderde ziektestadium en de resistentie van prostaat- en blaaskanker [2,3]. Daarom moeten nieuwe, effectievere alternatieven worden onderzocht.

Dichlooracetaat (DCA), een kleine en goedkope molecule, be├»nvloedt verschillende metabolische routes door pyruvaat dehydrogenase kinase (PDK) te remmen [4,5]. Dit impliceert dat pyruvaatdehydrogenase (PDH) mogelijk indirect wordt geactiveerd door DCA, waardoor een metabole verschuiving optreedt ten gunste van oxidatie van pyruvaat tot acetyl-co-enzym-A in mitochondri├źn [5]. Ondanks dit feit is DCA de afgelopen decennia gebruikt bij de behandeling van een groot aantal aandoeningen zoals congenitale lactaatacidose [6,7], hypercholesterolemie [8], hyperglykemie [9], congestief hartfalen [10] en pas recentelijk bij kankeronderzoek [11-16]. DCA werd getest in verschillende in vitro-benaderingen op het gebied van menselijke oncologie, waaronder colorectale kanker [17,18], endometriumkanker [14], oraal plaveiselcelcarcinoom [19] en borstkanker [20]. In een klinische studie waarin pati├źnten met glioblastoom en andere vaste tumoren werden geanalyseerd, verminderde DCA de tumorgroei en de angiogenese [15]. Met uitzondering van enkele onderzoeken naar de farmacokinetische effecten van DCA bij honden [21-23], zijn er momenteel geen publicaties over het effect van DCA bij kanker bij honden. DCA werd echter met succes gebruikt bij honden met melkzuursyndroom [24] en wordt naar verluidt goed verdragen bij honden [22]. Ernstige bijwerkingen zoals dood en verlamming werden alleen waargenomen in een langdurig onderzoek met hoge doses [21].

Onder a├źrobe omstandigheden gaan niet-neoplastische cellen over tot glucose-oxidatie via mitochondri├źn die pyruvaat oxideren tot acetyl-co-enzym-A [25]. PDH zorgt ervoor dat pyruvaat de mitochondri├źn binnenkomt. De energieproductie van kankercellen wordt hoofdzakelijk verschoven van glucose-oxidatie naar a├źrobe glycolyse, wat leidt tot een verhoogde cytosolische lactaatproductie ondanks het feit dat er voldoende zuurstof beschikbaar is [26]. Dit gedrag wordt Warburg-effect genoemd. De biochemicus Otto Warburg meldde deze kenmerken voor het eerst in 1926 en veronderstelde dat mitochondriaal falen de reden zou kunnen zijn [26]. Carcinogenese vindt bij voorkeur plaats in hypoxische weefsels waar het glucoseverbruik laag is. Dienovereenkomstig wordt hypoxie-induceerbare factor 1╬▒ geactiveerd en leidt tot een upregulatie van glucosetransporters en PDK. Activering van PDK leidt tot remming van PDH en dus tot glycolyse [27,28]. Door deze metabole verandering en de afname van mitochondriale depolarisatie hebben kankercellen een overlevingsvoordeel en worden ze niet be├»nvloed door intrinsieke apoptosewegen [29,30].

Voor de preklinische beoordeling van geneesmiddelen tegen kanker zijn in vitro experimenten met cellijnen belangrijke benaderingen in zowel humaan als veterinair onderzoek. In vitro onderzoek biedt de mogelijkheid om meer informatie te krijgen over de werkzaamheid en gevoeligheid van verschillende tumoren [31-33]. In deze studie werden verschillende gevestigde [34] en nieuwe cellijnen gebruikt.

Voor zover wij weten is dit de eerste studie waarin het effect van DCA op prostaatadenocarcinoom- en overgangscelcarcinoom (TCC)-cellen bij de hond is onderzocht. De invloed van DCA op celtellingen, lactaatniveaus, mitochondriale activiteit, apoptose en metabolische activiteit werd bepaald. Daarnaast werd het effect van DCA op PDH en op apoptose betrokken eiwitten ge├źvalueerd. Het effect van DCA op verschillende microRNA’s (miR) is nog niet eerder bepaald. Verder is er geen literatuur over de invloed van DCA op blaaskanker bij de mens of in de diergeneeskunde.

Materialen en methoden

Cellijnen en celkweek

Drie canine prostaatadenocarcinoom (DT08/46, CT1258, DT15/08) en drie canine TCC (DT08/40, DT15/06, DT15/09) werden gebruikt voor experimenten. Twee TCC-cellijnen (DT08/40 en DT15/09) waren afkomstig van prostaatweefsel en ├ę├ęn TCC (DT15/06) van vrouwelijk blaasweefsel. De cellijnen werden na pathohistologisch onderzoek van de oorspronkelijke weefsels ingedeeld als prostaatadenocarcinoom of TCC. Alle cellijnen werden vastgesteld in de Kliniek voor Kleine Dieren, Universiteit voor Diergeneeskunde Hannover, Duitsland. De cellijnen werden gekweekt in kolven van 75 cm2 (TPP, Faust Lab Science, Klettgau, Duitsland) met 10 ml medium 199 (GibcoÔäó, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Duitsland), 10% foetaal kalfsserum (Hyclone┬«, Thermo Fisher Scientific), 2% penicilline-streptomycine (Biochrom, Berlijn, Duitsland); het medium werd om de 48 uur ververst. De cellen mochten groeien tot een dichtheid van 90% voordat ze 1:3 werden gesplitst. De cellen werden ge├»ncubeerd bij 37┬░C en 5%CO2 in vochtige lucht. Voor de experimenten werden de cellen behandeld met 10 mM DCA (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Duitsland) gedurende 48 uur. Voor het splitsen van de cellen of na de behandelingsperiode werden de cellen getrypsiniseerd met TrypLEÔäó Express (GibcoÔäó, Thermo Fisher Scientific) en het aantal cellen werd geteld met een geautomatiseerde CellometerÔäó Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) en vergeleken met de negatieve controle. De cellen werden gewassen met PBS (Biochrom) en opgeslagen bij -80┬░C voor verder onderzoek (kwantitatieve RT-PCR en eiwitanalyse). DCA werd opgelost in gede├»oniseerd water, gefilterd en de pH werd met NaOH op 7,4 gebracht. De dosis van 10 mM werd gekozen volgens eerdere studies met menselijke HeLa-cellen [14]. Ook al zou deze concentratie in vivo niet veilig kunnen worden bereikt, toch werd deze concentratie gekozen om de vergelijkbaarheid met andere menselijke in vitro studies mogelijk te maken.

Lactaatniveaus

Voor lactaatniveau metingen werd het supernatant van de celkweek gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 10 minuten om zwevende cellen en debris te verwijderen en 1,3 ml werd overgebracht in een natriumfluoridevat (Sarstedt, N├╝mbrecht, Duitsland). Om veranderingen als gevolg van fenolrood en lactaat uit foetaal kalfsserum te elimineren, werd medium gebruikt als negatieve controle en afgetrokken van de metingen. De colorimetrische bepaling van lactaat werd uitgevoerd met Cobas┬« C311 (Hitachi, Tokio, Japan). Om de beoordeelde lactaatniveaus te relateren aan het aantal cellen en het celvolume, werd het totale lactaatgehalte genormaliseerd aan de intracellulaire eiwitconcentratie, die werd bepaald met PierceÔäó BCA-assay (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant.

Metabolische activiteit

De cellen werden uitgezaaid in een 96-wells plaat (Falcon, Corning, Amsterdam, Nederland) met 200 ╬╝l medium 199, 10% foetaal kalfsserum, 2% penicilline-streptomycine en ge├»ncubeerd bij 37┬░C en 5% bevochtigdeCO2. Het medium werd om de 24 uur ververst en voor de meting werd in elk putje 20 ╬╝l MTT (CellTiter96┬« Aqueous One Solution assay, Promega, Mannheim, Duitsland) toegevoegd. De absorptie werd na 2 uur bepaald met een Synergy2-plaatlezer (BioTek, Bad Friedrichshall, Duitsland). Over een periode van vier dagen werden elke 24 uur metingen verricht. De gegevens werden geanalyseerd met Gen5Ôäó 1.11 Software (BioTek) en genormaliseerd naar de negatieve controle van het medium.

Stroomcytometrie

Voor de bepaling van apoptose werden105 cellen gekweekt in een 6-well-plate (TPP, Faust Lab Science) met 4 ml medium en behandeld met 10 mM DCA zoals hierboven beschreven gedurende 48 uur. Na deze periode werden de cellen getrypsiniseerd en gecentrifugeerd samen met medium dat niet-vastzittende en dode cellen bevatte bij 1.000 rpm gedurende 6 minuten. Het supernatant werd weggegooid en de cellen werden geresuspendeerd in 500 ╬╝l testbuffer. Kleuring werd uitgevoerd met 5 ╬╝l Annexin-FITC en 1 ╬╝l Sytox (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg, Duitsland). Na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur werden104 cellen geanalyseerd met BD FACScaliburÔäó (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland) en CellQuestÔäó Pro 6.0 software (BD Biosciences). Annexine en Sytox werden gedetecteerd in FL-1. Gegevensanalyse werd uitgevoerd met FlowJo versie 10.0.8r1 (FlowJo, Ashland, OR, USA). De poorten werden bepaald door het gemiddelde van positieve controles (met Saponine gepermeabiliseerde cellen) en negatieve controles van elke cellijn (niet-behandelde levensvatbare cellen).

RNA-isolatie en kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd ge├»soleerd uit106 cellen met behulp van de NucleoSpin Small RNA kit (Macherey Nagel, D├╝ren, Duitsland) zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. cDNA werd bereid met 35 ng totaal RNA door omgekeerde transcriptie met behulp van TaqMan┬« MicroRNA Reverse Transkription kit (Applied BiosystemsÔäó, Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Relatieve kwantificering van microRNA expressie van behandelde cellen in vergelijking met negatieve controle werd uitgevoerd met Eppendorf realplex4 Cycler (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland) met 1.33 ╬╝l cDNA in een totaal volume van 20 ╬╝l met TaqMan┬« Universal Master Mix NoAmpErase┬« UNG (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) en TaqMan┬« MicroRNA-assays voor Mir-141 (ID 245445_mat), Mir-145 (ID 002278), Mir-375 (ID 000564), gekocht van Thermo Fisher Scientific. Procedure werd gehandhaafd zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Gegevens werden genormaliseerd naar het huishoudgen RNU6B (ID 001093) en analyse werd uitgevoerd met Rest2009 (Qiagen, Hilden, Duitsland).

Luminex-magneetkraalanalyse

Eiwitexpressieanalyse werd uitgevoerd met xMAP┬« Luminex Bead Technology met een Luminex 200Ôäó instrument (Luminex Corp., Hertogenbosch, Nederland). Gegevens worden weergegeven als totale hoeveelheid (survivin pg/ml) of netto MFI (andere targets) en werden getoond met xPONENT 3.1 software (Luminex Corp.). Monsterresultaten met lagere waarden als MFI < achtergrond MFI + 2├Ś standaardafwijking werden uitgesloten van analyse. Kwantificering van survivin werd uitgevoerd met ProcartaPlex Human Survivin Simplex kit (eBioscience, Frankfurt am Main, Duitsland) met behulp van celcultuursupernatant zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. De hoeveelheid Survivin werd genormaliseerd naar de eiwitconcentratie, die werd vastgesteld met behulp van Pierce BCA-assay (Thermo Fisher Scientific). PDH en apoptotische eiwitten (BAD en JNK) werden gedetecteerd met multiplex assays van Merck Millipore (Multi-species PDH Complex Magnetic Bead Panel en 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead kit, Darmstadt, Duitsland). De monsters werden verwerkt zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Bovendien werden de monsters voor PDH-metingen gefilterd met centrifugale ultravrije filtereenheden met een poriegrootte van 0,65 ╬╝m (Merck Millipore) bij 7.000 rpm gedurende 4 min.

Mitochondriale activiteit

Cellen gekweekt op 8-wells ╬╝-platen (Ibidi, Martinsried, Duitsland) behandeld met en zonder 10 mM DCA werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde, driemaal gewassen met HBSS met calcium en magnesium en gekleurd met 4 uM MitoSox (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) gedurende 15 min. Na kleuring werden de cellen driemaal gewassen met HBSS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) en de celkern werd tegengekleurd met DAPI (verdunning 1:1.000, Sigma-Aldrich GmbH) gedurende 5 min. Fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd met een omgekeerde confocale laser scanning microscoop (Eclipse TE2000-E, Nikon, D├╝sseldorf, Duitsland) met een 60 ├Ś water onderdompeling objectief (Nikon). De beelden werden gemaakt met EZ-C1 1.80 software (Nikon). De excitatie vond plaats met een diodelaser bij 408 nm (DAPI) en met een helium/neon laser bij 543 nm (MitoSox). De totale celfluorescentie van MitoSox met aftrek van de achtergrond werd geanalyseerd met ImageJ en genormaliseerd naar het aantal cellen.

Immunofluorescentiekleuring van Ki67 en TUNEL

Cellen werden gezaaid, gefixeerd en gewassen zoals hierboven beschreven. Na het wassen met HBSS werden de cellen gedurende 20 minuten gepermeabiliseerd met 0,2% Triton X-100, gewassen en ’s nachts ge├»ncubeerd met een specifiek konijn-polyklonaal Ki67-antilichaam met een verdunning van 1:150 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Voor kleuring werd een monoklonaal anti-rabbit Alexa Fluor┬« 555 antilichaam (Cell Signaling Technology, Leiden, Nederland) gedurende 1 uur ge├»ncubeerd met een verdunning van 1:250 en de cellen werden gedurende 5 minuten tegengekleurd met DAPI (1:1.000). Fluorescentie beeldvorming protocol was hetzelfde als hierboven beschreven. Totale celfluorescentie werd vastgesteld zoals hierboven beschreven. Voor TUNEL-kleuring werd Apoptag Fluorescein Direct kit (Merck Millipore) gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. De excitatie vond plaats met een argonlaser bij 488 nm en de beeldvorming werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Het percentage TUNEL-positieve cellen werd ge├źvalueerd.

Statistische analyse

Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met SAS software 7.1 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). Voor de vergelijking van twee gemiddelden werd een tweezijdige t-toets gebruikt. De betrouwbaarheidswaarde werd vastgesteld op 5% (P<0,05) en werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Celtellingen na DCA-behandeling

In vergelijking met niet-behandelde negatieve controles vertoonden de prostaat-adenocarcinoomcellijnen DT08/46 (P<0,0001) en CT1258 (P=0,0122) significant lagere celaantallen na behandeling met 10 mM DCA gedurende 48 uur (fig. 1A). De derde prostaatcellijn DT15/08 DCA vertoonde geen significante vermindering (P=0,0748), maar er werd een tendens naar een lagere celhoeveelheid, respectievelijk een lagere proliferatiesnelheid in de eigen celkweek waargenomen (fig. 1A). Zoals blijkt uit fig. 1B werd hetzelfde dalende effect van DCA waargenomen in alle onderzochte TCC-cellijnen DT08/40 (P=0,0031), DT15/06 (P=0,0016) en in DT15/09 (P=0,0143).

Figuur 1 – Effect van 10 mM DCA op verschillende kankercellen van de hond na 48 uur. Na blootstelling aan DCA nam het aantal cellen van alle cellijnen significant af, behalve bij ├ę├ęn prostaatadenocarcinoomcellijn (DT15/08). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD, n=3. De figuur toont het relatieve aantal cellen in vergelijking met de negatieve controle (%). De controle was ingesteld op 100%. Statistische analyse werd bepaald met een tweezijdige t-toets, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Canine prostaat adenocarcinoom cellijnen. (B) Canine transitional cell carcinoma cellijnen.

Lactaatniveaus in supernatant van celkweek na blootstelling aan DCA
Om het lactaatafgifteverlagende effect van DCA-behandeling na 48 uur te beoordelen, werd respectievelijk de lactaathoeveelheid in het supernatant van de celkweek gemeten. In alle cellijnen van beide kankerentiteiten had 10 mM DCA een significant lactaatverlagend effect (fig. 2).

Figuur 2 – Effect van 10 mM DCA op het lactaatgehalte na 48 uur in het supernatant van de celkweek. Na DCA-behandeling daalden de lactaatspiegels significant in alle cellijnen. Relatieve lactaatniveaus vergeleken met negatieve controle worden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD (%), n=3. Controle was ingesteld op 100%. Statistische analyse werd uitgevoerd met een tweezijdige t-test, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Canine prostaat adenocarcinoom cellijnen. (B) Canine transitional cell carcinoma cellijnen.

Metabolische activiteit na behandeling met DCA gedurende een periode van 96 uur

Om het negatieve effect op de celproliferatie te bevestigen, werd de metabolische activiteit als indicator voor proliferatie en levensvatbaarheid van de cellen geanalyseerd met MTT-tests. Zoals blijkt uit fig. 3A, was de metabolische activiteit in DT15/08 significant verminderd in vergelijking met de respectieve negatieve controle na 48 uur DCA-behandeling (P=0,0202). Na 96 uur continue DCA-behandeling was de metabolische activiteit significant (P=0,007). Een soortgelijk effect werd waargenomen in DT08/40 (fig. 3B) na 96 uur (P=0,0025) en in DT15/06 (P=0,0419) na 96 uur DCA-behandeling (gegevens niet getoond). De cellijnen DT08/46, CT1258 en DT15/09 vertoonden geen statistisch significant effect van DCA op de metabolische activiteit (gegevens niet getoond).

Figuur 3 – Invloed van 10 mM DCA op de metabolische activiteit over een periode van 96 uur met behulp van MTT-test. Statistische evaluatie werd uitgevoerd met ANOVA, *P<0,05, **P<0,01. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD, n=3. (A) Canine prostaatadenocarcinoom cellijn DT15/08. Na 48 uur werd een duidelijk verminderde metabolische activiteit waargenomen en een verdere vermindering werd vastgesteld ÔëĄ96 uur. (B) Canine transitional cell carcinoma cell line DT08/40. In de loop van de tijd nam de metabolische activiteit licht af binnen 24 uur en bereikte een significante afname na 96 uur.
Proliferatie na DCA-behandeling gedurende 48 uur

De celproliferatie in aan 10 mM DCA blootgestelde cellijnen werd geanalyseerd met Ki67-kleuring en gevisualiseerd met confocale fluorescentiemicroscopie. DCA verminderde de hoeveelheid Ki67, wat wijst op verminderde celproliferatie na 48 uur in alle ge├źvalueerde cellijnen met significantie (P<0,05) (fig. 4).

Figuur 4 – Effect van 10 mM DCA op de celproliferatie met confocale fluorescentiemicroscopie na 48 uur. In alle cellijnen werden significant verminderde hoeveelheden Ki67 vastgesteld, hetgeen wijst op een verminderde celproliferatie. De fluorescentiebeelden tonen verminderde totale celfluorescentie van Ki67-positieve cellen in vergelijking met onbehandelde controle (A-D). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD (%), n=3. De controle was ingesteld op 100%. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweezijdige t-test, *P<0,05. (A) DT15/08 onbehandeld. (B) DT15/08 behandeld met 10 mM DCA. (C) DT15/06 onbehandeld. (D) DT15/06 behandeld met 10 mM DCA. Zowel in DT15/08 als in DT15/06 kon een verminderde hoeveelheid Ki67-fluorescentie worden waargenomen. (E) Canine prostaat adenocarcinoom cellijnen. (F) Canine overgangscelcarcinoom cellijnen.
Effect van DCA op apoptose

Het effect van 10 mM DCA op apoptose en levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van Annexine en Sytox met behulp van flowcytometrie. Met betrekking tot apoptose en dode cellen werden in geen van de cellijnen statistisch significante effecten waargenomen (gegevens niet getoond). Bevestiging van de FACS-apoptosecijfers werd gedaan met TUNEL-kleuring om de negatieve effecten van trypsinisatie op gekweekte cellen te elimineren. Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. De resultaten bevestigen de apoptosegraad in alle met DCA behandelde cellijnen, behalve DT15/06. Significant verminderde apoptoseniveaus werden waargenomen in DT15/08 (P=0,022) en DT15/09 (P=0,0265). DT15/06 vertoonde significant verhoogde (P=0,041) apoptosewaarden (gegevens niet getoond). De andere cellijnen vertoonden geen significante apoptosewaarden.

Survivine-expressie geanalyseerd met xMAP® Magnetic Bead Technology

DCA verminderde de productie van survivine significant in de prostaatadenocarcinoomcellijn DT08/46 (P=0,0053) en in de TCC-cellijnen DT15/06 (P=0,0027) en DT15/09 (P=0,0206). De cellijnen CT1258 (P=0,0761), DT15/08 (P=0,1551) en DT08/40 (P=0,0598) vertoonden geen significante effecten op de productie van survivine (fig. 5).

Figuur 5 – Effect van 10 mM DCA op de expressie van survivine in het supernatant na 48 uur. Survivine niveaus werden genormaliseerd naar intracellulaire eiwitconcentratie. In vergelijking met de respectieve controle nam de hoeveelheid survivin significant af in ├ę├ęn prostaatadenocarcinoomcellijn (DT08/46) en in twee TCC-cellijnen (DT15/06 en DT15/09). De andere cellijnen vertoonden ook een dalende maar niet-significante tendens. De gegevens worden weergegeven als relatief gemiddelde in vergelijking met de negatieve controle ┬▒ SD (%), n=3. De controle werd ingesteld op 100%. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweezijdige t-tests met *P<0,05, **P<0,01. (A) Canine prostaat adenocarcinoom cellijnen. (B) Canine transitional cell carcinoma cellijnen.
Bcl-2-antagonist-van-celdood (BAD) en c-jun N-terminal kinases (JNK) expressie geanalyseerd met xMAP Magnetic Bead Technology

Na 48 uur DCA-incubatie nam de gefosforyleerde en dus inactieve vorm van BAD alleen significant toe in DT08/46 (P=0,0285), CT1258 (P=0,0039) en DT15/06 (P=0,0235). Verder kon geen effect van DCA worden waargenomen op de actieve gefosforyleerde JNK, met uitzondering van DT08/46 (P=0,0044) die lagere waarden vertoonde (gegevens niet getoond).

Pyruvaat-dehydrogenase (PDH) expressie geanalyseerd met xMAP Magnetic Bead Technology

Ter bevestiging van verminderde lactaatspiegels als gevolg van lagere glycolyse werd de hoeveelheid gefosforyleerd PDH (PDH-P) (Ser232, Ser293, Ser300) gemeten met Luminex Magnetic Bead Technology. Verlaagde niveaus van PDH-P en dus verhoogde actieve enzymen worden in verband gebracht met een verhoogde pyruvaatoxidatie en acetylcoenzym A-metabolisme, wat leidt tot een verhoogde activiteit van de TCA-cyclus [35]. Bij PDH-P (Ser232) werd een statistisch significante daling in vergelijking met niet-behandelde controles waargenomen in alle cellijnen, behalve DT08/46. Deze cellijn vertoonde een hoger maar niet-significant PDH-P (Ser232) niveau. Het PDH-P op residu Ser293 werd alleen in DT15/08 (P=0,0082) en DT15/06 (P=0,0122) cellijnen significant beïnvloed door DCA. In alle andere cellijnen kon geen effect worden waargenomen na behandeling met DCA. PDH-P op Ser300 werd door DCA significant aangetast in DT08/46 (P=0,0060), CT1258 (P=0,0215), DT15/08 (P=0,0002) en DT15/06 (P=0,0097) (Tabel I).

Tabel I

PDH-P expressie na blootstelling aan DCA met relatieve gemiddelde waarden ┬▒ SD (%).

CellijnPDH-P Ser232P-waardePDH-P Ser293P-waardePDH-P Ser300P-waarde
Controle100100100
Prostaat adenocarcinoom
dT08/46121.2┬▒31.50.2715127.7┬▒27.80.090047.7┬▒28.00.0060b
cT125811.0┬▒5.10.0011b73.7┬▒30.50.274024.3┬▒19.50.0215a
dT15/0818.0┬▒17.60.0026b39.7┬▒19.20.0082b18.4┬▒6.80.0002c
Transitiecelcarcinoom
dT08/4014.3┬▒10.20.0047b84.5┬▒22.80.359448.6┬▒32.10.1090
dT15/0628.2┬▒17.70.0039b72.3┬▒5.40.0122a39.1┬▒10.40.0097b
dT15/0920.5┬▒24.80.0308a99.8┬▒71.30.996734.1┬▒41.00.1085
Tabel I – PDH-P expressie na blootstelling aan DCA met relatieve gemiddelde waarden ┬▒ SD (%).
PDH-P, gefosforyleerd pyruvaat dehydrogenase; Ser, serine; DCA, dichlooracetaat; ┬▒, plus minus.
a P<0,05;
b P<0,01;
c P<0,001;
SD, standaarddeviatie; %, procent.
Mitochondriale activiteit na DCA-behandeling

Verificatie van de metabole verandering van de mitochondriale activiteit door glucose-oxidatie werd uitgevoerd door detectie van mitochondriale reactieve zuurstofsoorten (ROS). Bij de prostaatadenocarcinoomcellijnen (fig. 6E) werd een significant verhoogde mitochondriale activiteit waargenomen in CT1258 (P=0,0153). De cellijnen DT08/46 (P=0,2829) en DT15/08 (P=0,3082) vertoonden geen afnemend effect na behandeling met DCA. Daarentegen kon DCA de mitochondriale activiteit aanzienlijk verhogen (P<0,05) in alle TCC-cellijnen (fig. 6F).

Figuur 6 – Bepaling van de mitochondriale activiteit met confocale fluorescentiemicroscopie na blootstelling aan 10 mM DCA gedurende 48 uur. Mitochondriale ROS werden gekleurd met MitoSox (rood) en kernen werden gecontrasteerd met DAPI (blauw). De mitochondriale activiteit, uitgedrukt als verhoogde ROS-productie, was significant toegenomen in de prostaatadenocarcinoom-cellijn CT1258. DT08/46 vertoonde een significant verminderd en DT15/08 geen effect op de ROS-productie. Daarentegen vertoonden alle TCC-cellijnen een significant verhoogde mitochondriale activiteit (F). In vergelijking met de negatieve controle vertonen de behandelde cellen een duidelijk hogere rode fluorescentie (A-D). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD (%), n=3. Controle was ingesteld op 100%. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweezijdige t-toets, *P<0,05. (A) CT1258 onbehandeld. (B) CT1258 behandeld. (C) DT15/06 onbehandeld. (D) DT15/06 behandeld. (E) Canine prostaat adenocarcinoom cellijnen. (F) Canine overgangscelcarcinoom cellijnen.
Kwantitatieve miRNA RT-PCR

Om te beoordelen of de waargenomen lagere proliferatiecijfers correleren met veranderingen in micro-RNA’s, werden drie miR die betrokken zijn bij proliferatie of apoptose ge├źvalueerd. miR-141-expressie vertoonde significante veranderingen met verlaagde niveaus in DT15/08 (P=0,0451) en verhoogde niveaus in DT08/40 (P=0,0135) in vergelijking met niet-behandelde controles, terwijl DT08/46 (P=0,9285) en DT15/06 (P=0,1520) geen verschil vertoonden in vergelijking met de controles. In CT1258 en DT15/09 was miR-141 gedownreguleerd en uitgesloten van analyse. DT08/46 (P=0,0322) toonde een lagere en DT15/06 (P=0,0267) evenals DT15/09 (P=0,0031) een hogere expressie van miR-375. De prostaatadenocarcinoomcellijn CT1258 vertoonde geen significante veranderingen in respectievelijk alle onderzochte microRNA’s. De expressie van miR-145 werd in geen van de cellijnen be├»nvloed door DCA-behandeling (uitgesloten van analyse vanwege Ct-waarden >30). Samenvattend vertonen prostaatadenocarcinoom cellijnen de neiging tot downregulatie van miR-141 (DT15/08) en miR-375 (DT08/46, DT15/08), de TCC cellijnen vertoonden upregulatie van beide (Fig. 7).

Figuur 7 – Effect van 10 mM DCA op miR-141 en miR-375 expressie na 48 uur. (A) MicroRNA-141 expressie. (B) MicroRNA-375 expressie. miR-141 was significant verminderd in de prostaat adenocarcinoom cellijn DT15/08 terwijl DT08/46 geen waarneembaar effect vertoonde in vergelijking met de negatieve controle. In tegenstelling tot prostaatadenocarcinoomcellijnen, brengen TCC-cellijnen DT08/40 en DT15/06 hogere miR-141-niveaus tot expressie. CT1258 en DT15/09 vertoonden gedownreguleerde expressies en werden uitgesloten van analyse. Expressieanalyse van miR-375 liet vergelijkbare resultaten zien. Na DCA-behandeling vertoonden de prostaat-adenocarcinoom cellijnen inconsistente expressiepatronen. DT08/46 was significant toegenomen en CT1258 en DT15/08 hadden geen effect op miR-375 niveaus. TCC-cellijnen daarentegen vertoonden een verhoogde expressie van miR-375, vooral DT15/06 en DT15/09. De relatieve expressie wordt getoond als relatief gemiddelde ┬▒ SD, n=3. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweezijdige t-test, *P<0.05, **P<0.01.

Bespreking

DCA verminderde het aantal cellen in prostaatadenocarcinoom en in TCC-cellijnen. Dit kan gebeuren op basis van verminderde proliferatie of verhoogde apoptose. In dit onderzoek werd een proliferatieverlagend effect waargenomen, wat blijkt uit een verlaagd Ki67 in alle cellijnen en lagere metabolische activiteiten in DT15/08 en DT08/40. Deze bevinding is in overeenstemming met eerdere resultaten van Bonnet et al bij verschillende menselijke cellijnen [35] en Sun et al bij borstkanker [ 12]. Verder werd verminderde celproliferatie na blootstelling aan DCA ook waargenomen in humaan prostaatcarcinoom [36], colorectaal [37], colon [11] en longkanker [38]. Echter, inductie van mitochondria afhankelijke apoptose door DCA, zoals eerder gerapporteerd door verschillende onderzoeksgroepen [14,35,39] kon in deze studie niet worden waargenomen. Dit verschijnsel werd echter ook waargenomen door Feuerecker et al in muriene en menselijke neuroblastoomcellen (40). Stockwin et al meldden dat hoge DCA-concentraties nodig zijn voor apoptose-inductie [38]. De inconsistente resultaten in ├ę├ęn cellijn (DT15/06) tussen flowcytometrie en TUNEL-kleuring laten niet toe te beoordelen of DCA de apoptose be├»nvloedt. De resultaten van de apoptose-eiwit expressie JNK en BAD zijn consistent met de effecten waargenomen in alle andere cellijnen en ondersteunen de hypothese dat DCA geen invloed heeft op apoptose in prostaat- en TCC-kankercellen van de hond.

Survivin, een remmer van apoptose en tumorpromotor [41,42], was significant afgenomen in alle cellijnen die een verhoogde mitochondriale activiteit vertoonden (DT15/06, DT15/09). Verlaagde niveaus van survivin zouden apoptose induceren via intrinsieke paden door activering van caspase-3 [41] en werden waargenomen in endometriumkankercellijnen na blootstelling aan DCA [14]. Onverwacht kon in deze cellijnen geen toegenomen apoptose worden waargenomen, met uitzondering van DT15/06 (P=0,041), dat een lichte maar inconsistente toename in celdood liet zien. Dit leidt tot de conclusie dat verminderde survivinniveaus mogelijk gepaard gaan met verminderde proliferatie. Daarnaast is een ontregeling van andere genen die betrokken zijn bij apoptose-inductie denkbaar en zou verklaren waarom verlaagde survivin-niveaus niet tot apoptose leidden.

DCA is een PDK-remmer die indirect PDH activeert. Door verminderde waarden van PDH-P kan pyruvaat worden geoxideerd door mitochondri├źn [4,5]. Verminderde PDH-fosforylering werd waargenomen in verschillende menselijke kankercellijnen [16,37,43]. In overeenstemming met gepubliceerde resultaten in menselijke cellijnen, bevestigde deze studie een verminderde PDH-fosforylering in alle met DCA behandelde cellen, hetgeen bevestigd wordt door een verminderde afgifte van lactaat in alle cellijnen. Dit wijst erop dat DCA de oxidatie van glucose bevordert in kankercellen van zowel honden als mensen. Voorts werden in deze studie verhoogde ROS-niveaus in mitochondri├źn van alle cellijnen, behalve twee prostaatadenocarcinoom cellijnen, aangetoond. Verhoogde ROS-soorten in mitochondri├źn, die optreden als gevolg van de celademhaling, bevestigen de verminderde PDH-P-waarden en de lactaatreductie. Het is mogelijk dat een verhoogde mitochondriale activiteit niet resulteert in apoptose, maar in een verhoogde celademhaling die de overleving van kankercellen met een veranderd metabolisme belemmert. Dit zou de verhoogde levensvatbaarheid van cellen na blootstelling aan DCA kunnen verklaren. Een verhoogde levensvatbaarheid na blootstelling aan DCA werd ook waargenomen door McPherson et al die rapporteerden over verhoogde pyruvaatoxidatie en levensvatbaarheid van embryo’s in een ouder muismodel [44].

van miR-375 upregulatie is gemeld dat het een anti-prolifererende werking heeft in vele cellen zoals maagkanker [45], pancreaskanker [46], foetale cardiomyocytachtige cellen [47] en darmkanker [48]. In prostaatcarcinogenese heeft microRNA-375 variabele effecten, afhankelijk van het tumorfenotype. Costa-Pinheiro et al toonden anti-proliferatieve effecten aan in PC-3 cellen als gevolg van upregulatie en verhoogde apoptose in 22Rv1 cellen na miR-375 knockdown [49]. Onze resultaten illustreren dat de up- of downregulatie van miR-375 na DCA-behandeling niet consistent is in prostaat-adenocarcinoom cellijnen, wat in overeenstemming is met de hierboven beschreven bevindingen. In vergelijking met prostaatkankercellen vertoonden alle TCC cellijnen verhoogde miR-375 niveaus. Er is geen literatuur die miR-375 effecten bij blaaskanker beschrijft. Het is mogelijk dat deze resultaten in overeenstemming zijn met anti-proliferatieve effecten die in vele andere cellen zijn beschreven. Dezelfde bevindingen werden waargenomen bij microRNA-141. Een upregulatie van miR-141 remde de kankerproliferatie en de celcyclusprogressie in neuroblastoomcellen [ 50]. Verder is miR-141 gedownreguleerd bij blaaskanker met spierinvasie [ 51]. In onze studie werden miR-141 en miR-375 geupreguleerd gevonden in alle TCC-cellijnen na DCA-behandeling, wat erop wijst dat deze veranderingen een lagere proliferatie veroorzaken. Bij prostaatkanker is gemeld dat miR-141 ge├╝preguleerd is [52]. In deze studie zijn de miR-141 niveaus licht gedaald, maar wij veronderstellen dat dit effect te mild is om kankercellen te be├»nvloeden. Voor een analyse om te bepalen of een direct verband tussen DCA en veranderingen in verschillende microRNA’s de oorzaak is van de waargenomen biologische reacties, is echter een uitgebreide transcriptomische aanpak nodig.

Concluderend toont deze studie aan dat kankercellijnen van honden reageren op de behandeling met DCA en dat het effect kan worden herleid tot verminderde proliferatie, verhoogde pyruvaatoxidatie en mitochondriale activiteit. De resultaten tonen ook verschillen aan tussen de onderzochte kankerentiteiten. Zo lijken TCC-cellijnen consistent te reageren en gevoeliger te zijn voor DCA-behandeling dan prostaatadenocarcinoom-cellijnen. In vergelijking met de meeste menselijke cellijnen had DCA geen invloed op apoptose, wat kan betekenen dat DCA nuttig zou kunnen zijn voor het beperken van tumorgroei bij hondenkanker, maar niet voor het verkleinen van de omvang.

Bovendien kan DCA voordelig zijn in het sensibiliseren van kankercellen bij honden voor andere antikankermedicijnen en daarom zou het geschikt kunnen zijn voor combinatietherapie├źn [53]. Om te zorgen voor hogere DCA-concentraties in het kankerweefsel en om ernstige algemene bijwerkingen te voorkomen zou een intralesionale therapie, vergelijkbaar met intravesicale chemotherapie bij mensen [54] en honden met TCC [55,56], een verdere mogelijkheid kunnen zijn. De concentratie van 10 mM DCA is gekozen om de vergelijkbaarheid met andere in vitro studies bij de mens mogelijk te maken [14,18,37]. Voor klinische studies moet de DCA-concentratie opnieuw worden beoordeeld op compatibiliteit en negatieve bijwerkingen. Daarom moeten verdere studies met lagere DCA-concentraties worden onderzocht.

Afkortingen:

DCAdichlooracetaat
PDHpyruvaat dehydrogenase
PDKpyruvaat dehydrogenase kinase
TCCovergangscelcarcinoom
RNAribonucleïnezuur
PCRpolymerase kettingreactie
JNKc-jun N-terminal kinases
BADBcl-2-antagonist van celdood
ROSreactieve zuurstofsoorten
PBSfosfaatgebufferde zoutoplossing

REFERENTIES

1 Vail DM: Ondersteuning van de veterinaire kankerpati├źnt op chemotherapie: Neutropenie en gastro-intestinale toxiciteit. Top Companion Anim Med. 24:122-129. 2009.
2 Cornell KK, Bostwick DG, Cooley DM, Hall G, Harvey HJ, Hendrick MJ, Pauli BU, Render JA, Stoica G, Sweet DC, et al: Clinical and pathologic aspects of spontaneous canine prostate carcinoma: A retrospective analysis of 76 cases. Prostate. 45:173-183. 2000.
3 Mutsaers AJ, Widmer WR en Knapp DW: Canine transitional cell carcinoma. J Vet Intern Med. 17:136-144. 2003.
4 Sutendra G en Michelakis ED: Pyruvaat dehydrogenase kinase als nieuw therapeutisch doelwit in de oncologie. Front Oncol. 3:382013.
5 Stacpoole PW: The pharmacology of dichloroacetate. Metabolism. 38:1124-1144. 1989.
6 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW en Shuster JJ: Evaluation of long-term treatment of children with congenital lactic acidosis with dichloroacetate. Pediatrics. 121:e1223-e1228. 2008.
7 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, et al: Controlled clinical trial of dichloroacetate for treatment of congenital lactic acidosis in children. Pediatrics. 117:1519-1531. 2006.
8 Moore GW, Swift LL, Rabinowitz D, Crofford OB, Oates JA en Stacpoole PW: Reduction of serum cholesterol in two patients with homozygous familial hypercholesterolemia by dichloroacetate. Atherosclerosis. 33:285-293. 1979.
9 Stacpoole PW, Moore GW en Kornhauser DM: Metabolic effects of dichloroacetate in patients with diabetes mellitus and hyperlipoproteinemia. N Engl J Med. 298:526-530. 1978.
10 Kato T, Niizuma S, Inuzuka Y, Kawashima T, Okuda J, Tamaki Y, Iwanaga Y, Narazaki M, Matsuda T, Soga T, et al: Analysis of metabolic remodeling in compensated left ventricular hypertrophy and heart failure. Circ Heart Fail. 3:420-430. 2010.
11 Sánchez-Aragó M, Chamorro M and Cuezva JM: Selection of cancer cells with repressed mitochondria triggers colon cancer progression. Carcinogenesis. 31:567-576. 2010.
12 Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG en Blackburn AC: Reversal of the glycolytic phenotype by dichloroacetate inhibits metastatic breast cancer cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat. 120:253-260. 2010.
13 Saed GM, Fletcher NM, Jiang ZL, Abu-Soud HM and Diamond MP: Dichloroacetate induces apoptosis of epithelial ovarian cancer cells through a mechanism involving modulation of oxidative stress. Reprod Sci. 18:1253-1261. 2011.
14 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC en De Vivo I: Dichloroacetate induceert apoptose in endometriumkankercellen. Gynecol Oncol. 109:394-402. 2008.
15 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, et al: Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med. 2:31ra342010.
16 Kinnaird A, Dromparis P, Saleme B, Gurtu V, Watson K, Paulin R, Zervopoulos S, Stenson T, Sutendra G, Pink DB, et al: Metabolic modulation of clear-cell renal cell carcinoma with dichloroacetate, an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinase. Eur Urol. 69:734-744. 2016.
17 Delaney LM, Ho N, Morrison J, Farias NR, Mosser DD en Coomber BL: Dichloroacetate affects proliferation but not survival of human colorectal cancer cells. Apoptosis. 20:63-74. 2015.
18 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA and Jayne DG: Dichloroacetate induces apoptosis and cell-cycle arrest in colorectal cancer cells. Br J Cancer. 102:1746-1752. 2010.
19RuggieriV, Agriesti F, Scrima R, Laurenzana I, Perrone D, Tataranni T, Mazzoccoli C, Lo Muzio L, Capitanio N en Piccoli C: Dichloroacetate, a selective mitochondria-targeting drug for oral squamous cell carcinoma: A metabolic perspective of treatment. Oncotarget. 6:1217-1230. 2015.
20 Xintaropoulou C, Ward C, Wise A, Marston H, Turnbull A en Langdon SP: A comparative analysis of inhibitors of the glycolysis pathway in breast and ovarian cancer cell line models. Oncotarget. 6:25677-25695. 2015.
21 Cicmanec JL, Condie LW, Olson GR en Wang SR: 90-Day toxicity study of dichloroacetate in dogs. Fundam Appl Toxicol. 17:376-389. 1991.
22 Maisenbacher HW III, Shroads AL III, Zhong G, Daigle AD, Abdelmalak MM, Samper IS, Mincey BD, James MO en Stacpoole PW: Pharmacokinetics of oral dichloroacetate in dogs. J Biochem Mol Toxicol. 27:522-525. 2013.
23 Lukas G, Vyas KH, Brindle SD, Le Sher AR en Wagner WE Jr: Biological disposition of sodium dichloroacetate in animals and humans after intravenous administration. J Pharm Sci. 69:419-421. 1980.
24 Park R, Arieff AI, Leach W en Lazarowitz VC: Treatment of lactic acidosis with dichloroacetate in dogs. J Clin Invest. 70:853-862. 1982.
25 Racker E: History of the Pasteur effect and its pathobiology. Mol Cell Biochem. 5:17-23. 1974.
26 Warburg O, Wind F en Negelein E: ├ťber den Stoffwechsel von Tumoren im K├Ârper. Klin Wochenschr. 5:829-832. 1926.
27 Kim JW, Tchernyshyov I, Semenza GL en Dang CV: HIF-1-gemedieerde expressie van pyruvaat dehydrogenase kinase: A metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 3:177-185. 2006.
28 Lum JJ, Bui T, Gruber M, Gordan JD, DeBerardinis RJ, Covello KL, Simon MC en Thompson CB: The transcription factor HIF-1alpha plays a critical role in the growth factor-dependent regulation of both aerobic and anaerobic glycolysis. Genes Dev. 21:1037-1049. 2007.
29 Zhao Y, Butler EB en Tan M: Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death Dis. 4:e5322013.
30 Plas DR en Thompson CB: Cell metabolism in the regulation of programmed cell death. Trends Endocrinol Metab. 13:75-78. 2002.
31 Simon D, Knebel JW, Baumgartner W, Aufderheide M, Meyer-Lindenberg A en Nolte I: In vitro efficacy of chemotherapeutics as determined by 50% inhibitory concentrations in cell cultures of mammary gland tumors obtained from dogs. Am J Vet Res. 62:1825-1830. 2001.
32 Knapp DW, Chan TC, Kuczek T, Reagan WJ and Park B: Evaluation of in vitro cytotoxicity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs against canine tumor cells. Am J Vet Res. 56:801-805. 1995.
33 Sartin EA, Barnes S, Toivio-Kinnucan M, Wright JC and Wolfe LG: Heterogenic properties of clonal cell lines derived from canine mammary carcinomas and sensitivity to tamoxifen and doxorubicin. Anticancer Res. 13:229-236. 1993.
34 Winkler S, Murua Escobar H, Eberle N, Reimann-Berg N, Nolte I en Bullerdiek J: Establishment of a cell line derived from a canine prostate carcinoma with a highly rearranged karyotype. J Hered. 96:782-785. 2005.
35 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, et al: A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell. 11:37-51. 2007.
36 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, Porvasnik S, Urbanek C en Rosser CJ: Dichloroacetate (DCA) sensitizes both wild-type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation. Prostate. 68:1223-1231. 2008.
37 Ho N and Coomber BL: Pyruvate dehydrogenase kinase expression and metabolic changes following dichloroacetate exposure in anoxic human colorectal cancer cells. Exp Cell Res. 331:73-81. 2015.
38 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG en Newton DL: Natriumdichlooracetaat richt zich selectief op cellen met defecten in de mitochondriale ETC. Int J Cancer. 127:2510-2519. 2010.
39 Xie J, Wang BS, Yu DH, Lu Q, Ma J, Qi H, Fang C en Chen HZ: Dichloroacetate shifts the metabolism from glycolysis to glucose oxidation and exhibits synergistic growth inhibition with cisplatin in HeLa cells. Int J Oncol. 38:409-417. 2011.
40 Feuerecker B, Seidl C, Pirsig S, Bruchelt G en Senekowitsch-Schmidtke R: DCA promote progression of neuroblastoma tumors in nude mice. Am J Cancer Res. 5:812-820. 2015.
41 Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S, Marchisio PC en Altieri DC: Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature. 396:580-584. 1998.
42 Ambrosini G, Adida C en Altieri DC: A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med. 3:917-921. 1997.
43 Abemayor E, Kovachich GB en Haugaard N: Effects of dichloroacetate on brain pyruvate dehydrogenase. J Neurochem. 42:38-42. 1984.
44 McPherson NO, Zander-Fox D and Lane M: Stimulation of mitochondrial embryo metabolism by dichloroacetic acid in an aged mouse model improves embryo development and viability. Fertil Steril. 101:1458-1466. 2014.
45 Zhou N, Qu Y, Xu C en Tang Y: Upregulation of microRNA-375 increases the cisplatin-sensitivity of human gastric cancer cells by regulating ERBB2. Exp Ther Med. 11:625-630. 2016.
46 Zhou J, Song S, He S, Zhu X, Zhang Y, Yi B, Zhang B, Qin G en Li D: MicroRNA-375 richt zich op PDK1 in pancreascarcinoom en onderdrukt de celgroei via de Akt-signaleringsroute. Int J Mol Med. 33:950-956. 2014.
47 Wang L, Song G, Liu M, Chen B, Chen Y, Shen Y, Zhu J en Zhou X: MicroRNA-375 overexpression influences P19 cell proliferation, apoptosis and differentiation through the Notch signaling pathway. Int J Mol Med. 37:47-55. 2016.
48 Zaharie F, Muresan MS, Petrushev B, Berce C, Gafencu GA, Selicean S, Jurj A, Cojocneanu-Petric R, Lisencu CI, Pop LA, et al: Exosome-carried microRNA-375 inhibits cell progression and dissemination via Bcl-2 blocking in colon cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24:435-443. 2015.
49 Costa-Pinheiro P, Ramalho-Carvalho J, Vieira FQ, Torres-Ferreira J, Oliveira J, Gon├žalves CS, Costa BM, Henrique R en Jer├│nimo C: MicroRNA-375 plays a dual role in prostate carcinogenesis. Clin Epigenetics. 7:422015.
50 Wang Z, Lei H and Sun Q: MicroRNA-141 and its associated gene FUS modulate proliferation, migration and cisplatin chemosensitivity in neuroblastoma cell lines. Oncol Rep. 35:2943-2951. 2016.
51 Mahdavinezhad A, Mousavi-Bahar SH, Poorolajal J, Yadegarazari R, Jafari M, Shabab N en Saidijam M: Evaluation of miR-141, miR-200c, miR-30b Expression and Clinicopathological features of bladder cancer. Int J Mol Cell Med. 4:32-39. 2015.
52 Brase JC, Johannes M, Schlomm T, F├Ąlth M, Haese A, Steuber T, Beissbarth T, Kuner R en S├╝ltmann H: Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer. Int J Cancer. 128:608-616. 2011.
53 Xue X, You S, Zhang Q, Wu Y, Zou GZ, Wang PC, Zhao YL, Xu Y, Jia L, Zhang X, et al: Mitaplatin increases sensitivity of tumor cells to cisplatin by inducing mitochondrial dysfunction. Mol Pharm. 9:634-644. 2012.
54 Porten SP, Leapman MS en Greene KL: Intravesical chemotherapy in non-muscle-invasive bladder cancer. Indian J Urol. 31:297-303. 2015.
55 Song D, Wientjes MG, Gan Y en Au JL: Bladder tissue pharmacokinetics and antitumor effect of intravesical 5-fluorouridine. Clin Cancer Res. 3:901-909. 1997.
56 Abbo AH, Jones DR, Masters AR, Stewart JC, Fourez L en Knapp DW: Phase I clinical trial and pharmacokinetics of intravesical mitomycin C in dogs with localized transitional cell carcinoma of the urinary bladder. J Vet Intern Med. 24:1124-1130. 2010.

Geef een reactie