­čôľ 53 mins.

Balkrishna Chaube1, Parmanand Malvi1, Shivendra Vikram Singh1, Naoshad Mohammad1, Avtar Singh Meena1,2 en Manoj Kumar Bhat1

1 National Centre for Cell Science, Savitribai Phule Pune University Campus, Ganeshkhind, Pune, India
2 Huidig adres: Afdeling Fysiologie, Universiteit van Tennessee Health Science Center, Memphis, VS


Correspondentie: Manoj Kumar Bhat, e-mail: [email protected]

Ontvangen: 16 juni 2015
Aanvaard: 23 september 2015
Gepubliceerd: 15 oktober 2015

Abstract

Melanoom is een grotendeels ongeneeslijke huid maligniteit als gevolg van de onderliggende moleculaire en metabole heterogeniteit verward door de ontwikkeling van resistentie. Kankercellen hebben metabole flexibiliteit in het kiezen van ofwel oxidatieve fosforylering (OXPHOS) of glycolyse voor ATP generatie, afhankelijk van de beschikbaarheid van voedingsstoffen in de tumor micro-omgeving. In deze studie onderzochten wij de betrokkenheid van het ademhalingscomplex I en lactaatdehydrogenase (LDH) bij de progressie van melanoom. Wij tonen aan dat remming van complex I door metformine de groei van melanoom in muizen bevordert via verhoging van lactaat- en VEGF-niveaus. Daarentegen leidt het tot groeistilstand in vitro door verhoogde extracellulaire verzuring als gevolg van verhoogde glycolyse. Inhibitie van LDH of lactaatgeneratie veroorzaakt afname van de glycolyse met gelijktijdige groeistilstand, zowel in vitro als in vivo. Blokkering van de lactaatproductie in metformine behandelde melanoomcellen leidt tot verminderde celproliferatie en tumorgroei in muizen. Interessant genoeg leidt remming van LDH of complex I alleen niet tot apoptose, terwijl remming van beide samen leidt tot uitputting van de cellulaire ATP-pool, wat resulteert in door metabole catastrofe geïnduceerde apoptose. In het algemeen suggereert onze studie dat LDH en complex I een verschillende rol spelen bij de regulering van glycolyse en celproliferatie. Remming van deze twee vergroot de synthetische letaliteit in melanoom.


Trefwoorden: melanoom; complex I; LDH; metabole catastrofe; synthetische letaliteit


INLEIDING

Kwaadaardig melanoom is een van de meest agressieve vormen van huidkanker met een hoog metastatisch potentieel en resistentie tegen vele cytotoxische middelen [1, 2]. Ondanks uitgebreid onderzoek en gedeeltelijke successen door het gebruik van momenteel beschikbare geneesmiddelen is er geen effectieve behandeling tegen kwaadaardig melanoom [1-3]. Het aantal gevallen van melanoom neemt elk jaar toe en is verantwoordelijk voor ongeveer 75% van de sterfgevallen door huidkanker wereldwijd [2, 3]. De slechte respons op de momenteel beschikbare therapeutische opties en de ontwikkeling van resistentie tegen therapie rechtvaardigen de exploratie van nieuwe strategie├źn voor de behandeling van melanoom.

Versterkte a├źrobe glycolyse is een karakteristiek kenmerk van veel kankers [3-5]. Er is gemeld dat melanoomcellen als gevolg van de BRAF-mutatie grotendeels afhankelijk zijn van glycolyse voor het genereren van ATP, en disfunctionele oxidatieve fosforylering vertonen [6, 7]. Kankercellen verkrijgen ATP, biosynthetische tussenproducten en reductie-equivalenten door ongewone biochemische processen zoals glycolyse, glutaminolyse en de pentosefosfaatroute [5]. Normale (niet-kankercellen) halen ATP hoofdzakelijk uit mitochondriaal OXPHOS, terwijl kankercellen hoofdzakelijk vertrouwen op a├źrobe glycolyse om ATP en glycolytische tussenproducten te genereren die een snelle groei mogelijk maken [4, 5]. Een verhoogde lactaatproductie is in verband gebracht met de agressiviteit van kanker. Talrijke studies hebben lactaatdehydrogenase (LDH), dat de omzetting van pyruvaat in lactaat katalyseert, ge├»dentificeerd als de meest consistente marker van agressieve en snel groeiende kankers [8-11]. LDH speelt een belangrijke rol bij het reguleren van de glycolyse, het handhaven van de cellulaire redoxtoestand, de mitochondriale fysiologie en het behoud van de tumor [12]. Veranderd metabolisme van kankercel kan worden geassocieerd met mitochondriale disfunctie die gepaard gaat met remming van OXPHOS, toename van reactieve zuurstofspecies (ROS) en bevordering van ongecontroleerde groei, die op zijn beurt de ontwikkeling van een metastatisch fenotype verder ondersteunt [13,14]. Respiratoir complex I is het grootste en meest complexe enzym dat de oxidatie van NADH in de elektronentransportketen katalyseert [ 15]. Complex I speelt een belangrijke rol bij het genereren van ATP in normale cellen en is een belangrijke plaats waar ROS worden gegenereerd, maar de rol ervan bij tumorigenese is grotendeels onduidelijk. De meeste rapporten suggereren dat de activiteit van complex I wordt onderdrukt in kankercellen en dat remming ervan proliferatie en metastase bevordert [16-18]. Omgekeerd is ook gemeld dat melanoomcellen een verhoogde OXPHOS-functie vertonen, die geneesmiddelenresistentie veroorzaakt [19-21]. Vanwege de metabole flexibiliteit bij het kiezen van verschillende metabole routes, met name het glutaminemetabolisme [22], kunnen melanoomcellen ontsnappen aan verstoring van een molecuul in een metabole route [23]. Daarom moeten meerdere moleculen van verschillende metabolische routes worden aangepakt voor een effectief en curatief resultaat.

Van biguaniden zoals metformine en fenformine is bekend dat zij het ademhalingscomplex I remmen. Metformine, een eerstelijnstherapie voor pati├źnten met diabetes mellitus type 2 (T2DM), behoort tot de biguaniden en is onlangs ontdekt als anti-tumorigene activiteit [24, 25]. Op fysiologisch niveau oefent metformine zijn biologische activiteit uit door de leverglucogenese te verminderen, de insulinegevoeligheid te vergroten, de perifere glucoseopname te verhogen en de opname van glucose uit het maagdarmkanaal te verminderen [26]. Op cellulair niveau werkt metformine voornamelijk door remming van het mitochondriaal complex I, waardoor de oxidatieve fosforylering wordt belemmerd, hetgeen resulteert in een verlaagd ATP-niveau dat leidt tot activering van AMPK [27-30]. Bovendien is aangetoond dat metformine de mitochondriale ademhaling gekoppeld aan de ATP-productie vermindert, waardoor de glycolyse toeneemt [31, 32]. De antikankerwerking van metformine is aangetoond bij verschillende kankers met verschillende mechanismen [33, 34]. De rol van metformine bij melanoom is echter niet erg duidelijk. In tegenstelling tot andere kankersoorten blijkt metformine bij melanoom zowel tumorbevorderende als antitumoractiviteit te hebben [35-37]. Ook is aangetoond dat metformine, in combinatie met BRAF-remmers, de groei van melanoom onderdrukt [38].

In de huidige studie, met de speculatie dat het verstoren van ATP genererende routes door remming van complex I en LDH samen synthetisch dodelijk zou kunnen zijn voor melanoomcellen, gebruikten wij metformine of fenformine en oxamaat/dichlooracetaat (DCA) om deze twee enzymen te remmen met behulp van zowel cel- als diermodellen. Wij tonen aan dat remming van complex I en LDH activiteit een verschillend effect heeft op celgroei en proliferatie. Interessant is dat remming van complex I door metformine de a├źrobe glycolyse verder bevordert, wat resulteert in versterkte tumorgroei bij muizen. Ablokkering van metformine-ge├»nduceerde lactaatgeneratie door gebruik van oxamaat of DCA leidt tot cytostase en/of apoptose in melanoomcellen.

RESULTATEN

Metformine vertoont verschillende in vitro en in vivo effecten op de groei van melanoom
Metformine onderdrukt de tumorgroei door remming van complex I, dat door glucose wordt beïnvloed [30]. Bovendien is bekend dat glucose de activiteit van ademhalingsenzymen verandert [39]. Om de gevolgen van remming van complex I en de invloed van glucose op de werking van metformine op de progressie van melanomen te onderzoeken, hebben wij daarom de progressie van de isograft/xenograft gecontroleerd in door streptozotocine (STZ) geïnduceerde hyperglycemische muizen. Wij constateerden dat metformine de progressie van B16F10-afgeleide isografts in hyperglykemische muizen bevorderde in vergelijking met onbehandelde controles (figuur 1A, 1B en 1C). Ook beïnvloedde metformine de progressie van de tumor in normoglycemische C57BL/6J muizen positief (figuur 1D, 1E en 1F). Ook orale toediening van metformine bevorderde de groei van A375 xenografts in zowel hyperglycemische als normoglycemische NOD/SCID-muizen in vergelijking met onbehandelde controles (figuur 1G, 1H en 1I).

Figuur 1: Metformine bevordert de groei van melanoomtumoren in muizen. A.-C. C57BL/6J-muizen werden diabetisch gemaakt door 50 mg/kg streptozotocine (STZ) intraperitoneaal in te spuiten gedurende 3 opeenvolgende dagen. Tumoren werden ontwikkeld door 1 ├Ś105 B16F10 melanoomcellen subcutaan te injecteren in C57BL/6J muizen, ├ę├ęn week na STZ-injectie. Bij hyperglycemische muizen werd metformine (200 mg/kg) oraal toegediend voordat de cellen werden ge├»njecteerd. Grafiek die het tumorverloop A., het tumorgewicht B. en het tumorvolume van individuele muizen C. in hyperglycemische muizen weergeeft. De resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD(n = 7). D. Tumorprogressie van B16F10 isograft in normoglycemische muizen. Muizen kregen metformine (200 mg/kg) oraal toegediend na het verschijnen van een palpabele tumor. E. en F. Gewicht en representatief beeld van tumoren uitgesneden uit normoglycemische muizen toegediend met of zonder metformine. Resultaten worden weergegeven als gemiddelden ┬▒ SD(n = 5). G. Tumorprogressie van A375 xenograft in hyperglycemische muizen toegediend met of zonder metformine (200 mg/kg). De resultaten worden weergegeven als gemiddelden ┬▒ SD(n = 5). H. Tumorprogressie van A375 xenograft in normoglycemische muizen toegediend met of zonder metformine (200 mg/kg). Resultaten worden gegeven als gemiddelde ┬▒ SD(n = 5). I. Gewicht van de uitgesneden tumoren van hyperglycemische of normoglycemische muizen toegediend met of zonder metformine. De waarden *p < 0,05, **p < 0,01 duiden op significante verschillen tussen de groepen. (HG- hyperglycemisch, NG- normoglycemisch, Ctrl- controle, Met- metformine)

Om de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen te controleren die verband houden met een verhoogde tumorprogressie, werden tumorsecties onderzocht voor histopathologische analyse. Hoge celdichtheid en verminderde necrose waren duidelijk zichtbaar in de secties van beide tumortypes (B16F10 afgeleid isograft en A375 afgeleid xenograft) van metformine toegediende muizen (figuur 2A en 2B). Wij stelden vast dat de metformine versterkte proliferatie en progressie van de A375 afgeleide xenograft fenotypisch verschillend was in vergelijking met de controletumor. Dit wijst op een verhoging van de rang van de primaire tumor, wat blijkt uit de langgerekte morfologie van de kernen in vergelijking met de afgeronde morfologie in de secties van de controletumoren (ongepubliceerde informatie). Immunohistochemische kleuring van het celcyclus regulerende eiwit cycline D1 (figuur 2C) bleek hoger te zijn in tumorgedeelte van metformine toegediende muizen. Verder valideerden wij de verhoogde tumorgroei door de status van celcyclusregulerende eiwitten te controleren door immunoblotting van tumorlysaten. Wij vonden dat de niveaus van de moleculen cycline D1, CDK4, E2F1 en PCNA aanzienlijk waren verhoogd in de tumorlysaten van metformine toegediende muizen in vergelijking met de controle, terwijl het niveau van p21 was verlaagd (figuur 2D). Deze resultaten wijzen erop dat metformine, ongeacht de glycemische status van de muizen, de groei van het melanoom bevordert door modulatie van celcyclusregulerende eiwitten. Bovendien versterkte immunohistochemische analyse van tumorsecties deze waarneming, omdat metforminebehandeling de eiwitniveaus van CD31, een endotheelmarker (figuur 2E en 2F), verhoogde en het serumniveau van VEGF (figuur 2G) verhoogde, wat suggereert dat metformine angiogenese in melanoomtumoren bevordert.

Vervolgens controleerden wij het effect van metformine op de groei en proliferatie van melanoomcellen in vitro. In tegenstelling tot onze in vivo bevindingen resulteerde behandeling met metformine in groeionderdrukking van melanoomcellen in vitro (aanvullende figuur S1A, S1B, S1C en S1D). Vervolgens onderzochten wij het effect van complex I-remming met metformine en fenformine op de groei van melanoomcellen, aangezien beide de complex I-activiteit remden (aanvullende figuur S2). Wij vonden dat metformine en fenformine groeistilstand veroorzaakten in melanoomcellen die onder hoge glucose werden gekweekt. In aanwezigheid van lage glucose resulteerde behandeling met deze middelen echter in celdood (aanvullende figuren S3A, S3B, S3C en S3D). Het is waarschijnlijk dat metformine gemedieerde groeistilstand te wijten is aan verlaging van het glucoseniveau en extracellulaire verzuring, van media (aanvullende figuur S4A en S4B). Interessant is dat vervanging van het medium na elke 12 uur door vers medium met 25 mM glucose de klonogene overleving bij behandeling met metformine verhoogde. Aangezien met metformine behandelde cellen glucose zeer snel gebruikten in vergelijking met de controle, is aanvulling van het medium in wezen vereist om het glucoseniveau en de pH te handhaven, waardoor cellen in de aanwezigheid van metformine overleven (aanvullende figuur S4C en S4D). Deze resultaten wijzen erop dat de concentratie van glucose in het kweekmedium van invloed is op de werking van metformine.

Figuur 2: Metformine bevordert melanoom tumorgroei door het induceren van angiogenese en door het remmen van necrose. A. en B. Representatieve H & E beelden van tumorsecties van B16F10 isograft A. en A375 xenograft B. van controle en metformine groepen met necrotische gebieden (roze) en gezonde cellen (blauw). A. H&E kleuring van B16F10 isograft sectie van controle en metformin groep. B. H&E kleuring van A375 xenograft sectie van controle en metformine groepen. C. Representatieve immunoblots met de expressie van aangegeven celcyclus regulerende moleculen in het lysaat van B16F10 afgeleide tumoren van controle en metformine groepen. D. Representatief immunohistochemisch beeld met de expressie van celcyclus regulerende molecuul cycline D1 in de B16F10 isograft sectie van controle en metformine groepen. E. en F. Immunohistochemische analyse van angiogenese marker CD31 in de tumor sectie van B16F10 isograft van controle en metformine groep G. Relatief serumniveau van VEGF in C57- en NOD/SCID-muizen met controle- en metforminetoediening. Al deze experimenten werden uitgevoerd in normoglycemische muizen. De gegevens werden weergegeven als gemiddelden ┬▒ SD. De waarden *p < 0,05, **p < 0,01 duiden op significante verschillen tussen de groepen. (HG- hyperglycemisch, NG- normoglycemisch, Ctrl- controle, Met- metformine).

Remming van respiratoire complex I activiteit bevordert a├źrobe glycolyse
Discrepantie in het resultaat van metformine behandeling in vivo en in vitro bracht ons ertoe de oorzaak daarvan te onderzoeken. Het is bekend dat metformine zijn werking voornamelijk uitoefent door remming van het mitochondriale OXPHOS-enzym complex I <a href=”#[“> [</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib27″>27</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib29″>29</a><a href=”#]”>]</a></sup> en remming van complex I resulteert in verhoogde tumorgroei en proliferatie<sup><a href=”#14″> [</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib14″>14</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib18″>18</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Omdat wij constateerden dat behandeling met metformine verzuring van het kweekmedium veroorzaakte als gevolg van versterkte a├źrobe glycolyse (aanvullende figuren 4A en 4B), speculeerden wij dat dit de reden kon zijn voor celgroeistilstand. Daarom maten we het niveau van glucose en lactaat in het gebruikte kweekmedium, verzameld uit controle- en metformine behandelde cellen. Verhoogd glucosegebruik (zoals blijkt uit de aanwezigheid van minder restglucose in het medium) en een hoger lactaatgehalte werden gedetecteerd in metformine behandelde cellen in vergelijking met de controle (figuur 3A en 3B).</p&gt

<p>Om deze bevindingen kracht bij te zetten, onderzochten we verder het expressiepatroon en de activiteit van enkele van de eiwitten en enzymen die betrokken zijn bij de regulering van de glycolyse. Wij vonden dat metformine de eiwitniveaus van de belangrijkste glycolytische moleculen GLUT1, LDHA en ChREBP op een concentratie-afhankelijke manier verhoogde (figuur 3C). Deze resultaten suggereren dat remming van de activiteit van complex I door metformine kankercellen mogelijk kan dwingen de glycolytische route voor ATP-opwekking te volgen, waardoor de tumorgroei bij muizen toeneemt

<p>Om te evalueren of het glycolytische fenotype ook <em>in vivo</em> kan worden ge├»nduceerd bij remming van complex I, controleerden we eerst het glucoseniveau in serum van muizen met tumor en van normoglycemische muizen die al dan niet werden behandeld met metformine. Een significante daling van het serumglucosegehalte werd waargenomen bij metformine toegediende normoglykemische, tumordragende muizen (104,3 ┬▒ 13,7 mg/dl in C57BL/6J, en 134,0 ┬▒ 7,2 mg/dl in NOD/SCID) in vergelijking met onbehandelde controle (139,7 ┬▒ 16,3 mg/dl in C57BL/6J, en 168,0 ┬▒ 8,5 mg/dl in NOD/SCID) (figuur 3D en 3E). Ook metformine behandeling veroorzaakt vermindering van serum glucose in tumor dragende hyperglycemische muizen (Met, 237,3 ┬▒ 30,0 mg / dl in C57BL/6J, en 227,3 ┬▒ 12,3 mg / dl in NOD/SCID) in vergelijking met controle (388 ┬▒ 31,5 mg / dl in C57BL/6J, en 409,3 ┬▒ 18,6 mg / dl in NOD/SCID muizen) (figuur 3D en 3E). Afscheiding van lactaat is een kenmerk van glycolytische tumoren. Daarom controleerden wij het lactaatgehalte, dat zeer hoog bleek te zijn in het serum van tumordragende normoglykemische en hyperglykemische muizen die met metformine werden behandeld (figuur 3F en 3G). Verhoogd serum LDH wordt in verband gebracht met hooggradige agressieve tumoren en een slechte prognose bij uitgezaaid melanoom <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib8″>8</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib10″>10</a><a href=”#]”>]</a></sup>. De serum-LDH-activiteit werd gecontroleerd en bleek zeer hoog te zijn in het serum van hyperglycemische en normoglycemische muizen die met metformine werden behandeld, vergeleken met de controle (figuur<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#F3″> </a>3H en 3I). Voorts werd een verhoogde LDH-activiteit vastgesteld in tumorweefsel van metformine toegediende muizen in vergelijking met de onbehandelde controle (figuur 3J).</p&gt <p><strong>Remming van complex I samen met LDH of lactaatgeneratie is synthetisch dodelijk voor melanoomcellen<br></strong>Om de mogelijkheid te onderzoeken of metformine bevorderde glycolyse of overmatige lactaatgeneratie de belangrijkste oorzaak is van verhoogde groei en proliferatie van melanoomtumoren, werd lactaatgeneratie geremd met behulp van LDH-remmer oxamaat en PDK1-remmer DCA. Wij vonden dat oxamaat en DCA alleen een remmend effect hebben op de groei van melanoomcellen (figuur 4A, 4B en 4C; aanvullende figuur S5). Verminderde celoverleving werd waargenomen bij behandeling met oxamaat of DCA samen met metformine (figuur 4A, 4B en 4C). Ook andere bekende glycolytische remmers zoals chloretine (GLUT1-remmer), 2-deoxy-D-glucose (2DG) en iodoacetaat beperkten de proliferatie van met metformine behandelde melanoomcellen (aanvullende figuren S6A en S6B). Een verhoogde glucose-opname via GLUT1 en een verhoogde a├źrobe glycolyse via LDHA en PDK1 is het kenmerk van kankercellen. Daarom verkozen wij oxamaat en DCA boven andere glycolytische remmers.</p&gt <p>Volgende controle van de overlevingskansen op lange termijn van melanoomcellen in aanwezigheid van metformine en oxamaat/DCA alleen of in combinatie met elkaar, voerden wij een klonogene overlevingstest uit. In melanoomcellen die met oxamaat en metformine samen werden behandeld, werden geen overlevende kolonies ontdekt (figuur<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#F4″> </a>4D, 4E en 4F). Soortgelijke resultaten werden ook verkregen in cellen die werden behandeld met metformine en DCA samen (figuur 4D, 4E en 4F). Vervolgens controleerden wij of remming van deze twee enzymen de dood in melanoomcellen induceerde, zoals blijkt uit Annexine V en PI-kleuring. Al deze middelen alleen veroorzaakten groeistilstand, maar induceerden geen apoptose. In A375- en B16F10-cellen die met oxamaat/DCA in combinatie met metformine werden behandeld, werd echter meer apoptose geconstateerd dan bij de enkele stof alleen (figuur 5A en 5B). Deze waarneming werd verder bevestigd door immunoblotting voor de apoptotische markers PARP1, Bax en Bcl-2 (figuur 5C en 5D). Verhoogde PARP-splitsing en Bax-niveau, terwijl het niveau van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 afnam in cellen die werden behandeld met metformine en oxamaat/DCA samen in vergelijking met ├ę├ęn enkel middel (figuur 5C en 5D). Deze resultaten wijzen erop dat remming van complex I en LDH samen de inductie van apoptose kan bevorderen.</p> <p>Verder hebben we het effect gecontroleerd van metformine en oxamaat/DCA, alleen of in combinatie, op de overleving van niet-kankercellen. Wij gebruikten drie verschillende niet-kankerachtige cellijnen, namelijk AML12 (hepatocyten van muizen), L6 (spiercellen van ratten) en MEF (embryonale fibroblasten van muizen) om het effect van de combinatiebehandeling te testen. Hoewel de combinatie van metformine en oxamaat/DCA de proliferatie van deze cellen verminderde (aanvullende figuur S7A, S7B en S7C), had zij geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen (aanvullende figuur S7D), wat erop wijst dat deze combinatie effectief is in het selectief doden van kankercellen.</p> <h3></h3&gt <p><strong>Het blokkeren van complex I en lactaatgeneratie legt een metabole catastrofe op<br></strong>Om na te gaan of oxamaat en metformine samen het metabolisme van melanoomcellen be├»nvloeden, hebben we metabole parameters gemeten in aanwezigheid van deze remmers. Behandeling met metformine verhoogde de glycolyse, terwijl behandeling met oxamaat resulteerde in afname van glucosegebruik en lactaatafscheiding (figuur 6A en 6B). Interessant is dat het glucosegebruik en de lactaatafscheiding aanzienlijk werden geremd bij de behandeling van cellen met zowel oxamaat als metformine samen (figuur 6A en 6B). Bovendien, zowel oxamaat als metformine verminderd ATP niveaus door het remmen van substraat niveau fosforylering en OXPHOS respectievelijk (figuur 6C). Ook werd een significante daling van het ATP-niveau vastgesteld in cellen die werden behandeld met oxamaat en metformine samen (figuur 6C). Verder, om de betrokkenheid van LDH in melanoom celgroei en proliferatie te bevestigen, werd knock down van LDHA (LDHA-KD) uitgevoerd met behulp van specifieke siRNA (figuur 6D). In LDHA-KD-cellen behandeld met metformine of fenformine (figuur 6E) werd een verhoogde celdood waargenomen. Een significante vermindering van de glycolyse (zoals blijkt uit verminderde glucosebenutting en lactaatafscheiding) en het ATP-niveau werd waargenomen in LDHA-KD-cellen in vergelijking met de controle (figuur 6F, 6G en 6H). Bovendien werd een afname van de glycolytische snelheid en een scherpe daling van het ATP-niveau waargenomen in LDHA-KD-cellen die werden behandeld met metformine of fenformine (figuur 6F, 6G en 6H). Deze resultaten wijzen erop dat gelijktijdige remming van zowel complex I als LDH of lactaatgeneratie pathway metabole catastrofe induceert als gevolg van de verstoring van cellulaire ATP-pool, uiteindelijk leidend tot groeistilstand en celdood.</p&gt

<p><strong>Simultane remming van complex I en LDH door metformine en oxamaat vertraagt tumorprogressie bij muizen<br></strong>Om na te gaan of combinatie van oxamaat en metformine ook effectief is in het verminderen van tumorprogressie, werden tumoren ontwikkeld door het injecteren van B16F10-cellen in C57BL/6J muizen. Nadat de tumoren een grootte van 50 mm<sup>3</sup> hadden bereikt, werden de muizen gerandomiseerd in vier groepen: (a) controle, (b) metformine, (c) oxamaat, en (d) met metformine en oxamaat samen behandelde muizen. Het viel ons op dat muizen die met metformine werden behandeld een grotere tumor ontwikkelden dan de onbehandelde controle (figuur 7A, 7B en 7C). Bij muizen die oxamaat kregen toegediend, ontwikkelden de tumoren zich langzamer dan bij de onbehandelde controle en bij muizen die met metformine werden behandeld (figuur 7A). Interessant genoeg zagen wij dat oxamaat de tumorgroei drastisch vertraagde wanneer het samen met metformine werd toegediend, zoals blijkt uit de vermindering van het tumorvolume en het tumorgewicht (figuur 7A, 7B en 7C)

<p>Verder, om te bevestigen of abrogatie van metformine ge├»nduceerde tumorprogressie door oxamaat een gevolg is van vermindering van aerobe glycolyse, maten we metabole parameters <em>in vivo</em>. Metformine toegediende muizen hadden lage serumglucose, hogere lactaat- en LDH-spiegels in serum vergeleken met de controle, terwijl relatief hogere serumglucose- en lage lactaatspiegels werden waargenomen bij de muizen die werden behandeld met oxamaat alleen of metformine samen met oxamaat (figuur 7D en 7E). De activiteit van het LDH-enzym werd aanzienlijk verminderd in de tumoren van muizen die met oxamaat alleen of metformine samen met oxamaat werden behandeld (figuur 7F). In de tumoren van muizen die zowel oxamaat als metformine kregen toegediend, werd een relatief zeer laag ATP-niveau waargenomen in vergelijking met een enkel middel. Wij namen echter geen significante veranderingen waar in de eiwitniveaus van moleculen die de glycolyse regelen (figuur 7I). Belangrijk is dat geen significante verandering in lichaamsgewicht werd geconstateerd bij de muizen die een combinatiebehandeling kregen en dat bij visuele inspectie geen mogelijke bijwerkingen of grove symptomen van gegeneraliseerde toxiciteit werden waargenomen (aanvullende figuur S8A). Bovendien werden schijnbaar geen pathologische afwijkingen waargenomen in de vitale organen zoals long, lever, nier en hart van deze muizen (aanvullende figuur S8B). Deze resultaten suggereren dat deze combinatie geen algemene toxiciteit uitoefent en effectief is in het vertragen van tumorprogressie bij muizen.</p&gt <h2>Discussie</h2&gt <p>Kankercellen, waaronder melanoomcellen, leiden een enorme hoeveelheid koolstofflux om naar glycolyse <sup><a href=”#5″>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib5″>5</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib7″>7</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Dit helpt de cellen bij het genereren van ATP en andere bouwstenen voor snelle tumorgroei <sup><a href=”#5″>[5]</a></sup>. Verschillende rapporten suggereren dat het aanpakken van metabolische routes de tumorgroei en celgroei <em>in vitro</em> <sup><a href=”#40″>[40-</a><a href=”#42″>[42]</a></sup> vermindert. In de huidige studie tonen wij aan dat metformine de groei van melanoom bevordert door verhoging van de glycolyse als gevolg van remming van de complex I-functie, terwijl remming van LDH groeistilstand in de cellen veroorzaakt. Remming van de lactaatproductie in melanoomcellen behandeld met metformine be├»nvloedt de celoverleving, waardoor de tumorgroei afneemt (figuur 8).</p> <p>De gevolgen van remming van complex I op de groei van kankercellen zijn niet duidelijk, hoewel rapporten suggereren dat remming van complex I leidt tot celtransformatie en de celgroei versterkt<a href=”#[“> <sup>[</sup></a><sup><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib14″>14</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib18″>18</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Omgekeerd is ook gemeld dat remming van complex I de tumorgroei bij muizen vertraagt <sup><a href=”#30″>[30]</a></sup>. Deze verschillende resultaten zijn waarschijnlijk afhankelijk van de beschikbaarheid van voedingsstoffen in de tumormicro-omgeving. Er is gemeld dat wanneer glucose in overvloed beschikbaar is, remming van complex I de glycolyse en snelle celproliferatie bevordert, terwijl het celdood induceert onder metabole stressomstandigheden<sup><a href=”#43″> [43]</a></sup>. In deze studie hebben wij geconstateerd dat remming van complex I door metformine de progressie van melanoomtumoren bij muizen bevordert.</p&gt <p>Terwijl is aangetoond dat metformine de proliferatie van veel kankercellen remt en ook de tumorprogressie van xenografts in muizen beperkt <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib33″>33</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib34″>34</a><a href=”#]”>]</a></sup>, het is bekend dat het zowel groeiremmende als groeibevorderende effecten uitoefent in melanoom<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib35″>35</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib37″>37</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Interessant is dat wij ontdekten dat B16F10- en A375-tumoren snel groeiden bij muizen die met metformine werden behandeld en dat de groeisnelheid afhing van de glykemische status van de muizen (figuur 2D en 2E). Deze waarneming komt overeen met een recent verslag waaruit blijkt dat metformine de tumorgroei van BRAF-mutant-melanoomcellen vergemakkelijkt<sup><a href=”http://335″> [35]</a></sup>.</p&gt <p>De verschillen in de werking van metformine op de groei van melanoomcellen <em>in vitro</em> en <em>in vivo</em> worden waarschijnlijk be├»nvloed door de beschikbaarheid van glucose en de lactaatconcentratie die de werking kunnen be├»nvloeden. Metformine remt de celgroei en induceert apoptose onder glucosebeperkende omstandigheden <sup><a href=”#43″>[43]</a></sup>, terwijl wij constateerden dat het in aanwezigheid van hoge glucose groeistilstand veroorzaakt zonder de celdood te be├»nvloeden. Voor deze discrepantie redeneerden wij dat kankercellen ATP <em>via</em> OXPHOS onttrekken onder metabole stress, terwijl bij een overvloed aan glucose ATP voornamelijk wordt onttrokken via glycolyse. Het afremmen van complex I onder hoge glucosewaarden bevordert de glycolyse verder, wat leidt tot een overmaat aan lactaat, en dit verschijnsel is al eerder gemeld<sup><a href=”#44″> [44]</a></sup>. Tezamen suggereren deze bevindingen dat door metformine ge├»nduceerde groeistilstand in melanoomcellen <em>in vitro</em> een gevolg is van verzuring van het medium door overmatige melkzuuraccumulatie als gevolg van snel gebruik van beschikbare glucose. Met name de door metformine ge├»nduceerde groeistilstand kan worden voorkomen door het medium regelmatig aan te vullen om optimale groeiomstandigheden te handhaven, aangezien met metformine behandelde cellen meer glucose nodig hebben om te prolifereren als gevolg van de versterkte a├źrobe glycolyse. Dit bootst de <em>in vivo</em> toestand na, waarin waarschijnlijk een snelle, constante circulatie van toegangsmelkzuur de kankercellen in staat stelt meer glucose te gebruiken, hetgeen bijdraagt tot een snelle proliferatie. Bovendien kan lactaat ook worden gebruikt door kankercellen in tumor <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib45″>45</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib46″>46</a></sup><a href=”#]”><sup>]</sup></a>. Bovendien is gemeld dat metformine angiogenese induceert <em>via</em> het verhogen van het VEGF-niveau<sup><a href=”#[“> [</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib35″>35</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib47″>47</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Wij melden dat remming van complex I de lactaatproductie verhoogt en er is eerder gesuggereerd dat de glycolytische switch de angiogenese bevordert<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib48″>48</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib49″>49</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Onze resultaten laten een positieve correlatie zien tussen serumlactaat en VEGF-niveau bij muizen die metformine kregen toegediend. Daarom is het waarschijnlijk dat metformine bevorderde tumorgroei wordt vergemakkelijkt door lactaat ge├»nduceerde angiogenese die gemedieerd kan worden door VEGF <sup><a href=”#48″>[48]</a></sup>. Bovendien zagen we een verhoogd niveau van E2F1, een belangrijke celcyclusregulerende molecule, in de tumoren van muizen die met metformine werden behandeld. Naast het bevorderen van de celproliferatie regelt E2F1 ook veel genen die betrokken zijn bij glycolyse<sup><a href=”#50″> [50]</a></sup>, wat essentieel is voor de snelle groei van kankercellen. Daarom is het waarschijnlijk dat E2F1 een belangrijke rol speelt bij het medi├źren van metformine-ge├»nduceerde snelle tumorprogressie, waarschijnlijk <em>via</em> het reguleren van aerobe glycolyse.</p&gt <p>Glycolytische remmers zoals 2-deoxy glucose, lonimide, 3-bromopyruvate, DCA, en geneesmiddelen die interfereren met metabolische routes hebben veelbelovende resultaten laten zien in het onderdrukken van tumorgroei<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib40″>40</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib42″>42</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib51″>51</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib53″>53</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Daarnaast is het aanpakken van de lactaatgeneratieroute vooral aantrekkelijk bij glycolytische kankers <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib54″>54</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib55″>55</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Melanoomcellen zijn metabolisch glycolytisch, en zijn daarom in de eerste plaats afhankelijk van de hoge activiteit van LDH voor het genereren van ATP <sup><a href=”#6″>[6]</a></sup>. Melanoomcellen brengen LDH tot overexpressie en een hoog serumniveau correleert vaak met een slechte prognose en overleving van pati├źnten<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib3″>3</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib8″>8</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib10″>10</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Onze resultaten wijzen erop dat verstoring van de omzetting van pyruvaat in lactaat de proliferatie van melanoomcellen diepgaand be├»nvloedt. Dit is in overeenstemming met de rapporten dat tumoren van glycolytische celtypes gevoeliger zijn voor remming van LDH-A met FX11<sup><a href=”#56″> [56]</a></sup>.</p&gt <p>LDH speelt een belangrijke rol in metabole homeostase en tumoronderhoud<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib12″>12</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib57″>57</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Wij gebruikten oxamaat en DCA om de lactaatvorming in melanoomcellen te remmen. DCA is een oraal toe te dienen kleine molecule die is gebruikt voor de behandeling van melkzuursyndroom, en er is aangetoond dat het herstel van de OXPHOS-functionaliteit door DCA celdood induceert<sup><a href=”#[“> [</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib52″>52</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib53″>53</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Bovendien is eerder aangetoond dat DCA de lactaatproductie vermindert en apoptose veroorzaakt in melanoomcellen <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib58″>58</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib59″>59</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Oxamaat, een analoog van pyruvaat, wordt ook gebruikt om LDH te remmen. Een recente studie van Miskimins et al. suggereert dat het samen aanpakken van complex I en LDH een veelbelovende strategie kan zijn om de groei van agressieve kankers een halt toe te roepen <sup><a href=”#60″>[60]</a></sup>. In overeenstemming hiermee merkten we ook op dat het voorkomen van lactaatvorming en het gelijktijdig remmen van complex I door respectievelijk oxamaat/DCA of LDH-specifiek siRNA en metformine resulteert in uitputting van de cellulaire ATP-pool. Afname van de cellulaire ATP-pool roept een metabole catastrofe op die leidt tot apoptose in melanoomcellen. Metabole catastrofe-ge├»nduceerde celdood wordt beschouwd als een veelbelovende strategie om de voortgang van kanker een halt toe te roepen<sup><a href=”#61″> [61]</a></sup>. Bovendien wijst onze studie op de onderscheiden rol van complex I en LDH in de celproliferatie, en deze twee vormen ATP genererende route via respectievelijk OXPHOS of fosforylering op substraatniveau. Blokkering van een van beide enzymen alleen leidt niet tot celdood, aangezien de cellen kunnen overschakelen op een alternatieve route voor ATP-opwekking. Gelijktijdige remming van beide enzymen leidt wel tot apoptose. Dit geeft duidelijk aan dat cellen afhankelijk zijn van de functie van deze twee enzymen die een synthetisch dodelijk paar vormen, wat een veelbelovend fenomeen is dat kan worden gebruikt voor het selectief aanpakken van melanoomcellen<a href=”#[“> </a><sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib62″>62</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib63″>63</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Aangezien E2F1 betrokken is bij de regulering van apoptose <sup><a href=”#64″>[64]</a></sup>, is het waarschijnlijk dat de apoptose ge├»nduceerd door de combinatie van metformine en oxamaat/DCA betrekking heeft op E2F1. Metformine bevordert apoptose in kankercellen <em>via</em> activering van p53 <sup><a href=”#37″>[37]</a></sup>. Bij melanoom is de rol van p53 echter niet duidelijk. Volgens de literatuur is p53 niet-functioneel in melanoom en zijn de niveaus ervan paradoxaal verhoogd in gevorderde graden van melanoom <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib65″>65</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib67″>67</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Eerder hebben wij gemeld dat een verhoogd niveau van p53 in verband wordt gebracht met een toename van de tumorgroei<sup><a href=”#68″> [68]</a></sup>. Daarom is het onwaarschijnlijk dat p53 betrokken is bij de door de combinatiebehandeling ge├»nduceerde apoptose, en dus zijn meer studies nodig om de functionaliteit van E2F1 en p53 in melanoom te evalueren.</p&gt <p>Het gebruik van combinaties van verschillende geneesmiddelen die synergetisch de dood van kankercellen kunnen bevorderen, kan ook de toxiciteit voor normale cellen vergroten. Daarom is het cruciaal om het effect van de combinatiebehandeling op normale cellen te onderzoeken. Belangrijk is dat onze gegevens suggereren dat deze combinatie effectief is in het doden van kankercellen, zowel <em>in vitro</em> als <em>in vivo</em>, en het minste effect heeft op de overleving van normale cellen. De differenti├źle gevoeligheid tussen melanoom- en normale cellen als gevolg van de combinatie van metformine en oxamaat/DCA kan worden toegeschreven aan het feit dat melanoomcellen in hoge mate glycolytisch zijn en een overexpressie vertonen van moleculen die betrokken zijn bij de productie en secretie van lactaat in vergelijking met normale cellen <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib3″>3</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib6″>6</a>-<a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib10″>10</a><a href=”#]”>]</a></sup>. In vergelijking met normale cellen vertonen kankercellen een hogere ontkoppelde mitochondriale ademhaling<sup><a href=”#31″> [31]</a></sup>. Kankercellen vertonen na behandeling met metformine een grotere compenserende verhoging van de glycolyse dan normale cellen <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib31″>31</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib32″>32</a><a href=”#]”>]</a></sup>, waardoor de metabole gevoeligheid van kankercellen wordt verzwaard. Daarom onderdrukt remming van LDH of lactaatgeneratie/afscheiding de groei van kankercellen, terwijl normale cellen het minst worden getroffen omdat er nog voldoende ATP kan worden geproduceerd uit OXPHOS omdat metformine een zwakke complex I-remmer is. Aangezien de OXPHOS-activiteit in normale cellen hoger is dan in melanoomcellen, heeft de combinatie van metformine en oxamaat/DCA waarschijnlijk de minste nadelige gevolgen voor de ademhaling van normale cellen.</p&gt <p>Onze studie opent nieuwe wegen bij het aanpakken van het metabolisme van kankercellen en kan verder worden betrokken bij het testen van andere klinisch goedgekeurde geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze samen met metformine de glycolyse remmen. De huidige studie suggereert dat elk geneesmiddel/remmer die de productie van lactaat blokkeert, kan worden gebruikt in combinatie met metformine voor een beter beheer en het voorkomen van tumorgroei. Zo is aangetoond dat rapamycine, een klinisch goedgekeurd geneesmiddel, de vorming van lactaat voorkomt<sup> <a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib69″>69</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib70″>70</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Evenzo is aangetoond dat remming van BRAF leidt tot onderdrukking van de glycolyse <sup><a href=”#[“>[</a><a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib6″>6</a>, <a href=”https://www.oncotarget.com/article/6134/text/#bib7″>7</a><a href=”#]”>]</a></sup>. Daarom kunnen zowel rapamycine als BRAF-remmers samen met metformine worden gebruikt om het therapeutische resultaat te verbeteren met minder bijwerkingen. Tezamen geven onze resultaten aan dat LDH of een ander mechanisme dat de lactaatproductie of -secretie controleert, cruciaal is voor snelle progressie van het melanoom onder OXPHOS-gecompromitteerde omstandigheden, en dit kan worden benut als een geschikt therapeutisch doelwit voor het beheersen van de groei van glycolytische kankercellen. Uitgebreidere studies zijn nodig om de functionaliteit van LDH en complex I in andere kankermodellen te evalueren, en vervolgens hun implicatie in kankertherapie in het algemeen.</p&gt <h2>MATERIALEN EN METHODEN</h2&gt <p><strong>Dierexperimenten<br></strong>Muizen werden verkregen van de Experimental Animal Facility (EAF) van het National Centre for Cell Science (NCCS), Pune, India. Hyperglykemie bij muizen werd opgewekt met STZ zoals eerder beschreven<sup><a href=”#71″> [71]</a></sup> met kleine wijzigingen. Kort gezegd werden mannelijke C57BL/6J- en NOD/SCID-muizen gedurende 6 uur gevast voorafgaand aan de intraperitoneale injectie van STZ (50 mg/kg) in 0,01 M citraatbuffer (pH 4,4) gedurende drie opeenvolgende dagen. De bloedglucosemeting werd uitgevoerd door de staart af te knippen en bloed aan te brengen op een glucose-analysator (Accu-Chek Active, Roche, Duitsland). Muizen met een bloedglucosewaarde van meer dan 200 mg/dl werden beschouwd als hyperglycemisch. Tumor werd ge├»nduceerd door injectie van B16F10 (2 ├Ś 10<sup>5</sup>) of A375 (1 ├Ś 10<sup>6</sup>) cellen in 100 ┬Ál steriele PBS subcutaan in de rechterflank van respectievelijk C57BL/6J- en NOD/SCID-muizen. De ontwikkeling van de tumoren werd regelmatig gecontroleerd door de grootte te meten met een digitale schuifmaat (Sigma, USA) na het verschijnen van voelbare tumoren. Bij hyperglycemische muizen werd begonnen met orale toediening van metformine op afwisselende dagen een week v├│├│r de tumoruitdaging. Anders werd metformine pas toegediend nadat de tumor een optimale grootte had bereikt en de behandeling werd voortgezet tot het einde van het experiment. Aan het einde van het experiment werden de muizen gedood; de tumoren werden verwijderd en opgeslagen in ofwel -80<sup>┬░</sup>C ofwel in 10% formalineoplossing voor verder onderzoek. In een andere reeks experimenten werden muizen (C57BL/6J achtergrond, mannelijk) willekeurig verdeeld in 4 groepen na het verschijnen van een voelbare tumor. Om het resultaat van metforminebehandeling in combinatie met LDH-remmer oxamaat te onderzoeken, kregen de muizen om de dag oraal ofwel metformine (200 mg/kg) ofwel oxamaat alleen (500 mg/kg) ofwel beide samen toegediend. De ontwikkeling van de tumor werd regelmatig gecontroleerd met een schuifmaat. Aan het einde van het experiment werd tumor-, spier- en leverweefsel uitgesneden, gewogen en opgeslagen in -80<sup>┬░</sup>C voor verdere analyse. Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de commissie voor controle en toezicht op dierproeven (CPCSEA), regering van India, en na het verkrijgen van toestemming van de Ethische Commissie voor Dieren van het Instituut (IAEC).</p> <p><strong>Cellijnen en kweekomstandigheden<br></strong>B16F10 murien melanoom, A375 en SKMel28 menselijke melanoomcellen werden gekocht bij ATCC (VA, VS) en bewaard in onze eigen opslagplaats. Niet-kanker cellen, AML12 (muis hepatocyten), L6 (rat spiercellen) en MEF (muis embryonale fibroblasten) werden parallel gebruikt met kankercellen als controle. Alle cellen werden gekweekt in hun respectieve medium met ofwel 1 mM of 25 mM glucose, afhankelijk van de experimenten en aangevuld met 10% door warmte ge├»nactiveerd foetaal runderserum (Hyclone, UT, VS), penicilline (100 U/ml) en streptomycine 100 ┬Ág/ml (Life Technologies, NY, VS), bij 37<sup>┬░</sup>C in aanwezigheid van 5%<sub> </sub>CO<sub>2</sub>.</p&gt <p><strong>Chemicali├źn en reagentia<br></strong>Metformine, fenformine, oligomycine, rotenon, decylubiquinon, streptozotocine (STZ), [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5difenylterazoliumbromide] (MTT), NAD+, NADH, ATP, AMP, D-glucose, natriumoxamaat, iodoacetaat, 2-deoxy-D-glucose, dichlooracetaat (DCA), Diaminobenzidine (DAB) en floretine werden gekocht bij Sigma (MO, USA). Antilichamen voor ChREBP (1:1000), GLUT1 (1:1000), LDHA (1:1000), Cycline D1 (1:1000), PCNA (1:1000), CDK4 (1:1000), p21 (1:1000), E2F1 (1:1000) CD31 (1:100), PARP-1 (1.:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), ╬▓-tubuline (1:1000), GAPDH (1:1000), HSP60 (1:1000) en VEGF (1:50) waren afkomstig van Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).</p&gt <p><strong>Celllysaatbereiding en immunoblotting<br></strong>De cellen werden driemaal gewassen met PBS (phosphate buffered saline) en gelyseerd in lysisbuffer met 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 120 mM NaCl, 10 mM natriumfluoride, 10 mM natriumpyrofosfaat, 2 mM EDTA, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 1% NP-40 en proteaseremmercocktail (Roche, Duitsland). Tumorlysaten werden bereid door tumorweefsels in fijne stukjes te hakken, vijfmaal te wassen met 0,85% zoutoplossing met proteaseremmercocktail en te lyseren in lysisbuffer door homogeniseren met een weefselhomogenisator (Sigma, VS), gevolgd door sonicatie. De lysaten werden geklaard door centrifugeren bij 15.000 rpm gedurende 30 minuten. Cellysaten werden onder gekoelde omstandigheden bereid. Ongeveer 50-100 ┬Ág eiwit van hele cellysaten werden opgelost op 8-12% SDS-polyacrylamidegel die vervolgens werd overgebracht op PVDF-membraan (Millipore, Duitsland). Het membraan werd geprofileerd met de gewenste primaire antilichamen, gevolgd door HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. De immunoblots werden gedetecteerd met luminaal reagens (Santa Cruz Biotechnology). Indien nodig werden de blots gestript door incubatie van het membraan bij 50<sup>┬░</sup>C gedurende 15 minuten in strippingbuffer (62,5 mM Tris-Cl, pH 6,8, 100 mM mercaptoethanol en 2% SDS) met intermitterend schudden. De membranen werden grondig gewassen met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) en werden opnieuw geprofileerd met de gewenste antilichamen.</p&gt <p><strong>Immunofluorescentie of confocale microscopie<br></strong>Cellen werden uitgezet in Labtek-kamerplaatjes (Nunc, VS) en mochten 24 uur groeien. Behandeling met metformine en andere remmers werd gedurende de gewenste tijd en concentraties gegeven. Cellen werden gewassen met gekoelde steriele PBS en gefixeerd met 3,7% paraformaldehyde-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Deze werden vervolgens gedurende 10 minuten gepermeabiliseerd met 0,025% Triton X-100 in PBS en vervolgens geblokkeerd met 5% BSA in PBS gedurende 1 uur bij 37<sup>┬░</sup>C. De cellen werden ge├»ncubeerd met 1:100 verdunningen van primaire antilichamen in de blokkeeroplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en ten minste vijfmaal gewassen met TBST (TBS met 0,05% Tween-20) alvorens te worden ge├»ncubeerd met de juiste gelabelde secundaire antilichamen (1:200) in de blokkeeroplossing gedurende nog eens 1 uur bij kamertemperatuur. Na vijfmaal wassen met TBST werden de monsters bedekt met inbedmiddel met DAPI (Santa Cruz Biotechnology, USA). Dia’s werden verzegeld, onderzocht onder een confocale laser scanning microscoop (LSM510 Carl Zeiss, Duitsland) en beelden werden vastgelegd. Beelden werden vervolgens verwerkt door LSM beeldanalyse software.</p&gt <p><strong>Immunohistochemie en histopathologie<br></strong>Immunohistochemie en histopathologie werden uitgevoerd volgens de Malvi et al. <sup><a href=”#72″>[72]</a></sup>. In het kort werden fijne coupes van de tumor en andere organen gemaakt met een microtoom, gefixeerd op glasplaatjes en geparafiniseerd. Voor de immunohistochemie werden de glaasjes tweemaal gedurende 10 minuten in xyleenoplossing gedeparaffineerd en vervolgens driemaal gewassen met 100%, 95%, 70% en 50% ethanol. De glaasjes werden nogmaals gewassen met gedistilleerd water, gevolgd door wassen met PBS gedurende 5 minuten. Voor het ophalen van het antigeen werden de glaasjes gedurende 10 minuten in natriumcitraatbuffer (0,01 M, pH 4,5) in de microgolfoven gekookt en vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur afgekoeld. BSA of normaal geitenserum (2%) werd gebruikt voor blokkering in een vochtige kamer of in een koelbox gedurende 1 uur. De glaasjes werden geprobed met de gewenste antilichamen (1:100 verdunning) in PBST (PBS met 0,025% Tween-20) met 0,01% BSA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4<sup>┬░</sup>C. Glaasjes werden 4 keer gewassen met PBST gedurende 5 minuten, en werden gedurende 1 uur geprofileerd met compatibele HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Deze werden opnieuw gewassen en gekleurd met Diaminobenzidine (DAB) gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen en tegenkleuren met hematoxyline. De plaatjes werden verder gewassen met water, gedehydrateerd met absolute alcohol, gevolgd door een laagje inbedmiddel, en vervolgens geanalyseerd op de expressie van de gewenste moleculen. Voor histopathologie werden deparafiniseerde dia’s gekleurd met hematoxyline en eosine, en microscopische analyse voor celdichtheid, celmorfologie, metastase, cytotoxiciteit en necrose werd uitgevoerd door pathologen op een geblindeerde manier in het KEM Hospital Pune, India.</p&gt <p><strong>Cellulaire cytotoxiciteit en overlevingstest</strong><br>Approximaal 5 ├Ś 10<sup>3</sup> (B16F10) en 10 ├Ś 10<sup>3</sup> (A375 en SKMel28) cellen werden in elk putje van 96 wells weefselkweekplaten gezaaid en lieten zich gedurende 24 uur bij 37<sup>┬░</sup>C hechten. De cellen werden behandeld volgens de experimentele vereisten en de proliferatie of levensvatbaarheid werd beoordeeld met een MTT-test. MTT (50 ┬Ál, 1 mg/ml in DMEM zonder fenolrood) werd toegevoegd aan elk putje en gedurende 4 uur ge├»ncubeerd bij 37<sup>┬░</sup>C. Formazankristallen werden opgelost<sup> </sup>in 100 ┬Ál isopropanol door incubatie onder schudden bij kamertemperatuur gedurende 5 min. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met 630 nm als referentiefilter. Onbehandelde cellen werden beschouwd als controle (100% celoverleving).</p&gt <p><strong>Detectie van apoptose door annexine V-kleuring<br></strong>Cellen werden gezaaid bij een dichtheid van ongeveer 3 ├Ś 10<sup>5</sup> cellen in platen van 35 mm en mochten 24 uur groeien. Cellen werden behandeld met of zonder oxamaat en DCA, hetzij alleen of met metformine gedurende 48 uur of volgens de experimentele eis. De cellen werden geoogst door trypsinisatie en verwerkt voor flowcytometrie. Apoptose werd gedetecteerd door dubbele kleuring van Annexine V en PI met behulp van apoptosis assay kit (BD Bioscience, USA) volgens de instructies van de fabrikant.</p&gt <p><strong>Celcyclusanalyse<br></strong>Cellen werden gezaaid bij een dichtheid van ongeveer 3 ├Ś 10<sup>5</sup> cellen in 35 mm platen en mochten 24 uur groeien. Cellen werden behandeld met of zonder metformine, oxamaat en andere glycolytische remmers alleen of samen zoals aangegeven gedurende 48 uur of als experimentele vereiste. De cellen werden geoogst door trypsinisatie en verwerkt voor flowcytometrie. In het kort werden de cellen gewassen met gekoelde PBS en gefixeerd in 70% ethanol op ijs gedurende 30 minuten. Na behandeling met RNase (200 ╬╝g/ml) gedurende 30 minuten bij 37┬░C werd 50 ╬╝g/ml PI toegevoegd aan de celpellet en gedurende 30 minuten in het donker ge├»ncubeerd op ijs. De fluorescentie van PI werd opgenomen door een 585 nm filter in een flowcytometer (FACS Calibur, Becton Dickinson, California, USA). De gegevens werden geanalyseerd met Cell Quest Pro-software voor 10.000 cellen.</p&gt <p><strong>Lange termijn celoverlevingstest<br></strong>Cellen (5 ├Ś 10<sup>2</sup>) werden gedurende 24 uur uitgezet in platen met 12 putjes. De cellen werden behandeld zonder of met 25 mM of 50 mM oxamaat en 10 of 20 mM DCA samen met metformine en bleven nog 48 uur in behandeling. Platen werden ge├»ncubeerd voor een extra 10-15 dagen bij 37 ┬░ C in CO<sub>2</sub> incubator met medium verandering op elke 2-3 dagen. De cellen werden vervolgens gefixeerd (3% paraformaldehyde en 0,02% glutaaraldehyde in PBS) en gekleurd met 0,05% kristalviolet.</p&gt <p><strong>Glucose utilization assay<br></strong>Cellen (3 ├Ś 10<sup>5</sup>) werden gekweekt in DMEM met 25 mM glucose. Na 24 uur werd het medium vervangen door een medium met een toenemende concentratie metformine (0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM en 2 mM) of rotenon gedurende 24 uur, en de resterende glucose in het gebruikte medium werd gecontroleerd met behulp van de GOD-POD glucose assay kit (Spinreact, Spanje) volgens de instructies van de fabrikant. Voor het meten van het glucosegebruik in aanwezigheid van glycolytische remmers werden de cellen behandeld met 50 mM oxamaat, 100 ┬ÁM floretine en 20 mM DCA, alleen of samen met 2 mM metformine of 100 ┬ÁM fenformine. De verbruikte glucose werd geschat door de resterende glucose in het medium af te trekken van de oorspronkelijke concentratie in het controlemedium (450 mg/dl). De experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd en de waarden werden genormaliseerd naar het totale aantal cellen.</p&gt

<p><strong>Lactaatschattingstest<br></strong>Lactaatconcentratie in gebruikt medium, verzameld van de cellen behandeld met of zonder metformine, oxamaat en andere glycolytische remmers, werd bepaald met behulp van in de handel verkrijgbare lactaatschattingskit (Spinreact, Spanje) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, het kweekmedium of serum werd tot 10 maal verdund in 0,9% zoutoplossing en 10 ╬╝l monster werd toegevoegd aan elk putje van de 96 wells ELISA-plaat. 150 ┬Ál van het bij de kit geleverde reagens werd toegevoegd aan elk putje met monsters, waarbij het ongebruikte medium en het reagens alleen als blanco werden bewaard, en de absorptie werd gemeten bij 405 nm met een spectrofotometer (Thermo-Scientific, VS). De experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd en de eindwaarden werden genormaliseerd met het totale aantal cellen

<p><strong>siRNA-transfectie<br></strong>Specifiek siRNA tegen LDHA werd gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (VS). Transfectie werd uitgevoerd met behulp van Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, cellen werden uitgezet bij ongeveer 60% confluentie. De volgende dag werd het medium vervangen door OptiMEM (Life Technologies, USA) en gedurende 3 uur bewaard. Gewenste siRNA’s werden opgelost in meegeleverde buffers. Lipofectamine2000 en siRNA werden afzonderlijk verdund in OptiMEM en ge├»ncubeerd gedurende 5 min. Daarna werden verdunde reagentia gemengd en verder ge├»ncubeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Het resulterende neerslag werd gedurende 6 uur op de cellen gelaten, waarna vers DMEM aangevuld met 10% FBS werd toegevoegd en verder ge├»ncubeerd gedurende 24-36 uur. Transfectie-effici├źntie werd beoordeeld door gelijktijdig pEGFPN1 plasmide te transfecteren. Immunoblotting werd uitgevoerd om remming van de respectieve genexpressie te verzekeren.</p&gt

<p><strong>Bereiding van mitochondriarijke fractie van cellen en weefsels<br></strong>De mitochondriarijke fractie werd bereid uit gekweekte cellen en tumoren of normale weefsels zoals eerder gemeld<sup><a href=”#73″> [73]</a></sup>. Kortom, cellen (1 ├Ś 10<sup>6</sup>) werden uitgezet in een 10 cm plaat en werden getrypsiniseerd na behandeling met de gewenste remmers gedurende 24 uur. Celsuspensie werd onderworpen aan drie cycli van vriezen-dooien in hypotone buffer (20 mM kaliumfosfaat). Deze suspensie werd gecentrifugeerd bij 50.000 rpm gedurende 1 uur om supernatant te verkrijgen dat rijk is aan mitochondri├źn. Ook om mitochondri├źn uit weefsels te isoleren, werden bevroren weefsels in fijne stukjes gehakt en gehomogeniseerd in homogenisatiebuffer (0,5 M Tris-buffer pH 7,5, 100 mM EGTA en 250 mM sucrose), gevolgd door een cyclische vries-dooiprocedure en gecentrifugeerd bij 50.000 rpm gedurende 1 uur. Het supernatant werd verzameld als mitochondriale fractie en gebruikt voor de bepaling van de mitochondriale functie en OXPHOS enzymactiviteit

<p><strong>Enzymbepalingen<br></strong>De cellen werden gehomogeniseerd in hypotone (20 mM) kaliumfosfaatbuffer (pH 7,5) met proteaseremmercocktail (Roche, Duitsland), geveerd en gelyseerd door middel van drie cycli van vries- en dooiprocedure. Voor de bereiding van weefselextract werden tumormonsters in fijne stukjes gehakt en gehomogeniseerd in homogenisatiebuffer (0,1 M Tris, 0,1 M KCl, 350 mM EDTA en 1 M sucrose, pH 7,5) met behulp van een weefselhomogenisator. Homogenaten werden geklaard door centrifugeren bij 10.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4<sup>┬░</sup>C en op ijs bewaard tot de assays werden uitgevoerd.</p&gt <p><strong><em>LDH-activiteitstest:</em> </strong>Lactaatdehydrogenase-activiteit in cellysaten of tumorextract en serum werd bepaald met LDH-activiteitstestkit (Spinreact, Spanje) volgens de instructies van de fabrikant.</p&gt <p><em><strong>Complex I activiteit assay:</strong></em> Mitochondriaal OXPHOS complex I enzym assay werd uitgevoerd zoals elders beschreven<sup><a href=”#73″> [73]</a></sup>. Kort gezegd werd een mitochondriale rijke fractie van cel- of weefselhomogenaat (20-50 ┬Ág eiwit uit weefselhomogenaat of 10-20 ┬Ág mitochondriale rijke fractie) toegevoegd aan 700 ┬Ál gedestilleerd water in een cuvet van 1 ml, gevolgd door toevoeging van 100 ┬Ál kaliumfosfaatbuffer (0,5 M, pH 7,5), 60 ┬Ál vetzuurvrij BSA (50 mg/ml), 30 ┬Ál KCN (10 mM) en 10 ┬Ál NADH (10 mM). Het eindvolume werd op 994 ┬Ál gebracht met gedestilleerd water, gemengd door de cuvetten om te keren en de basislijn werd gedurende 2 minuten bij 340 nm afgelezen. De reactie werd gestart door 6 ┬Ál decylubiquinon (10 mM, Sigma, USA) toe te voegen, goed gemengd door de cuvetten om te keren. De afname van de absorptie bij 340 nm werd gedurende 10 minuten gevolgd. Een soortgelijke procedure werd gevolgd voor de berekening van de activiteit van complex I in aanwezigheid van 2 mM metformine en 100 ┬ÁM fenformine. Rotenon (10 ┬ÁM) werd gebruikt als positieve controle. De eindwaarden werden genormaliseerd met het totale cellulaire eiwitgehalte.</p&gt <p><strong>Totale cellulaire ATP-meting<br></strong>Het ATP-niveau werd gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare ATP-bioluminescentiekit (Roche, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden de cellen gekweekt in aanwezigheid van de aangegeven geneesmiddelen. De cellen werden geoogst en gelyseerd in 100 mM Tris-EDTA-buffer met 0,01% NP-40 en gedurende 1 minuut gekookt, gevolgd door een vries-dooicyclus. De luminescentie werd geregistreerd voor zowel de blanco als de monsters. Voor het meten van ATP dat uitsluitend door OXPHOS en glycolyse wordt gegenereerd, werden de cellen behandeld met oligomycine (10 ┬ÁM) en respectievelijk oxamaat of DCA met of zonder metformine. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud en ten minste eenmaal herhaald, en de eindwaarden werden genormaliseerd met het totale eiwitgehalte.</p&gt <p><strong>Statistieken</strong><br>Statistische analyse werd uitgevoerd met Sigma Plot 12.0 (Systat Software Inc., CA, USA). De meeste experimenten werden ten minste eenmaal herhaald met een minimum in drievoud, tenzij anders vermeld. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ┬▒ SD, behalve voor de aangegeven experimenten. Waar nodig, zowel gepaarde als ongepaarde, tweestaartstoets van de student <em>t</em> voor de experimenten, uitgaande van ongelijke variantie, tenzij anders vermeld, om de p-waarde te berekenen. De waarden *<em>p</em> < 0,05, **<em>p</em> < 0,01, ***<em>p</em> < 0,001 duiden op significante verschillen tussen de groepen (<em>n</em> > 3 ten minste).</p&gt <h2>AANWIJZINGEN</h2&gt <p>De auteurs danken Dr. S.C. Mande, Directeur, NCCS, Pune, India, en Dr. G.C. Mishra, voormalig Directeur, NCCS, Pune, India voor hun grote steun en aanmoediging om dit werk uit te voeren. Wij danken Dr. Benoit violet (INSERM, Frankrijk) voor het verstrekken van MEFs, Dr. Mahesh J Kulkarni (National Chemical Laboratory, India) voor L6 cellen en Dr. Rakesh K Tyagi (Jawaharlal Nehru University, India) voor het verstrekken van AML12 cellen. Wij danken ook Dr. Vijayakumar MV voor hulp bij dierproeven en voor kritisch lezen van manuscript. BC en NM danken Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) India; PM en SVS danken University Grant Commission (UGC), India voor het verstrekken van een beurs. De steun van andere lableden en collega’s bij NCCS en medewerkers van Experimental Animal Facility, FACS, Confocal en massaspectrometrie faciliteit wordt naar behoren erkend.</p> <h2>FINANCI├őLE STEUN</h2&gt <p>Dit werk werd ondersteund door een intramurale subsidie van NCCS, gefinancierd door het Department of Biotechnology, Government of India.</p> <h2>BELANGHEBBENDEN</h2&gt <p>De auteurs verklaren geen potenti├źle belangenconflicten te hebben</p> <h3>NOTEN</h3&gt <p>Dit werk is uitgevoerd ter gedeeltelijke vervulling van een proefschrift (van B.C.) in te dienen bij Savitribai Phule Pune University, Pune, India.</p> <p></p&gt <h2>Verwijzingen</h2&gt <br><span id=”1″ class=”referencess blue-text”>1</span> Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. Melanoma biology and new targeted therapy. Nature. 2007; 445:851-857. <br><span id=”2″ class=”referencess blue-text”>2</span> Demierre MF. Epidemiologie en preventie van cutaan melanoom. Curr Treat Options Oncol. 2006; 7:181-186. <br><span id=”3″ class=”referencess blue-text”>3</span> Hersey P, Watts RN, Zhang XD, Hackett J. Metabolic approaches to treatment of melanoma. Clin Cancer Res. 2009; 15:6490-6494. <br><span id=”4″ class=”referencess blue-text”>4</span> Warburg O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 1956; 124:269-270. <br><span id=”5″ class=”referencess blue-text”>5</span> Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009; 324:1029-1033. <br><span id=”6″ class=”referencess blue-text”>6</span> Hall A, Meyle KD, Lange MK, Klima M, Sanderhoff M, Dahl C, Abildgaard C, Thorup K, Moghimi SM, Jensen PB, Bartek J, Guldberg P, Christensen C. Disfunctionele oxidatieve fosforylering maakt kwaadaardige melanoomcellen verslaafd aan glycolyse aangedreven door het (V600E)BRAF oncogen. Oncotarget. 2013; 4:584-599. <br><span id=”7″ class=”referencess blue-text”>7</span> Haq R, Shoag J, Andreu-Perez P, Yokoyama S, Edelman H, Rowe GC, Frederick DT, Hurley AD, Nellore A, Kung AL, Wargo JA, Song JS, Fisher DE, et al. Oncogene BRAF reguleert oxidatief metabolisme via PGC1╬▒ en MITF. Cancer Cell. 2013; 23:302-315. <br><span id=”8″ class=”referencess blue-text”>8</span> Weide B, Els├Ąsser M, B├╝ttner P, Pflugfelder A, Leiter U, Eigentler TK, Bauer J, Witte M, Meier F, Garbe C. Serum markers lactate dehydrogenase en S100B voorspellen onafhankelijk ziekte-uitkomst in melanoompati├źnten met verre metastase. Br J Cancer. 2012; 107:422-428. <br><span id=”9″ class=”referencess blue-text”>9</span> Deichmann M, Benner A, Bock M, J├Ąckel A, Uhl K, Waldmann V, N├Ąher H. S100-Beta, melanoma-inhibiting activity, and lactate dehydrogenase discriminate progressive from nonprogressive American Joint Committee on Cancer stage IV melanoma. J Clin Oncol. 1999; 17:1891-1896. <br><span id=”10″ class=”referencess blue-text”>10</span> Giatromanolaki A, Sivridis E, Gatter KC, Turley H, Harris AL, Koukourakis MI; Tumor and Angiogenesis Research Group. Lactaat dehydrogenase 5 (LDH-5) expressie in endometriumkanker houdt verband met de geactiveerde VEGF/VEGFR2(KDR) pathway en prognose. Gynecol Oncol. 2006; 103:912-918. <br><span id=”11″ class=”referencess blue-text”>11</span> Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E. Lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 5: differential expression by neoplastic and stromal cells in non-small cell lung cancer and other epithelial malignant tumors. Tumour Biol. 2003; 24:199-202. <br><span id=”12″ class=”referencess blue-text”>12</span> Fantin VR, St-Pierre J, Leder P. Attenuation of LDH-A expression uncovers a link between glycolysis, mitochondrial physiology, and tumor maintenance. Cancer Cell. 2006; 9:425-434. <br><span id=”13″ class=”referencess blue-text”>13</span> Brandon M, Baldi P, Wallace DC. Mitochondriale mutaties in kanker. Oncogene. 2006; 25:4647-4662. <br><span id=”14″ class=”referencess blue-text”>14</span> Ishikawa K, Takenaga K, Akimoto M, Koshikawa N, Yamaguchi A, Imanishi H, Nakada K, Honma Y, Hayashi J. ROS-genererende mitochondriale DNA-mutaties kunnen tumorcelmetastase reguleren. Science. 2008; 320:661-664. <br><span id=”15″ class=”referencess blue-text”>15</span> Wallace DC. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet. 2005; 39:359-407. <br><span id=”16″ class=”referencess blue-text”>16</span> Santidrian AF, Matsuno-Yagi A, Ritland M, Seo BB, LeBoeuf SE, Gay LJ, Yagi T, Felding-Habermann B. Mitochondrial complex I activity and NAD+/NADH balance regulate breast cancer progression. J Clin Invest. 2013; 123:1068-1081. <br><span id=”17″ class=”referencess blue-text”>17</span> He X, Zhou A, Lu H, Chen Y, Huang G, Yue X, Zhao P, Wu Y. Suppression of mitochondrial complex I influences cell metastatic properties. PLoS One. 2013; 8:e61677. <br><span id=”18″ class=”referencess blue-text”>18</span> Sharma LK, Fang H, Liu J, Vartak R, Deng J, Bai Y. Mitochondrial respiratory complex I dysfunction bevordert tumorigenese via ROS alteratie en AKT activatie. Hum Mol Genet. 2011; 20:4605-4616. <br><span id=”19″ class=”referencess blue-text”>19</span> Gopal YN, Rizos H, Chen G, Deng W, Frederick DT, Cooper ZA, Scolyer RA, Pupo G, Komurov K, Sehgal V, Zhang J, Patel L, Pereira CG et al. Inhibition of mTORC1/2 overcomes resistance to MAPK pathway inhibitors mediated by PGC1╬▒ and oxidative phosphorylation in melanoma. Cancer Res. 2014; 74:7037-7047. <br><span id=”20″ class=”referencess blue-text”>20</span> Barbi de Moura M, Vincent G, Fayewicz SL, Bateman NW, Hood BL, Sun M, Suhan J, Duensing S, Yin Y, Sander C, Kirkwood JM, Becker D, Conrads TP, et al. Mitochondrial respiration–an important therapeutic target in melanoma. PLoS One. 2012; 7:e40690. <br><span id=”21″ class=”referencess blue-text”>21</span> Blackman RK, Cheung-Ong K, Gebbia M, Proia DA, He S, Kepros J, Jonneaux A, Marchetti P, Kluza J, Rao PE, Wada Y, Giaever G, Nislow C. Mitochondrial electron transport is the cellular target of the oncology drug elesclomol. PLoS One. 2012; 7:e29798. <br><span id=”22″ class=”referencess blue-text”>22</span> Filipp FV, Scott DA, Ronai ZA, Osterman AL, Smith JW. Reverse TCA cycle flux through isocitrate dehydrogenases 1 and 2 is required for lipogenesis in hypoxic melanoma cells. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:375-383. <br><span id=”23″ class=”referencess blue-text”>23</span> Lim JH, Luo C, Vazquez F, Puigserver P. Targeting mitochondrial oxidative metabolism in melanoma causes metabolic compensation through glucose and glutamine utilization. Cancer Res. 2014; 74:3535-3545. <br><span id=”24″ class=”referencess blue-text”>24</span> Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, Alessi DR, Morris AD. Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients. British Medical Journal. 2005; 330:1304-1305. <br><span id=”25″ class=”referencess blue-text”25</span> Decensi A, Puntoni M, Goodwin P, Cazzaniga M, Gennari A, Bonanni B, Gandini S. Metformin and cancer risk in diabetic patients: a systematic review and meta-analysis. Cancer Prev Res (Phila). 2010; 3:1451-1461. <br><span id=”26″ class=”referencess blue-text”>25</span> Kirpichnikov D, McFarlane SI, Sowers JR. Metformine: een update. Ann Intern Med. 2002; 137:25-33. <br><span id=”27″ class=”referencess blue-text”>27</span> Pollak MN. Onderzoek naar metformine voor de preventie en behandeling van kanker: het einde van het begin. Cancer Discov. 2012; 2:778-790. <br><span id=”28″ class=”referencess blue-text”>28</span> El-Mir MY, Nogueira V, Fontaine E, Averet N, Rigoulet M, Leverve X. Dimethylbiguanide remt de celademhaling via een indirect effect gericht op het ademhalingsketencomplex I. J Biol Chem. 2000; 275:223-228. <br><span id=”29″ class=”referencess blue-text”>29</span> Owen MR, Doran E, Halestrap AP. Evidence that metformin exert its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain. Biochem J. 2000; 348:607-614. <br><span id=”30″ class=”referencess blue-text”>30</span> Wheaton WW, Weinberg SE, Hamanaka RB, Soberanes S, Sullivan LB, Anso E, Glasauer A, Dufour E, Mutlu GM, Budigner GS, Chandel NS. Metformine remt mitochondriaal complex I van kankercellen om tumorigenese te verminderen. Elife. 2014; 3:e02242. <br><span id=”31″ class=”referencess blue-text”>31</span> Andrzejewski S, Gravel SP, Pollak M, St-Pierre J. Metformin directly acts on mitochondria to alter cellular bioenergetics. Cancer Metab. 2014; 2:12. <br><span id=”32″ class=”referencess blue-text”>32</span> Sesen J, Dahan P, Scotland SJ, Saland E, Dang VT, Lemari├ę A, Tyler BM, Brem H, Toulas C, Cohen-Jonathan Moyal E, Sarry JE, Skuli N. Metformine remt de groei van menselijke glioblastoomcellen en verbetert de therapeutische respons. PLoS One. 2015; 10:e0123721. <br><span id=”33″ class=”referencess blue-text”>33</span> Ben Sahra I, Laurent K, Loubat A, Giorgetti-Peraldi S, Colosetti P, Auberger P, Tanti JF, Le Marchand-Brustel Y, Bost F. The antidiabetic drug metformin exerts an antitumoral effect in vitro and in vivo through a decrease of cyclin D1 level. Oncogene. 2008; 27:3576-3586. <br><span id=”34″ class=”referencess blue-text”>34</span> Zakikhani M, Dowling R, Fantus IG, Sonenberg N, Pollak M. Metformin is an AMP kinase dependent growth inhibitor for breast cancer cells. Cancer Res. 2006; 66:10269-10273. <br><span id=”35″ class=”referencess blue-text”>35</span> Martin MJ, Hayward R, Viros A, Marais R. Metformin accelerates the growth of BRAF V600E-driven melanoma by upregulating VEGF-A. Cancer Discov. 2012, 2:344-355. <br><span id=”36″ class=”referencess blue-text”>36</span> Tomic T, Botton T, Cerezo M, Robert G, Luciano F, Puissant A, Gounon P, Allegra M, Bertolotto C, Bereder JM, Tartare-Deckert S, Bahadoran P, Auberger P, et al. Metformin inhibits melanoma development through autophagy and apoptosis mechanisms. Cell Death Dis. 2011; 2:e199. <br><span id=”37″ class=”referencess blue-text”>37</span> Cerezo M, Tichet M, Abbe P, Ohanna M, Lehraiki A, Rouaud F, Allegra M, Giacchero D, Bahadoran P, Bertolotto C, Tartare-Deckert S, Ballotti R, Rocchi S. Metformin blocks melanoma invasion and metastasis development in AMPK/p53-dependent manner. Mol Cancer Ther. 2013; 12:1605-1615. <br><span id=”38″ class=”referencess blue-text”>38</span> Yuan P, Ito K, Perez-Lorenzo R, Del Guzzo C, Lee JH, Shen CH, Bosenberg MW, McMahon M, Cantley LC, Zheng B. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110:18226-18231. <br><span id=”39″ class=”referencess blue-text”>39</span> Cannino G, El-Khoury R, Pirinen M, Hutz B, Rustin P, Jacobs HT, Dufour E. Glucose moduleert respiratoire complex I activiteit in reactie op acute mitochondriale disfunctie. J Biol Chem. 2012; 287:38729-38740. <br><span id=”40″ class=”referencess blue-text”>40</span> Xu RH, PelicanoH, Zhou Y, CarewJS, Feng L, Bhalla KN, Keating MJ, Huang P. Inhibition of glycolysis in cancer cells: a novel strategy to overcome drug resistance associated with mitochondrial respiratory defect and hypoxia. Cancer Res. 2005; 65:613-621. <br><span id=”41″ class=”referencess blue-text”>41</span> Pan JG, Mak TW. Metabolic targeting as an anticancer strategy: dawn of a new era? Sci STKE. 2007; 2007:pe14. <br><span id=”42″ class=”referencess blue-text”>42</span> Dalva-Aydemir S, Bajpai R, Martinez M, Adekola KU, Kandela I, Wei C, Singhal S, Koblinski JE, Raje NS, Rosen ST, Shanmugam M. Targeting the Metabolic Plasticity of Multiple Myeloma with FDA-Approved Ritonavir and Metformin. Clin Cancer Res. 2015; 21:1161-1171. <br><span id=”43″ class=”referencess blue-text”>43</span> Menendez JA, Oliveras-Ferraros C, Cuf├ş S, Corominas-Faja B, Joven J, Martin-Castillo B, Vazquez-Martin A. Metformin is synthetically lethal with glucose withdrawal in cancer cells. Cell Cycle. 2012; 11:2782-2792. <br><span id=”44″ class=”referencess blue-text”>44</span> Calabrese C, Iommarini L, Kurelac I, Calvaruso MA, Capristo M, Lollini PL, Nanni P, Bergamini C, Nicoletti G, Giovanni CD, Ghelli A, Giorgio V, Caratozzolo MF, et al. Respiratory complex I is essential to induce a Warburg profile in mitochondria-defective tumor cells. Cancer Metab. 2013; 1:11. <br><span id=”45″ class=”referencess blue-text”>45</span> Semenza GL. Tumormetabolisme: kankercellen geven en nemen lactaat. J Clin Invest. 2008; 118:3835-3837. <br><span id=”46″ class=”referencess blue-text”>46</span> Sonveaux P, Vegran F, Schroeder T, Wergin MC, Verrax J, Rabbani ZN, De Saedeleer CJ, Kennedy KM, Diepart C, Jordan BF, Kelley MJ, Bernard Gallez B, Wahl ML, et al. Targeting lactate-fueled respiration selectly kills hypoxic tumor cells in mice. J Clin Invest. 2008; 118:3930-3942. <br><span id=”47″ class=”referencess blue-text”>47</span> Phoenix KN, Vumbaca F, Claffey KP. Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model. Breast Cancer Res Treat. 2009; 113:101-111. <br><span id=”48″ class=”referencess blue-text”>48</span> V├ęgran F, Boidot R, Michiels C, Sonveaux P, Feron O. Lactate influx through the endothelial cell monocarboxylate transporter MCT1 supports an NF-╬║B/IL-8 pathway that drives tumor angiogenesis. Cancer Res. 2011; 71:2550-2560. <br><span id=”49″ class=”referencess blue-text”>49</span> Sonveaux P, Copetti T, De Saedeleer CJ, Vegran F, Verrax J, Kennedy KM, Moon EJ, Dhup S, Danhier P, Fr├ęrart F, Gallez B, Ribeiro A, Michiels C, et al. Targeting the lactate transporter MCT1 in endothelial cells inhibits lactate-induced HIF-1 activation and tumor angiogenesis. PLoS ONE. 2012; 7:e33418. <br><span id=”50″ class=”referencess blue-text”>50</span> Wu M, Seto E, Zhang J. E2F1 bevordert glycolyse door onderdrukking van Sirt6-transcriptie in kankercellen. Oncotarget. 2015; 6:11252-11263. <br><span id=”51″ class=”referencess blue-text”>51</span> Hernlund E, Strandberg Ihrlund L, Khan O, Ates YO, Linder S, Panaretakis T, Shoshan MC. Potenti├źring van chemotherapeutische geneesmiddelen door energiestofwisselingsremmers 2-deoxyglucose en etomoxir. Int J Cancer. 2008; 123:476-483. <br><span id=”52″class=”referencess blue-text”>52</span>. Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I. Dichloroacetate induceert apoptose in endometriumkankercellen. Gynecol Oncol. 2008; 109:402. <br><span id=”53″ class=”referencess blue-text”>53</span> Michelakis ED, Webster L, Mackey JR. Dichloroacetate (DCA) als potentieel metabool doelwit bij kankertherapie. Br J Cancer. 2008; 99:989-994. <br><span id=”54″ class=”referencess blue-text”>54</span> Walenta S, Mueller-Kliese WF. Lactaat: spiegel en motor van tumormaligniteit. Seminar Radiat Oncol. 2004; 14:267-274. <br><span id=”55″ class=”referencess blue-text”>55</span> Doherty JR, Cleveland JL. Targeting lactate metabolism for cancer therapeutics. J Clin Invest. 2013; 123:3685-3692. <br><span id=”56″ class=”referencess blue-text”>56</span> Le A, Cooper CR, Gouw AM, Dinavahi R, Maitra A, Deck LM, Royer RE, Vander Jagt DL, Semenza GL, Dang CV. Inhibitie van lactaat dehydrogenase A induceert oxidatieve stress en remt tumorprogressie. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107:2037-2042. <br><span id=”57″ class=”referencess blue-text”>57</span> Zhao YH, Zhou M, Liu H, Ding Y, Khong HT, Yu D, Fodstad O, Tan M. Upregulation of lactate dehydrogenase A by ErbB2 through heat shock factor 1 promotes breast cancer cell glycolysis and growth. Oncogene. 2009; 28:3689-3701. <br><span id=”58″ class=”referencess blue-text”>58</span> Kluza J, Corazao-Rozas P, Touil Y, Jendoubi M, Maire C, Guerreschi P, Jonneaux A, Ballot C, Balayssac S, Valable S, Corroyer-Dulmont A, Bernaudin M, Malet-Martino M, et al. Inactivatie van de HIF-1╬▒/PDK3-signaalas drijft melanoom aan tot mitochondriaal oxidatiemetabolisme en versterkt de therapeutische activiteit van pro-oxidanten. Cancer Res. 2012; 72:5035-5047. <br><span id=”59″ class=”referencess blue-text”>59</span> Parmenter TJ, Kleinschmidt M, Kinross KM, Bond ST, Li J, Kaadige MR, Rao A, Sheppard KE, Hugo W, Pupo GM, Pearson RB, McGee SL, Long GV, et al. Response of BRAF-mutant melanoma to BRAF inhibition is mediated by a network of transcriptional regulators of glycolysis. Cancer Discov. 2014; 4:423-433. <br><span id=”60″ class=”referencess blue-text”>60</span> Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS, Choi JY. Synergetisch anti-kanker effect van fenformine en oxamaat. PLoS One. 2014; 9:e85576. <br><span id=”61″ class=”referencess blue-text”>61</span> Jin S, DiPaola RS, Mathew R, White E. Metabolic catastrophe as a means to cancer cell death. J Cell Sci. 2007; 120:379-383. <br><span id=”62″ class=”referencess blue-text”>62</span> McLornan DP, List A, Mufti GJ. Applying synthetic lethality for the selective targeting of cancer. N Engl J Med. 2014; 371:1725-1735. <br><span id=”63″ class=”referencess blue-text”>63</span> Kaelin WG Jr. The concept of synthetic lethality in the context of anticancer therapy. Nat Rev Cancer. 2005; 5:689-698. <br><span id=”64″ class=”referencess blue-text”>64</span> Iaquinta PJ, Lees JA. Beslissingen over leven en dood door de E2F-transcriptiefactoren. Curr Opin Cell Biol. 2007; 19:649-657. <br><span id=”65″ class=”referencess blue-text”>65</span> Houben R, Hesbacher S, Schmid CP, Kauczok CS, Flohr U, Haferkamp S, M├╝ller CS, Schrama D, Wischhusen J, Becker JC. Hoge expressie van wild-type p53 in melanoomcellen gaat vaak gepaard met inactiviteit in p53 reporter gen assays. PLoS One. 2011; 6:e22096. <br><span id=”66″ class=”referencess blue-text”>66</span> Avery-Kiejda KA, Bowden NA, Croft AJ, Scurr LL, Kairupan CF, Ashton KA, Talseth-Palmer BA, Rizos H, Zhang XD, Scott RJ, Hersey P. P53 in human melanoma fails to regulate target genes associated with apoptosis and the cell cycle and may contribute to proliferation. BMC Cancer. 2011; 11:203. <br><span id=”67″ class=”referencess blue-text”>67</span> Lu M, Breyssens H, Salter V, Zhong S, Hu Y, Baer C, Ratnayaka I, Sullivan A, Brown NR, Endicott J, Knapp S, Kessler BM, Middleton MR, et al. Restoring p53 function in human melanoma cells by inhibiting MDM2 and cyclin B1/CDK1-phosphorylated nuclear iASPP. Cancer Cell. 2013; 23:618-633. <br><span id=”68″ class=”referencess blue-text”>68</span> Pandey V, Vijayakumar MV, Ajay AK, Malvi P, Bhat MK. Obesitas als gevolg van een dieet verhoogt de progressie van melanoom: betrokkenheid van Cav-1 en FASN. Int J Cancer. 2012; 130:497-508. <br><span id=”69″ class=”referencess blue-text”>69</span> Leontieva OV, Blagosklonny MV. M(o)TOR of pseudo-hypoxic state in aging: rapamycin to the rescue. Cell Cycle. 2014; 13:509-515. <br><span id=”70″ class=”referencess blue-text”>70</span> Leontieva OV, Blagosklonny MV. Gistachtige chronologische senescentie in zoogdiercellen: fenomeen, mechanisme en farmacologische onderdrukking. Aging (Albany NY). 2011; 3:1078-1091. <br><span id=”71″ class=”referencess blue-text”>71</span> Vijayakumar MV, Singh S, Chhipa RR, Bhat MK. The hypoglycaemic activity of fenugreek seed extract is mediated through the stimulation of an insulin signalling pathway. Br J Pharmacol. 2005; 146:41-48. <br><span id=”72″ class=”referencess blue-text”>72</span> Malvi P, Chaube B, Pandey V, Vijayakumar MV, Boreddy PR, Mohammad N, Singh SV, Bhat MK. Obesitas ge├»nduceerde snelle melanoomprogressie wordt omgekeerd door behandeling met orlistat en dieetinterventie: rol van adipokines. Mol Oncol. 2015; 9:689-703. <br><span id=”73″ class=”referencess blue-text”>73</span> Spinazzi M, Casarin A, Pertegato V, Salviati L, Angelini C. Assessment of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities on tissues and cultured cells. Nat Protoc. 2012; 7: 1235-1246. <p></p&gt

Geef een reactie