šŸ“– 24 mins.

Krishan Kumar1, Simon Wigfield2, Harriet E. Gee2,5, Cecilia M. Devlin1, Dean Singleton2, Ji-Liang Li2, Francesca Buffa2, Melanie Huffman1, Anthony L. Sinn3, Jayne Silver3, Helen Turley2, Russell Leek2, Adrian L. Harris2 & Mircea Ivan4

1 Department of Medicine, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA
2 Department of Oncology, Weatherall Institute of Molecular
Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford OX3 9DS, UK
e-mail: [email protected]
3 In Vivo Therapeutics Core, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA
4 Department of Medicine, Immunology and Microbiology, Indiana University, 980W. Walnut Street, Room C225, Indianapolis, IN 46202, USA
e-mail: [email protected]
5 Department of Radiation Oncology, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital, Camperdown, New South Wales 2050, Australia


Ontvangen: 7 november 2012
Herzien: 20 december 2012
Aanvaard: 2 januari 2013
Online gepubliceerd: 30 januari 2013

Abstract

Remming van vasculaire endotheliale groeifactor verhoogt de respons op chemotherapie en de progressievrije overleving in glioblastoma. Resistentie treedt echter steevast op, waardoor er dringend behoefte is aan identificatie van synergetische middelen. Een mogelijke strategie is het begrijpen van de aanpassing van de tumor aan veranderingen in de micro-omgeving, geĆÆnduceerd door antiangiogene geneesmiddelen, en het testen van middelen die dit proces benutten. Wij gebruikten een in vivo van glioblastoma afgeleid xenograft-model van tumorontsnapping in aanwezigheid van continue behandeling met bevacizumab. U87-MG of U118-MG cellen werden subcutaan geĆÆmplanteerd in BALB/c SCID of athymische naakte muizen. Bevacizumab werd toegediend door intraperitoneale injectie om de 3 dagen (2,5 mg/kg/dosis) en/of dichlooracetaat (DCA) werd toegediend door orale gavage tweemaal daags (50 mg/kg/dosis) wanneer het tumorvolume 0,3 cm3 bereikte en werd voortgezet tot de tumoren ongeveer 1,5-2,0 cm3 bereikten. Microarray-analyse van resistente U87-tumoren bracht gecoƶrdineerde veranderingen aan het licht op het niveau van metabolische genen, met name een groeiende kloof tussen glycolyse en mitochondriale ademhaling. Er was een zeer significant verschil tussen U87-MG-geĆÆmplanteerde athymische naakte muizen 1 week na behandeling met geneesmiddelen. Na 2 weken behandeling blokkeerden bevacizumab en DCA samen drastisch de tumorgroei in vergelijking met een van beide geneesmiddelen alleen. Vergelijkbare resultaten werden gezien in athymische naakte muizen geĆÆmplanteerd met U118-MG-cellen. Wij tonen voor het eerst aan dat omkering van de bevacizumab-geĆÆnduceerde verschuiving in het metabolisme met DCA schadelijk is voor neoplastische groei in vivo. Aangezien DCA wordt beschouwd als een veelbelovend middel tegen tumormetabolisme, bewijzen onze gegevens tijdig dat de combinatie met antiangiogene therapie een krachtige antineoplastische strategie vormt.


Trefwoorden: Dichlooracetaat; Hypoxie; Bevacizumab; Oxidatieve fosforylering; Glycolyse

Ā© Springer-Verlag Berlijn Heidelberg 2013


INLEIDING

Moleculaire therapieĆ«n gericht op neo-angiogenese en, in het bijzonder, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) hebben in verschillende klinische contexten antitumoractiviteit laten zien [1]. Glioblastoma (GBM) is een sterk gevasculariseerde en dodelijke primaire hersentumor, met een mediane overleving van ongeveer 12-14 maanden, en vormt daarom een belangrijk doelwit voor antiangiogene geneesmiddelen [2]. Bevacizumab, een gehumaniseerd anti-VEGF antilichaam, is momenteel door de Food and Drug Administration goedgekeurd als tweedelijns behandeling van GBM, en lopende klinische studies beogen het potentieel ervan als eerstelijns middel te beoordelen [3]. Aangezien VEGF-blokkade echter de progressievrije overleving verlengt, maar niet de totale overleving, is het noodzakelijk strategieĆ«n te vinden die het effect ervan vergroten en het ontstaan van resistentie vertragen [4]. Er is bijvoorbeeld beperkte vooruitgang geboekt in combinatie met irinotecan; er kon echter geen effect op de algehele overleving worden aangetoond [5]. Een belangrijke beperking bij de ontwikkeling van synergetische combinaties met anti-VEGF middelen is het gebrek aan robuuste klinische gegevens, aangezien tumoren die resistent worden tegen deze middelen niet routinematig beschikbaar zijn voor verdere analyses. Bovendien worden de cellulaire en moleculaire gevolgen van anti-VEGF-behandeling nog onvoldoende begrepen. Gedetailleerde informatie op moleculair niveau over hoe bevacizumab GBM gedurende een langere periode beĆÆnvloedt, is niet alleen essentieel voor ons begrip van tumoraanpassingsreacties en daaropvolgend falen van de behandeling, maar ook voor de ontwikkeling van rationele combinatietherapieĆ«n.

Daarom hebben wij getracht de tumorrespons op bevacizumab te bepalen op fenotypisch en moleculair niveau in xenograftmodellen die zijn afgeleid van GBM-cellijnen. Door de modellen te verlengen tot uiteindelijk therapeutisch falen ondanks voortdurende bevacizumab-behandeling, wilden wij de tumoraanpassingsprogramma’s en de bijbehorende herbedrading van de moleculaire routes vastleggen met behulp van microarray-analyse. Wij veronderstelden dat de belangrijkste mechanismen van resistentie tot uiting zouden komen in wijzigingen van deze routes, en dat kleine moleculen die deze processen verstoren realistische kandidaten zijn om de werkzaamheid van bevacizumab te verhogen. Bio-informatische analyse liet zien dat resistente tumoren een sterke hypoxie-induceerbare factor (HIF) signatuur vertonen en een verschuiving van mitochondriale ademhaling naar glycolyse. Reactivering van mitochondriale ademhaling met het weesgeneesmiddel dichlooracetaat (DCA) versterkt het voorbijgaande effect van bevacizumab, in tegenstelling tot het ontbreken van een additief effect van 2-deoxyglucose (2-DG), dat primair gericht is op glycolyse. Onze gegevens bieden inzicht in de plasticiteit van tumormetabolisme in reactie op therapeutische uitdagingen en suggereren nieuwe mogelijkheden voor synergetische interventies.

Materialen en methoden

In vivo tumorigeniciteit

Alle protocollen werden uitgevoerd volgens de Indiana University Institutional Animal Care and Use Committee en de door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken goedgekeurde protocollen en voorschriften.107 U87-MG-cellen (gekocht van ATCC) werden geĆÆmplanteerd in 6 tot 8 weken oude vrouwelijke BALB/c SCID-muizen (Harlan Sprague Dawley, Inc.), onderhuids, als 100 Ī¼L celsuspensies met een gelijk volume Matrigel (BD Bioscience). Tumoren werden tweemaal per week gemeten met een schuifmaat, en de volumes werden berekend met de formule lengte Ɨ breedte Ɨ hoogte Ɨ 0,52. Zodra het tumorvolume 150 mm3 bereikte, werden de muizen gerandomiseerd in twee groepen met een begincohort van vijf muizen per groep en begon de behandeling met bevacizumab (Roche) dat om de drie dagen intraperitoneaal werd geĆÆnjecteerd in een dosis van 10 mg/kg of controle met een zoutoplossing. De behandeling werd voortgezet totdat de tumoren groeiden tot een volume van ongeveer 600-800 mm3, waarna de muizen werden geĆ«uthanaseerd en de tumoren snel chirurgisch werden geĆ«xcideerd. Voor de athymische xenograftmodellen voor naakte muizen werden U87-MG-cellen geĆÆmplanteerd zoals hierboven beschreven in 4- tot 8-weekse vrouwelijke muizen (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA), of werden 7 Ɨ106 U118-MG-cellen (gekocht bij ATCC) geĆ«nt. Tumorfragmenten werden ofwel verwerkt door formalinefixatie vĆ³Ć³r paraffine-inbedding voor IHC of bevroren voor latere RNA-extractie, zoals eerder beschreven [6].

Drug delivery protocollen voor combinatie studies

DCA werd tweemaal daags oraal toegediend met 50 mg/kg/dosis in steriel water (voertuigcontrole was steriel water). Deze dosis was gebaseerd op gepubliceerde rapporten en allometrische schaling. Zo komt 100 mg/kg per muis per dag overeen met ongeveer 13 mg/kg bij de mens (http://home.fuse.net/clymer/minor/allometry.html), wat overeenkomt met de doses die in klinische settings worden gebruikt. Bevacizumab werd intraperitoneaal toegediend in een concentratie van 2,5 mg/kg/dosis (U87-MG) of 2,0 mg/kg/dosis (U118-MG). De behandeling werd voortgezet totdat de tumoren ongeveer 20 mm in diameter waren, waarna de muizen werden geƫuthanaseerd en de tumoren snel werden verwijderd. dagelijks werd 2-Deoxyglucose (Sigma, 500 mg/kg) toegediend via intraperitoneale injectie.

De details van celkweek, gene array analyse, histologische analyse en immunohistochemie, met DCA behandelde sferoĆÆden, en RNA-isolatie en kwantitatieve RT-PCR (QPCR) analyse worden beschreven in het elektronisch aanvullend materiaal.

Statistische analyse

Statistische significantie van waargenomen verschillen tussen verschillende experimentele groepen werd berekend met een tweezijdige t-test. P-waarden <0,05 werden beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Oprichting van het bevacizumab-resistentie tumormodel

U87-MG-celsuspensies werden subcutaan geĆÆnjecteerd in de rechterflank van SCID-muizen. De behandeling met bevacizumab (intraperitoneale injectie van 10 mg/kg om de 3 dagen) werd gestart wanneer de tumoren gemiddeld 100-200 mm3 groot waren. Verschillen tussen de behandelde en niet-behandelde cohorten werden 1 week later duidelijk, en op ongeveer dag 40 werd volledige resistentie tegen bevacizumab bereikt (fig. 1). Tumoren werden afzonderlijk uitgesneden voor controles en behandelde cohorten op tijdstippen waarop hun gemiddelde groeisnelheid en grootte vergelijkbaar waren. Een analoge respons (d.w.z. aanvankelijke respons gevolgd door resistentie) werd waargenomen met een submaximale dosis bevacizumab (2,5 mg/kg; om de 3 dagen via intraperitoneale injectie) in athymische naakte muizen. Dit zal in detail worden beschreven als onderdeel van de onderstaande combinatiestudies. Door immunohistochemie uit te voeren voor standaard vasculaire markers (CD31 en CD34), gevolgd door het tellen van de dichtheid van microvaten, bevestigden wij dat resistente tumoren een aanzienlijk spaarzamer vasculatuur vertonen (fig. 1). Therapeutische resistentie lijkt dus niet primair verband te houden met hernieuwde vascularisatie als gevolg van een overschakeling op alternatieve angiogene groeifactoren, zoals aangetoond in andere modellen van bevacizumab-resistentie [7]. Expressie van HIF-1Ī±, evenals van koolzuuranhydrase IX (CA9), een robuust HIF-doelwit en een bekende marker van hypoxie, was dramatisch verhoogd in de resistente tumoren, wat aangeeft dat hun groei doorging in een aanzienlijk zuurstofarmer milieu, in overeenstemming met de gegevens gerapporteerd door Rapisarda et al. [8].

Figuur 1: Analyse van met bevacizumab behandelde U87-MG-tumoren.(A) Tumorgroei van U87-MG in vivo, behandeld met bevacizumab (BVC) of voertuigcontrole (CTRL), vanaf dag 12 tot het einde van het experiment. gemiddelde Ā± SE, N= 5. Dubbele asterisk (**) P< 0,01.(B) Immunohistochemische kleuring van tumorsecties van met CTRL of BVC behandelde tumoren toont verhoogde hypoxie met HIF-1 en CA9, en een marker van vaatmorfologie met CD34. Hoofdbeelden zijn Ɨ10 vergroting en inzetbeelden Ɨ20 vergroting. Secties werden gekleurd en beoordeeld op(C) vaat Q (CD31),(D) CA9-niveaus en(E) necrose. Gemiddelde Ā± SE. EĆ©n sterretje (*) P< 0,05; drie sterretjes (***) P< 0,001

Moleculaire karakterisering van het bevacizumab-resistentiemodel
Om een uitgebreid inzicht te krijgen in de moleculaire processen die samenhangen met en mogelijk kritiek zijn voor het resistentieproces, werd totaal RNA van behandelde en niet-behandelde tumoren onderworpen aan expressieanalyse met behulp van HGU133plus2 Affymetrix arrays. De volledige dataset voor de Affymetrix array expressieanalyse is beschikbaar op http://www.ncbi.nlm.gog/geo/query/acc.cgi?acc=GSE37956. Een centraal thema in de bevacizumab-resistente tumoren was de gecoƶrdineerde activering van het HIF-gestuurde transcriptieprogramma (fig. 2). Een groot deel van de HIF targets vertoonde gecoƶrdineerde upregulatie, in de meeste gevallen met meer dan Ć©Ć©n array probe. Met name glycolytische HIF targets, waaronder aldolases A en C, triosefosfaatisomerase 1, en 6-fosfofructo-2-kinase/fructose-2,6-bifosfatase 3, alsmede de induceerbare glucosetransporters GLUT1/SLC2A1 en GLUT3/SLC2A3, werden sterk geĆÆnduceerd, hetgeen wijst op een grotere afhankelijkheid van glycolytisch gebruik van glucose. Daarentegen werd in bevacizumab-resistente tumoren een significante repressie gezien op het niveau van de genen pyruvaatdehydrogenase (PDH) alpha 1 en beta, die de opname van pyruvaat in de tricarbonzuurcyclus (TCA) regelen [9]. De activiteit van PDH wordt geremd door fosforylering door pyruvaat dehydrogenase kinases (PDK). PDK1- en PDK3-isovormen, die goed gedocumenteerde HIF-doelen zijn [10-12], waren sterk verhoogd in de bevacizumab-resistente tumoren, wat een biochemische verschuiving weg van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) verder ondersteunt (fig. 2). De meest opvallende genexpressieverandering in bevacizumab-resistente tumoren was ongetwijfeld de algemene downregulatie van mitochondriale stofwisselingsgenen, met name leden van alle vijf mitochondriale OXPHOS-complexen (fig. 2). Ten slotte werden verscheidene componenten van de TCA-cyclus, waaronder fumaraathydratase (FH) en succinaatdehydrogenase (SDH) gedownreguleerd (Fig. 2), die kunnen bijdragen tot tumorgroei omdat zij ook functioneren als tumorsuppressoren [13].

Figuur 2: Genexpressie veranderingen in controle versus bevacizumab behandelde groepen. X-as staat voor controle en bevacizumab-behandelde tumoren. Array gegevens werden voorbewerkt met GCRMA, genormaliseerd met behulp van kwantiel normalisatie en log basis 2. Expressie wordt getoond gestandaardiseerd per gen(Z-waarden; kleursleutel bovenaan). Y-as: gen-symbolen rechts. Blauwe banden aan de zijkant geven mitochondriale gencomplexen aan (van lichtblauw= I naar donkerblauw= V). Groene band geeft Krebscyclus-genen aan. Rode band geeft HIF-doelen aan

KEGG pathway analyse bevestigde dat energiemetabolisme een van de dominante veranderingen vertegenwoordigde die geassocieerd werden met de bevacizumab-resistente tumoren. Zo waren glycolytische genen het meest overvloedig aanwezig onder de upgereguleerde genen, samen met genen die behoren tot het fructose- en mannosemetabolisme, de pentosefosfaatroute, het aminosuiker- en nucleotidesuikermetabolisme en het inositolfosfaatmetabolisme (aanvullende tabel S1A). De hypergeometrische en gecorrigeerde hypergeometrische p-waarden waren lager dan 0,01 voor al deze routes. Onder de gedownreguleerde genen was OXPHOS daarentegen de belangrijkste onderdrukte pathway, met p-waarden lager dan 1,00E-28, waarbij pyruvaatmetabolisme en TCA-cyclus ook zeer significante onderdrukking vertoonden (aanvullende tabel S1B). Een ander kenmerk dat werd waargenomen in de bevacizumab-resistente tumoren was verhoogde endoplasmatische reticulumstress en ontvouwen eiwitrespons. In het bijzonder werden de belangrijkste mediatoren van deze reacties ATF4, 5, 6 en DDIT3/CHOP alle sterk overgeƫxpresseerd (aanvullende tabel S2), in overeenstemming met onze eerdere waarnemingen dat ernstiger hypoxie die zich ontwikkelt tijdens het verloop van de antiangiogene therapie niet-HIF pathways activeert [ 14].

In vitro effecten van chronische hypoxie op mitochondriale OXPHOS genexpressie

Om te onderzoeken of hypoxie de primaire oorzaak is van de downregulatie van mitochondriale respiratie en Krebs-cyclus genen, ondernamen wij een uitgebreid in vitro onderzoek naar zuurstofarme effecten in U87-cellen. Interessant is dat verscheidene OXPHOS-genen en Krebs-cycluscomponenten die in de arrays werden gedereguleerd, ook reageerden door downregulatie bij hypoxie, waaronder ATP5A1, ATP5G3, NDUFA9, FH en MDH1 (fig. 3). MRPL36 en MRPS11, twee genen waarvan gedacht wordt dat ze cruciaal zijn voor de assemblage van de OXPHOS-complexen [15, 16], vertoonden ook een downregulatie bij hypoxie, vergelijkbaar met het effect van bevacizumab (Fig. 3). De meerderheid van de in de arrays gedownreguleerde genen vertoonde echter geen downregulatie tijdens hypoxische blootstelling, hetgeen suggereert dat andere factoren primair verantwoordelijk kunnen zijn [17]. Herbestudering van de arrays liet zien dat verscheidene transcriptiefactoren die de mitochondriale genexpressie regelen (waaronder OXPHOS) werden gedownreguleerd: NRF1, TFAM en TFB2M [18-20] (aanvullende tabel S3).

Figuur 3: Downregulatie van metabolische mitochondriale genen in bevacizumab-resistente tumoren. Kwantitatieve PCR-analyse werd uitgevoerd om de effecten van BVC-behandeling of hypoxie op U87-cellen te onderzoeken. Voor normoxie versus hypoxie vergelijkingen werden de cellen geĆÆncubeerd bij 1% zuurstof gedurende 72 uur. De volgende mitochondriale genen werden getest:(A) mitochondriale ribosomale genen,(B) Krebs cyclus enzymen, en(C) elektronentransport complex I en V componenten. Genniveaus worden uitgedrukt als vouwveranderingen door vergelijking in vivo met PBS-controles en in vitro met normoxische controles. Gemiddelde Ā± SE. Enkele asterisk (*) P< 0,05; dubbele asterisk (**) P< 0,01; drievoudige asterisk (***) P< 0,001

Exploitatie van de verhoogde glycolytische kloof: in vivo synergisme tussen bevacizumab en DCA
Op basis van de duidelijke signatuur van verhoogde HIF-signalering en verminderd mitochondriaal OXPHOS, stelden wij de hypothese dat de bevacizumab-resistente tumoren bijzonder gevoelig zouden zijn voor mitochondriale reactivatoren. De belangrijkste kandidaat voor kleine moleculen uit deze klasse is DCA, dat de PDK-activiteit remt en daardoor de pyruvaatstroom naar de mitochondriƫn verhoogt en glucose-oxidatie bevordert in plaats van glycolyse [21, 22]. Rekening houdend met de welbekende bijwerkingen van antiangiogene therapie en van DCA, hebben wij voor de beoordeling van de geneesmiddelencombinatie gekozen voor een submaximale dosis van het antiangiogene middel (2,5 mg/kg; om de 3 dagen via intraperitoneale injectie), een strategie die in vivo veel wordt toegepast [23]. Deze aanpak zal naar verwachting ook ons vermogen vergroten om synergisme tussen de twee geneesmiddelen op te sporen, zowel vanuit het standpunt van de tumorrespons als van de effecten op de HIF-signalering. Behandeling met bevacizumab en DCA blokkeerde inderdaad drastisch de tumorgroei in vergelijking met elk middel afzonderlijk (Fig. 4A en aanvullende Fig. S1). Om de algemeenheid van de respons te beoordelen, onderzochten wij een extra GBM-celtype, U118. De respons in op U118 gebaseerde enten was ook veel robuuster met de combinatie, vergeleken met de afzonderlijke geneesmiddelen (Fig. 4B en Aanvullende Fig. S1).

Figuur 4: DCA versterkt de effecten van BVC op de tumorgroei in vivo.(A) Tumorgroei van U87-MG in vivo, behandeld met CTRL, BVC, DCA, of BVC/DCA, vanaf dag 7 tot het einde van het experiment. Gemiddelde Ā± SE, N= 4-6. Een sterretje (*) P< 0,05;(B) tumorgroei van U118 in vivo, behandeld met CTRL, BVC, DCA of BVC/DCA. De U118-tumoren groeiden langzaam en daarom is dag 0 de starttijd van de behandeling. Gemiddelde Ā± SE, N= 4-8. Enkele asterisk (*) P< 0,05; dubbele asterisk (**) P< 0,01;(zwarte sterren is vergelijking met CTRL, grijze sterren met BVC alleen);(C) groei van U87-MG sferoĆÆden behandeld met voertuigcontrole (CTRL) of 10 mM DCA. SferoĆÆden mochten groeien tot 0,2 mm3 alvorens om de 3 dagen met DCA te worden behandeld. NB: De foutbalkjes zijn klein en liggen binnen de symbolen.(D) Foto’s (bij Ɨ5 vergroting) tonen representatieve beelden van de met CTRL en DCA behandelde sferoĆÆden

De werkzaamheid van glycolytische remmers bij het overwinnen van resistentie tegen bevacizumab is eerder voorgesteld [24] zonder experimentele bevestiging. DCA en 2-DG werden samen besproken als onderdeel van dit concept. Toen 2-DG echter parallel aan DCA werd getest, werd geen additief effect ten opzichte van bevacizumab vastgesteld. Dit ondanks het voorbijgaande effect van 2-DG als enkelvoudig middel, toegediend in de in de literatuur beschreven concentratie (aanvullende Fig. S2). Mitochondriale reactivering en directe remming van de glycolyse hebben dus verschillende effecten in combinatie met bevacizumab.

In vitro effecten van DCA

SferoĆÆdemodellen bieden een systeem van intermediaire complexiteit tussen standaard tweedimensionale kweeksystemen en tumoren in vivo vanwege zuurstof- en nutriĆ«ntengradiĆ«nten. In tegenstelling tot monolaagsystemen bootsen expanderende sferoĆÆden de toegenomen avasculariteit na van de in vivo structuren die groeien in aanwezigheid van bevacizumab. U87 sferoĆÆden werden gegenereerd, zoals beschreven [25], en gedurende 7 dagen gekweekt tot ze 0,2 mm3 bereikten. SferoĆÆden van deze omvang zijn groot genoeg om diffusie van een geneesmiddel over de sferoĆÆde mogelijk te maken, maar beginnen ook een klein centraal gebied van hypoxie te vormen en vertonen gradiĆ«nten van voedingsstoffen, pH en O2. Een sterke divergentie van de groeikinetiek tussen met DCA behandelde en niet behandelde groepen werd opgemerkt na 3 dagen behandeling. Dit effect was persistent, en vanaf 6 dagen bracht DCA de sferoĆÆd-uitbreiding aanzienlijk in gevaar (Fig. 4C, D ).

Effect van de combinatie van bevacizumab en DCA op HIF-doelen en histologische markers van tumorgroei

Om na te gaan of het effect van de combinatie op de tumorgroei voornamelijk werd bepaald door verhoogde celdood of verminderde proliferatie, hebben wij histologische analyses uitgevoerd op deze tumoren, met gebruikmaking van bekende markers. De necrose was hoger in de behandelde tumoren dan in de onbehandelde, maar er werd geen significant verschil waargenomen tussen de geneesmiddelen alleen of in combinatie (fig. 5). Proliferatie, zoals geƫvalueerd door kwantificering van Ki-67 (MIB-1) kleuring, was significant lager in de combinatiegroep vergeleken met zowel onbehandelde als bevacizumab-only tumoren, hetgeen suggereert dat het effect van de combinatie voornamelijk cytostatisch was (Fig. 5). Vervolgens beoordeelden wij de effecten van de combinatie van geneesmiddelen op de HIF-signalering, met behulp van een combinatie van immunohistochemie en kwantitatieve RT-PCR (Fig. 5, 6). Verrassend genoeg was DCA alleen niet voldoende om de expressie van de HIF-doelen in vivo meetbaar te verhogen, hoewel bekend is dat het het zuurstofverbruik in verschillende experimentele systemen verhoogt. In combinatie met bevacizumab nam de expressie van CA9 echter dramatisch toe in de levensvatbare U87-tumorcellen. In U118 daarentegen leidde submaximaal bevacizumab alleen tot een dramatische toename van alle geteste HIF-targets, zonder verdere meetbare toename in de met de combinatie behandelde tumoren (fig. 6 en aanvullende fig. S3). Het belangrijkste voorbehoud is echter dat de tumoren die in aanwezigheid van de combinatie overleefden, dramatisch kleiner en praktisch stationair waren, factoren die de mate van hypoxie zouden moeten verminderen.

Figuur 5: Effect van bevacizumab en DCA op de histologie van U87-MG tumoren.(A) Immunohistochemische kleuring voor CA9, CD31, Ki-67 (MIB-1), en necrose in FFPE-secties van U87-MG tumor xenografts behandeld met BVC, DCA, een combinatie van BVC en DCA, of voertuigcontrole (CTRL). Kwantificering van(B) percentage van het levensvatbare weefsel positief voor CA9;(C) vaatscore, VQ, (CD31);(D) proliferatie-index, PQ, (Ki-67); en(E) necrose. Alle beelden worden getoond bij Ɨ20 vergroting. Gemiddelde Ā± SE. Enkele asterisk (*) P< 0,05; dubbele asterisk (**) P< 0,01; drievoudige asterisk (***) P< 0,001

Figuur 6: Effect van combinatietherapie van bevacizumab en DCA op belangrijke metabole genen. Kwantitatieve PCR-analyse werd uitgevoerd om de effecten te onderzoeken van CTRL, BVC, DCA, of BVC/DCA behandeling op U87-MG en U118 tumoren door het meten van vouwveranderingen in het RNA(A en B) PDK1(C en D) CA9. Gemiddelde Ā± SE, N= 4-8. Enkele asterisk (*) P< 0,05; dubbele asterisk (**) P< 0,01; drievoudige asterisk (***) P< 0,001

Bespreking

Het hoofddoel van onze studie was een beter inzicht te krijgen in de aanpassing van de tumor aan bevacizumab, door het identificeren van routes die geassocieerd zijn met resistentie, met bijzondere aandacht voor metabole reacties. Wij concentreerden ons op een heterotopisch in plaats van een orthotopisch model, in de eerste plaats om de haalbaarheid van het monitoren van neoplastische groei en ontsnapping te waarborgen. Bovendien zijn subcutane tumoren, die aanzienlijk grotere volumes bereiken dan hun orthotope tegenhangers, aantoonbaar relevanter voor het modelleren van geavanceerde en hypoxische maligniteiten.

In een recent gepubliceerd orthotopisch model van GBM is verhoogde hypoxie na-bevacizumab gerapporteerd [24, 26]; het onderzoeken van groeiverschillen op lange termijn is echter minder haalbaar in dergelijke systemen. Ondanks de “klassieke” status van tumormetabolisme in het kankeronderzoek en de recente opleving ervan, is geen enkel geneesmiddel dat hoofdzakelijk op dit niveau werkt, goedgekeurd voor routinematig klinisch gebruik [27]. DCA, een kleine molecule die de bloed-hersenbarriĆØre passeert [22], toonde veelbelovende resultaten in een klinische proef bij GBM in combinatie met chirurgie, temozolomide en bestraling [21], en er lopen momenteel meerdere aanvullende proeven http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=+Dichlooracetaat). Het effect van DCA als enkelvoudig middel is echter in het beste geval van voorbijgaande aard, en onze tumormodellen weerspiegelen zeker deze beperking. In een recente studie werd de mogelijkheid besproken dat bevacizumab-behandeling tumoren gevoelig zou moeten maken voor zowel 2-DG als DCA [24], maar deze voorspellingen zijn bij ons alleen voor DCA bevestigd. Het ontbreken van een meetbaar additief of synergetisch effect van 2-DG was waarschijnlijk niet te wijten aan biologische inactiviteit of inadequate dosering, aangezien het tijdelijk effectief was als enkelvoudig middel. Er blijven vragen over het mechanisme van DCA-gemedieerde tumorremming in aanwezigheid van bevacizumab. Hoewel DCA zelf angiogenese zou blokkeren [21], werd dit in ons systeem niet bevestigd door de meting van de gemiddelde vaatdichtheid.

Er is aangetoond dat DCA onder hypoxie een verhoogde cytotoxische werking heeft in verschillende cellijnen [28]. Het huidige paradigma is dat DCA het zuurstofverbruik versnelt door mitochondriale reactivering en de lokale zuurstofspanning verder verlaagt [29], waardoor tumorcellen voor een extra uitdaging komen te staan om te overleven en/of te prolifereren. Bovendien is aangetoond dat in cellen die vanwege mitochondriale DNA-mutaties “hardwired” zijn om selectief glycolyse te gebruiken voor het genereren van ATP, het door DCA geĆÆnduceerde gedwongen OXPHOS een toxisch effect heeft. DCA vertoont ook synergetische cytotoxiciteit in vitro in combinatie met cisplatine en topotecan, twee antineoplastische middelen waarvan bekend is dat ze mitochondriaal DNA beschadigen [30]. Men zou kunnen speculeren dat de downregulatie van mitochondriale genen in de bevacizumab-resistente tumoren een vorm van mitochondriale disfunctie vertegenwoordigt die gevoelig maakt voor de effecten van DCA.

Interessant is dat het effect van DCA, als afzonderlijk middel, op HIF-doelen in xenograften op zijn best subtiel was, ondanks het welbekende positieve effect op het zuurstofverbruik. Samen met bevacizumab leidde DCA daarentegen tot een verhoogde expressie van de meeste geteste HIF targets in de overlevende tumoren in vergelijking met bevacizumab alleen. Een mogelijke verklaring voor deze resultaten is dat het door DCA geforceerde OXPHOS in de aanwezigheid van zeer lage zuurstofniveaus kan leiden tot een verhoogde productie van reactieve zuurstofspecies, die op haar beurt kan bijdragen tot een bijkomende inductie van HIF [31]. Daarnaast, of als alternatief, kan DCA in aanwezigheid van bevacizumab leiden tot een verdere daling van de lokale zuurstofconcentratie tot niveaus waarop de inductie van HIF targets duidelijker wordt door kwantitatieve RT-PCR assay. Naast de verhoogde CA9-expressie werd in U87- of U118-cellen een verhoogde expressie van de HIF-targets PDK1, 3 en GLUT1 waargenomen in de tumoren die overleefden in aanwezigheid van de geneesmiddelencombinatie. Dit kan wijzen op een meer dramatische “laatste toevlucht” metabole verschuiving die cruciaal is voor het overleven van de tumorcellen. In het bijzonder kan de verhoogde expressie van PDK1/3 deel uitmaken van een “laatste poging” van de tumorcellen om het effect van DCA gedeeltelijk tegen te gaan en mitochondriaal OXPHOS te inactiveren. Dergelijke metabole verschuivingen in tumoren die overleven in aanwezigheid van bevacizumab plus DCA kunnen ook belangrijke aanwijzingen geven over hoe de werkzaamheid van deze combinatie verder kan worden verhoogd. Men zou bijvoorbeeld kunnen speculeren dat de resistente tumoren ten minste enige gevoeligheid vertonen voor een verdere escalatie van de DCA-concentratie, hoewel de toxiciteit van deze verbinding een beperkende factor kan worden. Upregulatie van tumorspecifiek CA9 kan ook een belangrijke rol spelen bij de overleving van de met de combinatie behandelde tumoren, omdat het de eliminatie van overtolligCO2, gegenereerd door de reactivering van de Krebs-cyclus, versnelt [ 25]. Daarom kunnen CA9-remmers, die onlangs veelbelovende antikankereffecten hebben laten zien [32, 33], worden beschouwd als realistische kandidaten voor een derde component van een combinatiestrategie.

Kortom, moleculaire ontleding van de aanpassing van tumoren aan anti-VEGF-middelen kan waardevolle aanwijzingen bieden voor het samenstellen van efficiƫntere combinaties die onder meer gericht zijn op het kanker-metabolisme.

Bijdragen van de auteurs

Concept en ontwerp: M.I. en A.L.H. Verwerving van gegevens: K.K., S.W., H.E.G., H.T., J.L., A.L.S., R.L., D.S., C.M.D., en M.H. Analyse en interpretatie van gegevens: M.I. en A.L.H. Schrijven, beoordelen en/of reviseren van het manuscript: M.I. en A.L.H. Administratieve, technische of materiƫle ondersteuning: F.B. Toezicht op de studie: M.I. en A.L.H.

Financieringsbron

Het werk werd ondersteund door subsidies van Cancer Research United Kingdom [S.W., A.L.H., H.T., R.L., J.L.], METOXIA p-Medicine European Union Framework 7 [D.S., F.B.], Rhodes Scholar [H.G.], Indiana University Cancer Center opstartfondsen, en American Cancer Society [M.I., C.M.D., K.K.].

Belangenverstrengeling

Geen potentiƫle belangenconflicten aan te geven.

VERWIJZINGEN


1 Cao Y, Arbiser J, D’Amato RJ, D’Amore PA, Ingber DE, Kerbel R, Klagsbrun M, Lim S, Moses MA, Zetter B et al (2011) Veertig jaar reis van angiogenese translationeel onderzoek. Sci Transl Med 3:114rv3
2 Wick W, Wick A, Weiler M, Weller M (2011) Patterns of progression in maligne glioma following anti-VEGF therapy: perceptions and evidence. Curr Neurol Neurosci Rep 11:305-312
3 Raizer JJ, Grimm S, Chamberlain MC, Nicholas MK, Chandler JP, Muro K, Dubner S, Rademaker AW, Renfrow J, Bredel M (2010) A phase 2 trial of single-agent bevacizumab given in an every-3-week schedule for patients with recurrent high-grade gliomas. Kanker 116:5297-5305
4 Bergers G, Hanahan D (2008) Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer 8:592-603
5 Friedman HS, Prados MD, Wen PY, Mikkelsen T, Schiff D, Abrey LE, Yung WK, Paleologos N, Nicholas MK, Jensen R et al (2009) Bevacizumab alleen en in combinatie met irinotecan in recidiverend glioblastoom. J Clin Oncol 27:4733-4740
6 Winter SC, Shah KA, Campo L, Turley H, Leek R, Corbridge RJ, Cox GJ, Harris AL (2005) Relation of erythropoietin and erythropoietin receptor expression to hypoxia and anemia in head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 11:7614-7620
7 Davies S, Dai D, Pickett G, Thiel KW, Korovkina VP, Leslie KK (2011) Effects of bevacizumab in mouse model of endometrial cancer: defining the molecular basis for resistance. Oncol Rep 25:855-862
8 Rapisarda A, Hollingshead M, Uranchimeg B, Bonomi CA, Borgel SD, Carter JP, Gehrs B, Raffeld M, Kinders RJ, Parchment R et al (2009) Increased antitumor activity of bevacizumab in combination with hypoxia inducible factor-1 inhibition. Mol Cancer Ther 8:1867-1877
9 Harris RA, Bowker-Kinley MM, Huang B, Wu P (2002) Regeling van de activiteit van het pyruvaat dehydrogenase complex. Adv Enzyme Regulering 42:249-259
10 Wigfield SM, Winter SC, Giatromanolaki A, Taylor J, Koukourakis ML, Harris AL (2008) PDK-1 regelt de lactaatproductie in hypoxie en is geassocieerd met een slechte prognose in hoofd-hals squameuze kanker. Br J Cancer 98:1975-1984
11 Kim JW, Tchernyshyov I, Semenza GL, Dang CV (2006) HIF-1-gemedieerde expressie van pyruvaat dehydrogenase kinase: een metabole schakelaar die nodig is voor cellulaire aanpassing aan hypoxie. Cell Metab 3:177-185
12 Lu CW, Lin SC, Chen KF, Lai YY, Tsai SJ (2008) Inductie van pyruvaat dehydrogenase kinase-3 door hypoxie-induceerbare factor-1 bevordert metabole switch en geneesmiddelenresistentie. J Biol Chem 283:28106-28114
13 Frezza C, Pollard PJ, Gottlieb E (2011) Inborn and acquired metabolic defects in cancer. J Mol Med (Berl) 89:213-220
14 Rzymski T, Milani M, Pike L, Buffa F, Mellor HR, Winchester L, Pires I, Hammond E, Ragoussis I, Harris AL (2010) Regeling van autofagie door ATF4 in reactie op ernstige hypoxie. Oncogene 29:4424-4435
15 Prestele M, Vogel F, Reichert AS, Herrmann JM, Ott M (2009) Mrpl36 is belangrijk voor het genereren van assemblagecompetente eiwitten tijdens mitochondriale translatie. Mol Biol Cell 20:2615-2625
16 Emdadul Haque M, Grasso D, Miller C, Spremulli LL, Saada A (2008) The effect of mutated mitochondrial ribosomal proteins S16 and S22 on the assembly of the small and large ribosomal subunits in human mitochondria. Mitochondrium 8:254-261
17 Tang X, Lucas JE, Chen JL, Lamonte G, Wu J, Wang MC, Koumenis C, Chi JT (2012) Functionele interactie tussen reacties op melkzuur en hypoxie regelt genomische transcriptionele uitgangen. Cancer Res 72:491-502
18 Scarpulla RC (2002) Nuclear activators and coactivators in mammalian mitochondrial biogenesis. Biochim Biophys Acta 1576:1-14
19 Falkenberg M, Gaspari M, Rantanen A, Trifunovic A, Larsson NG, Gustafsson CM (2002) Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat Genet 31:289-294
20 Larsson NG, Barsh GS, Clayton DA (1997) Structure and chromosomal localization of the mouse mitochondrial transcription factor A gene (Tfam). Mamm Genome 8:139-140
21 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D et al (2010) Metabole modulatie van glioblastoom met dichlooracetaat. Sci Transl Med 2:31ra34
22 Michelakis ED, Webster L, Mackey JR (2008) Dichlooracetaat (DCA) als een potentiƫle metabool-gerichte therapie voor kanker. Br J Cancer 99:989-994
23 Pechman KR, Donohoe DL, Bedekar DP, Kurpad SN, Hoffmann RG, Schmainda KM (2011) Characterization of bevacizumab dose response relationship in U87 brain tumors using magnetic resonance imaging measures of enhancing tumor volume and relative cerebral blood volume. J Neurooncol 105:233-239
24 Keunen O, Johansson M, Oudin A, Sanzey M, Rahim SA, Fack F, Thorsen F, Taxt T, Bartos M, Jirik R et al (2011) Anti-VEGF behandeling vermindert bloedtoevoer en verhoogt tumorcelinvasie in glioblastoom. Proc Natl Acad Sci U S A 108:3749-3754
25 Swietach P, Patiar S, Supuran CT, Harris AL, Vaughan-Jones RD (2009) The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. J Biol Chem 284:20299-20310
26 de Groot JF, Fuller G, Kumar AJ, Piao Y, Eterovic K, Ji Y, Conrad CA (2010) Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol 12:233-242
27 Kaelin WG Jr, Thompson CB (2010) Q&A: cancer: clues from cell metabolism. Nature 465:562-564
28 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M (2009) In vitro effecten van dichlooracetaat en CO2 op hypoxische HeLa-cellen. Antikankeronderzoek 29:4579-4588
29 Chen Y, Cairns R, Papandreou I, Koong A, Denko NC (2009) Zuurstofverbruik kan de groei van tumoren reguleren, een nieuw perspectief op het Warburg-effect. PLoS One 4:e7033
30 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL (2010) Natriumdichlooracetaat richt zich selectief op cellen met defecten in het mitochondriale ETC. Int J Kanker 127:2510-2519
31 Park JH, Kim TY, Jong HS, Kim TY, Chun YS, Park JW, Lee CT, Jung HC, Kim NK, Bang YJ (2003) Gastric epithelial reactive oxygen species prevent normoxic degradation of hypoxia-inducible factor-1alpha in gastric cancer cells. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 9:433-440
32 Dubois L, Peeters S, Lieuwes NG, Geusens N, Thiry A, Wigfield S, Carta F, McIntyre A, Scozzafava A, Dogne JM et al (2011) Specific inhibition of carbonic anhydrase IX activity enhances the in vivo therapeutic effect of tumor irradiation. Radiother Oncol 99:424-431
33 v Morris JC, Chiche J, Grellier C, Lopez M, Bornaghi LF, Maresca A, Supuran CT, Pouyssegur J, Poulsen SA (2011) Targeting hypoxic tumor cell viability with carbohydrate-based carbonic anhydrase IX and XII inhibitors. J Med Chem 54:6905-6918

Geef een reactie