📖 28 mins.

Mao-fa Zheng1, Si-yu Shen, Wei-da Huang

1DepartementBiochemie, School of Life Science, Fudan University, Handan Road 220, Shanghai, 200433, China.
E-mail: [email protected]


Ontvangen: 16 mei 2013
Aanvaard: 27 augustus 2013
Gepubliceerd: 17 september 2013

Abstract

Doel: Capecitabine is een van de weinige chemotherapie geneesmiddelen met een hoge orale beschikbaarheid. Recentelijk heeft natriumdichlooracetaat (DCA) een groot potentieel getoond als antikankermiddel. In de huidige studie evalueerden we het antikanker effect van DCA in combinatie met capecitabine voor kankers die TP bescheiden tot expressie brachten.

Methoden: Een muis B16 melanoom allograft en een menselijke niet-kleincellige longkanker A549 xenograft werden gebruikt om het effect van gecombineerde behandeling met DCA en capecitabine te beoordelen. Histologie en immunohistochemie werden gebruikt om de apoptose en proliferatie van kankercellen te detecteren. Real-time PCR en Western blot werden uitgevoerd om respectievelijk de expressie van TP en caspases te detecteren.

Resultaten: Voor het eerst melden wij dat DCA de antitumoreffecten van capecitabine verhoogde in een muis B16 allograft en een menselijke A549 xenograft door het bevorderen van apoptose van tumorcellen. DCA heeft weinig effect op de expressie van TP.

Conclusies: Onze bevinding suggereert dat DCA in combinatie met capecitabine potentieel zou kunnen zijn als een nieuw therapeutisch regime tegen sommige kankers.

Trefwoorden: DCA, Capecitabine, Combinatie, Antitumor effect

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013

Cancer Chemother Pharmacol (2013) 72:1031-1041
DOI: 10.1007/s00280-013-2281-z


INLEIDING

Natriumdichlooracetaat (DCA) is een klein moleculair zout van dichloorazijnzuur met een molecuulgewicht van 150 Da. DCA remt de activiteit van pyruvaatdehydrogenase kinase, waardoor het mitochondriale enzymcomplex pyruvaatdehydrogenase wordt geactiveerd [1] en de glycolytische stofwisselingsroute wordt omgezet in oxidatieve fosforylering. In de afgelopen 40 jaar is DCA gebruikt als weesgeneesmiddel bij de behandeling van congenitale melkziekte bij kinderen en andere melkziekte gecompliceerd door andere ziekten [2] en heeft hoge werkzaamheid en lage toxiciteit aangetoond in zowel preklinisch als klinisch onderzoek [3]. Recentelijk heeft DCA een groot potentieel aangetoond als middel tegen kanker vanwege de overeenkomsten in de metabole remodellering van sommige tumorcellen met die welke optreedt tijdens melkzuursyndroom [4]. Kankercellen, vooral kankerstamcellen (CSC’s), weerstaan apoptose door energie te produceren via glycolyse en melkzuurfermentatie, eerder dan via oxidatieve fosforylering, wegens de hypoxische aard van de tumormicro-omgeving, een fenomeen dat bekend staat als het Warburg-effect [5,6]. Na orale toediening is aangetoond dat DCA de mitochondriale functie herstelt en selectief tumorcelapoptose bevordert via een mitochondriaal afhankelijke route [7,8]. De therapeutische werking van DCA tegen glioblastoom is getest in klinische proeven (NCT00540176) en heeft enkele positieve resultaten opgeleverd [9]. Maar fase II proef NCT01029925 om de respons te bepalen van oraal dichlooracetaat bij patiënten met terugkerende en/of metastatische en voorbehandelde borstkanker en niet-kleincellige longkanker werd beëindigd wegens hoger dan verwachte risico’s en veiligheidsproblemen. Het klinisch nut van DCA voor de bestrijding van kanker moet dus zorgvuldiger worden ingeschat.

Als apoptosesensibilisator is DCA ook gebruikt in combinatie met andere kankertherapieën. Cao et al. [10] meldden dat DCA prostaatkankercellen in vitro gevoelig maakte voor bestraling. Xiao et al. [11] stelden vast dat DCA de dood van tumorcellen verhoogde in combinatie met een oncolytisch adenovirus dat de tumorsuppressor MDA-7/IL-24 uitdrukt. Onlangs werd metabool-gerichte therapie met DCA aangetoond als een nieuwe behandelingsstrategie om het resultaat van fotodynamische therapie te verbeteren [12]. Tong et al. [13] vonden dat DCA en 5-fluorouracil een synergetisch antitumoreffect vertoonden bij colorectale kankercellen in vitro. Er bestaan echter nog steeds controversiële resultaten en twijfels over het gebruik van DCA alleen of in combinatie met andere geneesmiddelen. Shahrzad et al. [14] toonden aan dat DCA de apoptose van kankercellen onder hypoxische omstandigheden zowel in vitro als in vivo verminderde. Heshe et al. [15] waarschuwden dat DCA de cytotoxiciteit van sommige standaard antikankergeneesmiddelen, zoals cisplatine en doxorubicine, verminderde, maar de activiteit van temozolomide in 7 van de 10 cellijnen in hun studie niet beïnvloedde. Deze tegenstrijdige resultaten impliceren dat het gebruik van DCA alleen of in combinatie met andere therapieën kankertype- en middelgebonden kan zijn.

Capecitabine is een van de weinige chemotherapiemiddelen die in hoge mate oraal beschikbaar zijn en is toegelaten als eerstelijnsbehandeling voor uitgezaaide rectumkanker of als alternatieve behandeling voor uitgezaaide borstkanker in combinatie met docetaxel [16,17]. Capecitabine is een prodrug van 5-fluorouracil (5-FU) en vereist 3 enzymatische reacties voor een definitieve omzetting in 5-FU in tumorcellen. De laatste reactie wordt gekatalyseerd door thymidinefosforylase (TP), dat in sommige tumoren meer tot expressie komt dan in normale weefsels [18]. Daarom wordt cytotoxisch 5-FU in hogere mate gegenereerd in tumorcellen dan in weefsels buiten het doelgebied, waardoor capecitabine een chemotherapeutisch middel met lage toxiciteit is [18]. TP-expressieniveaus zijn divers in verschillende tumortypes [18]; dit beperkt het gebruik van capecitabine tot slechts enkele soorten kanker. In deze studie hebben wij het antikanker effect van DCA in combinatie met capecitabine beoordeeld voor kankers die TP op bescheiden schaal tot expressie brachten. Wij veronderstelden dat DCA de antikankereffecten verhoogt en de effectieve dosis van capecitabine verlaagt. De combinatie van DCA met capecitabine zou een goed behandelingsschema kunnen opleveren omdat beide middelen oraal kunnen worden ingenomen met een goede therapietrouw van de patiënt. Bovendien kunnen generieke vormen van DCA de effectieve dosis capecitabine verlagen, waardoor de bijwerkingen en de kosten van de kankerbehandeling dalen.

Materialen en methoden

Materialen
Natriumdichlooracetaat
(DCA, CSA:2156-56-1), met een zuiverheid van 99 %, werd verkregen van Shanghai Jieshi Chemical Co., Ltd

. (China).

(China). 5-Fluorouracil (5-FU) en 5′-deoxy-fluorouridine (5-DFUR) werden verkregen van Sigma-Aldrich (VS). MTT werd verkregen van Shanghai Biological Engineering Co. (China). Capecitabine-tabletten (Xeloda) werden verkregen van Roche (VS). Muis B16 melanoom en menselijke niet-kleincellige longkanker A549 cellijn werden verkregen van American Type Cell Culture Collection (ATCC, VS).

Diermodelstudies

Allograft model

C57BL/6 muizen, vrouwtjes, 6-8 weken oud en met een gewicht van ongeveer 18-20 g, werden gekocht bij het Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) en mochten 1 week acclimatiseren. Eén miljoen B16-cellen werden subcutaan (s.c.) geïnoculeerd in de rechterflank van de C57BL/6-muizen. De muizen werden willekeurig gegroepeerd, met 6 muizen per groep in een kooi. Er waren twee sets muizen. DCA en capecitabine werden toegediend aan deze twee sets muizen op respectievelijk 3 en 10 dagen na inoculatie. DCA werd toegevoegd aan steriel drinkwater tot een eindconcentratie van 1,4 g/L. Meting van het verbruikte watervolume toonde aan dat de aan elke muis toegediende hoeveelheid DCA ongeveer gelijk was aan 100 mg/kg/dag. Capecitabinetabletten werden gemalen en gesuspendeerd in steriel water met 4% carboxymethylcellulose om verschillende concentraties te maken. Tweehonderd microliter van de capecitabinesuspensies werd intragastrisch toegediend aan elke muis. Om de 2 dagen werd de lange (a) en korte (b) diameter van de tumoren gemeten met een schuifmaat en werd het lichaamsgewicht genoteerd. Het tumorvolume werd berekend met de formule V = 0,5ab2. Tweeëntwintig dagen na inoculatie werden de muizen gedood en werden de tumoren verwijderd en gewogen.

Xenografiemodel

BALB/c-nu muizen, mannelijk, 5-6 weken oud en met een gewicht van ongeveer 18-20 g, werden gekocht bij Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) en mochten 1 week acclimatiseren. Ongeveer 2 × 2 mm secties van nieuw gehakt A549-tumorweefsel, afkomstig van BALB/c-nu-muizen die eerder met A549-cellen waren geïnoculeerd, werden s.c. geïnoculeerd in de rechterflankregio van mannelijke BALB/c-nu-muizen. DCA en capecitabine werden aan de muizen toegediend wanneer hun tumorvolume ~0,2 cm3 bereikte. Dertig tot vijfendertig dagen na de behandeling werden de muizen gedood en werden de tumoren verwijderd en gewogen. Andere methoden waren dezelfde als die beschreven in het allograft-experiment.

De dierstudies werden goedgekeurd door de Animal Welfare and Ethics Group of Laboratory Animal Science Department, Fudan University.

Histologie en immunohistochemie
Histologisch
onderzoek van de tumorknobbels werd uitgevoerd bij extra dieren (3 muizen per groep) die niet in aanmerking kwamen voor de controle van de tumorgroei. De weefsels werden gefixeerd in 4 % (w/v) paraformaldehyde, en na fixatie gedurende een nacht bij kamertemperatuur werden de monsters gedehydrateerd in gradatie ethanol en ingebed in paraffine. Daarna werden verschillende delen van de tumor willekeurig gesneden om 4 μm secties te maken op het Leica microtoom. Na deparaffinering en rehydratie werden drie secties van verschillende delen van elk monster gekozen voor de vervolgbewerkingen. Terminal deoxynucleotidyl transferase-gemedieerde dUTP nick end-labeling (TUNEL) en 4′6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van TUNEL en DAPI kits (Beyotime, China). Secties werden geanalyseerd met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Olympus, Japan). Detectie van prolifererend celkernantigeen (PCNA) werd uitgevoerd na deparaffinering van de coupes en incubatie bij 96-100 °C gedurende 20 minuten. De endogene peroxidaseactiviteit werd gedoofd met 0,3% (v/v) waterstofperoxide in 60% (v/v) methanol gedurende 30 minuten. Niet-specifieke adsorptie werd geminimaliseerd door de secties gedurende 20 minuten te incuberen in 2% (v/v) normaal geitenserum in PBS. Weefselsecties werden overnacht geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-PCNA antilichaam (Abcam; 1:100 in PBS), 3 keer gewassen met PBS, 30 min per keer, en geïncubeerd met een biotine-geconjugeerd geit antirabbit IgG gedurende 2 uur bij 37 °C en avidine-biotine-peroxidase complex gedurende 1 uur bij 37 °C. Secties werden met hematoxyline (Sigma-Aldrich) tegengekleurd en geanalyseerd met lichtmicroscopie (Olympus, Japan). Drie tumoren per groep werden gebruikt voor immunohistochemische analyse. Eén of twee coupes per tumor werden blind geselecteerd om PCNA- of TUNEL-positieve cellen te meten. Vijf willekeurige velden per glaasje in 400× vergroting werden blind gemeten (n = 250 cellen per groep). Bij de kwantitatieve analyse van TUNEL-positieve cellen werden de mogelijke necrotische cellen uitgesloten door de nucleaire morfologie met DAPI-kleuring te observeren. Er werden zowel positieve als negatieve controles uitgevoerd om nauwkeurige resultaten te waarborgen.

Eiwitextractie en Western blot
Tumorweefsels van elke groep (3 extra muizen per groep) werden samengevoegd en vermalen onder vloeibare stikstof en vervolgens gelyseerd in 150 μL weefsellysebuffer (Beyotime, China). De buisjes werden gedurende 1 minuut krachtig geschud, 20 minuten op ijs geplaatst en bij 5.000 g gedurende 5 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd. De totale eiwitconcentratie werd bepaald met een BCA eiwitbepalingskit (BioRad). Dertig microgram totaal eiwit van elk monster werd gescheiden door SDS-PAGE op een 10 %-gel, overgebracht op PVDF-membraan, geblokkeerd, een nacht geïncubeerd met primair antilichaam, 1 uur geïncubeerd met secundair antilichaam en ontwikkeld met het chromogene substraat NBT/BCIP. Muis monoklonaal anticaspase 3 antilichaam (1:500), anticaspase 9 antilichaam (1:1.000), anti-β-actine antilichaam (1:2.000), en konijn polyklonaal anticaspase 8 antilichaam (1:1.000) werden verkregen van Beyotime (Nanjing, China). Muis monoklonaal anti-TP antilichaam (1:2.000) was afkomstig van Abcam (UK). β-Actine werd gebruikt als interne controle. Banddichtheid van Western blot werd geanalyseerd met Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, China).

Real-time PCR
B16-tumoren
en leverweefsel werden ontleed uit dezelfde C57BL/6 muis die eerder was geïnoculeerd met B16-cellen (er werden 3 muizen gebruikt, geschenk van Wenlong Ren van het Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry). Colo205/A549 en leverweefsels werden verwijderd van dezelfde BALB/c-nu-muis die eerder was geïnoculeerd met Colo205/A549-cellen (er werden respectievelijk 3 muizen gebruikt, gift van Wenlong Ren van het Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry). Voor de analyse van TP-expressie na behandeling werden tumormonsters samengevoegd uit 3 tumorweefsels van gelijk gewicht per groep. Totaal RNA werd geïsoleerd met Trizol-reagens (Invitrogen, VS) en omgekeerd getranscribeerd met PrimeScript® RT-reagenskit (Takara, Japan). cDNA werd genormaliseerd met β-actine. Real-time PCR werd uitgevoerd door driestapsmethoden met behulp van SYBR® Premix Ex Taq™ II kit (Takata, Japan) met een annealingtemperatuur van 55 °C en 40 amplificatiecycli. Elke test werd in drievoud uitgevoerd. β-actine werd gebruikt als interne controle. De relatieve hoeveelheid van elk cDNA werd geanalyseerd door middel van2-△△Ct. Primers voor real-time PCR: β-actine F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ en β-actine R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGACAGCAG-3′ en hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGCTC-3′ en mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Statistieken
We gebruikten meervoudige vergelijkingen ANOVA met post hoc analyse (Tukey’s test), met behulp van SPSS 16.0 software (SPSS Inc., USA). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, en P < 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

TP expressie in muis B16 melanoom en menselijke A549 NSCLC tumoren
TP expressie in B16 en A549 tumoren verwijderd uit muizen werd geanalyseerd door real-time PCR. Menselijke levers brengen relatief meer TP tot expressie dan andere normale weefsels [18]. In een typisch kankertype dat geschikt is voor behandeling met capecitabine, is de TP-expressie in de tumor dichtbij of hoger dan in de lever, bijvoorbeeld colorectale en borstkankers [18,19]. In xenograften van menselijke kanker waren kankers met een hoge TP-activiteit gevoeliger voor behandeling met capecitabine dan kankers met een lage TP-activiteit [20]. Colorectale kankercellijn Colo205 werd gekozen als referentie op basis van zijn matige TP-expressie en matige gevoeligheid voor capecitabine [21]. Zoals blijkt uit fig. 1a waren de TP-transcriptieniveaus in Colo205 iets hoger dan in de lever van de BALB/c-nu-muis. Zoals blijkt uit Fig. 1b, c, lagen de TP-transcriptieniveaus in B16- en A549-tumoren dicht bij die in de muizenlevers. Daarom waren B16 en A549 ook matig TP-exporterende cellijnen. Wij kunnen hieruit afleiden dat B16 en A549 tot op zekere hoogte zullen reageren op capecitabinebehandeling zonder het effect van DCA te dekken. B16 allograft- en A549 xenograft-modellen waren dus geschikt om het antitumoreffect van DCA en capecitabine in combinatie te bestuderen.

Figuur 1. Vergeleken met muizenlever, B16 en A549 tumoren bescheiden TP uitdrukken real-time PCR analyse van TP transcriptie niveaus. Er werden primers gebruikt die specifiek gericht zijn op muis en mens TP. De primer van β-actine is geschikt voor zowel muizen als mensen. a TP-transcriptieniveaus in Colo205 tumor vergeleken met die in de lever van BALB/c-nu dragende muizen. b TP-transcriptieniveaus in A549 tumor vergeleken met die in de lever van BALB/c-nu dragende muizen. c TP-transcriptieniveaus in B16 tumor vergeleken met die in de lever van C57BL/6 dragende muizen. Per groep zijn monsters van 3 muizen gebruikt

DCA verhoogt het antitumoreffect van capecitabine in een melanoom B16 allograft in muizen zonder extra toxiciteit
Aangezien de hypoxische aard van de tumormicro-omgeving essentieel is voor optimale DCA-activiteit, werd het antitumoreffect van DCA plus capecitabine getest in diermodellen in plaats van cellijnen. Zesendertig C57BL/6 muizen werden geïnoculeerd met 1 ×106 B16 melanoomcellen en willekeurig verdeeld in 6 groepen (n = 6): een controlegroep die geen geneesmiddel kreeg, een groep met alleen DCA, een groep met alleen 10 mg/dag capecitabine, en 3 groepen met DCA plus 5, 10 of 20 mg/dag capecitabine. Drie dagen na inoculatie van tumorcellen werden DCA in drinkwater en oraal (p.o.) capecitabine als enkelvoudige middelen of in combinatie met oplopende concentraties capecitabine aan de muizen toegediend. Zoals getoond in het bovenste paneel van fig. 2a, remden zowel DCA als 10 mg/dag capecitabine alleen de groei van B16-melanoomtumoren in bescheiden mate in vergelijking met de controlegroep. DCA plus 10 mg/dag capecitabine daarentegen verhoogde de remming van de tumorgroei aanzienlijk (P <0,05). Het antitumoreffect van DCA plus 20 mg/dag capecitabine was vergelijkbaar met dat van DCA plus 10 mg/dag capecitabine; de tumorgroei werd bijna volledig geremd. Opmerkelijk is dat muizen behandeld met DCA plus 20 mg/dag capecitabine een acuut verlies van lichaamsgewicht ondervonden (fig. 2a, onderste paneel), terwijl DCA plus 10 mg/dag capecitabine weinig effect had op het lichaamsgewicht in vergelijking met de controle.

Figuur 2. DCA verhoogt het antitumoreffect van capecitabine in een melanoomallograft van de muis B16 zonder extra toxiciteit. a Drie dagen na inoculatie werden DCA en capecitabine (CAP) alleen of in combinatie toegediend aan de muizen. Er werden geëscaleerde doses [5, 10 en 20 mg/dag] capecitabine in combinatie met een constante dosis DCA toegediend. Een tumorvolume curve(bovenste paneel) en lichaamsgewicht curve(onderste paneel) worden getoond. b Tien dagen na inoculatie werden DCA en 7,5 mg/dag capecitabine alleen of in combinatie toegediend aan de muizen. Een curve van het tumorvolume(bovenste paneel) en de curve van het lichaamsgewicht(onderste paneel) worden getoond

Om het antitumoreffect van DCA plus capecitabine tegen palpabele, detecteerbare tumoren te beoordelen, werden DCA en capecitabine alleen of in combinatie toegediend aan een tweede groep van 36 C57BL/6 muizen geïnoculeerd met 1 ×106 B16-melanoomcellen, 10 dagen na inoculatie van de tumorcellen. Muizen met palpabele tumoren werden willekeurig verdeeld in 4 groepen (n = 9, 3 muizen werden gebruikt voor immunohistochemische analyse), controle, alleen DCA, alleen capecitabine met 7,5 mg/dag, en DCA plus capecitabine met 7,5 mg/dag. Zoals getoond in het bovenste paneel van fig. 2b, remde DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine de tumorgroei aanzienlijk in vergelijking met DCA of capecitabine alleen (P <0,05). Tweeëntwintig dagen na inoculatie remde DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine de tumorgroei met 75% (P < 0,05), terwijl DCA en capecitabine alleen de groei met respectievelijk 25% en 35% remden (P < 0,05). DCA veroorzaakte geen acuut verlies van lichaamsgewicht in vergelijking met behandeling met alleen capecitabine (fig. 2b, onderste paneel). Deze resultaten tonen aan dat DCA en capecitabine een synergetisch antitumoreffect kunnen hebben in B16-melanoomtumoren.

DCA verhoogt het antitumoreffect van capecitabine in een humaan NSCLC A549 xenograft model zonder extra toxiciteit
Er is eerder gemeld dat humaan NSCLC behandeld kon worden met DCA [7] of capecitabine [22-24]. In de huidige studie onderzochten we het antitumoreffect van DCA plus capecitabine in een humaan NSCLC A549 xenograft model. Zesenzestig mannelijke BALB/c-nu muizen met menselijke NSCLC A549 tumoren (~2 × 2 mm) die s.c. in de rechterflank werden geïnoculeerd, werden willekeurig verdeeld in 9 groepen: controle; alleen DCA; alleen 2,5, 5, 7,5 of 10 mg capecitabine per dag; of DCA plus 2,5, 5 of 7,5 mg capecitabine per dag.5 mg/dag capecitabine (n = 6, behalve controle, DCA alleen, 7,5 mg/dag capecitabine en DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine; in deze groepen, n = 9, werden 3 muizen gebruikt voor immunohistochemische analyse en Western blot of real-time PCR-analyse). Capecitabine van 10 mg/dag werd ingesteld als controle met hoge dosis. Wanneer het tumorvolume 0,15-0,2 cm3 bereikte, werden de muizen geneesmiddelen toegediend. Capecitabine werd p.o. toegediend in een schema van 14 dagen op 7 dagen af. Zoals getoond in de linkerpanelen van Fig. 3a, b, en c, had DCA alleen een licht groeiremmend effect op A549 tumoren; deze bevinding was niet consistent met die van eerdere rapporten [7] waarin DCA alleen een groter antitumor effect vertoonde. Capecitabine alleen bij 10 mg/dag remde de groei van A549 tumoren krachtig af, maar er werd een dramatisch verlies van lichaamsgewicht geconstateerd, wat duidt op ernstige toxiciteit (Fig. 3a, b, c, rechter panelen). Zoals getoond in het linker paneel van Fig. 3a, verminderde 2,5 mg/dag capecitabine alleen de groei van A549 tumoren aanzienlijk; de combinatie van DCA plus 2,5 mg/dag capecitabine verhoogde de groeiremming. De stijgende tumorvolumecurve van behandeling met DCA alleen suggereert dat capecitabine het dominante antitumoreffect uitoefent bij combinatiebehandeling. Het effect van DCA plus 5 mg/dag capecitabine was iets beter dan DCA plus 2,5 mg/dag capecitabine, maar slechter dan 10 mg/dag capecitabine alleen, en er werd geen significant verlies van lichaamsgewicht waargenomen (fig. 3b, rechterpaneel). Opmerkelijk is dat DCA plus 5 mg/dag capecitabine de tumorgroei aanzienlijk meer afremde dan 5 mg/dag capecitabine alleen (fig. 3b, linkerpaneel). Het antitumoreffect van de combinatie lag dicht bij de behandeling met 10 mg/dag capecitabine, maar zonder significant verlies van lichaamsgewicht (fig. 3b, rechterpaneel). Het effect van 7,5 mg/dag capecitabine alleen (fig. 3c) was iets beter dan 5 mg/dag capecitabine alleen; in combinatie met DCA was er echter geen significant verschil tussen DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine en DCA plus 5 mg/dag capecitabine. Deze resultaten impliceren dat DCA de dosis capecitabine kan verlagen zonder verlies van antitumoreffecten of toename van toxiciteit.

Figuur 3. DCA verhoogt het antitumoreffect van capecitabine in een humaan NSCLC A549 xenograft model zonder extra toxiciteit a DCA plus 2,5 mg/dag (mg/dag) capecitabine. b DCA plus 5 mg/dag capecitabine. c DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine. De behandelgroep met 10 mg capecitabine per dag werd gebruikt als controlegroep met hoge doses. Tumorgroeicurven(linker panelen) en lichaamsgewichtscurven(rechter panelen) worden getoond. Het tumorvolume wordt weergegeven op een logaritmische as

DCA verhoogt het apoptotisch effect van capecitabine op B16- en A549-cellen in vivo
Histologisch
onderzoek van de B16-melanoomtumoren werd 7 dagen na het begin van de behandeling uitgevoerd. TUNEL-kleuring toonde aan dat behandeling van B16-melanoomtumoren met DCA of 7,5 mg/dag capecitabine alleen respectievelijk 8 en 17 % cellulaire apoptose induceerde. In combinatie induceerden DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine apoptose tot ongeveer 30%, meer dan de som van de afzonderlijke behandelingen samen (Fig. 4a, c, linkerpaneel). Kleuring van PCNA in de B16 melanoomtumoren toonde aan dat DCA alleen weinig invloed had op de proliferatie, terwijl 7,5 mg/dag capecitabine alleen de proliferatie aanzienlijk verminderde. DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine verhoogde niet de proliferatieremming van capecitabine alleen in de B16-tumorcellen (Fig. 4b, c, rechterpaneel).

Figuur 4. DCA verhoogt het apoptotisch effect van capecitabine in B16 melanoomtumoren. a Immunofluorescente TUNEL-kleuring van B16 melanoomtumorspecimens van muizen behandeld met DCA, 7,5 mg/dag capecitabine alleen, of DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine gedurende 7 dagen. b Immunohistochemische analyse van het proliferatie-antigeen PCNA in B16 melanoom tumormonsters van muizen behandeld met DCA, 7,5 mg/dag capecitabine alleen, of DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine gedurende 7 dagen. c Kwantitatieve analyse van TUNEL-positieve cellen(links) en PCNA-positieve cellen(rechts). *P < 0.05

Net als bij de B16-melanoomtumoren leidde behandeling van NSCLC A549-tumoren met DCA of 7,5 mg/dag capecitabine alleen tot apoptose van respectievelijk 15 en 30 %. Bij gecombineerde behandeling leidde DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine tot 50 % apoptose, meer dan de som van de behandelingen met de afzonderlijke agentia samen (fig. 5a, b). Deze resultaten suggereren dat DCA en capecitabine een synergetisch effect hebben op de apoptose van NSCLC A549 tumorcellen. DCA verhoogde de proliferatieremming van capecitabine in NSCLC A549 tumorcellen niet (gegevens niet getoond).

Figuur 3. DCA verhoogt de apoptotische werking van capecitabine in NSCLC A549 tumoren. a Immunohistochemische TUNEL analyse van NSCLC A549 tumormonsters van muizen behandeld met DCA, 7,5 mg/dag capecitabine alleen, of DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine gedurende 7 dagen. b Kwantitatieve analyse van TUNEL-positieve cellen. c Western blot van caspase activering in NSCLC A549 tumoren. Activering van initiator caspases (caspase 8 en caspase 9) en effector caspase (caspase 3) werd gedetecteerd in NSCLC A549 tumoren geïnoculeerd in BALB/c-nu muizen behandeld met DCA, 7,5 mg/dag capecitabine, of DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine. dichtheidsanalyse van gekloofd caspase (C. caspase). Genormaliseerd door β-actine. *P < 0.05

Western blot liet zien dat DCA weinig effect had op de expressie en activering van procaspase 8, procaspase 9, en procaspase 3 in NSCLC A549 tumoren vergeleken met de controle op dag 7 na behandeling (Fig. 5c, d). Capecitabine alleen bij 7,5 mg/dag verhoogde de activering van alle 3 de procaspasen (fig. 5c, d). Interessant is dat, hoewel DCA alleen weinig effect had op de expressie en activering van de 3 procaspasen, DCA plus capecitabine de expressie van procaspase 8 en procaspase 3 bevorderde in vergelijking met behandeling met capecitabine alleen, en de activering van procaspase 8, procaspase 9 en procaspase 3 verhoogde.

DCA heeft weinig effect op de expressie van TP in tumor
We analyseerden de expressie van TP in tumormonsters van A549 xenografts op dag 7 na de behandeling. Zowel real-time PCR (Fig. 6a) als Western blot (Fig. 6b) toonden aan dat DCA als enkelvoudig middel of in combinatie met capecitabine weinig effect heeft op de expressie van TP, wat betekent dat het mechanisme van DCA en capecitabine in combinatie anders was dan andere eerder gerapporteerde capecitabinesynergisten [19,25-27]. Real-time PCR toonde ook aan dat DCA de expressie van andere metabole enzymen van capecitabine niet beïnvloedde (thymidylate synthase, orotate phosphoribosyl transferase, dihydropyrimidine dehydrogenase, thymidine kinase 1, en cytidine deaminase, gegevens niet getoond). De resultaten suggereren dat DCA weinig effect heeft op het metabolisme van capecitabine, waardoor de toxiciteit van capecitabine niet zou toenemen.

Figuur 6. Transcriptie en expressie van TP in A549 tumor na behandeling. a Real-time PCR analyse van TP transcriptie. Genormaliseerd door β-actine. b Western blot analyse van TP expressie. β-actine werd gebruikt als interne controle. A549 tumoren werden 7 dagen na DCA, 7,5 mg/dag capecitabine, of DCA plus 7,5 mg/dag capecitabine behandeling of controlegroep uit BALB/c-nu muizen verwijderd. Monsters van drie tumoren per groep werden samengevoegd

Bespreking

DCA alleen of in combinatie met andere therapieën is getest in klinische proeven; er zijn echter geen rapporten beschikbaar over de antitumoreffecten van DCA in combinatie met capecitabine. Wij veronderstelden dat het apoptosebevorderende effect van DCA op vaste tumorcellen deze gevoeliger zou maken voor capecitabine. In de huidige studie had 1,4 g/L DCA alleen weinig effect op de groei van NSCLC A549 tumoren in muizen. Gecombineerde toediening van DCA en capecitabine kon echter de effectieve dosis capecitabine met 50% verminderen. DCA verhoogde het antitumoreffect van capecitabine in vivo via sensibiliserende apoptose. DCA heeft weinig effect op het metabolisme van capecitabine, waardoor de toxiciteit van capecitabine niet zou toenemen.

Aangezien er zowel positieve als negatieve resultaten zijn gerapporteerd (zoals blijkt uit de inleiding), bestaat er nog steeds onenigheid over het gebruik van DCA als antikankermiddel. Deze discrepantie kan te wijten zijn aan verschillende experimentele omstandigheden, met name tussen in vivo en in vitro resultaten. De in deze studie gebruikte cellulaire tests toonden aan dat tumorcellen ongevoelig zijn voor DCA wanneer ze in vitro worden gekweekt; de IC50 ligt boven de 50 mM. (gegevens niet getoond). Het effect van DCA op kankercellen is niet het gevolg van directe cytotoxiciteit, maar hangt af van het stofwisselingspatroon van de kankercellen [7, 28]. In vitro gekweekte cellijnen kunnen de tumormicro-omgeving niet nabootsen en kunnen het “Warburg-effect” verliezen. Daarom zijn op cellen gebaseerde in vitro testen wellicht niet de meest relevante modelsystemen om het gebruik van DCA te bepalen. Daarom werd het gecombineerde antitumoreffect van DCA en capecitabine in deze studie eerst in vivo geëvalueerd in muistumormodellen. Wij vonden ook dat het effect van DCA op de NSCLC A549 xenograft in deze studie minder was dan dat van Bonnet et al. [7], ook al werd een grotere dosis DCA gebruikt. Dit kan te wijten zijn aan het verschil in de metabolische capaciteit van DCA tussen muizen en ratten. De resultaten suggereren dat het effect van DCA kan worden beïnvloed door de toestand van kankercellen en patiënten, hetgeen vraagt om zorgvuldig onderzoek bij klinisch gebruik van DCA bij de behandeling van kanker.

In deze studie toonden diermodelstudies aan dat DCA zelf een mild antitumoreffect vertoonde tegen gevestigde tumoren. Maar in combinatie met capecitabine verhoogde DCA dramatisch het antitumoreffect van capecitabine, wat blijkt uit zowel de diermodelstudies als de resultaten van immunohistochemische apoptose. Consistent daarmee toonde Western blot analyse aan dat DCA zelf weinig effect had op de expressie en splitsing van procaspases. Maar in combinatie met capecitabine verhoogt DCA opmerkelijk de expressie en splitsing van de procaspasen 8, 9 en 3. Er is gemeld dat cytotoxische agentia, zoals 5-Fu, kunnen leiden tot verhoogde expressie en activering van caspase 8 [29,30]. De reden waarom capecitabine leidt tot verhoogde expressie en activering van caspase 9 is nog niet duidelijk. Het zou verband kunnen houden met het antiangiogenetisch effect van capecitabine. Er is gemeld dat DCA een mitochondria-K+ kanaal as kan normaliseren en kan fungeren als een apoptose sensitizer [7]. Wij speculeren dat DCA het mitochondriaal potentieel van kankercellen kan depolariseren door de as te normaliseren, en daardoor de activering van caspase 8 en caspase 9 door capecitabine kan verhogen. Verhoogde activering van caspase 8 en caspase 9 leidt tot verhoogde activering van caspase 3.

Onlangs is gewezen op de cruciale bijdrage van CSC’s, met hun verhoogde tumorigene vermogen en resistentie tegen radiotherapie en chemotherapie, aan kwaadaardig gedrag [31]. Van CSC’s in vaste tumoren wordt gemeld dat zij een belangrijke rol spelen in de antichemotherapie- en antistralingseigenschappen van tumoren [32, 33]. Vele therapieën om CSC’s aan te pakken zijn besproken [34, 35], en combinatietherapieën om zowel CSC’s als “normale” kankercellen aan te pakken hebben grote belangstelling gewekt [36-38]. Er is gemeld dat DCA zowel in vitro als in vivo apoptose induceerde in vermeende glioblastoma-stamcellen [ 9]. In onze studie verminderde het aantal CD133-positieve cellen in de A549 tumorglaasjes, bepaald door immunohistochemie, na 7 dagen DCA-behandeling tot 0,5%, vergeleken met 6% in de controlegroep (gegevens niet getoond), wat ons doet vermoeden dat DCA ook effect kan hebben op het induceren van apoptose in longkanker-CSC’s. Wij speculeren dat DCA tumorcellen, vooral CSC’s, kan sensibiliseren voor capecitabine. De combinatie van DCA en capecitabine werkt op 2 manieren tegen tumorcellen; capecitabine richt zich op de “normale” kankercellen en spaart de CSC’s, en DCA richt zich op de CSC’s en bevordert apoptose tegen capecitabine. Een ander waarschijnlijk scenario om de combinatie-effecten te verklaren is dat DCA de angiogenese van kanker in vivo onderdrukt [9], waarbij DCA geen direct effect op kankercellen vertoont. Naast zijn klassieke antitumoractiviteit kan capecitabine volgens recente studies ook werken als een antiangiogenetisch molecuul [ 39]. DCA kan het antiangiogene effect van capecitabine versterken, wat het gecombineerde antitumoreffect verklaart. Er zullen diepgaande studies worden verricht om het gedetailleerde mechanisme te bepalen.

Kortom, wij gebruikten zowel syngenetisch geënte tumoren als xenografisch geënte tumormodellen om het gecombineerde antitumoreffect van DCA en capecitabine te bestuderen en ontdekten dat DCA voor het eerst het antitumoreffect van capecitabine versterkte. Wij stelden vast dat DCA in staat was kankercellen te sensibiliseren en de apoptotische effecten van capecitabine te verhogen. In combinatie kon DCA de effectieve dosis van capecitabine verlagen zonder verhoogde toxiciteit. Het goedkope, generieke en orale DCA in combinatie met orale capecitabine kan een goed behandelingsregime tegen kanker zijn.

Dankbetuigingen

Wij zijn Wenlong Ren van het Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry zeer dankbaar voor de hulp bij de voorbereiding van de muistumormodellen.

Belangenverstrengeling

Geen.

VERWIJZINGEN


1 Wigfield SM, Winter SC, Giatromanolaki A, Taylor J, Koukourakis ML, Harris AL (2008) PDK-1 regelt de lactaatproductie in hypoxie en is geassocieerd met een slechte prognose in hoofd-hals squameuze kanker. Br J Cancer 98(12):1975-1984. doi:10.1038/sj.bjc.6604356
2 Cohen RD, Iles RA (1978) Dichloroacetate and the treatment of lactic acidosis. New Engl J Med 298(24):1364. doi:1056/NEJM197806152982413
3 Agbenyega T, Planche T, Bedu-Addo G, Ansong D, Owusu-Ofori A, Bhattaram VA, Nagaraja NV, Shroads AL, Henderson GN, Hutson AD, Derendorf H, Krishna S, Stacpoole PW (2003) Populatiekinetiek, werkzaamheid en veiligheid van dichloroacetaat voor melkzuurgasverzuring ten gevolge van ernstige malaria bij kinderen. J Clin Pharmacol 43(4):386-396
4 Michelakis ED, Webster L, Mackey JR (2008) Dichlooracetaat (DCA) als een potentiële metabool-gerichte therapie voor kanker. Br J Cancer 99(7):989-994. doi:10.1038/sj.bjc.6604554
5 Warburg O, Wind F, Negelein E (1927) Het metabolisme van tumoren in het lichaam. J General Physiol 8(6):519-530
6 Gatenby RA, Gillies RJ (2004) Waarom hebben kankers een hoge aerobe glycolyse? Nat Rev Cancer 4(11):891-899. doi:10.1038/nrc1478
7 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED (2007) A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11(1):37-51. doi:10.1016/j.ccr.2006.10.020
8 Pan JG, Mak TW (2007) Metabolic targeting as an anticancer strategy: dawn of a new era? Science’s STKE: signal transduction knowledge environment 2007(381):pe14. doi:10.1126/stke.3812007pe14
9 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, Niven E, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, Abdulkarim B, McMurtry MS, Petruk KC (2010) Metabole modulatie van glioblastoom met dichlooracetaat. Sci Transl Med 2(31):31ra34. doi:10.1126/scitranslmed.3000677
10 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT, Namiki K, Sakai Y, Porvasnik S, Urbanek C, Rosser CJ (2008) Dichlooracetaat (DCA) sensibiliseert zowel wild-type als over-expressie van Bcl-2 prostaatkankercellen in vitro voor bestraling. Prostaat 68(11):1223-1231. doi:10.1002/pros.20788
11 Xiao L, Li X, Niu N, Qian J, Xie G, Wang Y (2010) Dichloroacetate (DCA) verbetert tumorceldood in combinatie met oncolytisch adenovirus gewapend met MDA-7/IL-24. Mol Cell Biochem 340(1-2):31-40. doi:10.1007/s11010-010-0397-6
12 Kwitniewski M, Moan J, Juzeniene A (2011) Metabolic-targeted therapy with dichloroacetate (DCA): a novel treatment strategy to improve the outcome of photodynamic therapy. Photochem Photobiol Sci Off J Eur Photochem Assoc Eur Soc Photobiol 10(1):25-28. doi:10.1039/c0pp00193g
13 Tong J, Xie G, He J, Li J, Pan F, Liang H (2011) Synergetisch antitumoreffect van dichlooracetaat in combinatie met 5-fluorouracil bij colorectale kanker. J Biomed Biotechnol 2011:740564. doi:10.1155/2011/740564
14 Shahrzad S, Lacombe K, Adamcic U, Minhas K, Coomber BL (2010) Natriumdichlooracetaat (DCA) vermindert apoptose bij colorectale tumorhypoxie. Cancer Lett 297(1):75-83. doi:10.1016/j.canlet.2010.04.027
15 Heshe D, Hoogestraat S, Brauckmann C, Karst U, Boos J, Lanvers-Kaminsky C (2011) Dichlooracetaat metabolisch gerichte therapie verslaat cytotoxiciteit van standaard antikankermedicijnen. Cancer Chemother Pharmacol 67(3):647-655. doi:10.1007/s00280-010-1361-6
16 Mandelblat J, Bashir T, Budman DR (2006) Capecitabine-docetaxel combinatiebehandeling. Expert Rev Anticancer Ther 6(9):1169-1178. doi:10.1586/14737140.6.9.1169
17 Budman DR (2000) Capecitabine. Invest New Drugs 18(4):355-363
18 Miwa M, Ura M, Nishida M, Sawada N, Ishikawa T, Mori K, Shimma N, Umeda I, Ishitsuka H (1998) Design of a novel oral fluoropyrimidine carbamate, capecitabine, which generates 5-fluorouracil selectively in tumours by enzymes concentrated in human liver and cancer tissue. Eur J Cancer 34(8):1274-1281
19 Endo M, Shinbori N, Fukase Y, Sawada N, Ishikawa T, Ishitsuka H, Tanaka Y (1999) Induction of thymidine phosphorylase expression and enhancement of efficacy of capecitabine or 5′-deoxy-5-fluorouridine by cyclophosphamide in mammary tumor models. Int J kanker 83(1):127-134
20 Ishikawa T, Sekiguchi F, Fukase Y, Sawada N, Ishitsuka H (1998) Positieve correlatie tussen de werkzaamheid van capecitabine en doxifluridine en de verhouding tussen thymidinefosforylase en dihydropyrimidinedefrogenase activiteiten in tumoren in menselijke kanker xenograften. Cancer Res 58(4):685-690
21 Kolinsky K, Shen BQ, Zhang YE, Kohles J, Dugan U, Zioncheck TF, Heimbrook D, Packman K, Higgins B (2009) In vivo activiteit van nieuwe capecitabine regimes alleen en met bevacizumab en oxaliplatine in colorectale kanker xenograft modellen. Mol Cancer Ther 8(1):75-82. doi:10.1158/1535-7163.MCT-08-0596
22 Lee DH, Han JY, Yoon SM, Lee JJ, Lee HG, Kim HY, Yoon SJ, Hong EK, Lee JS (2006) A pilot trial of gemcitabine and vinorelbine plus capecitabine in locally advanced or metastatic nonsmall cell lung cancer. Am J Clin Oncol 29(2):143-147. doi:10.1097/01.coc.0000203743.32845.40
23LeeJJ, Han JY, Lee DH, Kim HY, Chun JH, Lee HG, Yoon SM, Lee SY, Lee JS (2006) A phase II trial of docetaxel plus capecitabine in patients with previously treated non-small cell lung cancer. Jpn J Clin Oncol 36(12):761-767. doi:10.1093/jjco/hyl106
24 Kindwall-Keller T, Otterson GA, Young D, Neki A, Criswell T, Nuovo G, Soong R, Diasio R, Villalona-Calero MA (2005) Phase II evaluation of docetaxel-modulated capecitabine in previously treated patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res off J Am Assoc Cancer Res 11(5):1870-1876. doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-1727
25 Sawada N, Ishikawa T, Fukase Y, Nishida M, Yoshikubo T, Ishitsuka H (1998) Induction of thymidine phosphorylase activity and enhancement of capecitabine efficacy by taxol/taxotere in human cancer xenografts. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 4(4):1013-1019
26 Sawada N, Kondoh K, Mori K (2007) Enhancement of capecitabine efficacy by oxaliplatin in human colorectal and gastric cancer xenografts. Oncol Rep 18(4):775-778
27 Sawada N, Ishikawa T, Sekiguchi F, Tanaka Y, Ishitsuka H (1999) X-ray irradiation induceert thymidine phosphorylase en verhoogt de werkzaamheid van capecitabine (Xeloda) in menselijke kanker xenografts. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 5(10):2948-2953
28 Kumar A, Kant S, Singh SM (2012) Nieuwe moleculaire mechanismen van de antitumorwerking van dichlooracetaat tegen T-cellymfoom: implicatie van veranderd glucosemetabolisme, pH-homeostase en regulering van de celoverleving. Chem Biol Interact 199(1):29-37. doi:10.1016/j.cbi.2012.06.005
29 Milner AE, Palmer DH, Hodgkin EA, Eliopoulos AG, Knox PG, Poole CJ, Kerr DJ, Young LS (2002) Induction of apoptosis by chemotherapeutic drugs: the role of FADD in activation of caspase-8 and synergy with death receptor ligands in ovarian carcinoma cells. Cell Death Differ 9(3):287-300. doi:10.1038/sj.cdd.4400945
30 Ehrhardt H, Hacker S, Wittmann S, Maurer M, Borkhardt A, Toloczko A, Debatin KM, Fulda S, Jeremias I (2008) Cytotoxische drug-geïnduceerde, p53-gemedieerde upregulatie van caspase-8 in tumorcellen. Oncogene 27(6):783-793. doi:10.1038/sj.onc.1210666
31 Ghotra VP, Puigvert JC, Danen EH (2009) The cancer stem cell microenvironment and anti-cancer therapy. Int J Radiat Biol 85(11):955-962. doi:10.3109/09553000903242164
32 Kitamura H, Okudela K, Yazawa T, Sato H, Shimoyamada H (2009) Cancer stem cell: implications in cancer biology and therapy with special reference to lung cancer. Longkanker 66(3):275-281. doi:10.1016/j.lungcan.2009.07.019
33 Dylla SJ, Beviglia L, Park IK, Chartier C, Raval J, Ngan L, Pickell K, Aguilar J, Lazetic S, Smith-Berdan S, Clarke MF, Hoey T, Lewicki J, Gurney AL (2008) Colorectale kankerstamcellen zijn verrijkt in xenogene tumoren na chemotherapie. PLoS One 3(6):e2428. doi:10.1371/journal.pone.0002428
34 Tao H, Zhu Y (2011) Colorectale kankerstamcel: een potentieel therapeutisch doelwit. Clin Transl Oncol Off Publ Fed Span Oncol Soc Natl Cancer Inst Mexico 13(12):833-838. doi:10.1007/s12094-011-0743-5
35 Tang C, Ang BT, Pervaiz S (2007) Cancer stem cell: target for anti-cancer therapy. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol 21(14):3777-3785. doi:10.1096/fj.07-8560rev
36 Sun XY, Nong J, Qin K, Warnock GL, Dai LJ (2011) Mesenchymale stamcel-gemedieerde kankertherapie: een dual-targeted strategie van gepersonaliseerde geneeskunde. World J Stem Cells 3(11):96-103. doi:10.4252/wjsc.v3.i11.96
37 Sapi E (2009) Nieuwe kankerstamceltherapie aan de horizon. Cancer Biol Ther 8(18):1754-1755
38 Shigdar S, Lin J, Li Y, Yang CJ, Wei M, Zhus Y, Liu H, Duan W (2012) Cancer stem cell targeting: the next generation of cancer therapy and molecular imaging. Ther Deliv 3(2):227-244
39RanieriG, Roccaro AM, Vacca A, Ribatti D (2006) Thymidinefosforylase (platelet-derived endothelial cell growth factor) als doelwit voor capecitabine: from biology to the bedside. Recent Pat Anti-Cancer Drug Discov 1(2):171-183

Gerelateerde inhoud:

Geef een reactie