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Ellappan Babu, Ph. D, Sabarish Ramachandran, Ph. D, Veena CoothanKandaswamy, Ph. D, Selvakumar Elangovan, Ph. D, Puttur D. Prasad, Ph. D, Vadivel Ganapathy, Ph. D, e Muthusamy Thangaraju, Ph. D.

Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Medical College of Georgia, Georgia Health Sciences University, Augusta, Georgia, Stati Uniti

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Corrispondenza: M. Thangaraju, Ph. D., Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Georgia, Augusta, GA 30912, USA., [email protected].

Conflitto di interessi: Gli autori dichiarano che non vi sono interessi finanziari concorrenti in relazione al lavoro descritto in questo manoscritto.

Pubblicato in forma definitiva come: Oncogene. 2011 September 22; 30(38): 4026-4037. doi:10.1038/onc.2011.113.

Parole chiave: SLC5A8; dicloroacetato; farmaco antitumorale; effetto Warburg; piruvato deidrogenasi chinasi; ossidazione mitocondriale nel cancro


Astratto

Il dicloroacetato come potenziale farmaco antitumorale ha suscitato un crescente interesse da parte del pubblico e degli scienziati. Esistono prove credibili dell’attività antitumorale di questo composto, ma sono necessarie concentrazioni elevate per ottenere un effetto terapeutico significativo. Purtroppo, queste alte concentrazioni producono effetti collaterali dannosi che coinvolgono il sistema nervoso, precludendone l’uso per il trattamento del cancro. La base meccanicistica dell’attività antitumorale del composto è la sua capacità di attivare il complesso della piruvato deidrogenasi attraverso l’inibizione della piruvato deidrogenasi chinasi. Poiché il composto inibisce la chinasi a concentrazioni micromolari, non è noto perché siano necessarie dosi elevate, proibitive dal punto di vista terapeutico, per sopprimere la crescita tumorale. Abbiamo ipotizzato che la mancanza di meccanismi efficaci per l’ingresso del dicloroacetato nelle cellule tumorali possa essere alla base di questo fenomeno. Qui dimostriamo che SLC5A8 trasporta il dicloroacetato in modo molto efficace e con elevata affinità. Questo trasportatore è espresso nelle cellule normali, ma la sua espressione è silenziata nelle cellule tumorali attraverso meccanismi epigenetici. La mancanza del trasportatore rende le cellule tumorali resistenti all’attività antitumorale del dicloroacetato. Tuttavia, se il trasportatore viene espresso ectopicamente nelle cellule tumorali, queste diventano sensibili al farmaco a basse concentrazioni. Ciò è evidente nelle cellule del cancro al seno, del cancro al colon e della prostata. Le cellule normali, che esprimono costitutivamente il trasportatore, non sono invece influenzate dal composto, il che indica un’attività terapeutica selettiva per le cellule tumorali. Il meccanismo dell’attività antitumorale del composto è ancora la sua capacità di inibire la piruvato deidrogenasi chinasi e di forzare l’ossidazione mitocondriale del piruvato. Poiché il silenziamento di SLC5A8 nei tumori coinvolge la metilazione del DNA e la sua espressione può essere indotta dal trattamento con inibitori della metilazione del DNA, i nostri risultati suggeriscono che la combinazione di dicloroacetato con un inibitore della metilazione del DNA offrirebbe un mezzo per ridurre le dosi di dicloroacetato per evitare gli effetti dannosi associati a dosi elevate, senza compromettere l’attività antitumorale.


INTRODUZIONE

Il dicloroacetato è attualmente utilizzato per il trattamento dell’acidosi lattica congenita (Stacpoole et al., 2003, 2008). L’efficacia terapeutica di questo farmaco è dovuta alla sua capacità di attivare il complesso piruvato deidrogenasi (PDC) nella matrice mitocondriale. Tuttavia, il complesso enzimatico non è il bersaglio diretto del farmaco. Il dicloroacetato è un inibitore della piruvato deidrogenasi chinasi (PDK), che fosforila la subunità E1α della PDC e inattiva il complesso (Stacpoole et al. 2003, 2008). Inibendo la PDK, il dicloroacetato impedisce la fosforilazione di E1α e quindi mantiene la PDC in forma attiva. L’attivazione della PDC indotta dal farmaco facilita il metabolismo mitocondriale del piruvato. Poiché il piruvato citosolico può essere trasportato nei mitocondri e metabolizzato o essere convertito in lattato nel citoplasma dalla lattato deidrogenasi, l’attivazione della PDC da parte del dicloroacetato e il conseguente metabolismo del piruvato all’interno dei mitocondri sposta l’equilibrio tra piruvato e lattato verso il piruvato. Questo favorisce la conversione del lattato in piruvato, riducendo così i livelli di lattato.
Negli ultimi anni il dicloroacetato ha suscitato un notevole interesse come potenziale farmaco antitumorale (Michelakis et al., 2008). L’idea che questo farmaco possa avere la capacità di uccidere le cellule tumorali ha una base razionale. Le cellule tumorali ricavano la maggior parte dell’energia dalla glicolisi aerobica piuttosto che dall’ossidazione mitocondriale. Questo cambiamento metabolico nelle cellule tumorali è stato riconosciuto per la prima volta da Warburg (Warburg, 1956) ed è diventato noto come effetto Warburg (Gatenby e Gillies, 2004; Kim e Dang, 2006; Chen et al., 2007; Brahimi-Horn et al., 2007; Vander Heiden et al., 2009; Ganapathy et al., 2009; Mathupala et al., 2010). Dato che la glicolisi aerobica, che converte il glucosio in lattato, genera solo 2 ATP mentre l’ossidazione mitocondriale del piruvato derivato dalla glicolisi genera 30 ATP, sembra sconcertante che le cellule tumorali preferiscano la via metabolica meno efficiente per ottenere energia. Le cellule tumorali, tuttavia, non soffrono di carenza di ATP; infatti, generano più energia delle cellule normali per sostenere la loro crescita e proliferazione. Questo risultato è ottenuto grazie all’attivazione della glicolisi di diverse volte. È vero che l’ossidazione mitocondriale genera più ATP rispetto alla glicolisi citoplasmatica, ma allo stesso tempo l’ossidazione mitocondriale produce specie reattive dell’ossigeno, che potrebbero rivelarsi dannose per le cellule. A quanto pare, le cellule tumorali riconoscono questo aspetto negativo dell’ossidazione mitocondriale e quindi optano per la glicolisi come fonte primaria di ATP. La glicolisi non richiede ossigeno e non genera specie reattive dell’ossigeno. Inoltre, grazie alla generazione di energia prevalentemente attraverso la glicolisi, le cellule tumorali possono proliferare in condizioni anerobiche, spesso presenti nei tumori solidi. Tuttavia, la soppressione della funzione mitocondriale nei tumori è reversibile. È interessante notare che uno dei meccanismi con cui le cellule tumorali sopprimono l’ossidazione mitocondriale è l’induzione della PDK, che inattiva la PDC (Semenza, 2010). Pertanto, l’ossidazione del piruvato nei mitocondri può essere indotta nelle cellule tumorali invertendo la soppressione dell’attività della PDC associata al cancro. Il dicloroacetato fa esattamente questo, inibendo la PDK. Nonostante questa base razionale per il dicloroacetato come potenziale farmaco antitumorale, in letteratura esistono notevoli controversie sull’utilità clinica di questo composto per il trattamento del cancro nell’uomo. Sebbene lo studio di Bonnet et al. (2007) abbia dimostrato l’efficacia antitumorale del dicloroacetato in vitro e in vivo negli animali, un recente studio di Stockwin et al. (2010) ha dimostrato che sono necessarie concentrazioni molto elevate di dicloroacetato per indurre la morte cellulare nelle cellule tumorali e che a queste concentrazioni il composto non è selettivo per le cellule tumorali.
Il dicloroacetato è ionizzato e non può attraversare la membrana plasmatica per diffusione. Ciò solleva la questione di come questo composto entri nelle cellule e acceda alla PDK all’interno della matrice mitocondriale. Per quanto ne sappiamo, esiste un solo rapporto sul trasporto del dicloroacetato nelle cellule di mammifero, che ha dimostrato che i trasportatori di monocarbossilato negli epatociti e nelle cellule tumorali del Lettre di Ehrlich mediano l’ingresso cellulare di questo composto (Jackson e Halestrap, 1996). Poiché i trasportatori di monocarbossilato sono elettroneutrali, la maggior parte delle cellule, comprese quelle tumorali che esprimono questi trasportatori, potrebbero non avere la capacità di concentrare questo farmaco. Recentemente noi e altri abbiamo identificato un nuovo trasportatore per i monocarbossilati, che presenta una selettività del substrato simile a quella dei trasportatori dei monocarbossilati, ma è accoppiato al Na+ ed elettrogenico (Coady et al., 2004; Miyauchi et al., 2004). Questo trasportatore, noto come trasportatore monocarbossilato accoppiato al sodio (SMCT1) o SLC5A8 secondo la nomenclatura dell’Organizzazione del Genoma Umano, ha la capacità di concentrare i suoi substrati contro un gradiente di concentrazione grazie al coinvolgimento del gradiente transmembrana di Na+ e del potenziale di membrana come forze trainanti. SLC5A8 trasporta acetato, propionato, butirrato, lattato, piruvato, 3- bromopiruvato, nicotinato, β-idrossibutirrato e piroglutammato (Miyauchi et al., 2004, 2010; Gopal et al., 2004, 2005; Martin et al., 2006; Thangaraju et al., 2006, 2008, 2009a). Ci siamo chiesti se questo trasportatore altamente accoppiato dal punto di vista energetico accettasse il dicloroacetato come substrato. Questo problema è direttamente rilevante per l’attività antitumorale di questo farmaco, poiché le cellule tumorali silenziano questo trasportatore con meccanismi epigenetici (Ganapathy et al., 2005, 2008, 2009; Gupta et al., 2006). Pertanto, abbiamo intrapreso il presente studio per rispondere a due domande: (a) SLC5A8 trasporta il dicloroacetato? (b) L’attività antitumorale del farmaco dipende dall’espressione del trasportatore nelle cellule tumorali? I risultati dello studio dimostrano che SLC5A8 è obbligatorio per l’attività antitumorale del dicloroacetato.

Risultati

SLC5A8 trasporta il dicloroacetato in modo accoppiato al Na+
Il trasporto di acetato e dei suoi cloro derivati da parte di SLC5A8 umano è stato studiato utilizzando il sistema di espressione di oociti di X. laevis. Il trasportatore umano è stato espresso in ovociti in modo eterologo mediante iniezione di SLC5A8 cRNA. La funzione di trasporto è stata monitorata elettrofisiologicamente con la tecnica del voltage-clamp a due microelettrodi. SLC5A8 funziona come trasportatore accoppiato al Na+ per i monocarbossilati con una stechiometria Na+: monocarbossilato di 2:1. Il processo di trasporto è quindi elettrogeno. Il processo di trasporto è quindi elettrogeno, associato al trasferimento di una carica positiva netta nelle cellule per ogni ciclo di trasporto. La conseguente depolarizzazione della membrana può essere monitorata come corrente ascendente in condizioni di voltage-clamp. Come si può vedere nella Fig. 1A, l’esposizione di oociti che esprimono SLC5A8 all’acetato (1 mM) ha indotto correnti verso l’interno quando sono state monitorate in presenza di Na+ nel mezzo di perfusione (129 ± 9 nA; n = 3 oociti). Tuttavia, queste correnti non sono state osservate in assenza di Na+. Questi dati dimostrano che SLC5A8 media il trasporto di acetato in modo accoppiato al Na+. La cinetica di saturazione ha rivelato che la costante di Michaelis (Kt) per il processo di trasporto è 1,6 ± 0,1 mM. Dopo aver stabilito l’attività funzionale di SLC5A8 umano clonato utilizzando l’acetato come controllo positivo, abbiamo esaminato il trasporto di dicloroacetato. L’esposizione di oociti esprimenti SLC5A8 al dicloroacetato (0,25 mM) ha indotto marcate correnti verso l’interno in presenza di Na+ (153 ± 28 nA; n = 5 oociti) (Fig. 2A). Tali correnti non sono state osservate in assenza di Na+. Il processo di trasporto era saturabile con un Kt di 36 ± 7 μM (Fig. 2B). Pertanto, l’affinità del dicloroacetato per il trasportatore è ~45 volte superiore a quella dell’acetato. Le correnti indotte dal dicloroacetato (0,25 mM) sono aumentate all’aumentare della concentrazione di Na+ nel mezzo di perfusione (Fig. 2C). La relazione è stata sigmoidale, indicando il coinvolgimento di più di un Na+ nel processo di attivazione. L’analisi dei dati secondo l’equazione di Hill ha prodotto un valore di 2,1 ± 0,2 per il coefficiente di Hill. Questi dati dimostrano che la stechiometria Na+: dicloroacetato per il processo di trasporto è 2:1.

Fig. 1. Trasporto di acetato tramite SLC5A8 SLC5A8 umano è stato espresso in oociti di X. laevis e la funzione di trasporto è stata monitorata elettrofisiologicamente utilizzando la tecnica del voltage-clamp a due microelettrodi. (A) Correnti entranti indotte da acetato (1 mM) in presenza (NaCl) o in assenza (cloruro NMDG) di Na+. (B) Cinetica di saturazione delle correnti indotte da acetato.
Fig. 2. Caratteristiche del trasporto di dicloroacetato (DCA) attraverso SLC5A8 SLC5A8 umano è stato espresso in oociti di X. laevis e la funzione di trasporto è stata monitorata elettrofisiologicamente con la tecnica del voltage-clamp a due microelettrodi. (A) Correnti entranti indotte da DCA (0,25 mM) in presenza (NaCl) o assenza (cloruro NMDG) di Na+. (B) Cinetica di saturazione delle correnti indotte da DCA. (C) Cinetica di attivazione del Na+ per le correnti indotte dal DCA (0,25 mM). (D) Competizione tra [14C]-nicotinato e DCA per l’assorbimento negli oociti attraverso SLC5A8. L’assorbimento di [14C]-nicotinato (50 μM) in ovociti iniettati con acqua e cRNA SLC5A8 è stato misurato per 1 ora in assenza e in presenza di acetato (0,25 mM) o DCA (0,25 mM).


Abbiamo anche utilizzato un metodo alternativo per valutare il trasporto di dicloroacetato attraverso SLC5A8. Questo metodo ha utilizzato il [14C]-nicotinato come substrato per SLC5A8. Gli ovociti iniettati in acqua non esprimono il trasportatore e quindi sono stati utilizzati come controlli. L’assorbimento di [14C]-nicotinato (50 μM) è stato 60 volte superiore negli ovociti che esprimono SLC5A8 rispetto a quelli iniettati in acqua (Fig. 2D). L’assorbimento specifico di nicotinato da parte di SLC5A8 è stato inibito per oltre l’80% in presenza di acetato (0,25 mM) o dicloroacetato (0,25 mM), indicando che l’acetato e il dicloroacetato competono con il nicotinato per l’assorbimento attraverso SLC5A8.
Questi risultati hanno dimostrato che il dicloroacetato è un substrato ad alta affinità per SLC5A8 umano. Abbiamo poi studiato il trasporto di monocloroacetato e tricloroacetato per confronto (Fig. 3). Entrambi i composti sono stati trasportati tramite SLC5A8 in modo saturabile e accoppiato al Na+. La Kt era di 177 ± 16μM per il monocloroacetato e di 134 ± 11 μM per il tricloroacetato.

Fig. 3. Trasporto di monocloroacetato (MCA) e tricloroacetato attraverso SLC5A8 SLC5A8 umano è stato espresso in oociti di X. laevis e la funzione di trasporto è stata monitorata elettrofisiologicamente con la tecnica del voltage-clamp a due microelettrodi. (A) Correnti entranti indotte da MCA (1 mM) in presenza (NaCl) o assenza (cloruro NMDG) di Na+. (B) Cinetica di saturazione per le correnti indotte da monocloroacetato. (C) Cinetica di saturazione per le correnti indotte dal tricloroacetato.


L’apoptosi indotta dal dicloroacetato nelle cellule tumorali richiede SLC5A8
Anche se diversi studi hanno dimostrato che il dicloroacetato induce l’apoptosi in diverse linee cellulari tumorali (Bonnet et al., 2007; Wong et al., 2008; Cao et al., 2008), una recente indagine non è stata in grado di confermare questi risultati (Stockwin et al., 2010). Gli studi di Bonnet et al. (2007) hanno dimostrato che il dicloroacetato, a una concentrazione di 0,5 mM, è in grado di indurre cambiamenti metabolici specificamente nelle cellule tumorali e non in quelle normali. Questi cambiamenti includono la depolarizzazione della membrana mitocondriale, la soppressione della glicolisi, l’aumento dell’ossidazione mitocondriale, la produzione di specie reattive dell’ossigeno, l’induzione del canale del potassio Kv1.5 della membrana plasmatica e il rilascio di fattori pro-apoptotici dai mitocondri. Wong et al (2008) hanno poi dimostrato che il dicloroacetato provoca apoptosi nelle cellule del cancro endometriale e Cao et al (2008) hanno dimostrato che il composto sensibilizza le cellule del cancro alla prostata alle radiazioni. Al contrario, gli studi di Stockwin et al. (2010) hanno dimostrato che, sebbene il dicloroacetato sia in grado di indurre la depolarizzazione mitocondriale e la generazione di specie reattive dell’ossigeno, questi cambiamenti si verificano sia nelle cellule tumorali che in quelle normali. Inoltre, per indurre l’apoptosi era necessaria una concentrazione molto elevata del composto (≥25 mM). Sulla base dei risultati del nostro studio attuale, secondo cui SLC5A8 media l’ingresso attivo del dicloroacetato nelle cellule, accoppiato all’energia, e del fatto che le cellule tumorali silenziano il trasportatore, ci siamo chiesti se l’assenza del trasportatore nelle cellule tumorali fosse la ragione della mancanza di apoptosi rilevabile a basse concentrazioni del composto osservata da Stockwin et al (2010). Abbiamo affrontato questa domanda utilizzando tre diverse linee cellulari di cancro del colon umano (HCT116, SW620 e HT29). Queste tre linee cellulari non esprimono SLC5A8 (Thangaraju et al., 2008).
Abbiamo anche confermato l’assenza di espressione di SLC5A8 a livello proteico nelle linee cellulari umane di cancro del colon e della mammella (Fig. 4A e B). Abbiamo espresso SLC5A8 nelle linee cellulari HCT116, SW620 e HT29 mediante trasfezione transitoria di un costrutto di espressione di mammifero e abbiamo confermato l’espressione mediante RT-PCR e analisi Western blot (Fig. 4C). Le cellule trasfettate con un vettore vuoto sono servite come controllo. Abbiamo quindi esposto le cellule di controllo e quelle che esprimono SLC5A8 al dicloroacetato (1 mM) per 48 ore e abbiamo monitorato l’apoptosi (Fig. 4D-F). I risultati sono stati interessanti. Nelle cellule di controllo, che non esprimono il trasportatore, il dicloroacetato non ha avuto alcun effetto significativo. Tuttavia, in condizioni identiche, le cellule che esprimono SLC5A8 sono andate incontro ad apoptosi in misura marcata. Questo fenomeno è stato osservato in tutte e tre le linee cellulari di cancro del colon. Il monocloroacetato si è comportato in modo simile al dicloroacetato anche nelle cellule HCT116 e SW620, ma non nelle cellule HT29, dove la capacità del monocloroacetato di indurre apoptosi è stata significativamente inferiore a quella del dicloroacetato. L’acetato e il tricloroacetato non hanno avuto alcun effetto apprezzabile. In questi esperimenti abbiamo utilizzato il butirrato come controllo positivo, sulla base del nostro precedente rapporto secondo cui l’induzione dell’apoptosi da parte del butirrato in linee cellulari di cancro del colon dipende obbligatoriamente dall’espressione di SLC5A8 (Thangaraju et al., 2008).

Fig. 4. L’espressione della proteina SLC5A8 è stata analizzata in linee cellulari epiteliali umane normali del colon e in linee cellulari tumorali del colon, nonché in linee cellulari umane normali dell’epitelio mammario e in linee cellulari tumorali del seno mediante analisi immunoblot (A, B). Le linee cellulari umane di cancro del colon (HT29, SW620 e HCT116) sono state trasfettate con il solo vettore o con il cDNA di SLC5A8 umano, quindi coltivate in assenza o in presenza di acetato, monocloroacetato (MCA), dicloroacetato (DCA), tricloroacetato (TCA) o butirrato per 48 h. La concentrazione degli acidi grassi era di 1 mM. Le cellule sono state poi utilizzate per l’isolamento di RNA e proteine e per l’analisi dell’apoptosi. (C) Analisi di RT-PCR e immunoblot dell’espressione di SLC5A8 in cellule trasfettate con vettori e cDNA SLC5A8. (D-F) L’apoptosi è stata quantificata in queste cellule mediante analisi FACS.


Abbiamo poi voluto determinare se l’apoptosi indotta dal dicloroacetato mostrasse una selettività delle cellule tumorali e se l’effetto fosse visibile anche in linee cellulari tumorali di origine diversa dal colon. A tal fine, abbiamo selezionato CCD841 e MCF10A come linee cellulari normali (CCD841, colon; MCF10A, epitelio mammario) e quattro linee cellulari tumorali umane: MCF7 (una linea cellulare di cancro al seno positiva al recettore degli estrogeni), MB231 (una linea cellulare di cancro al seno negativa al recettore degli estrogeni), DU145 (una linea cellulare di cancro alla prostata insensibile agli androgeni) e LNCaP (una linea cellulare di cancro alla prostata sensibile agli androgeni). Come riportato in precedenza (Thangaraju et al., 2006, 2008), le linee cellulari normali CCD841 e MCF10A hanno espresso livelli rilevabili di SLC5A8, sia a livello di mRNA che di proteine (Fig. 5A). Al contrario, nessuna delle quattro linee cellulari tumorali qui esaminate esprimeva il trasportatore. L’espressione è diventata evidente nelle linee cellulari tumorali dopo la trasfezione transitoria di un costrutto di espressione di mammifero. Nelle cellule normali, i livelli di espressione aumentavano con la trasfezione. Utilizzando queste linee cellulari, abbiamo confrontato la capacità del dicloroacetato di indurre l’apoptosi tra linee cellulari normali e tumorali (Fig. 5B). Non abbiamo riscontrato differenze significative nell’apoptosi delle linee cellulari normali con e senza trattamento con dicloroacetato (1 mM). Anche l’aumento dei livelli di espressione di SLC5A8 non ha avuto alcun effetto sull’entità dell’apoptosi. Al contrario, il dicloroacetato è stato in grado di indurre una marcata apoptosi nelle quattro linee cellulari tumorali, ma solo se le cellule esprimevano il trasportatore. Senza l’espressione del trasportatore, le linee cellulari tumorali non sono andate incontro ad apoptosi dopo il trattamento con dicloroacetato. Questi risultati dimostrano che il dicloroacetato è in grado di causare apoptosi anche a concentrazioni di 1 mM in modo selettivo per le cellule tumorali, ma solo se SLC5A8 è espresso. Queste osservazioni sono state confermate anche con l’espressione stabile di SLC5A8 mediata da un virus lenti (inducibile con la doxiciclina) in due linee cellulari di cancro al seno, MCF7 e MB231 (Fig. 5C, D). È stato dimostrato che il silenziamento di SLC5A8 è associato alla metilazione del DNA e che il trattamento delle cellule tumorali con agenti DNAdemetilanti riattiva l’espressione di SLC5A8. Pertanto, abbiamo trattato linee cellulari normali e tumorali con 5′-aza-2-deossicitidina (5-Azadc), un agente DNA-demetilante, e la riattivazione di SLC5A8 è stata confermata dall’analisi di immunoblotting (Fig. 5E). il trattamento con 5-Azadc non ha alterato l’espressione proteica di SLC5A8 nelle cellule epiteliali normali del colon e della mammella, mentre ha riattivato l’espressione di SLC5A8 in tutte le linee cellulari tumorali. Inoltre, il trattamento di queste cellule con 5-Azadc di per sé ha indotto un’apoptosi significativa; tuttavia, il trattamento di queste cellule con dicloroacetato (1 mM) ha aumentato drasticamente l’apoptosi indotta da 5-Azadc (Fig. 5F).

Fig. 5. Induzione dell’apoptosi in linee cellulari di cancro al seno e alla prostata da parte del DCA in modo SLC5A8-dipendente Linee cellulari di cancro al seno umano (MCF7, una linea cellulare di cancro ER-positiva, e MB231, una linea cellulare di cancro ER-negativa) e linee cellulari di cancro alla prostata umano (DU145, e LNCaP, una linea cellulare sensibile agli ormoni) sono state trasfettate con il solo vettore o con il cDNA di SLC5A8 umano e poi coltivate in assenza o in presenza di dicloroacetato (DCA, 1 mM) per 48 ore. Sono state utilizzate in modo analogo anche due linee cellulari normali, una rappresentante l’epitelio del colon (CCD841) e l’altra l’epitelio mammario (MCF10A). Le cellule sono state poi utilizzate per l’isolamento di RNA e proteine e per l’analisi dell’apoptosi. (A) Analisi RT-PCR e immunoblot dell’espressione di SLC5A8 in cellule trasfettate con vettori e cDNA SLC5A8. (B) L’apoptosi è stata quantificata in queste cellule mediante analisi FACS. (C) Linee cellulari stabili SLC5A8 e pLVX mediate dal sistema Tet-On sono state generate in cellule MCF7 e MB231. Analisi RT-PCR e immunoblot dell’espressione di SLC5A8 in presenza e assenza di doxiciclina (Dox) nelle linee cellulari stabili pLVX e SLC5A8. (D) Analisi del ciclo cellulare per le linee cellulari stabili pLVX e SLC5A8 in presenza e assenza di Dox e con e senza DCA. (E) Le cellule epiteliali umane normali del colon e della mammella e le cellule tumorali del colon e della mammella sono state trattate con 5′-Azadc per 72 ore e la riattivazione dell’espressione di SLC5A8 è stata analizzata mediante analisi immunoblot. (F) Le cellule di controllo e quelle riattivate con SLC5A8 sono state trattate con DCA (1 mM), dopodiché l’entità dell’apoptosi è stata monitorata mediante analisi FACS.


Effetto del dicloroacetato sui livelli intracellulari di piruvato
Qual è il meccanismo responsabile dell’induzione dell’apoptosi da parte di SLC5A8/dicloroacetato nelle cellule tumorali? SLC5A8 è un trasportatore attivo per il dicloroacetato con un Kt di 36 ± 7μM. Pertanto, il composto si concentrerà nelle cellule tumorali se il trasportatore è espresso. Ciò spiegherebbe il requisito obbligatorio di SLC5A8 per basse concentrazioni di dicloroacetato per indurre l’apoptosi in queste cellule. Se il trasportatore non è espresso, le cellule potrebbero non accumulare il composto a livelli sufficienti per causare l’apoptosi. Una volta accumulato all’interno delle cellule tumorali, come agisce il dicloroacetato per indurre l’apoptosi? L’unico meccanismo d’azione noto del dicloroacetato è la sua capacità di attivare la PDC attraverso l’inibizione della PDK (Stacpoole et al., 1998, 2003, 2008). Ciò comporterebbe la stimolazione dell’ossidazione mitocondriale, la generazione di specie reattive dell’ossigeno, la depolarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale e l’induzione dell’apoptosi. L’attivazione della PDC da parte del dicloroacetato in cellule intatte diminuirebbe i livelli intracellulari di piruvato. Su questa base, abbiamo ipotizzato che il dicloroacetato diminuisca i livelli di piruvato nelle cellule tumorali e che l’effetto dipenda obbligatoriamente dall’espressione di SLC5A8. Abbiamo testato questa ipotesi in tre diverse linee cellulari tumorali (HT29, SW620 e HCT116) con e senza espressione esogena di SLC5A8 (Fig. 6). L’espressione del trasportatore di per sé non ha avuto alcun effetto sui livelli intracellulari di piruvato. Il dicloroacetato è stato in grado di diminuire i livelli di piruvato in misura significativa in tutte e tre le linee cellulari tumorali, ma solo quando il trasportatore era espresso. È interessante notare che anche il monocloroacetato ha avuto un effetto simile, sempre solo in presenza di SLC5A8; al contrario, il tricloroacetato e l’acetato non sono stati in grado di influenzare i livelli di piruvato.

Fig. 6. Effetto differenziale del dicloroacetato (DCA) sui livelli intracellulari di piruvato nelle cellule di cancro del colon e sua dipendenza da SLC5A8 Tre linee cellulari umane di cancro del colon (HT29, SW620, e HCT116) sono state trasfettate con il solo vettore o con il cDNA di SLC5A8 e poi coltivate in assenza o in presenza di acetato, monocloracetato (MCA), dicloroacetato (DCA) o tricloroacetato (TCA) per 48 ore. La concentrazione degli acidi grassi era di 1 mM. Le cellule sono state poi lisate e utilizzate per la determinazione del piruvato e delle proteine. I dati relativi al piruvato sono stati normalizzati con i livelli di proteine. (A) HT29; (B) SW620; (C) HCT116. *p < 0,05, **, p < 0,01 e ***, p < 0,001.


Finora l’unico meccanismo attraverso il quale SLC5A8 funziona come soppressore tumorale era la sua capacità di concentrare all’interno delle cellule butirrato e piruvato, che sono inibitori delle istone deacetilasi. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il dicloroacetato induce anche l’apoptosi nelle cellule tumorali e che l’effetto dipende dall’espressione di SLC5A8. Questi risultati sono simili a quelli ottenuti con il butirrato e il piruvato. Ci siamo quindi chiesti se l’inibizione delle istone deacetilasi fosse coinvolta nell’apoptosi indotta dal dicloroacetato nelle cellule tumorali. Questo sembra improbabile, tuttavia, perché l’acetato non è un inibitore delle istone deacetilasi (Thangaraju et al., 2006). Tuttavia, non potevamo escludere che il dicloroacetato potesse funzionare come inibitore delle istone deacetilasi. Pertanto, abbiamo esaminato l’influenza di acetato, monocloroacetato, dicloroacetato e butirrato sull’attività delle istone deacetilasi. In primo luogo, abbiamo utilizzato lisati di cellule SW620 come fonte di istone deacetilasi (Fig. 7A). Il butirrato è stato utilizzato come controllo positivo in questi esperimenti. Come previsto, il butirrato ha inibito l’attività delle istone deacetilasi. In condizioni identiche, il dicloroacetato era almeno 100 volte meno potente del butirrato nell’inibire le istone deacetilasi. Abbiamo quindi utilizzato isoforme ricombinanti di istone deacetilasi umana per determinare se isoforme specifiche dell’enzima potessero essere inibite dal dicloroacetato. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che il butirrato è un inibitore specifico delle isoforme di istone deacetilasi HDAC1 e HDAC3 (Thangaraju et al., 2009b). Nel presente studio, abbiamo riscontrato la stessa cosa con il butirrato (Fig. 7B). Anche il dicloroacetato ha inibito in misura significativa le isoforme HDAC1, HDAC2 e HDAC5, ma la potenza è stata molto bassa (~20% di inibizione a una concentrazione di 1 mM) (Fig. 7C). L’acetato (Fig. 7D) e il monocloroacetato (Fig. 7E) non hanno avuto alcun effetto su nessuna delle isoforme esaminate nello studio.

Fig. 7. Mancanza di effetto inibitorio sull’attività dell’istone deacetilasi (HDAC) da parte del dicloroacetato (DCA) (A) I lisati di cellule SW620 sono stati utilizzati come fonte di attività HDAC. I saggi sono stati eseguiti in assenza o in presenza di acetato, monocloroacetato (MCA), dicloroacetato (DCA) o butirrato alle concentrazioni indicate. (B-E) Inibizione delle isoforme HDAC ricombinanti umane da parte di butirrato, dicloroacetato, acetato e monocloroacetato. La concentrazione degli acidi grassi era di 1 mM. I dati sono presentati come percentuale dell’attività di controllo misurata in assenza degli acidi grassi. *p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Discussione

Dalla pubblicazione dell’articolo di Bonnet et al. su Cancer Cell (2007), che ha dimostrato che il dicloroacetato promuove l’apoptosi in linee cellulari tumorali in vitro e inibisce la crescita del cancro in xenotrapianti di topo in vivo, si è assistito a un costante aumento dell’interesse pubblico per la potenziale utilità di questo composto come farmaco antitumorale. Il dicloroaetato è stato utilizzato come farmaco per il trattamento dell’acidosi lattica congenita e pertanto sono stati elaborati i dettagli della farmacocinetica e del profilo di tossicità del farmaco (Stacpoole at al., 1998). La recente scoperta che il farmaco può essere utile anche nel trattamento del cancro ha spinto molti pazienti oncologici a utilizzare questo farmaco non approvato senza la raccomandazione del medico (Pearson, 2007). È interessante notare che non sono stati condotti studi clinici controllati per documentare l’efficacia terapeutica del dicloroacetato come farmaco antitumorale. Poiché la struttura del dicloroacetato non può essere brevettata, sembra che le aziende farmaceutiche non fossero interessate a sviluppare il farmaco per la terapia del cancro attraverso studi clinici, spingendo così il ricercatore principale della pubblicazione originale su Cancer Cell a raccogliere fondi per i propri piccoli studi clinici (Pearson, 2007). I risultati dello studio clinico sono stati pubblicati di recente (Machelakis et al., 2010) e hanno dimostrato che il farmaco è efficace nei pazienti con gliobastoma. Purtroppo, anche se il farmaco si è rivelato efficace in vivo nel trattamento del glioblastoma, per ottenere l’efficacia terapeutica è stato necessario utilizzare alte concentrazioni di farmaco, con conseguente neuropatia periferica. Questo è stato l’unico effetto collaterale indesiderato che ha limitato l’uso di dosaggi più elevati del farmaco per una maggiore efficacia terapeutica. Non è stata riscontrata alcuna evidenza di tossicità ematologica, epatica, renale o cardiaca. Diversi studi hanno documentato complicazioni neurologiche con dosi elevate di dicloroacetato negli animali e nell’uomo (Calcutt et al., 2009; Wiemer e Sachdev, 2009; Brandsma et al., 2010). Le complicazioni neurologiche si verificano solo a dosi molto elevate di dicloroacetato: 12.5 mg/kg/die per 3 mesi (Bonnet et al., 2007) o 15 mg/kg/die per 4 settimane (Brandsma et al., 2010). La necessità di dosi elevate di dicloroacetato per essere terapeuticamente efficace in vivo concorda con la maggior parte dei dati in vitro pubblicati di recente, che mostrano come siano necessarie concentrazioni pari o superiori a 10 mM per provocare l’apoptosi nelle linee cellulari tumorali (Stockwin et al., 2010; Madhok et al., 2010; Xiao et al., 2010; Heshe et al., 2010; Sun et al., 2010).
Esistono prove convincenti della capacità del dicloroacetato di invertire il fenotipo metabolico delle cellule tumorali e di promuoverne la morte, ma l’effetto antitumorale si manifesta solo a concentrazioni molto elevate sia in vitro che in vivo. Poiché a queste concentrazioni terapeuticamente efficaci si verifica una tossicità neurologica, l’utilità del composto come farmaco antitumorale è limitata nell’uomo. È interessante notare che l’unico bersaglio molecolare dell’attività antitumorale del dicloroacetato è la PDK, che viene inibita dal composto a concentrazioni micromolari (costante di inibizione, 50-100 μM) (Whitehouse et al., 1974; Cooper et al., 1974). Perché allora sono necessarie alte concentrazioni millimolari di dicloroacetato in vitro per uccidere le cellule tumorali? È necessario rispondere a questa domanda per poter sfruttare il potenziale di questo composto come farmaco antitumorale. I nostri studi forniscono una risposta soddisfacente a questa importante domanda. Le cellule tumorali non esprimono alcun sistema di trasporto in grado di trasferire efficacemente il composto dal mezzo extracellulare al suo bersaglio intracellulare. I trasportatori monocarbossilati espressi nelle cellule tumorali trasportano il dicloroacetato con un Kt di 0,6 mM (Jackson e Halestrap, 1996). Si tratta di un processo di trasporto a bassa affinità. Inoltre, i trasportatori di monocarbossilati non sono altamente concentrati. Inoltre, le cellule tumorali generano grandi quantità di lattato, che è anche un substrato per i trasportatori di monocarbossilato con un’affinità paragonabile a quella del dicloroacetato, causando così una competizione per il processo di trasporto. I presenti studi dimostrano che SLC5A8 trasporta il dicloroacetato con un’affinità notevolmente superiore a quella dei trasportatori di monocarbossilati (Kt: 36 μM contro 600 μM). Ancora più importante è il fatto che SLC5A8 è molto più efficace dei trasportatori monocarbossilati nel trasportare il dicloroacetato a causa dell’energia fornita al primo da un gradiente elettrochimico transmembrana di Na+. È interessante notare che l’affinità per il trasportatore cambia drasticamente con la clorazione del secondo carbonio nell’acetato (Kt: 1572 ± 101 μM per l’acetato; 177 ± 16 μM per il monocloroacetato; 36 ± 7 μM per il dicloroacetato; 134 ± 11 μM per il tricloroacetato). I nostri risultati ci portano a concludere che le cellule tumorali sono resistenti all’apoptosi indotta dal dicloroacetato perché queste cellule non possiedono sistemi di trasporto efficaci per il farmaco. Questo è il motivo più probabile per cui sono necessarie concentrazioni molto elevate del composto per indurre la morte cellulare nelle cellule tumorali. È anche possibile che la morte cellulare osservata nelle cellule tumorali a queste alte concentrazioni non sia dovuta all’attivazione della PDC, perché effetti simili si osservano anche nelle cellule normali (Stockwin et al., 2010).
Nel presente studio abbiamo dimostrato che, se SLC5A8 è espresso nelle cellule tumorali, il dicloroacetato induce la morte cellulare a una concentrazione relativamente bassa (1 mM) in modo selettivo per le cellule tumorali. In condizioni identiche, le cellule normali (CCD841 e MCF10A) non vengono colpite. La resistenza delle cellule normali al dicloroacetato non è dovuta all’assenza di un sistema di trasporto del farmaco. Le cellule normali esprimono SLC5A8 in modo costitutivo e abbiamo dimostrato che non vanno incontro ad apoptosi con o senza l’espressione aggiuntiva del trasportatore. Ciò conferma l’effetto specifico del dicloroacetato sulle cellule tumorali. I nostri studi hanno anche dimostrato che l’efficacia del dicloroacetato come induttore di apoptosi si manifesta non solo con linee cellulari di cancro del colon, ma anche con linee cellulari di cancro della mammella e della prostata. Il meccanismo della morte cellulare indotta dal dicloroacetato nelle cellule tumorali è dovuto principalmente all’attivazione dell’ossidazione mitocondriale del piruvato. Ciò è supportato dai risultati che i livelli intracellulari di piruvato nelle cellule tumorali diminuiscono in risposta al trattamento con dicloroacetato in modo dipendente da SLC5A8, suggerendo che l’ingresso concentrativo del farmaco nelle cellule tumorali mediato da SLC5A8 espresso in modo esogeno è responsabile di questo effetto. Il dicloroacetato non inibisce le istone deacetilasi, il che esclude l’inibizione delle istone deacetilasi come potenziale meccanismo di apoptosi nelle cellule tumorali indotte dal composto.
La scoperta che il dicloroacetato induce la morte cellulare in modo selettivo nelle cellule tumorali a basse concentrazioni, ma solo se SLC5A8 è espresso, ha un significato clinico e terapeutico. La capacità del dicloroacetato di attivare la PDC attraverso l’inibizione della PDK nelle cellule tumorali fornisce una base meccanicisticamente razionale per l’attività antitumorale del composto. Tuttavia, le cellule tumorali sono resistenti al farmaco a causa dell’assenza di un trasportatore efficace per il farmaco, rendendo necessarie alte concentrazioni del composto per indurre la morte cellulare, il che purtroppo causa effetti collaterali dannosi come la neuropatia. Nel presente studio abbiamo dimostrato che SLC5A8 funge da trasportatore attivo per il dicloroacetato. Tuttavia, poiché l’espressione del trasportatore è silenziata nelle cellule tumorali, come possono i risultati attuali essere rilevanti per il potenziale uso terapeutico del farmaco? Il silenziamento di SLC5A8 nelle cellule tumorali avviene attraverso meccanismi epigenetici che coinvolgono la metilazione del DNA; il trattamento delle cellule tumorali con 5′-azacitidina, un inibitore della metilazione del DNA, riattiva l’espressione del gene (Li et al., 2003; Ueno et al., 2004; Hong et al., 2005; Porra et al., 2005; Thangaraju et al., 2006; Park et al., 2007, 2008). La metilazione del DNA svolge un ruolo critico nel silenziamento dei geni soppressori del tumore in diversi tipi di cancro e gli inibitori della metilazione del DNA sono promettenti come farmaci antitumorali (Baylin, 2005). Due composti con attività di inibizione della metilazione del DNA sono in uso clinico per il trattamento di neoplasie ematologiche. Si tratta della 5′-aza-2′-deossicitidina, nota anche come decitabina (nome commerciale Dacogen) e della 5′-azacitidina (nome commerciale Vidaza). Studi in vitro hanno dimostrato che il trattamento di diverse linee cellulari tumorali con questi composti riattiva l’espressione di SLC5A8. Si ipotizza che lo stesso fenomeno si verifichi anche in vivo. Pertanto, la combinazione di un inibitore della metilazione del DNA e del dicloroacetato è probabilmente efficace per il trattamento del cancro, perché l’inibitore della metilazione del DNA indurrebbe l’espressione di SLC5A8 nei tumori, che trasporterebbe efficacemente il dicloroacetato nelle cellule tumorali per ottenere la sua attività antitumorale. Questa modalità di trattamento ridurrebbe notevolmente la concentrazione di dicloroacetato necessaria per l’efficacia in vivo come agente antitumorale, fornendo così potenzialmente una selettività tumorale ed evitando anche gli effetti collaterali dannosi come la neuropatia. I risultati del presente studio forniscono una base razionale per tale terapia combinata.

Materiali e metodi

Materiali
Il [ 14C]-Nicotinato è stato acquistato da American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO). L’acetato e i suoi cloro derivati sono stati ottenuti da Sigma (St. Louis, MO). SLC5A8 è stato originariamente clonato dall’intestino umano (Miyauchi et al., 2004).
Sistema di espressione in ovociti di X. laevis
Il cRNA con cappuccio del cDNA umano di SLC5A8 (clonato in pGH19, un vettore di espressione in ovociti di X. laevis) è stato sintetizzato utilizzando il kit mMESSAGE-mMACHINE (Ambion, Austin, TX). Gli ovociti maturi di X. laevis sono stati isolati mediante trattamento con collagenasi A (1,6 mg/ml), defollicati manualmente e mantenuti a 18 °C in terreno di Barth modificato, integrato con 25 μg/ml di gentamicina. Gli ovociti sono stati iniettati con 50 ng di cRNA. Gli ovociti iniettati con acqua sono serviti come controllo. Gli studi elettrofisiologici sono stati eseguiti con il metodo del voltage-clamp a due microelettrodi. Gli ovociti sono stati perifusi con un tampone contenente NaCl (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), seguito dallo stesso tampone contenente acetato o suoi cloro derivati. Il potenziale di membrana è stato bloccato a -50 mV. Le differenze tra le correnti allo stato stazionario misurate in presenza e in assenza di substrati sono state considerate come correnti indotte dai substrati. Nell’analisi della cinetica di saturazione delle correnti indotte dal substrato, il parametro cinetico Kt (cioè la concentrazione di substrato necessaria per l’induzione della corrente dimezzata) è stato calcolato adattando l’equazione di Michaelis-Menten ai valori delle correnti indotte dal substrato. La cinetica di attivazione del Na+ delle correnti indotte dal substrato è stata analizzata misurando le correnti specifiche del substrato in presenza di concentrazioni crescenti di Na+. I dati delle correnti Na+-dipendenti sono stati analizzati secondo l’equazione di Hill per determinare il coefficiente di Hill (il numero di ioni Na+ coinvolti nel processo di attivazione). Poiché i livelli di espressione variavano significativamente da un oocita all’altro, le analisi cinetiche sono state effettuate normalizzando i livelli di espressione. A tale scopo, la corrente massimamente indotta specifica per SLC5A8 in ogni esperimento cinetico in singoli ovociti è stata considerata pari a 1. Ogni esperimento è stato ripetuto con 3 o 4 ovociti diversi. L’attività della SLC5A8 espressa eterologicamente negli ovociti è stata monitorata anche mediante l’assorbimento di [14C]-nicotinato. La concentrazione di nicotinato in questi esperimenti è stata di 50 μM e il tempo di incubazione è stato di 1 h.
Il protocollo per l’uso delle rane in questi esperimenti è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali.
Espressione ectopica di SLC5A8 in linee cellulari coltivate
Le cellule sono state seminate in piastre di coltura da 35 mm e coltivate in assenza di piruvato. Le cellule sono state trasfettate con pcDNA o con il cDNA di SLC5A8 umano utilizzando Fugene 6 e Opti-MEM. Per determinare l’efficienza della trasfezione è stato utilizzato pEGFP-N1 per la co-trasfezione. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con o senza acetato o suoi derivati clorurati (1 mM) per 24 ore. Per l’analisi FACS, le cellule sono state fissate in etanolo al 50%, trattate con citrato di sodio allo 0,1%, 1 mg/ml di RNasi A e 50 μg/ml di ioduro di propidio, quindi sottoposte ad analisi di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS; FACS Caliber, Becton Dickinson).
Generazione di linee cellulari stabili esprimenti SLC5A8
Abbiamo generato cloni stabili esprimenti SLC5A8 in due linee cellulari, MCF7e MDA-MB231, per esprimere in modo condizionale SLC5A8 ponendo il cDNA di SLC5A8 sotto il controllo del promotore dipendente da Tet (Tet-On Advanced, Clontech). Il sistema è dotato di due elementi, il vettore regolatore (pLVX-Tet-On Advanced) e il vettore di risposta (pLVX-Tight-Puro). In breve, il virus lenti ricombinante è stato prodotto per co-trasfezione in cellule 293FT del vettore regolatore (pLVX-Tet-On Advanced) e di altri tre vettori helper, pLP-1, pLP-2 e pVSVG (Invitrogen) utilizzando il reagente di trasfezione Lipofectamine 2000. Il surnatante virale Lenti è stato raccolto 72 ore dopo la trasfezione e filtrato attraverso una membrana da 0,45 μm. Le cellule MCF7 e MDA-MB231 sono state infettate per 24 ore con il virus lenti in terreno contenente 8 μg/ml di polibrene e coltivate per altre 48 ore. Le cellule sono state selezionate con G418 (2 mg/ml) e l’espressione della proteina rTet R è stata controllata con Western blot. SLC5A8 è stato subclonato in pLVX-Tight-Puro e SLC5A8 pLVX-Tight-Puro è stato trasdotto in cellule MCF7 e MDA-MB231 esprimendo la proteina rTetR con la stessa procedura descritta sopra. Le cellule sono state selezionate con 2 μg/ml di puromicina e mantenute in terreno contenente FBS privo di Tet, 0,25 μg/ml di puromicina e 250 μg/ml di G418. L’induzione dell’mRNA di SLC5A8 con l’aggiunta di doxiciclina è stata confermata mediante RT-PCR.
Riattivazione dell’espressione di SLC5A8 mediante l’agente demetilante del DNA
Le cellule sono state seminate in piatti da 10 cm a densità molto bassa (0,5 ×106 cellule/piatto) e coltivate nel rispettivo terreno di coltura senza sodio piruvato. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con 5′-Azadc (2 μg/ml) per 72 ore. Il terreno è stato sostituito con terreno fresco contenente 5′-Azadc ogni 24 ore. Dopo il trattamento con 5′-Azadc, le cellule sono state trattate con DCA (1 mM) per 48 ore. Dopo il trattamento, le cellule sono state raccolte e trattate per l’estrazione delle proteine e per l’analisi FACS.
Trascrizione inversa-PCR
L’RNA preparato da linee cellulari normali e tumorali è stato utilizzato per la RT PCR semiquantitativa. L’RNA (2 μg) è stato trascritto in reverse-transcript in cDNA utilizzando il sistema GeneAmp PCR (Roche). I primer PCR per i geni specifici sono stati progettati sulla base delle sequenze nucleotidiche disponibili in GenBank. La trascrizione inversa-PCR (RT-PCR) è stata ripetuta due volte con ciascun campione di RNA. La GAPDH (Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) è stata utilizzata come controllo interno.
Analisi Western blot
Cinquanta microgrammi di proteine sono stati frazionati mediante SDS-PAGE e le proteine frazionate sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Whatman GmbH). Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte secco non grasso e quindi esposte all’anticorpo primario anti-SLC5A8 (Cat. # ARP44110, Aviva System Biology) a 4 °C per una notte, seguita dal trattamento con anticorpi secondari appropriati. Le proteine sono state visualizzate mediante ECL SuperSignal Western System (GE Healthcare).
Analisi dell’apoptosi
Le cellule sono state fissate in etanolo al 50%, trattate con citrato di sodio allo 0,1%, 1 mg/mL di RNasi A e 50 μg/mL di ioduro di propidio e sottoposte all’analisi del cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS, Becton Dickinson).
Misurazione dell’attività HDAC
Per determinare l’attività HDAC è stato utilizzato un kit disponibile in commercio (Biovision, Mountain View, CA). Quando il lisato cellulare della linea cellulare di cancro del colon SW620 è stato utilizzato come fonte di attività HDAC, 100 μg di proteine del lisato sono stati aggiunti al saggio enzimatico in presenza o in assenza di acetato o dei suoi derivati clorurati (1 mM). L’attività delle isoforme umane ricombinanti di HDAC è stata misurata utilizzando lo stesso kit. Le isoforme HDAC ricombinanti sono state acquistate dalla Cayman Chemical Company.

Misurazione dei livelli intracellulari di piruvato

Le cellule sono state seminate in piastre di coltura da 35 mm e coltivate in assenza di piruvato. Le cellule sono state trasfettate con pcDNA o cDNA di SLC5A8 umano utilizzando Fugene 6 e Opti-MEM. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con o senza acetato o suoi derivati clorotici (1 mM) per 24 ore. I lisati cellulari sono stati quindi utilizzati per la misurazione del piruvato utilizzando un kit disponibile in commercio (Biovision, Mountain View, CA).

Ringraziamenti

Il lavoro qui descritto è sostenuto in parte dalla sovvenzione CA131402 del National Institutes of Health.

RIFERIMENTI


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