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Nathan Patrick Ward


Approvato: 7 novembre 2016

Abstract

Il robusto metabolismo glicolitico dei glioblastomi multiformi (GBM) li ha resi suscettibili agli aumenti del metabolismo ossidativo indotti dal piruvato mimetico dicloroacetato (DCA). Rapporti recenti dimostrano che il farmaco antidiabetico metformina aumenta lo stress ossidativo dannoso associato al trattamento con DCA nelle cellule tumorali. Abbiamo cercato di chiarire il ruolo della segnalata attivit√† della metformina come inibitore del complesso I mitocondriale nel potenziamento della citotossicit√† del DCA nel modello VM-M3 di GBM. Abbiamo dimostrato che la metformina potenziava la produzione di superossido indotta dal DCA e che ci√≤ era necessario per una maggiore citotossicit√† nei confronti delle cellule VM-M3 con la combinazione. Allo stesso modo, il rotenone ha potenziato lo stress ossidativo derivante dal trattamento con DCA e anche questo √® stato necessario per l’aumento della citotossicit√† osservato. L’attivazione dell’adenosina monofosfato chinasi (AMPK) non √® stata osservata con la concentrazione di metformina necessaria per aumentare l’attivit√† del DCA. Inoltre, l’aggiunta di un attivatore dell’AMPK non ha aumentato la citotossicit√† del DCA, mentre un inibitore dell’AMPK ha aumentato la citotossicit√† della combinazione. Dimostriamo inoltre che il DCA e la metformina riducono la carica tumorale e prolungano la sopravvivenza nei topi affetti da tumore VM-M3 come terapie individuali. A differenza del nostro lavoro in vitro, non abbiamo osservato una sinergia tra DCA e metformina in vivo. I nostri dati indicano che l’aumento della citotossicit√† del DCA da parte della metformina dipende dall’inibizione del complesso I. In particolare, l’inibizione del complesso I non √® stata in grado di stimolare l’attivit√† del DCA. In particolare, l’inibizione del complesso I coopera con l’induzione dell’ossidazione del glucosio da parte del DCA per aumentare lo stress ossidativo citotossico nelle cellule VM-M3 GBM. Questo lavoro supporta ulteriori indagini e l’ottimizzazione della combinazione DCA/metformina come potenziale terapia combinata pro-ossidante per il GBM.


Parole chiave: Metabolismo del cancro, ossidazione mitocondriale del glucosio, inibizione del complesso I, stress ossidativo, DCA, metformina

Copyright © 2017, Nathan P. Ward


METABOLISMO DEL CANCRO

Sinossi del capitolo

Qui forniamo una revisione dei programmi metabolici impiegati dai tumori per soddisfare i requisiti biosintetici della tumorigenesi. Il metabolismo dei tumori è strettamente legato alle caratteristiche della malattia e fornisce alle cellule tumorali un vantaggio di sopravvivenza in risposta agli stress imposti dal microambiente tumorale. La comprensione delle caratteristiche metaboliche dei tumori fornisce una base per un intervento razionale su queste dipendenze metaboliche come strategia terapeutica. In questo capitolo vengono discussi anche gli approcci attuali per colpire il metabolismo del cancro.

Metabolismo energetico alterato

Il cancro è tradizionalmente considerato una malattia genetica, caratterizzata da instabilità genomica e frequenti mutazioni che cooperano per promuovere un ambiente cellulare distinto che consente una proliferazione sfrenata (1). Il sequenziamento genomico dei tumori ha identificato una moltitudine di mutazioni bersaglio di farmaci che hanno guidato la ricerca e lo sviluppo farmaceutico. Purtroppo, la promessa di risultati preclinici incoraggianti non si è spesso tradotta in efficacia clinica. Ciò ha spinto il settore a considerare ulteriori caratteristiche dello sviluppo del tumore e della progressione della malattia e a ideare strategie alternative per la gestione del cancro (1).

Da questa iniziativa √® scaturito un rinnovato apprezzamento per la distinta attivit√† metabolica dei tumori (2). Oltre alla disregolazione del ciclo cellulare e alla perdita del controllo di qualit√† dell’acido desossiribonucleico (DNA) che accompagnano la proliferazione delle cellule tumorali, c’√® una richiesta fondamentale di biomassa. Un’intricata rete di vie metaboliche converge per generare i mattoni molecolari necessari alla biosintesi (3). Il metabolismo delle cellule tumorali √® cablato in modo tale da consentire la produzione continua di nucleotidi, proteine e membrane lipidiche necessarie per la proliferazione, generando al contempo l’energia e il potenziale di riduzione necessari per la sopravvivenza cellulare (4). L’ultimo decennio di ricerca sul metabolismo del cancro ha comportato una rinascita metodologica per caratterizzare le dipendenze metaboliche delle cellule tumorali e l’intersezione tra metabolismo e biologia tumorale (5-8). Soprattutto, questo lavoro ha dimostrato che puntare sul metabolismo del cancro pu√≤ essere un’alternativa terapeutica sostenibile per la gestione di questa devastante malattia.

Fermentazione aerobica
La nozione di metabolismo peculiare nel cancro non √® un fenomeno recente. Otto Warburg ha osservato per la prima volta una netta differenza nel metabolismo dei tumori rispetto ai tessuti normali all’inizio del XX secolo (9). Warburg rifer√¨ che i tumori assumevano una quantit√† di glucosio circolante significativamente maggiore rispetto al tessuto normale e che, mentre il lattato generato dal tessuto normale era molto scarso, Warburg calcol√≤ che il 66% del glucosio consumato veniva convertito in lattato dal tumore. Ci√≤ suggerisce che i tumori fermentavano prevalentemente il glucosio piuttosto che respirare con lo zucchero.

Il glucosio √® il metabolita energetico predominante nell’organismo e viene metabolizzato preferenzialmente dalla maggior parte dei tessuti. Quando entra nella cellula, il glucosio viene metabolizzato in piruvato attraverso la via di Embden-Meyerhof, o via glicolitica. In genere, il piruvato viene importato nei mitocondri dove viene completamente ossidato ad anidride carbonica (CO2) finch√© l’ossigeno, l’accettore finale di elettroni della catena di trasporto degli elettroni, non √® limitante. In condizioni fisiologiche normali, i tessuti sono adeguatamente perfusi, il che facilita l’apporto di ossigeno e consente la respirazione mitocondriale del glucosio. In un contesto di limitazione dell’ossigeno, come nel muscolo durante un esercizio fisico vigoroso, il piruvato viene fermentato in lattato dalla lattato deidrogenasi (LDH).

L’aspetto notevole dei risultati di Warburg √® che i tumori erano ben perfusi e quindi l’ossigeno non era limitato (9). Pertanto, i tumori fermentavano preferenzialmente il piruvato in lattato in un ambiente aerobico. Questa fermentazione aerobica del glucosio √® oggi ampiamente riconosciuta come un fenotipo caratteristico della maggior parte dei tumori ed √® ora definita effetto Warburg (10). Infatti, la robusta captazione di glucosio da parte dei tumori √® alla base della tomografia a emissione di positroni con fluorodesossiglucosio (FDG-PET) (11).

La dipendenza dal metabolismo glicolitico sembra controintuitiva per una robusta proliferazione da una prospettiva bioenergetica. La generazione della biomassa necessaria per la divisione cellulare dipende in parte dall’energia potenziale immagazzinata nell’adenosina trifosfato (ATP), un sottoprodotto di alcune reazioni cataboliche. La glicolisi √® piuttosto inefficiente dal punto di vista energetico, generando solo 2 moli di ATP per mole di glucosio, mentre l’ossidazione completa del glucosio produce circa 36 moli di ATP per mole di glucosio. Tuttavia, le cellule tumorali che presentano questo metabolismo di Warburg non soffrono di un deficit di ATP (12). La conversione del piruvato in lattato da parte della LDH √® accoppiata all’ossidazione del nicotinammide adenina dinucleotide ridotto (NADH) nella sua forma ossidata, NAD+ . La rigenerazione del NAD+ mantiene un elevato rapporto NAD+/NADH citosolico che consente un rapido flusso glicolitico, poich√© l’enzima gliceraldeide fosfato deidrogenasi (GAPDH) richiede il NAD+ come cofattore.

Metabolismo mitocondriale
Sulla base della sua osservazione originale, Warburg ipotizz√≤ che la fermentazione aerobica nei tumori fosse il risultato di un insulto irreversibile alla capacit√† ossidativa che impediva alle cellule tumorali di ricavare energia sufficiente dal metabolismo ossidativo (13). L’evidenza suggerisce che la produzione di ATP non √® una funzione necessaria dei mitocondri tumorali, tuttavia il metabolismo mitocondriale √® fondamentale per la proliferazione delle cellule tumorali (14). In linea di principio, l’abbondante generazione di lattato come risultato dell’effetto Warburg potrebbe limitare il flusso di piruvato nei mitocondri, dove viene prontamente metabolizzato in acetil coenzima A (acetil-CoA) e CO2 attraverso il complesso della piruvato deidrogenasi (PDH).

L’acetil-CoA √® un vettore critico di carbonio che viene ampiamente utilizzato nel metabolismo centrale del carbonio. L’acetil-CoA √® necessario per il flusso continuo del ciclo dell’acido citrico (TCA), che genera gli equivalenti riducenti NADH e la flavina adenina dinucleotide ridotta (FADH2). Questi equivalenti riducenti sono ossidati da complessi proteici presenti o associati alla membrana mitocondriale interna (IMM) in reazioni che accoppiano il rilascio di elettroni con il movimento di protoni (H+ ) dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana. Anche il movimento di questi elettroni attraverso i complessi proteici successivi, che costituiscono complessivamente la catena di trasporto degli elettroni (ETC), √® accoppiato al movimento di H+ attraverso l’IMM. La traslocazione di questi H+ genera una forza motrice protonica e un potenziale di membrana attraverso l’IMM. L’ATP sintasi sfrutta questa forza motrice protonica per accoppiare il movimento di H+ nella matrice con la generazione di ATP dall’adenina difosfato (ADP) e dal fosfato inorganico (Pi).

Oltre a fornire gli equivalenti riducenti per la fosforilazione ossidativa, gli intermedi del ciclo TCA sono importanti per la biosintesi di macromolecole critiche. Un flusso ridotto di glucosio-carbonio attraverso il complesso PDH limiterebbe quindi il ciclo TCA e diminuirebbe i livelli di intermedi del ciclo TCA. Le cellule tumorali, soprattutto in coltura, hanno aumentato il metabolismo della glutammina per compensare i deficit nel flusso di glucosio-carbonio attraverso il ciclo TCA (15). La glutammina √® un aminoacido anaplerotico che viene convertito in glutammato nei mitocondri dalla glutaminasi (GS). Il glutammato pu√≤ poi essere deaminato a ‚ćļ-chetoglutarato (‚ćļ-KG), un intermedio del ciclo TCA. il ‚ćļ-KG pu√≤ quindi contribuire al rifornimento degli intermedi successivi attraverso il flusso tradizionale del ciclo o essere convertito nel metabolita a monte, l’isocitrato, attraverso la carbossilazione riduttiva mediata dall’isocitrato deidrogenasi 2 (IDH2).

In alcune specie tumorali, gli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) leucina e valina possono essere utilizzati come substrati anaplerotici (5). Inoltre, il carbonio del glucosio pu√≤ entrare nel ciclo TCA in modo indipendente dalla PDH attraverso la piruvato carbossilasi (PC), che converte il piruvato citosolico in ossalacetato. L’ossalacetato viene poi convertito in malato attraverso la malato deidrogenasi (MDH). Il malato pu√≤ essere portato nei mitocondri attraverso la navetta malato-aspartato e incorporato nel ciclo TCA. Insieme, queste vie forniscono mezzi alternativi per mantenere la funzione TCA.

L’avvento della tracciabilit√† dei metaboliti marcati con isotopi ha dimostrato che la fermentazione aerobica non limita completamente l’ossidazione del glucosio, anzi, la tracciabilit√† del flusso metabolico del 13C-glucosio mostra una fermentazione e un’ossidazione concomitanti del carbonio del glucosio in alcuni tumori (16). Il metabolismo energetico cellulare dipende dal movimento regolato di elettroni tra intermedi metabolici e cofattori enzimatici attraverso una serie di reazioni di ossidoriduzione (redox). Recenti evidenze suggeriscono che l’ossidazione mitocondriale √® fondamentale per la proliferazione cellulare indipendentemente dalla generazione di ATP.

La stimolazione dell’attivit√† dell’ETC attraverso l’ossidazione degli equivalenti riducenti promuove l’equilibrio redox attraverso la rigenerazione di NAD+ e di flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD+ ), che sono accettori di elettroni critici. Gli accettori di elettroni sono necessari per un flusso metabolico continuo, soprattutto nel contesto di soddisfare le richieste biosintetiche di una rapida proliferazione (17). L’ossigeno funge da accettore terminale di elettroni nel metabolismo ossidativo e la riduzione dell’ossigeno √® considerata l’aspetto pi√Ļ vitale del metabolismo ossidativo mitocondriale per le cellule proliferanti (18). √ą stato dimostrato che anche l’amminoacido aspartato funge da accettore di elettroni essenziale per la proliferazione (17, 18).

Il mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale (őĒő®m) dipende generalmente dal flusso continuo e regolato di elettroni attraverso l’ETC derivante dal metabolismo ossidativo. La conservazione del őĒő®m √® fondamentale per la capacit√† proliferativa delle cellule, indipendentemente dal suo accoppiamento con la produzione di ATP (19). Infatti, i mitocondri del cancro sono spesso iperpolarizzati, il che suggerisce un flusso inefficiente di H+ verso la matrice ai fini della generazione di ATP (20).

Oltre al glucosio, gli acidi grassi possono servire come substrato per il metabolismo ossidativo mitocondriale. La beta-ossidazione degli acidi grassi (FAO) produce acetil-CoA, che viene incorporato nel ciclo TCA, e NADH e FADH2 per il trasporto di elettroni e la potenziale generazione di ATP. √ą dimostrato che la FAO √® essenziale per la sopravvivenza e la crescita in condizioni di stress metabolico (21). Alcune neoplasie ematopoietiche presentano un aumento della FAO (22, 23). Il linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) sembra dipendere in larga misura dalla FAO per mantenere i livelli di ATP cellulare. Mentre le cellule leucemiche spesso mostrano una maggiore FAO, associata alla prevenzione dell’accumulo tossico di acidi grassi (21). Inoltre, alcune cellule leucemiche richiedono la FAO per mantenere l’equilibrio redox citosolico sotto forma di generazione di nicotinammide adenina dinucleotide fosfato ridotto (NADPH) dipendente dal citrato.

Mantenimento dell’equilibrio redox
Come gi√† detto, il metabolismo cellulare dipende dal movimento coordinato degli elettroni attraverso i metaboliti intermedi e dallo stato di ossidazione di importanti trasportatori di elettroni. Le cellule sfruttano il potere riducente di NADH e NAPDH per le reazioni cataboliche e biosintetiche necessarie alla crescita e alla vitalit√†. I rapporti NAD+ /NADH e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato ossidato (NADP+ )/NADPH sono indicatori dello stato redox della cellula. Il flusso metabolico e l’attivit√† degli enzimi metabolici bidirezionali dipendono dallo stato di questi rapporti. Lo stato redox della cellula √® compartimentato all’interno degli organelli, in quanto esistono meccanismi metabolici distinti per la regolazione di NAD+ /NADH e NADP+/NADPH, ad esempio nel citosol e nella matrice mitocondriale. Tuttavia, questi non sono completamente indipendenti l’uno dall’altro, poich√© esistono meccanismi di scambio di metaboliti tra i compartimenti che facilitano le alterazioni di questi rapporti.

Il mantenimento del rapporto NAD+/NADH è prevalentemente mediato nel citosol attraverso la glicolisi e attraverso il ciclo TCA nella matrice mitocondriale. Come già accennato, le cellule tumorali presentano una maggiore attività della LDH, che ricicla il NADH generato dalla glicolisi in NAD+, facilitando il rapido flusso glicolitico associato al metabolismo di Warburg (4). Il trasferimento del piruvato tra il citosol e la matrice collega i pool NAD+/NADH dei due compartimenti ed è strettamente regolato nel cancro (24).

Il NADPH fornisce il potere riducente per la biosintesi ed √® un componente critico della capacit√† antiossidante cellulare, entrambi aspetti che saranno discussi in modo approfondito pi√Ļ avanti in questa rassegna. Il NADPH citosolico √® generato attraverso due reazioni enzimatiche nella via del pentoso fosfato (PPP), attraverso la conversione del malato in piruvato da parte dell’enzima malico (ME) e l’ossidazione dell’isocitrato in ‚ćļ-KG da parte di IDH1. Lo scambio di citrato tra la matrice e il citosol collega i pool di NADPH dei due compartimenti. √ą stato dimostrato che la carbossilazione riduttiva della glutammina contribuisce ai pool citosolici di NADPH attraverso il citrato, che pu√≤ essere metabolizzato in ossalacetato dalla citrato liasi e successivamente in malato tramite MDH. Infine, il malato derivato dal citrato viene convertito in piruvato dalla ME, generando NADPH (25, 26). il tracciamento della 13C-glutammina ha dimostrato che una frazione significativa del NADPH mitocondriale deriva dal metabolismo dei folati (27, 28). Ulteriori fattori che contribuiscono al pool di NADPH della matrice sono IDH2 e l’enzima nicotinammide nucleotide transidrogenasi (NNT), che sfrutta la forza motrice protonica attraverso l’IMM e il potere riducente del NADH per generare NADPH.

Lo stato redox cellulare √® influenzato anche dallo stress ossidativo, un sottoprodotto naturale del metabolismo. Lo stress ossidativo √® causato dalla generazione di specie altamente reattive contenenti radicali liberi dell’ossigeno o dell’azoto (ROS, RNS) che svolgono una serie di funzioni biologiche, sia di sostegno alle cellule che citotossiche. Ad esempio, il trasporto di elettroni non √® un processo totalmente efficiente. Gli elettroni possono essere rilasciati prematuramente dall’ETC per ridurre l’ossigeno molecolare in anione superossido (-O2 – ). Questo avviene sul lato matrice dell’IMM a livello del complesso I (NADH deidrogenasi) e del complesso II (succinato deidrogenasi) dell’ETC. Inoltre, -O2 – pu√≤ essere generata sia sul lato della matrice che su quello dello spazio intermembrana (IMS) dell’IMM in corrispondenza del complesso III (coenzima Q: citocromo c ossidoreduttasi). -L’O2 pu√≤ essere generato anche nel citosol e nella matrice attraverso un processo NADPH-dipendente catalizzato dalle NADPH ossidasi (NOX).

In presenza di ossido nitrico (NO), un sottoprodotto del metabolismo dell’arginina, il superossido contribuisce alla formazione dello ione perossinitrito (ONOO- ), molto reattivo. Inoltre, questo -O2- pu√≤ essere dismesso a perossido di idrogeno (H2O2) dalle superossido dismutasi (SOD). L’H2O2 pu√≤ essere successivamente detossificato in acqua attraverso una serie di sistemi enzimatici. Le perossidossine (PRX) subiscono un’ossidazione mediata dall’H2O2 che avvia un ciclo catalitico in cui la tioredoxina (TRX), la tioredoxina reduttasi (TrxR) e il NADPH cooperano per rigenerare le PRX ridotte. Le glutatione perossidasi (GPX) utilizzano il glutatione ridotto (GSH) per detossificare l’H2O2. La glutatione reduttasi utilizza poi il NADPH per convertire il glutatione ossidato (GSSG) in GSH. Infine, anche la catalasi pu√≤ convertire l’H2O2 in acqua. In alternativa, in presenza di ioni ferrosi (Fe2+) o rameici (Cu+ ), l’H2O2 pu√≤ generare radicali idrossilici (-OH) attraverso le reazioni di Fenton.

Collettivamente, questi enzimi detossificanti contribuiscono alla capacit√† antiossidante della cellula, che impedisce l’accumulo di radicali liberi che potenziano lo stress ossidativo. La regolazione trascrizionale di questi enzimi √® controllata dal regolatore principale della macchina antiossidante cellulare, il fattore nucleare simile a 2 (Nrf2). L’attivit√† di Nrf2 √® stimolata dallo stress ossidativo, con conseguente upregulation di una serie di enzimi detossificanti e un programma metabolico che potenzia la capacit√† antiossidante. L’equilibrio tra la generazione di ROS e RNS e la detossificazione antiossidante influenza notevolmente la funzione e la vitalit√† delle cellule ed √® una componente critica della tumorigenesi (29).

Conseguenze del metabolismo tumorale

I tumori sono una popolazione eterogenea di cellule sottoposte a forti pressioni di selezione che determinano una risposta evolutiva. Le mutazioni acquisite durante la tumorigenesi devono conferire un vantaggio di sopravvivenza o permettere passivamente una proliferazione sfrenata (1, 2). I tumori sono soggetti ai vincoli della selezione naturale e le mutazioni che riducono la fitness delle cellule tumorali sono in ultima analisi selezionate contro (30). Dato che l’alterazione del metabolismo cellulare √® un segno distintivo costante del cancro, deve esserci un vantaggio di sopravvivenza associato al metabolismo delle cellule neoplastiche. In questa sede, descrivo le conseguenze del metabolismo del cancro che forniscono un vantaggio di sopravvivenza alle cellule tumorali e contribuiscono alla progressione della malattia.

RIFERIMENTI


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