ūüďĖ 16 mins.

Gulsah ALBAYRAK1, Ece KONAC1, Umit Akin DERE2, Hakan EMMEZ2

1 Università Gazi, Facoltà di Medicina, Dipartimento di Biologia Medica e Genetica, Ankara, Turchia
2 Università Gazi, Facoltà di Medicina, Dipartimento di Neurochirurgia, Ankara, Turchia


Corrispondenza: Ece KONAC; E-mail: [email protected]

Ricevuto: 16 gennaio 2020
Accettato: 3 luglio 2020
Pubblicato: 29 dicembre 2020

Abstract

OBIETTIVO: indagare gli effetti di metformina, dicloroacetato (DCA) e memantina sulle cellule di glioblastoma umano (GBM) T98G e U87-MG per colpire il metabolismo delle cellule tumorali in modo multidirezionale.
MATERIALI e METODI: i livelli IC50 di metformina, DCA, metformina+DCA e memantina sono stati determinati mediante saggio MTT in cellule T98G e U87-MG in vitro. Le espressioni delle proteine Casp3, Bcl-2, Bax, c-Myc e GSK-3B sono state analizzate dopo i trattamenti. Quindici tessuti tumorali GBM+ sono stati valutati per i modelli di espressione delle proteine apoptotiche Casp-3, Bcl-2, Bad, Bax.
RISULTATI: i farmaci contro il metabolismo delle cellule tumorali metformina, DCA, metformina+DCA e memantina hanno indotto citotossicit√† in modo dose-dipendente nelle cellule T98G e U87-MG. L’IC50 per la memantina √® risultata pari a 0,5 mM (p<0,01), una concentrazione quasi 10 volte inferiore a quella della metformina. Quindici tessuti tumorali GBM+ presentavano espressioni proteiche apoptotiche differenti.
CONCLUSIONE: la memantina ha esercitato un meccanismo d’azione antitumorale nelle cellule T98G e U87-MG, tuttavia tale meccanismo richiede un’indagine pi√Ļ approfondita per il trattamento del GBM.


Parole chiave: Glioblastoma, Cellule tumorali, Metabolismo, Metformina, Dicloroacetato, Memantina
DOI: 10.5137/1019-5149.JTN.29176-20.3


INTRODUZIONE

Il glioblastoma (GBM) √® uno dei tumori pi√Ļ aggressivi del sistema nervoso centrale e rappresenta circa il 50% di tutti i tipi di tumore gliale [12,27]. Il tasso di sopravvivenza mediana dei pazienti affetti da GBM non cambia signicantly utilizzando gli attuali trattamenti standard di cura, che prevedono la resezione del tumore seguita da radioterapia e trattamento con Temozolomide. La sopravvivenza mediana √® di circa 12-14 mesi nonostante l’uso combinato di chirurgia, radioterapia e chemioterapia [7,23].

I tumori GBM presentano un’ampia gamma di variazioni genetiche che portano a dierent risposte terapeutiche [5,9,21]. L’etero-geneit√† intratumorale potrebbe essere la chiave per identificare la causa del fallimento del trattamento [22]. I farmaci chemioterapici, come la temozolamide, aumentano il carico mutazionale all’interno del genoma del tumore rispetto alle cellule di GBM non trattate [17]. Per questo motivo, sono urgentemente necessari approcci terapeutici alternativi nel trattamento del GBM.

La metformina √® un comune farmaco antidiabetico utilizzato nel trattamento del diabete di tipo 2 [18]. Il trattamento con metformina √® associato a un minor rischio di diversi tipi di cancro, ma i suoi effetti sul GBM non sono stati ben caratterizzati [4,24]. Il trattamento con metformina riduce la resistenza alla temozolomide nelle cellule di GBM [26]. La metformina, tuttavia, presenta problemi di sicurezza in ambito clinico, poich√© la maggior parte dei lavori preclinici ha utilizzato dosi sovrafisiologiche di metformina [25]. In questo studio abbiamo cercato di superare questa sfida studiando l’effetto della metformina combinandola con il dicloroacetato (DCA), che ha come bersaglio il metabolismo delle cellule tumorali attraverso l’inibizione della piruvato deidrogenasi chinasi [11]. Puntare sul metabolismo delle cellule tumorali potrebbe avere implicazioni per il trattamento del GBM aggressivo. Inoltre, abbiamo cercato di studiare i profili di espressione delle proteine apoptotiche per comprendere meglio il GBM a livello molecolare. Abbiamo anche cercato di interferire con il metabolismo delle cellule tumorali utilizzando metformina, DCA e memantina nelle linee cellulari di GBM T98G e U87-MG.

Materiali e metodi

Coltura cellulare e sostanze chimiche
Le linee cellulari di glioblastoma umanoT98Ge U87-MG sono state fornite dall’ATCC. Le cellule T98G e U87-MG sono state coltivate in terreno DMEM/F12 integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Le cellule sono state coltivate in un incubatore al 5%di CO2 a 37¬į C. Metformina, dicloroacetato e memantina sono stati forniti da SigmaAldrich, St Louis, MO, USA. Le cellule sono state trattate con questi agenti per 48 ore per determinare i livelli di IC50. Tutti gli agenti sono stati disciolti in acqua distillata sterile.

Saggio di citotossicità cellulare
3X103
cellule T98G e U87-MG sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e coltivate per una notte. Nel saggio MTT sono state utilizzate diverse concentrazioni di metformina, DCA e memantina. √ą stata aggiunta la soluzione di MTT (5 mg/ml in PBS) e le cellule sono state ulteriormente incubate per 4 ore a 37¬įC. √ą stato aggiunto DMSO per solubilizzare i cristalli. Il rapporto di assorbanza √® stato misurato con SpectraMax M3 (Molecular Devices, USA)

Campioni di pazienti affetti da GBM e isolamento di proteine da tessuti tumorali
Un totale di 17 campioni di tessuto tumorale di GBM sono stati raccolti dall’Universit√† di Gazi, Dipartimento di Neurochirurgia, nel periodo aprile 2015-aprile 2016 con l’approvazione del Comitato etico per la ricerca clinica dell’Universit√† di Gazi. I campioni tumorali sono stati congelati a fresco a -80¬įC. Due dei tessuti tumorali sono stati esclusi dallo studio in quanto i loro referti patologici sono risultati GBM (-). 0.1 grammo di campione di tessuto tumorale √® stato omogeneizzato in tampone di lisi RIPA. Il lisato √® stato centrifugato per 15 minuti a 14.000 giri/minuto e il surnatante √® stato raccolto per eseguire il saggio di quantificazione delle proteine BCA. I campioni sono stati conservati a -80 ¬įC per ulteriori elaborazioni.

Western Blotting
Le celluleT98Ge U87-MG sono state lavate con PBS e raschiate nel tampone di lisi RIPA contenente 1mM PMSF seguito da sonicazione. I campioni sono stati centrifugati per 15 minuti a 13500 rpm a 4¬įC e il surnatante √® stato raccolto. Le proteine sono state quantificate utilizzando il BCA Assay Kit (Thermo Pierce, Rockford, IL, USA). I lisati proteici (20 őľg) sono stati riscaldati per 5 minuti a 95¬įC in tampone campione LDS non riducente (Pierce, Rockford, IL, USA), quindi caricati su gel di Tris-glicina al 10% e trasferiti su membrana PVDF (Pierce, Rockford, IL, USA). Le membrane sono state bloccate per 1 ora a temperatura ambiente e incubate per una notte a 4¬įC con gli anticorpi primari per Casp3, Bcl2, Bad, Bax, GSK-3B, C-Myc e ő≤-actina (Thermo Pierce, Rockford, IL, USA). I blot sono stati visualizzati con Luminata Forte Western HRP Substrate (Merck Millipore, Darmtadt, Germania). I segnali chemiluminescenti degli immunoblot sono stati documentati con Gel Logic 2200 Pro (Carestream Health; Rochester, NY, USA).

Analisi statistica
Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicati. I livelli di IC50 di metformina, dicloroacetato e memantina per le linee cellulari T98G e U87-MG sono stati calcolati con Graph-Pad Prism7. I risultati sono stati espressi come media¬Īdeviazione standard. p<0,05 √® stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Effetti di metformina, DCA, metformina+DCA e memantina sulla citotossicità delle cellule GBM T98G e U87-MG
La metformina ha ridotto la vitalit√† cellulare delle cellule tumorali GBM umane T98G e U87- MG in modo dose-dipendente, come mostrato nella Figura 1A; il trattamento con metformina 45mM e 25mM ha ridotto la vitalit√† cellulare per 48 ore (p<0,01). Abbiamo analizzato l’effetto del DCA sulle cellule T98G e U87-MG per 48 ore, testando un intervallo di concentrazioni di DCA compreso tra 10 e 60 mM. Il DCA ha ridotto la vitalit√† cellulare alla concentrazione di 45 mM, come mostrato nella Figura 1B (p<0,01). Sono state testate anche diverse concentrazioni di metformina+DCA sulle cellule di GBM per diminuire le dosi IC50. La combinazione metformina+DCA ha ridotto la vitalit√† cellulare a dosi inferiori; la dose IC50 per il trattamento combinato √® risultata pari a 20mM DCA e 20mM metformina per le cellule T98G e U87MG per 48 ore, come mostrato nella Figura 1C (p<0,01). Inoltre, la memantina ha influenzato la tossicit√† cellulare in modo dose-dipendente, come mostrato nella Figura 1D. 0.la concentrazione di memantina 125-5 mM √® stata testata sulle cellule T98G e U87MG per 48 ore e il valore IC50 √® stato determinato in 0,5 mM per le cellule T98G e U87MG (p<0,01).

Figura 1. A) La metformina √® stata testata nell’intervallo 10-50 mM sulle cellule T98G e U87-MG per 48 ore (h). Il valore IC50 √® stato determinato in 45 mM per le cellule T98G e 25 mM per le cellule U87-MG (p<0,01). B) Il dicloroacetato (DCA) √® stato testato nell’intervallo 10-60 mM sulle cellule T98G e U87-MG per 48 ore. Il valore IC50 √® stato determinato in 45 mM per le cellule T98G e U87-MG (p<0,01). C) La combinazione di metformina e DCA √® stata testata in diversi range su cellule T98G e U87-MG per 48 ore. Il valore IC50 √® stato determinato in 20 mM di DCA e 20 mM di metformina per le cellule T98G e U87-MG (p<0,01). D) La memantina √® stata testata nell’intervallo 0,125-5 mM per le cellule T98G e U87-MG per 48 ore. Il valore IC50 √® stato determinato come 0,5 mM per le cellule T98G e U87-MG (p<0,01).

Effetti di metformina, DCA, metformina+DCA e memantina sui livelli di espressione delle proteine Casp3, Bcl2, Bax, c-Myc, GSK3B
Le celluleT98Gsono state trattate con 45mM di metformina, 45mM di DCA, 20mM di metformina in combinazione con 20mM di DCA e 0,5mM di memantina per 48 ore. Le cellule U87-MG sono state trattate con 25mM di metformina, 45mM di DCA, 20mM di metformina in combinazione con 20mM di DCA e 0,5mM di memantina per 48 ore. Le espressioni delle proteine correlate all’apoptosi e alla progressione del ciclo cellulare, ossia Casp3, Bcl2, Bax, c-Myc e GSK3B, sono state valutate mediante western blot. La metformina e la combinazione metformina-DCA hanno ridotto l’espressione della proteina Casp-3 nelle cellule T98G (Figura 2), mentre l’espressione della proteina Casp-3 √® aumentata in tutti i trattamenti (metformina, DCA, metformina+DCA, memantina) nelle cellule U87-MG (Figura 3). L’espressione della proteina Bcl-2 √® aumentata con il trattamento con DCA, metformina+DCA e memantina, mentre l’espressione della proteina Bax √® diminuita in tutti i trattamenti per le cellule T98G. L’espressione della proteina c-Myc √® diminuita con i trattamenti sopra menzionati (metformina, DCA, metformina+DCA, memantina) nelle cellule T98G. Il trattamento con memantina ha inibito l’espressione della proteina GSK3B nelle cellule T98G (Figura 2).

Figura 2: Effetto del trattamento per 48 ore della linea cellulare T98G con metformina (45mM), DCA (45mM), combinazione metformina+DCA (20mM DCA+20mM metformina) e memantina (0,5 mM) sui livelli di espressione di: Casp3, Bcl-2, Bax, c-Myc e GSK-3B. L’espressione della proteina B-Act √® stata utilizzata come controllo di carico.

Figura 3: Effetto del trattamento di 48 ore della linea cellulare U87-MG con metformina (25mM), DCA (45mM), combinazione metformina+DCA (20mM DCA+20mM metformina) e memantina (0,5 mM) sui livelli di espressione di: Casp3, Bcl-2, Bax, c-Myc e GSK-3B. L’espressione della proteina B-Act √® stata utilizzata come controllo di carico.

Profili di espressione proteica differenziale deitessuti tumoralipositivi al GBM
I campioni di tessuto tumorale positivo al GBM sono stati caratterizzati in termini di apoptosi, poiché questo potrebbe essere un indicatore della progressione della malattia. Quindici campioni di tessuto tumorale GBM+ sono stati analizzati per i profili di espressione delle proteine Casp-3, Bcl-2, Bad e Bax. Le proteine apoptotiche analizzate sono risultate differenzialmente espresse in ciascun paziente (Figura 4).

Figura 4: Profili di espressione proteica differenziale di 15 campioni di tessuto GBM+tumorale per i geni dell’apoptosi Casp-3, Bcl-2, Bad, Bax.

Discussione

L’approvazione del farmaco anti-angiogenico bevacizumab nel GBM ha mostrato un miglioramento del tasso di sopravvivenza globale dei pazienti; tuttavia, questo risultato rimane controverso [6]. Nell’era della medicina personalizzata, sono necessari regimi di trattamento alternativi per un tumore cos√¨ aggressivo come il GBM.

La dipendenza da glucosio e glutammina delle cellule tumorali √® nota come segno distintivo dei tumori [16]. L’alterazione del metabolismo del glucosio √® definita come la causa dell’aggressivit√† e della chemioresistenza del GBM. L’obiettivo del metabolismo tumorale nel trattamento del cancro ha ampliato l’interesse oltre il metabolismo del glucosio ad altre molecole come la glutammina. √ą quindi fondamentale approfondire le conoscenze sul metabolismo della glutammina nelle cellule tumorali [2]. Lo scopo del presente studio √® quindi quello di colpire il metabolismo del glucosio e della glutammina utilizzando metformina, DCA e memantina.

Il meccanismo d’azione della metformina, farmaco per il diabete, sulle cellule tumorali √® noto per la sua selettivit√† nel colpire le cellule staminali del cancro. Questo meccanismo potrebbe dipendere dal metabolismo della glutammina [8]. Il DCA √® un inibitore della piruvato deidrogenasi chinasi che inverte l’effetto Warburg [20]. La sensibilizzazione delle cellule tumorali all’inibizione della glicolisi potrebbe essere ottenuta con un doppio bersaglio, la metformina e il DCA. Inoltre, il farmaco per l’Alzheimer memantina ha una dose IC50 molto pi√Ļ bassa rispetto a quella della metformina. La dose IC50 relativamente pi√Ļ bassa della memantina (0,5 mM) potrebbe quindi superare le preoccupazioni legate alla dose sovrafisiologica della metformina in ambito clinico. I derivati della memantina di nuova sintesi sono risultati avere anche attivit√† antitumorali nella linea cellulare U87-MG GBM [3]. L’uso della memantina come bersaglio delle vie di segnalazione associate ai recettori NMDA potrebbe migliorare il trattamento del glioma e del GBM [1,14]. L’approfondimento del meccanismo antitumorale della memantina sulle cellule GBM √® quindi promettente come nuovo farmaco riproposto.

Anche i profili di espressione proteica differenziale di 15 tessuti tumorali GBM+ per i geni apoptotici Casp-3, Bcl-2, Bad e Bax confermano la natura eterogenea della malattia. L’espressione positiva di Bax √® stata associata in modo significativo a un migliore tasso di sopravvivenza in un’ampia serie di tumori [19]. Il profilo di espressione della proteina Bax, quindi, potrebbe essere prognostico nella risposta al trattamento del GBM. L’attivazione della caspasi-3 √® risultata essere un predittore di sopravvivenza libera da progressione nei pazienti con GBM [13].

La stratificazione molecolare dei pazienti è indispensabile per individuare i gruppi di pazienti che hanno maggiori probabilità di trarre beneficio dal protocollo di trattamento selezionato.

In un recente studio in fase II, i ricercatori hanno analizzato le dosi massime tollerate di memantina, meflochina e metformina in combinazione con la temozolomide. Maraka et al. hanno concluso che questi farmaci possono essere combinati in modo sicuro con la temozolomide nel GBM di nuova diagnosi [10]. Tuttavia, sono stati segnalati alcuni effetti collaterali nei regimi di terapia combinata e l’approccio √® stato messo in discussione, sollevando dubbi sul fatto che memantina o meflochina abbiano causato gli effetti collaterali osservati [15]. Resta fondamentale comprendere le interazioni farmaco-farmaco e/o farmacocinetiche quando si utilizzano combinazioni di farmaci.

CONCLUSIONE

I nostri risultati in vitro dimostrano che la memantina, farmaco contro l’Alzheimer, potrebbe essere utilizzata nel trattamento della GBM a dosi inferiori rispetto alla metformina. Le propriet√† di penetrazione della barriera ematica cerebrale della memantina sono promettenti anche per il trattamento del GBM. √ą inoltre interessante l’ipotesi che la memantina possa costituire una terapia neoadiuvante alternativa, soprattutto per i pazienti oncologici anziani. Questa affermazione richiede ulteriori indagini mediante studi randomizzati e controllati.

RICONOSCIMENTI

Questo studio è stato sostenuto da una borsa di studio scientifica del Consiglio per la Ricerca Scientifica e Tecnologica della Turchia, TUBITAK (Progetto n. SBAG- 214S578).

RIFERIMENTI

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