📖 39 mins.

Jong-Lyel Roh a, *, Jin Young Park a, Eun Hye Kim a, Hye Jin Jang a, Minsu Kwon b

a Dipartimento di otorinolaringoiatria, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Repubblica di Corea
b Dipartimento di otorinolaringoiatria, Gyeongsang National University Hospital School of Medicine, Jinju, Repubblica di Corea

Corrispondenza autore: Tel: +82 2 3010 3965; fax: +82 2 489 2773. Indirizzo e-mail: [email protected] (J.-L. Roh).



Ricevuto: 9 settembre 2015
Rivisto: forma rivista 13 novembre 2015
Accettato: 14 novembre 2015

Abstract

Il dicloroacetato (DCA), un farmaco orfano che promuove il passaggio dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa, è stato riproposto per la terapia del cancro. Il presente studio ha esaminato se il DCA possa superare la resistenza al cisplatino nel cancro della testa e del collo (HNC). Sono state utilizzate due linee cellulari HNC resistenti al cisplatino (AMC-HN4R e -HN9R), le loro linee parentali e altre linee HNC umane. L’effetto del DCA, da solo e in combinazione con il cisplatino, è stato valutato misurando il ciclo cellulare, la vitalità, la morte, la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), il potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) e l’espressione proteica in modelli preclinici di xenotrapianto tumorale di topo. L’aumento della glicolisi è correlato a una minore sensibilità al cisplatino ed è stato ridotto dal DCA. Le cellule resistenti al cisplatino sovraesprimevano la piruvato deidrogenasi chinasi 2 (PDK2). Il DCA ha indotto la morte delle cellule HNC diminuendo il ΔΨm e promuovendo la produzione di ROS mitocondriali. Questo effetto è stato ridotto dall’antiossidante N-acetil-l-cisteina o dall’inibizione dell’apoptosi mediata dalla caspasi. L’attivazione dell’ossidazione mitocondriale del glucosio da parte del DCA ha infine attivato la segnalazione apoptotica mitocondriale a valle, portando alla morte delle cellule tumorali chemioresistenti. Pertanto, il DCA ha sensibilizzato in modo significativo le cellule HNC resistenti al cisplatino in vitro e in vivo. L’elevata glicolisi e la sovraespressione di PDK2 sono strettamente legate alla resistenza al cisplatino nelle cellule HNC; quest’ultima può essere superata dal DCA.

Parole chiave: Cancro della testa e del collo, resistenza al cisplatino, PDK2, dicloroacetato, rimodellamento mitocondriale
Abbreviazioni: HNC, head and neck cancer; DCA, dicloroacetato; CDDP, cisplatino; OXPHOS, fosforilazione ossidativa; PDK2, piruvato deidrogenasi chinasi 2; PDHE1α, piruvato deidrogenasi isoforma E1α; ROS, specie reattive dell’ossigeno; ΔΨm, potenziale di membrana mitocondriale; NAC, N-acetil-l-cisteina; DCF-DA, 2′,7′- diclorofluoresceina diacetato; PARP, poli(ADP-ribosio) polimerasi; siRNA, short interfering RNA; 18F-FDG, 18F-fluorodeossiglucosio; PET, tomografia a emissione di positroni; SUV, valore di captazione standardizzato; MTV, volume metabolico del tumore; TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling.

© 2015 Elsevier Ireland Ltd. Tutti i diritti riservati.


INTRODUZIONE

Il tumore della testa e del collo (HNC) è l’ottavo tumore più comune al mondo, con oltre mezzo milione di nuovi casi diagnosticati ogni anno [1]. I tumori insorgono nel tratto aerodigestivo superiore, compresa la cavità orale o nasale, la faringe e la laringe, e metastatizzano ai linfonodi regionali e a siti distanti. L’attuale standard di cura dell’HNC prevede un approccio multimodale che include chirurgia, chemioterapia e radioterapia, in particolare nell’HNC avanzato. Insieme al recente interesse per le strategie di conservazione degli organi, le modalità non chirurgiche, come la radioterapia combinata con la chemioterapia, sono state sempre più utilizzate come terapia di prima linea nell’HNC [2]. Nella gestione dei pazienti con HNC avanzato, la chemioterapia sistemica è ora una componente centrale di diversi approcci curativi, tra cui la combinazione con la radioterapia definitiva o il trattamento di induzione, superando la prenotazione solo per la palliazione [3]. Il cisplatino, il derivato del platino cis-diamminedicloroplatino (II) (CDDP), rimane un agente chemioterapico di prima linea nelle modalità non chirurgiche contro l’HNC, nonostante i recenti progressi nella terapia mirata [4]. Negli ultimi tre decenni, tuttavia, nonostante i progressi diagnostici e terapeutici, il tasso di sopravvivenza globale dell’HNC non è cambiato sostanzialmente, a causa della tenace resistenza delle cellule tumorali alle terapie, tra cui il cisplatino e le radiazioni [2].

Le alterazioni metaboliche sono una caratteristica comune delle cellule tumorali: lo spostamento della produzione di energia cellulare dalla fosforilazione ossidativa mitocondriale alla glicolisi aerobica fornisce un vantaggio biosintetico alle cellule tumorali [5]. L’aumento della glicolisi nelle cellule tumorali, chiamato effetto Warburg, è comunemente correlato a cambiamenti fenotipici, tra cui l’adattamento all’ipossia e alla scarsità di nutrienti, la resistenza allo stress ossidativo e agli stimoli apoptotici e l’elevata sintesi di biomassa [6]. La deregolazione del metabolismo è legata alla resistenza ai trattamenti antitumorali [7]. Nella via glicolitica, l’upregulation del trasportatore del glucosio (GLUT), dell’esochinasi (HK), della piruvato chinasi M2 (PKM2), della piruvato deidrogenasi chinasi (PDK), della lattato deidrogenasi-A (LDHA), della sintesi degli acidi grassi (FASN) e della glutaminasi, tra gli altri, è associata alla resistenza ai farmaci antitumorali [7]. È dimostrato che la regolazione del metabolismo delle cellule tumorali può migliorare la terapia e superare la resistenza alla chemioterapia o alla radioterapia [8,9].

Il dicloroacetato (DCA), un farmaco orfano per l’acidosi lattica, sposta il metabolismo del cancro dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa [10]. Il DCA inibisce selettivamente la PDK, attivata in molti tumori, con conseguente attivazione della piruvato deidrogenasi (PDH), un complesso di enzimi che converte il piruvato citosolico in acetil-CoA mitocondriale. L’inibizione della PDK con small interfering RNA (siRNA) o il trattamento con DCA modifica la bioenergetica del cancro e ripristina l’apoptosi mitocondri-dipendente nelle cellule tumorali [11]. Il DCA è efficace nel trattamento di tumori con fenotipi aggressivi in vitro e in vivo[12,13] e supera la resistenza al sorafenib nel carcinoma epatocellulare attivando la fosforilazione ossidativa mitocondriale [14]. Pertanto, il DCA potrebbe essere un farmaco antitumorale adatto ad aumentare l’efficacia della chemioterapia e a superare la resistenza agli agenti chemioterapici nel cancro umano; tuttavia, sebbene il DCA sia stato ampiamente studiato in campo oncologico, è stato raramente testato nelle cellule di HNC [15], in particolare nel contesto della resistenza agli agenti chemioterapici. Sono necessarie ulteriori indagini sui meccanismi del DCA e sulla sinergia con gli agenti chemioterapici convenzionali. Qui dimostriamo che il DCA sposta la bioenergetica delle HNC verso l’ossidazione mitocondriale del glucosio e porta all’accumulo cellulare di specie reattive mitocondriali dell’ossigeno (mROS), sensibilizzando così le cellule HNC chemioresistenti al cisplatino in vitro e in vivo.

Materiali e metodi

Coltura cellulare e creazione di cellule HNC resistenti al cisplatino
Le cellule di cancro umano della testa e del collo (HNC) AMC-HN2, -HN3, -HN4, -HN5, -HN9 e -HN10 sono state coltivate in terreno minimo essenziale di Eagle (Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA); Le cellule SNU-1041, -1066 e -1076 sono state coltivate in terreno Roswell Park Memorial Institute (Life TechnologiesTM ); le cellule UMSCC1 sono state coltivate in terreno Dulbecco’s modified Eagle (Life TechnologiesTM ). I terreni sono stati integrati con il 10% di siero fetale bovino. Tutte le linee cellulari tumorali sono state autenticate mediante profilo del DNA (short-tandem-repeat, STR) fornito dalla Korean Cell Line Bank. Le cellule sono state incubate a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

Le cellule AMC-HN4 e HN9 resistenti al cisplatino (HN4R e HN9R) sono state sviluppate dalle cellule parentali AMC-HN4 e HN9 sensibili al cisplatino, rispettivamente, mediante esposizione a concentrazioni crescenti di cisplatino (cis-platino (II) dicloruro di diammina [CDDP]; Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA) [16]. La resistenza al cisplatino nelle linee cellulari stabilite è stata valutata mediante saggi di vitalità cellulare e confrontata con quella delle cellule parentali.

Saggio di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata determinata mediante esclusione del blu di Trypan, MTT e saggi clonogenici. L’esclusione del tripan blu è stata eseguita su cellule HNC seminate a 1 x105 in piastre a 6 pozzetti. Le cellule sono state lasciate raggiungere il 60-70% di confluenza e sono state esposte al dicloroacetato (DCA; Sigma-Aldrich) per 72 ore. Le cellule sono state quindi tripsinizzate, colorate con blu di tripan allo 0,4% (Life TechnologiesTM ) e contate con un emitometro. Il saggio MTT è stato eseguito su cellule HNC seminate a 3-5 x103 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Le cellule sono state incubate per una notte e poi esposte a DCA e cisplatino, da soli o in combinazione, per 72 ore. Le cellule sono state poi esposte al composto di tetrazolio 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT; Sigma-Aldrich) per 4 ore, dopodiché è stato aggiunto il tampone di solubilizzazione per 2 ore. L’assorbanza in ogni pozzetto è stata misurata a 570 nm con un lettore di micropiastre SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Per i saggi clonogenici, le cellule sono state esposte al DCA o al veicolo per 72 ore e poi incubate in terreno privo di farmaci per 7-10 giorni. I pozzetti sono stati colorati con una soluzione di cristalvioletto allo 0,5% e il numero di colonie è stato contato. Tutti i saggi sono stati eseguiti con campioni in triplo e ripetuti tre volte.

La citotossicità del cisplatino è stata valutata mediante MTT dopo 72 ore ed è stata calcolata la concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) di ciascuna cellula HNC. L’interazione di due farmaci è stata considerata sinergica quando l’inibizione della crescita indotta dalla combinazione di farmaci era maggiore della somma delle inibizioni indotte da uno dei due farmaci da solo: indice di combinazione (CI) = 1, interazione additiva; CI < 1, interazione sinergica; e CI > 1, interazione antagonista [17].

Misurazione della bioenergetica e della produzione di ROS
Le cellule HNC (1 x104 cellule per pozzetto) sono state seminate in piastre da 24 pozzetti; il giorno successivo, sono state lavate e incubate in DMEM privo di siero integrato con o senza 100 ng/mL di oligomicina (un inibitore dell’ATP sintasi; Sigma-Aldrich) per 6 ore. Il terreno di coltura (50 µL) è stato raccolto da ogni piastra e la concentrazione di lattato nel terreno di coltura è stata misurata con un kit per il dosaggio del lattato (Biovision, Mountain View, CA, USA). Lac (o) e Lac (c) indicano la concentrazione di lattato nel terreno di coltura dopo 6 ore di incubazione in presenza e assenza di oligomicina, rispettivamente. Il contributo della glicolisi e della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) alla bioenergetica cellulare è stato calcolato con la seguente formula: glicolisi (%) = Lac (c)/Lac (o) x 100; OXPHOS (%) = 100 – glicolisi (%) [14].

Le cellule sono state esposte a 15 o 30 mM di DCA per 24 ore e la generazione di ROS è stata rilevata nelle cellule incubate con 10 µM di 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCF-DA) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). Le cellule sono state incubate con 10 µM di DCF-DA per 30 minuti a 37 °C, lavate due volte con PBS e analizzate in un citometro a flusso FACScalibur. Le cellule sono state anche pretrattate con 3 mM di N-acetil-l-cisteina (NAC; Sigma-Aldrich) per 1 h o con 10 µM di inibitore della superossido dismutasi (SOD) dietil-ditio-carbammato (Sigma-Aldrich) prima dell’esposizione a 30 mM di DCA. I livelli di ROS sono stati misurati con la citometria a flusso utilizzando la DCF-DA e sono mostrati come variazione in termini di pieghe rispetto ai livelli di controllo (basali).

Saggi del ciclo cellulare e della morte cellulare
Per i saggi del ciclo cellulare, le cellule sono state esposte a DCA per 72 ore. Le cellule sono state quindi tripsinizzate, fissate per una notte in etanolo freddo e colorate per 30 minuti con ioduro di propidio (Sigma-Aldrich) a 37 °C.

Il contenuto di DNA cellulare è stato misurato utilizzando la citometria a flusso con DCF-DA.

Il contenuto di DNA cellulare è stato misurato con un citometro a flusso FACScalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Per i saggi di morte cellulare, le cellule sono state coltivate con cisplatino e DCA, da soli o in combinazione, o con una quantità equivalente di DMSO (controllo veicolo). Dopo 72 ore, le cellule sono state raccolte, lavate con PBS freddo e risospese nel tampone di legame. Le cellule sono state colorate con annexina V-FITC (isotiocianato di fluoresceina) e ioduro di propidio utilizzando un kit di rilevamento dell’apoptosi con annexina V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) e quindi analizzate mediante citometria a flusso. Tutti i dati sono stati analizzati con il software Cell Quest (BD Biosciences). La significatività statistica tra i diversi gruppi di trattamento è stata valutata mediante il test U di Mann-Whitney a due code o il test t di Student.

Per i saggi dell’attività delle caspasi, le cellule HN4R e HN9R seminate in una piastra a 96 pozzetti sono state esposte a 100 µL di terreno contenente cisplatino e DCA da soli o in combinazione, per 72 ore, con o senza 3 mM NAC o 50 µM di Z-VAD-fmk (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) prima dell’esposizione a 30 mM DCA. I saggi sono stati eseguiti in pozzetti triplicati utilizzando il test fluorimetrico Homogeneous Caspase Assay (Roche Life Science, Basilea, Svizzera). È stata aggiunta la soluzione di substrato di lavoro e la piastra è stata incubata al buio a 37 °C per 2-8 ore o a temperatura ambiente per tutta la notte. L’assorbanza in ciascun pozzetto è stata misurata a una lunghezza d’onda di eccitazione di 485 nm e a una lunghezza d’onda di emissione di 520 nm utilizzando un lettore di micropiastre SpectraMax M2.

Per la misurazione del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm), le cellule HN4R e HN9R seminate in una piastra a 96 pozzetti sono state esposte a 100 µL di terreno contenente cisplatino e DCA da soli o in combinazione per 36 h. Le cellule sono state colorate con 200 nM di tetrametil rodamina etil estere (TMRE, Life Technologies TM ) per 20 min e poi analizzate mediante citometria a flusso. L’intensità media di fluorescenza (MFI) di ciascun gruppo di trattamento è stata normalizzata rispetto al gruppo di controllo.

Trascrizione quantitativa inversa-PCR in tempo reale
L’RNA cellulare totale è stato estratto utilizzando il reagente di lisi QIAzol e il kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). Il cDNA è stato generato dall’RNA purificato utilizzando il kit di trascrizione inversa QuantiTect (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Il cDNA della piruvato deidrogenasi chinasi 2 (PDK2) è stato amplificato mediante PCR utilizzando i seguenti primer: 5′-ATGGCAGTCCTCCTCTGA-3′ (forward) e 5′-CACCCACTCTTCCTAACA-3′ (reverse). Per la β-actina (controllo endogeno) sono stati utilizzati i seguenti primer: 5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ (forward) e 5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′ (reverse). La trascrizione quantitativa inversa in tempo reale (qRT-PCR) è stata eseguita utilizzando SYBR Green (Qiagen) su un sistema 7900HT Fast Real-time PCR (Applied Bioscience, Foster, CA, USA). I livelli relativi di mRNA target sono stati normalizzati rispetto all’espressione della β-actina.

siRNA
Per l’abbattimento di PDK2 e PDHE1α, AMC-HN4-cisR e HN9-cisR sono state seminate su piastre da 60 mm in terreno senza antibiotici e, 18 ore dopo, sono state trasfettate con 100 nmol/L di small interfering RNA (siRNA) mirato al gene PDK2 o PDHE1α umano o con un siRNA di controllo scrambled (Life Technologies TM ). Dopo 72 ore, le cellule sono state esposte a DCA per un ulteriore periodo di 72 ore e quindi analizzate per l’espressione proteica. L’abbattimento è stato confermato mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-PDK2 o PDHE1.

Immunoblotting
Le cellule sono state lisate a 4 °C in un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Life TechnologiesTM ). L’immunoblotting è stato eseguito secondo le procedure standard. In breve, un totale di 50 µg di proteine è stato risolto mediante elettroforesi in gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) su gel al 10-12%, trasferito su membrane di nitrocellulosa o polivinilidene difluoruro e testato con anticorpi primari e secondari. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: p53 (DO1) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); esochinasi 2 (HK2), p21 WAF1/CIP1, PUMA, poli(ADP-ribosio) polimerasi scissa (PARP), fosfo-p53-Ser15 e caspasi-3 scissa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); PDK2 (Abcam, Cambridge, MA, USA); PDHE1α e fosfo-PDHE1α (ser293) (Calbiochem, Billerica, MA, USA). la β-actina (Sigma-Aldrich) è stata utilizzata come controllo di carico. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti tra 1:250 e 1:5000.

Microscopia confocale
Il ΔΨm è stato imitato in cellule tumorali vive utilizzando TMRM (Life TechnologiesTM ), un colorante a base di rodamina sensibile ai mitocondri e al voltaggio (fluorescenza rossa). Il superossido mitocondriale (mROS, Life TechnologiesTM ) prodotto durante la respirazione cellulare è stato misurato con MitoSOX (fluorescenza rossa). Le immagini di fluorescenza di TMRM o mitoSOX sono state acquisite da un microscopio confocale a due fotoni Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss AG, Heidenheim, Germania) e la fluorescenza media è stata quantificata (unità arbitrarie di fluorescenza, AFU) nelle cellule tumorali in coltura utilizzando il software Zen imaging (Carl Zeiss AG). L’acquisizione e l’analisi delle immagini sono state eseguite da due scienziati in cieco rispetto alla fonte dei campioni cellulari.

Tomografia a emissione di positroni (PET)
L’assorbimento di glucosio è stato analizzato in vivo in topi nudi con trapianto di cellule HN4R o HN9R utilizzando anestesia con gas isoflurano (20% di ossigeno) e 18 F-fluorodeossiglucosio (18 F-FDG) come radiotracciante. L’imaging PET è stato eseguito con microPET FOCUS 120 (Concorde Microsystem Inc., Knoxville, TN, USA). I topi sono rimasti a digiuno per una notte e poi sono stati iniettati per via endovenosa con 0,15 mCi. Dopo 1 ora, è stata eseguita una scansione PET 18 F-FDG in tutto il corpo. Le immagini di acquisizione dei dati PET sono mostrate utilizzando una mappa pseudocolore con il colore rosso che indica un’elevata captazione di 18 F-FDG.

Per determinare l’attività della 18 F-FDG-PET sono stati utilizzati il valore di captazione massimo e medio standardizzato (SUVmax e SUVmean). Il SUV è stato analizzato utilizzando l’equazione SUV = A/(ID/BW), dove A è l’attività corretta per il decadimento nel tessuto (in mCi/mL), ID è la dose iniettata di FDG (in mCi) e BW è il peso corporeo del topo (in grammi). Le regioni di interesse (ROI) sferiche o ellittiche sono state posizionate sulle lesioni visibili sulle immagini PET. Il SUVmax e il SUVmean sono stati calcolati disegnando automaticamente una ROI sulla fetta più intensa dei tumori visibili sulle immagini PET. I MTV sono stati calcolati dai dati PET corretti per l’attenuazione utilizzando un pacchetto software commerciale (INFINITT PACS; INFINITT Healthcare Co., Ltd). i dati PET 18 F-FDG sono stati inseriti nella workstation in formato DICOM e i valori di intensità sono stati automaticamente convertiti in SUV. Per i calcoli di MTV, i margini di contorno del tumore sono stati definiti utilizzando un SUV fisso di 2,0 e il volume del tumore è stato quindi delineato con l’isocontour di SUV 2,0. Le immagini PET sono state ottenute in topi impiantati nel tumore il giorno 21 dopo l’inizio del trattamento. I valori medi dei valori SUVmax e MTV del tumore sono stati confrontati tra i diversi gruppi di trattamento.

Studi preclinici
Tutte le procedure di studio sugli animali sono state eseguite in conformità ai protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della nostra istituzione. Topi nudi atimici BALB/c maschi (nu/nu) di sei settimane sono stati acquistati da Central Lab Animal Inc. (Seoul, Repubblica di Corea). Le cellule AMC-HN4R o HN9R (5 x 10 6 ) sono state iniettate sottocute nel fianco. Il volume del tumore e il peso corporeo sono stati misurati ogni 3 giorni. I tumori sono stati misurati con un calibro, e il volume è stato calcolato come (lunghezza x larghezza2 )/2. Il trattamento è iniziato quando gli impianti cellulari sono diventati noduli palpabili (=giorno 0). I topi sono stati randomizzati in quattro gruppi di trattamento: veicolo, DCA, cisplatino e DCA più cisplatino.

I topi sono stati trattati con acqua potabile integrata con 0,5 g/L di DCA, o con iniezione i.p. di 5 mg/kg di cisplatino una volta alla settimana, o con una combinazione di DCA e cisplatino secondo gli stessi schemi. I topi sono stati sacrificati il giorno 24 e i tumori sono stati isolati e analizzati mediante immunoblotting e saggio TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) in situ (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Il numero di corpi apoptotici è stato contato in cieco in dieci campi ad alta potenza selezionati a caso. La significatività statistica tra i diversi gruppi di trattamento è stata valutata mediante il test U di Mann-Whitney a due code o il test t di Student.

Risultati

L’aumento della glicolisi nelle cellule HNC è associato alla resistenza al cisplatino e invertito dal DCA
Tutte le linee cellulari utilizzate nel nostro studio erano HNC umane. L’effetto citotossico del DCA è stato valutato nelle cellule HNC mediante esclusione del blu di Tripan, colorazione con cristalvioletto e saggio MTT. Il DCA, testato fino a 30 mM per 72 ore, ha inibito marcatamente la crescita delle cellule HNC (saggio MTT, Fig. 1A ). La bioenergetica delle cellule HNC è stata modificata dal DCA: la glicolisi cellulare è diminuita significativamente, mentre la fosforilazione ossidativa è aumentata (Fig. 1B ). Il cambiamento nella bioenergetica variava tra le linee cellulari HNC ed era significativamente associato alla sensibilità al cisplatino: le cellule HNC con glicolisi elevata mostravano resistenza al cisplatino (R2 = 0,859, P < 0,001; Fig. 1C ). Inoltre, dopo l’esposizione al DCA, le cellule tumorali con il maggiore cambiamento nella bioenergetica erano probabilmente più apoptotiche (R2 = 0,769, P = 0,002; Fig. 1D ). Ciò suggerisce che il DCA induce l’apoptosi specifica delle cellule tumorali diminuendo la glicolisi nelle cellule HNC.

Fig. 1. L’aumento della glicolisi nelle cellule HNC è correlato a una minore sensibilità al cisplatino ed è ridotto dal dicloroacetato (DCA). (A) Il DCA ha indotto la morte cellulare nelle cellule HNC. La citotossicità è stata valutata con il saggio MTT dopo l’esposizione a diverse concentrazioni di DCA per 72 ore. (B) Variazione della bioenergetica indotta dal DCA nelle cellule HNC. Le misure di glicolisi e OXPHOS (%) sono state descritte nella sezione Materiali e metodi. (C) Correlazione tra glicolisi e IC50 del cisplatino in un gruppo di linee cellulari HNC. L’IC50 è stata calcolata mediante saggio MTT in tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito con campioni in triplo. La correlazione è stata valutata mediante regressione lineare. (D) Correlazione tra cambiamenti bioenergetici e apoptosi nelle cellule HNC. I saggi di apoptosi hanno misurato le frazioni apoptotiche positive all’annexina V dopo l’esposizione a DCA 20 mM per 72 ore.

L’espressione di PDK2 è associata alla resistenza al cisplatino in HNC
Gli effetti citotossici del cisplatino sono stati testati nelle linee cellulari HN4-cisR e HN9-cisR coltivate e nelle linee tumorali parentali (Fig. 2A). Le cellule HN4-cisR e HN9-cisR resistenti al cisplatino hanno mostrato un aumento dell’IC50 rispettivamente di 12 e 18 volte rispetto alle rispettive linee parentali. L’analisi Western blot ha mostrato che HK2 e PDK2 erano altamente espressi sia nelle cellule HN4-cisR che HN9-cisR rispetto alle rispettive cellule parentali, mentre l’espressione di PDHE1α era bassa nelle cellule resistenti al cisplatino ( Fig. 2B ). Anche il livello di espressione dell’mRNA di PDK2 era più alto nelle cellule resistenti rispetto a quelle sensibili (P < 0,01) (Fig. 2C). Il DCA ha inibito la crescita delle cellule HNC resistenti al cisplatino tanto quanto quella delle cellule HNC sensibili al cisplatino (Fig. 2D). L’analisi Western blot ha mostrato che il DCA ha ridotto significativamente i livelli di PDK2 e di fosfo-PDHE1α (pPDHE1α), ma ha aumentato il livello di proteine pro-apoptotiche, tra cui la PARP scissa (cPARP) e PUMA, e quello di p21 nelle cellule HN4-cisR e HN9-cisR (Fig. 2E). Ciò suggerisce che il DCA può inibire efficacemente la crescita delle cellule HNC resistenti al cisplatino e quella delle cellule HNC sensibili al cisplatino.

Fig. 2. L’espressione di PDK2 è associata alla resistenza al cisplatino nelle cellule HNC. (A) La vitalità cellulare è stata valutata con il saggio MTT dopo esposizione al cisplatino per 72 ore. (B) Analisi Western blot che mostra diversi livelli di esochinasi 2 (HK2), piruvato deidrogenasi chinasi 2 (PDK2), piruvato deidrogenasi (PDH) E1α (PDHE1α) e lattato deidrogenasi-A (LDHA) nelle cellule HN4 (HN4R) e HN9 (HN9R) resistenti al cisplatino non trattate e nelle loro cellule parentali. (C) Variazione del livello di espressione genica di PDK2 tra le cellule resistenti al cisplatino (cis-R) e le loro cellule parentali. * indica P <0,01 rispetto alle cellule HNC parentali. (D) La vitalità cellulare è stata valutata con il saggio MTT dopo l’esposizione a 15 e 30 mM di DCA per 72 ore. Le barre di errore rappresentano l’E.S. di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito con campioni in triplo. (E) Analisi Western blot che rivela i cambiamenti nei livelli di PARP clivata, PUMA, p21, PDK2, phosho-PDHE1α (pPDHE1α) e PDHE1α in cellule HN4R e HN9R resistenti al cisplatino esposte a DCA per 24 h. Il livello di β-actina è stato valutato come controllo di carico.

IlDCA induce l’accumulo di ROS nelle cellule HNC
La variazione dei ROS cellulari da parte del DCA è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando la sonda fluorescente sensibile al redox DCF-DA. L’esposizione al DCA ha causato un aumento significativo dei livelli di ROS nelle cellule HNC (P < 0,01), che è stato bloccato dalla co-esposizione con NAC o con l’inibitore della SOD dietil-ditio-carbammato (Fig. 3A). La glicolisi è aumentata significativamente nelle cellule HNC resistenti al cisplatino rispetto alle cellule parentali (P < 0,01), ma il DCA ha indotto una diminuzione significativa della glicolisi e un aumento della fosforilazione ossidativa sia nelle cellule HNC sensibili al cisplatino che in quelle resistenti al cisplatino (P < 0,01) ( Fig. 3B ). Il potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) è stato misurato utilizzando il TMRM, un colorante a base di rodamina sensibile al voltaggio dei mitocondri, mentre il ROS mitocondriale (mROS, superossido mitocondriale) è stato misurato utilizzando il rosso MitoSOX. Le cellule HNC trattate con DCA hanno mostrato una diminuzione del ΔΨm e un aumento del mROS (P < 0,01) (Fig. 3C). La variazione del ΔΨm nelle cellule HNC resistenti al cisplatino in seguito all’esposizione al DCA è stata bloccata dal pretrattamento con NAC (Fig. 3D). Ciò suggerisce che il DCA può indurre l’accumulo di ROS nelle cellule HNC attivando la fosforilazione ossidativa.

Fig. 3. Il DCA induce l’accumulo intracellulare di ROS nelle cellule HNC. (A) Aumento dei ROS da parte del DCA. Le cellule HN4R e HN9R resistenti al cisplatino sono state esposte a 15 o 30 mM di DCA per 24 ore. Le cellule sono state anche pretrattate con l’inibitore dei ROS N-acetil-l-cisteina(NAC, 3 mM) o l’inibitore della superossido dismutasi (iSOD) dietil-ditio-carbammato (10 µM). I livelli di ROS sono stati misurati mediante citometria a flusso con DCF-DA e sono indicati come variazioni in termini di pieghe rispetto ai livelli di controllo (basali). Tutti i valori sono la media ± S.E. di tre esperimenti indipendenti. * indica P <0,01 rispetto al controllo e ** indica P <0,01 rispetto a 30 mM DCA. (B) Cambiamento della bioenergetica a causa del DCA nelle cellule HNC. * indica P <0,05 rispetto al controllo e ** indica P <0,01 rispetto alle cellule parentali sensibili al cisplatino. (C) Variazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS, cioè superossido) misurata mediante mitoSOX e del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm, colorazione rossa) in seguito all’esposizione a 20 mM di DCA rispetto al controllo non trattato (ctr). Unità di fluorescenza arbitraria (AFU) in cellule di controllo e trattate con DCA. (D) Variazioni del ΔΨm nelle cellule HN4R e HN9R dopo un’esposizione di 36 ore al DCA. Il ΔΨm è stato misurato con tetrametilrodamina etil estere e analizzato mediante citometria a flusso. L’intensità media della fluorescenza di ciascun gruppo di trattamento è stata normalizzata rispetto al gruppo di controllo. Le barre di errore rappresentano la S.E. di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito con campioni in triplo. * indica P <0,01 rispetto al controllo. ** indica P <0,01 rispetto al solo DCA o al DCA più NAC.

IlDCA promuove l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi nelle cellule HNC
I saggi clonogenici hanno evidenziato una marcata diminuzione del numero di colonie HN4-cisR e HN9-cisR in seguito all’esposizione al DCA (P < 0,01) (Fig. 4A ). La citometria a flusso con colorazione allo ioduro di propidio ha mostrato un significativo cambiamento del ciclo cellulare nelle cellule HNC: la wogonina ha aumentato la popolazione apoptotica sub-G1 (P < 0,05) e questo effetto è stato bloccato dalla co-esposizione con NAC (Fig. 4B ). L’analisi Western blot ha mostrato che il DCA ha ridotto la pPDHE1α ma ha aumentato cPARP, p21, fosfo-p53 e la caspasi-3 scissa (cCasp3) in modo dipendente dal tempo (Fig. 4C ). L’attivazione di PDHE1α mediante knockdown di PDK2 nelle cellule AMC-HN4-cisR non ha aumentato significativamente le proteine proapoptotiche cPARP e cCasp3 (Fig. 4D ); tuttavia, il knockdown di PDHE1α ha diminuito l’espressione di p21 e la fosforilazione di p53. La citometria a flusso che utilizza lo ioduro di propidio e la colorazione con annexina-V ha mostrato un’efficace induzione dell’apoptosi e della morte cellulare nelle cellule HNC resistenti al cisplatino da parte del DCA; l’effetto è stato ridotto con la co-esposizione al DCA e all’antiossidante NAC o all’inibitore pan-caspasico Z-VAD-fmk ( Fig. 4E ). Ciò è stato confermato dalla misurazione dell’attività della caspasi, che è stata significativamente aumentata dal DCA in modo dipendente dalla concentrazione (Fig. 4F ).

Fig. 4. Il DCA induce morte cellulare e cambiamenti del ciclo cellulare nelle cellule HNC. (A) Saggio clonogenico di linee cellulari tumorali resistenti al cisplatino esposte al DCA. Le cellule tumorali AMC-HN4R e HN9R sono state esposte a DCA per 72 ore. Le barre di errore rappresentano la S.E. di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in triplicato. * indica P <0,01. (B) Analisi del ciclo cellulare dopo esposizione a DCA. Le cellule AMC-HN4R esposte a DCA per 72 ore sono state colorate con ioduro di propidio e sottoposte ad analisi di citometria a flusso. * indica P <0,05. (C) Analisi Western blot che rivela i cambiamenti nei livelli di PARP clivato (cPARP), p21WAF1, fosfo-p53-ser 15 (pp53), caspasi 3 clivata (cCasp3), pPDHE1α e PDHE1α. Gli estratti cellulari sono stati ottenuti dopo aver esposto le cellule AMC-HN4R a 30 mM di DCA. (D) Gli effetti del DCA e dell’inibizione genetica di PDK2 e PDHE1α sulle proteine proapoptotiche, sulla PARP scissa e sulla caspasi 3 scissa e sulla p21WAF1. Le proteine sono state misurate mediante analisi Western blot in cellule AMC-HN4R esposte a 30 mM DCA. Le cellule tumorali sono state trasfettate con siRNA scrambled (scr), PDK2 siRNA o PDHE1α siRNA per 48 ore, prima dell’esposizione a 30 mM DCA. (E) Saggi di apoptosi in cellule AMC-HN4R e HN9R esposte a DCA. Le cellule sono state esposte a DCA per 72 ore e sono state misurate le frazioni apoptotiche positive all’annessina V. (F) Elevazione della cascata di DCA per 72 ore. (F) Aumento dell’attività delle caspasi in seguito al trattamento con DCA. Le barre di errore rappresentano la S.E. di tre repliche. * e ** indicano P <0,01 rispetto al controllo e a 30 mM DCA, rispettivamente. Le cellule sono state anche pretrattate con 3 mM di NAC o 50 µM dell’inibitore pan-caspasico Z-VAD-fmk prima di essere esposte a 30 mM di DCA.

IlDCA sensibilizza le cellule HNC resistenti al cisplatino in vitro e in vivo
Il cisplatino (10 µM) non ha indotto alcuna citotossicità significativa o espressione di proteine apoptotiche nelle linee HNC resistenti al cisplatino HN4-cisR e HN9-cisR rispetto alle linee parentali HN4 e HN9 sensibili al cisplatino (Fig.

5A).

5A); tuttavia, il DCA ha indotto una marcata riduzione della sopravvivenza nelle cellule HNC resistenti al cisplatino (P < 0,05), bloccata dal pretrattamento con NAC. Il DCA ha indotto l’espressione di proteine apoptotiche e ha aumentato la citotossicità indotta dal cisplatino e l’espressione di proteine apoptotiche nelle cellule HN4-cisR (Fig. B). In combinazione, il DCA ha aumentato la citotossicità del cisplatino nelle cellule HN4-cisR incrementando l’attività delle caspasi in misura superiore alla somma degli effetti di entrambi gli agenti da soli (CI < 1, P < 0,01), che sono stati indeboliti dal silenziamento del gene PDHE1α (Fig. 5C). Il ΔΨm era più alto nelle cellule HN4-cisR resistenti al cisplatino rispetto alle cellule HN4 parentali sensibili al cisplatino (ΔΨm, intensità media di fluorescenza [MFI]: 1 ± 0 vs. 0,54 ± 0,09, P < 0,001) e ridotto dal DCA o dalla combinazione di cisplatino e DCA, che è stato abrogato dal silenziamento del gene PDHE1α (Fig. 5D).

Fig. 5. Il DCA ha sensibilizzato le cellule HNC resistenti al cisplatino. (A) La vitalità cellulare è stata valutata mediante esclusione del blu di tripan dopo esposizione a cisplatino (CDDP), DCA o alla loro combinazione. L’effetto citotossico del DCA è stato bloccato dall’antiossidante N-acetil-l-cisteina(NAC, 3 mM). Le barre di errore rappresentano la S.E. di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito con tre campioni in triplo. * indica P <0,01 rispetto al controllo e ** indica P <0,01 rispetto al pretrattamento con NAC. (B) Western blotting che mostra una maggiore sensibilità al cisplatino (CDDP) da parte del DCA. Le cellule AMC-HN4R resistenti al cisplatino sono state trattate con DCA, cisplatino o entrambi per 72 ore. (C) Elevazione della caspasi dopo un’esposizione di 72 ore a DCA, cisplatino e PDHE1α siRNA. Le cellule HN4R sono state esposte a DCA, cisplatino o alla combinazione di entrambi i farmaci e l’attività della caspasi è stata misurata.(D) Variazioni del ΔΨm nelle cellule HN4R dopo un’esposizione di 36 ore a DCA, cisplatino o alla combinazione di entrambi i farmaci. Il ΔΨm è stato misurato utilizzando l’estere etilico della tetrametil rodamina e analizzato mediante citometria a flusso. L’intensità mediana della fluorescenza di ciascun gruppo di trattamento è stata normalizzata rispetto al gruppo di controllo. Le barre di errore rappresentano la S.E. di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito con campioni in triplo. * e ** indicano P <0,01 rispetto al controllo e al siRNA scrambled (scr), rispettivamente. *** denota P <0,01 rispetto a DCA o cisplatino da soli.

Questi risultati sono stati ulteriormente esaminati in modelli murini di xenotrapianto tumorale in vivo. Topi atimici nudi BALB/c portatori di tumori AMC-HN4-cisR o HN9-cisR sono stati trattati con DCA, cisplatino, DCA più cisplatino o veicolo. La combinazione di cisplatino e DCA ha soppresso sinergicamente la crescita tumorale (Fig. 6A). L’imaging in vivo della crescita tumorale è stato condotto mediante 18 F-FDG PET il giorno 21 del trattamento. Sono state osservate captazioni focali di 18 F-FDG nei siti di impianto del tumore, dove sono stati misurati l’uptake massimo standardizzato (SUVmax) e il volume tumorale metabolico a SUV 2.0 (MTV2.0). Il SUVmax non era diverso tra i gruppi di trattamento (P > 0,1), ma il MTV2,0 era significativamente più basso nei gruppi trattati con DCA e combinazione rispetto agli altri gruppi (P < 0,05) (Fig. 6B). I saggi di apoptosi in situ hanno mostrato che i corpi apoptotici TUNEL-positivi erano più frequenti nei tumori trattati con DCA e cisplatino più DCA rispetto a quelli trattati con il veicolo (P < 0,01) (Fig. 6C). Le analisi Western blot dei tessuti tumorali hanno mostrato che i livelli di proteine apoptotiche sono aumentati in misura maggiore nelle cellule HN4-cisR trattate con la combinazione di cisplatino e DCA rispetto ai tumori trattati con i singoli agenti (Fig. 6D).

Fig. 6. Il DCA sensibilizza le cellule HNC resistenti al cisplatino in vivo. (A) Effetto antitumorale di DCA e cisplatino in un modello murino di xenotrapianto tumorale. A topi nudi sono state iniettate 5 ×106 cellule AMC-HN4R e HN9R nel fianco. I trattamenti con veicolo, cisplatino (CDDP), DCA o la combinazione di cisplatino e wogonina sono iniziati quando le cellule tumorali impiantate hanno formato noduli palpabili. Ogni gruppo comprendeva dieci topi. Le barre di errore rappresentano l’E.S. * e ** indicano rispettivamente P <0,05 e P <0,01 rispetto al controllo (ctr). (B) Imaging tumorale in vivo mediante tomografia a emissione di positroni (PET) con 18F-fluorodeossiglucosio. La scansione PET è stata eseguita 3 settimane dopo l’inizio del trattamento. Il volume massimo di captazione standardizzato (SUVmax) e il volume metabolico del tumore (MTV2.0) sono stati ottenuti nei tumori (frecce) e i valori medi sono stati confrontati tra i diversi gruppi di trattamento. * e ** indicano rispettivamente P <0,05 e P <0,01 rispetto al controllo. (C) Quantificazione da saggi TUNEL in situ in sezioni tumorali di ciascun gruppo. I corpi apoptotici TUNEL-positivi sono stati contati in cieco in dieci campi ad alta potenza selezionati a caso. Le barre di errore rappresentano l’E.S. Test t di Student a due code, * indica P <0,01. (D) Analisi Western blot in ogni gruppo. (D) Analisi Western blot delle proteine PARP scissa, fosfo-p53-ser15, caspasi 3 scissa e PDHE1α ottenute da tumori trattati con veicolo di controllo, DCA, cisplatino o la combinazione di entrambi i farmaci. la β-actina è servita come controllo di carico interno.

Discussione

L’aumento della glicolisi, frequentemente riscontrato nel cancro, è strettamente legato alla compromissione mitocondriale o alla fosforilazione ossidativa difettosa e contribuisce alla resistenza terapeutica [18,19]. La glicolisi aerobica è stata implicata nella resistenza alla chemioterapia [20] o alla radioterapia [21]. Nel presente studio, le linee cellulari resistenti al cisplatino mostrano una glicolisi elevata, indicando un legame biochimico tra glicolisi e chemioresistenza. Le cellule resistenti ai farmaci mostrano una maggiore necessità di ATP rispetto alle cellule normali per mantenere l’omeostasi cellulare e attivare le vie di sopravvivenza che consentono di sfuggire alla morte cellulare in caso di stress genotossico [20]. Le cellule tumorali resistenti aumentano la glicolisi per generare rapidamente ATP e soddisfare la domanda intracellulare. Ciò è stato chiaramente riscontrato nelle nostre cellule resistenti al cisplatino rispetto alle cellule parentali sensibili, indicando che la resistenza ai farmaci nell’HNC è direttamente associata a un aumento della glicolisi. Ciò implica che il cambiamento bioenergetico delle cellule tumorali verso un aumento della glicolisi è legato alla chemioresistenza [14,22]. Pertanto, il livello di glicolisi nei tumori umani può essere un biomarcatore di chemioresistenza e richiede una validazione clinica nei tessuti tumorali umani.

Il presente studio dimostra che il DCA sposta la generazione di energia dalla glicolisi all’ossidazione mitocondriale del glucosio nell’HNC. L’inversione dello spostamento metabolico verso la glicolisi, indotta dal DCA, elimina il vantaggio proliferativo delle cellule tumorali e porta infine alla morte cellulare [23]. Il DCA, come analogo strutturale del piruvato, inibisce la PDK e riattiva la PDH, un enzima che fa parte del complesso che converte il piruvato in acetil-CoA, il substrato primario del ciclo di Krebs [10,23]. Poiché la maggior parte dei tipi di cancro produce un ambiente ipossico, le cellule tumorali si affidano alla glicolisi anaerobica come fonte energetica primaria. L’attivazione del fattore inducibile dell’ipossia (HIF) induce la PDK mitocondriale [24]. L’attività della PDH mitocondriale nel cancro è bloccata dalla PDK, con conseguente minore disponibilità di acetil-CoA per l’ossidazione mitocondriale del glucosio [24]. L’aumento dell’espressione di PDK è associato alla resistenza ai farmaci nel cancro [25,26]. Nelle cellule HNC si osserva anche un’iperregolazione di PDK2 dovuta a mutazioni mitocondriali e alla stabilizzazione di HIF1α [27]. Nel presente studio è stata confermata anche l’associazione tra sovraespressione di PDK2 e resistenza al cisplatino nelle cellule HNC. Questi risultati indicano l’importanza di PDK come nuovo bersaglio molecolare nella terapia del cancro [10]. Dati precedenti hanno dimostrato che l’inibizione genetica o farmacologica di PDK modifica la bioenergetica del cancro e ripristina l’apoptosi mitocondri-dipendente nelle cellule tumorali [11,13]. Pertanto, il DCA è efficace per superare la resistenza ai trattamenti nei tumori con fenotipi aggressivi in vitro e in vivo[12-14].

L’attivazione della PDH da parte del DCA induce l’accumulo di mROS nelle cellule tumorali. Le cellule tumorali presentano una riduzione del metabolismo mitocondriale del glucosio, con conseguente diminuzione dell’attività della catena di trasporto degli elettroni (ETC) e della mROS [10], [28]. Il rimodellamento mitocondriale dell’iperpolarizzazione del ΔΨm e la diminuzione della produzione di mROS nel cancro portano alla resistenza all’apoptosi sotto stress genotossico. Nelle cellule tumorali resistenti con un fenotipo più glicolitico, l’HK2 determina la sua traslocazione alla membrana mitocondriale esterna e l’aumento del ΔΨm [29]. L’inibizione della glicolisi e della traslocazione di HK2 riduce il ΔΨm del tumore e inverte la resistenza all’apoptosi [29]. Nel presente studio, l’aumento dell’espressione di HK2 e PDK2 e del potenziale di membrana mitocondriale è stato riscontrato anche nelle cellule tumorali resistenti al cisplatino. Il DCA forza l’ingresso del piruvato nei mitocondri attraverso l’attivazione della PDH, il regolatore di gate-keeping dell’ossidazione mitocondriale del glucosio, e diminuisce il ΔΨm e aumenta il mROS [13]. Nel presente studio, il DCA ha semplicemente invertito l’elevato rimodellamento mitocondriale nelle cellule HNC resistenti al cisplatino, che ha contribuito alla morte delle cellule tumorali. L’attivazione dell’ossidazione mitocondriale del glucosio da parte del DCA ha indotto l’mROS e l’attivazione della segnalazione mitocondriale a valle, con conseguente attivazione di p53 e delle relative vie pro-apoptotiche, portando alla morte delle cellule tumorali chemioresistenti. Nel nostro studio, l’inibizione farmacologica della produzione di mROS o dell’apoptosi mediata dalla caspasi ha attenuato l’effetto citotossico del DCA nelle cellule HNC, confermando i meccanismi noti del farmaco.

Studi preclinici e clinici supportano l’uso del DCA in pazienti oncologici e in pazienti con acidosi lattica associata a malattie mitocondriali [10,23]. Numerosi studi dimostrano gli effetti citotossici del DCA, da solo o in combinazione con altri trattamenti, in una varietà di tumori derivati da tutti e tre gli strati germinali [23]. Uno studio precedente ha dimostrato che il glioblastoma, uno dei tumori umani più aggressivi, sovraesprime PDK2 nei tessuti tumorali prelevati da 49 pazienti e regredisce in cinque pazienti dopo il trattamento con DCA, dimostrando il beneficio clinico del DCA nei tumori resistenti [13]. Nell’HNC, uno studio recente ha confrontato l’effetto del DCA in tre linee cellulari di carcinoma orale a cellule squamose (OSCC) [15]. Le cellule OSCC che presentavano un deficit di fosforilazione ossidativa mitocondriale (cioè un’elevata glicolisi) erano più sensibili al DCA rispetto alle altre [15,30]. Il presente studio ha confermato che le cellule HNC con elevate alterazioni bioenergetiche sono più sensibili al DCA. Infatti, poiché le cellule tumorali chemioresistenti tendono ad avere un’elevata glicolisi, queste cellule potrebbero essere bersaglio di inibitori metabolici [31]. Pertanto, il DCA è un buon candidato per trattare le cellule tumorali con fenotipi aggressivi, comprese le cellule HNC chemioresistenti. Tuttavia, poiché i potenziali effetti antitumorali del DCA sono ancora controversi, in particolare nei tumori in condizioni di ipossia, sono necessari ulteriori studi preclinici e clinici sul DCA e il cancro [32]. Una recente revisione sistematica mostra che il DCA sinergizza con molti agenti antitumorali standard e gli studi clinici di fase iniziale suggeriscono che il DCA cronico è sicuro e ben tollerato quando viene somministrato per via orale 12,5 mg/kg due volte al giorno [23].

Il nostro studio ha rivelato che il DCA sinergizza con il cisplatino e quindi aggira la resistenza al cisplatino nelle cellule HNC. Poiché il cisplatino è un agente chemioterapico di prima linea nell’HNC, la combinazione di cisplatino e DCA potrebbe essere efficace in ambito clinico per ridurre la tossicità e superare la resistenza ai farmaci antitumorali. Rapporti precedenti hanno dimostrato che il DCA potenzia l’effetto citotossico del cisplatino inducendo l’apoptosi dipendente dai mitocondri [33,34]. Il legame di due molecole di DCA con il cisplatino, chiamato mitaplatino, induce l’uccisione selettiva delle cellule tumorali [35,36]. Questi risultati dimostrano che il DCA può avere ulteriori benefici in combinazione con le attuali terapie antitumorali. Nel nostro studio, il DCA e la sua combinazione con il cisplatino non hanno influenzato la SUVmax, ma hanno ridotto significativamente l’MTV2.0. Ciò significa che il DCA sopprime efficacemente il tumore e il suo impatto sulla salute. Ciò significa che il DCA sopprime efficacemente la crescita tumorale in vivo, nonostante non vi siano cambiamenti significativi nell’assorbimento massimo di glucosio nelle ROI localizzate nel tumore. Il presente studio è il primo a dimostrare che il DCA ripristina l’effetto citotossico del cisplatino nelle cellule HNC resistenti ai farmaci in vitro e in vivo. Il DCA ha indotto un forte aumento dell’apoptosi mediata dal cisplatino attraverso l’attivazione di p53, PARP e caspasi nelle cellule HNC resistenti al cisplatino. Il DCA ha sensibilizzato le cellule HNC farmaco-resistenti al cisplatino, determinando una maggiore citotossicità e una terapia più efficace per l’HNC aggressivo. Nel complesso, questi risultati possono avere un’importanza clinica fondamentale: indurre la morte delle cellule resistenti con il DCA potrebbe ridurre la dose di cisplatino necessaria in ambito clinico e quindi minimizzare i potenziali effetti avversi della chemioterapia con cisplatino.

In conclusione, i nostri dati suggeriscono che l’elevata glicolisi e la sovraespressione di PDK sono strettamente legate alla resistenza al cisplatino nelle cellule HNC. Il DCA sposta la bioenergetica delle cellule HNC verso la fosforilazione ossidativa mitocondriale. Questo porta a una diminuzione di ΔΨm e a un aumento di mROS, sensibilizzando così le cellule HNC chemioresistenti al cisplatino in vitro e in vivo. Questi dati giustificano ulteriori indagini precliniche e cliniche sul DCA, un promettente candidato farmaco antitumorale, negli HNC con fenotipi aggressivi. Tuttavia, le nostre conclusioni devono essere prese in considerazione con cautela, in uno scenario opposto. La fosforilazione ossidativa mitocondriale difettosa è stata correlata alla sensibilità delle cellule tumorali alle condizioni di basso glucosio, che potrebbe essere utilizzata come biomarcatore per la terapia del cancro [37]. Le cellule tumorali sono anche adattate a facilitare la proliferazione attraverso l’assorbimento e l’incorporazione di nutrienti nella biomassa piuttosto che per un’efficiente produzione di ATP [38]. Pertanto, gli effetti preclinici e clinici del DCA sull’HNC e su altri tipi di cancro dovrebbero essere ulteriormente esaminati.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (2015R1A2A1A15054540) del Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), Ministero della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura, e da una sovvenzione (HI14C23050000) del Korean Health Technology R&D Project, Ministero della Salute e del Benessere, Seoul, Repubblica di Corea (J.-L. Roh).

Conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

RIFERIMENTI


1 A. Jemal, F. Bray, M.M. Center, J. Ferlay, E. Ward, D. Forman, Statistiche globali sul cancro, CA Cancer J. Clin, Vol. 61, 2011, 69-90
2 R.I. Haddad, D.M. Shin, Recent advances in head and neck cancer, N. Engl. J. Med, Vol. 359, 2008, 1143-1154
3 E.B. Lamont, E.E. Vokes, Chemotherapy in the management of squamous-cell carcinoma of the head and neck, Lancet Oncol, Vol. 2, 2001, 261-269
4 F. Petrelli, A. Coinu, V. Riboldi, K. Borgonovo, M. Ghilardi, M. Cabiddu, Concomitante chemioterapia a base di platino o cetuximab con radioterapia per il tumore della testa e del collo localmente avanzato: una revisione sistematica e una meta-analisi degli studi pubblicati, Oral Oncol, Vol. 50, 2014, 1041-1048
5 D. Hanahan, R.A. Weinberg, Hallmarks of cancer: the next generation, Cell, Vol. 144, 2011, 646-674
6 J.R. Cantor, D.M. Sabatini, Cancer cell metabolism: one hallmark, many faces, Cancer Discov, Vol. 2, 2012, 881-898
7 Y. Zhao, E.B. Butler, M. Tan, Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics, Cell Death Dis, Vol. 4, 2013, e532
8 R.A. Cairns, I.S. Harris, T.W. Mak, Regulation of cancer cell metabolism, Nat. Rev. Cancer, Vol. 11, 2011, 85-95
9 R.H. Xu, H. Pelicano, Y. Zhou, J.S. Carew, L. Feng, K.N. Bhalla, Inhibition of glycolysis in cancer cells: a novel strategy to overcome drug resistance associated with mitochondrial respiratory defect and hypoxia, Cancer Res, Vol. 65, 2005, 613-621
10 G. Sutendra, E.D. Michelakis, Pyruvate dehydrogenase kinase as a novel therapeutic target in oncology, Front. Oncol, Vol. 3, 2013, 38
11 G. Sutendra, P. Dromparis, A. Kinnaird, T.H. Stenson, A. Haromy, J.M. Parker, Mitochondrial activation by inhibition of PDKII suppresses HIF1a signaling and angiogenesis in cancer, Oncogene, Vol. 32, 2013, 1638-1650
12 R.C. Sun, M. Fadia, J.E. Dahlstrom, C.R. Parish, P.G. Board, A.C. Blackburn, Reversal of the glycolytic phenotype by dichloroacetate inhibits metastatic breast cancer growth in vitro and in vivo, Breast Cancer Res. Treat, Vol. 120, 2010, 253-260
13 E.D. Michelakis, G. Sutendra, P. Dromparis, L. Webster, A. Haromy, E. Niven, Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate, Sci. Transl. Med, Vol. 2, 2010, 31ra34
14 Y.C. Shen, D.L. Ou, C. Hsu, K.L. Lin, C.Y. Chang, C.Y. Lin, L’attivazione della fosforilazione ossidativa da parte di un inibitore della piruvato deidrogenasi chinasi supera la resistenza al sorafenib del carcinoma epatocellulare, Br. J. Cancer, Vol. 108, 2013, 72-81
15 V. Ruggieri, F. Agriesti, R. Scrima, I. Laurenzana, D. Perrone, T. Tataranni, Il dicloroacetato, un farmaco selettivo per i mitocondri nel carcinoma orale a cellule squamose: una prospettiva metabolica del trattamento, Oncotarget, Vol. 6, 2015, 1217-1230
16 M. Nakamura, K. Nakatani, K. Uzawa, K. Ono, H. Uesugi, K. Ogawara, Establishment and characterization of a cisplatin-resistant oral squamous cell carcinoma cell line, H-1R, Oncol. Rep, Vol. 14, 2005, 1281-1286
17 T.C. Chou, Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method, Cancer Res, Vol. 70, 2010, 440-446
18 N. Guaragnella, S. Giannattasio, L. Moro, Mitochondrial dysfunction in cancer chemoresistance, Biochem. Pharmacol, Vol. 92, 2014, 62-72
19 S. Ganapathy-Kanniappan, J.F. Geschwind, Tumor glycolysis as a target for cancer therapy: progress and prospects, Mol. Cancer, Vol. 12, 2013, 152
20 Y. Zhou, F. Tozzi, J. Chen, F. Fan, L. Xia, J. Wang, Intracellular ATP levels are a pivotal determinant of chemoresistance in colon cancer cells, Cancer Res, Vol. 72, 2012, 304-314
21 S.P. Pitroda, B.T. Wakim, R.F. Sood, M.G. Beveridge, M.A. Beckett, D.M. MacDermed, STAT1-dependent expression of energy metabolic pathways links tumour growth and radioresistance to the Warburg effect, BMC Med, Vol. 7, 2009, 68
22 B. Bhattacharya, S.H. Low, C. Soh, N. Kamal Mustapa, M. Beloueche-Babari, K.X. Koh, L’aumento della resistenza ai farmaci è associato a livelli ridotti di glucosio e a un fenotipo di glicolisi potenziato, Br. J. Pharmacol, Vol. 171, 2014, 3255-3267
23 S. Kankotia, P.W. Stacpoole, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1846, 2014, 617-629
24 J.W. Kim, I. Tchernyshyov, G.L. Semenza, C.V. Dang, HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia, Cell Metab, Vol. 3, 2006, 177-185
25 Y. Sun, A. Daemen, G. Hatzivassiliou, D. Arnott, C. Wilson, G. Zhuang, Metabolic and transcriptional profiling reveals pyruvate dehydrogenase kinase 4 as a mediator of epithelial-mesenchymal transition and drug resistance in tumor cells, Cancer Metab, Vol. 2, 2014, 20
26 C.W. Lu, S.C. Lin, C.W. Chien, S.C. Lin, C.T. Lee, B.W. Lin, Overexpression of pyruvate dehydrogenase kinase 3 increases drug resistance and early recurrence in colon cancer, Am. J. Pathol, Vol. 179, 2011, 1405-1414
27 W. Sun, S. Zhou, S.S. Chang, T. McFate, A. Verma, J.A. Califano, Mutazioni mitocondriali contribuiscono all’accumulo di HIF1alpha attraverso l’aumento delle specie reattive dell’ossigeno e l’up-regolazione della piruvato deidrogenasi chinasi 2 nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, Clin. Cancer Res, Vol. 15, 2009, 476-484
28 S. Bonnet, S.L. Archer, J. Allalunis-Turner, A. Haromy, C. Beaulieu, R. Thompson, L’asse dei canali è soppresso nel cancro e la sua normalizzazione promuove l’apoptosi e inibisce la crescita del cancro, Cancer Cell, Vol. 11, 2007, 37-51
29 J.G. Pastorino, J.B. Hoek, N. Shulga, Activation of glycogen synthase kinase 3beta disrupts the binding of hexokinase II to mitochondria by phosphorylating voltage-dependent anion channel and potentiates chemotherapy-induced cytotoxicity, Cancer Res, Vol. 65, 2005, 10545-10554
30 L.H. Stockwin, S.X. Yu, S. Borgel, C. Hancock, T.L. Wolfe, L.R. Phillips, Sodium dichloroacetate selectively targets cells with defects in the mitochondrial ETC, Int. J. Cancer, Vol. 127, 2010, 2510-2519
31 E.J. Sullivan, M. Kurtoglu, R. Brenneman, H. Liu, T.J. Lampidis, Targeting cisplatin-resistant human tumor cells with metabolic inhibitors, Cancer Chemother. Pharmacol, Vol. 73, 2014, 417-427
32 S. Shahrzad, K. Lacombe, U. Adamcic, K. Minhas, B.L. Coomber, Sodium dichloroacetate (DCA) reduces apoptosis in colorectal tumor hypoxia, Cancer Lett, Vol. 297, 2010, 75-83
33 D. Heshe, S. Hoogestraat, C. Brauckmann, U. Karst, J. Boos, C. Lanvers-Kaminsky, Dichloroacetate metabolically targeted therapy defeats cytotoxicity of standard anticancer drugs, Cancer Chemother. Pharmacol, Vol. 67, 2011, 647-655
34 J. Xie, B.S. Wang, D.H. Yu, Q. Lu, J. Ma, H. Qi, Il dicloroacetato sposta il metabolismo dalla glicolisi all’ossidazione del glucosio e mostra un’inibizione sinergica della crescita con il cisplatino nelle cellule HeLa, Int. J. Oncol, Vol. 38, 2011, 409-417
35 S. Dhar, S.J. Lippard, Mitaplatin, una potente fusione di cisplatino e del farmaco orfano dicloroacetato, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 106, 2009, 22199-22204
36 X. Xue, S. You, Q. Zhang, Y. Wu, G.Z. Zou, P.C. Wang, Mitaplatin increases sensitivity of tumor cells to cisplatin by inducing mitochondrial dysfunction, Mol. Pharm, Vol. 9, 2012, 634-644
37 K. Birsoy, R. Possemato, F.K. Lorbeer, E.C. Bayraktar, P. Thiru, B. Yucel, Metabolic determinants of cancer cell sensitivity to glucose limitation and biguanides, Nature, Vol. 508, 2014, 108-112
38 M.G. Vander Heiden, L.C. Cantley, C.B. Thompson, Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell

Contenuti correlati:

Lascia un commento