Il dicloroacetato radiosensibilizza le cellule di cancro al seno ipossiche

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Sven de Mey¹, Inès Dufait ¹, Heng Jiang¹, Cyril Corbet ², Hui Wang¹, Melissa Van De Gucht ¹, Lisa Kerkhove ¹, Ka Lun Law ¹, Hugo Vandenplas ³, Thierry Gevaert ¹, Olivier Feron ² e Mark De Ridder ¹,*

1 Dipartimento di Radioterapia, Universitair Ziekenhuis Brussel, Vrije Universiteit Brussel, 1090 Bruxelles, Belgio; [email protected] (S.d.M.); [email protected] (I.D.); [email protected] (H.J.); [email protected] (H.W.); [email protected] (M.V.D.G.); [email protected] (L.K.); [email protected] (K.L.L.); [email protected] (T.G.)
2 Polo di Farmacologia e Terapeutica (FATH), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), UCLouvain, 1200 Bruxelles, Belgio; [email protected] (C.C.); [email protected] (O.F.)
3 Dipartimento di Oncologia Medica, Universitair Ziekenhuis Brussel, Vrije Universiteit Brussel, 1090 Bruxelles, Belgio; [email protected]

Corrispondenza: [email protected]

Ricevuto: 14 settembre 2020
Accettato: 4 dicembre 2020
Pubblicato: 9 dicembre 2020

Abstract

Il metabolismo mitocondriale è un bersaglio interessante per la terapia del cancro. La riprogrammazione delle vie metaboliche può potenzialmente sensibilizzare i tumori con opzioni terapeutiche limitate, come il cancro al seno triplo negativo (TNBC), alla chemioterapia e/o alla radioterapia. Il dicloroacetato (DCA) è un inibitore specifico della piruvato deidrogenasi chinasi (PDK), che porta a una maggiore produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). I ROS sono le principali molecole effettrici delle radiazioni e un loro aumento aumenta la risposta alla radio. In questo studio abbiamo valutato gli effetti del DCA e della radioterapia su due linee cellulari TNBC, EMT6 e 4T1, in condizioni aerobiche e ipossiche. Come previsto, il trattamento con DCA ha ridotto la piruvato deidrogenasi fosforilata (PDH) e ha abbassato il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e la produzione di lattato. In particolare, il trattamento con DCA ha portato a un aumento significativo della produzione di ROS (fino a 15 volte) nelle cellule tumorali ipossiche, ma non in quelle aerobiche. Coerentemente, il DCA ha radiosensibilizzato le cellule tumorali ipossiche e gli sferoidi 3D, lasciando invariata la radiosensibilità intrinseca delle cellule tumorali. I nostri risultati suggeriscono che, sebbene descritto come un farmaco che promuove la fosforilazione ossidativa (OXPHOS), il DCA può anche aumentare la radioresponsività ipossica. Questo studio apre quindi la strada alla possibilità di intervenire sul metabolismo mitocondriale delle cellule tumorali ipossiche, in particolare per combattere la radioresistenza.

Parole chiave: dicloroacetato; radiosensibilità ipossica; cancro al seno; specie reattive dell’ossigeno

© 2020 dagli autori. Licenziatario MDPI, Basilea, Svizzera. Questo articolo è un articolo ad accesso libero distribuito secondo i termini e le condizioni della licenza Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

INTRODUZIONE

Il cancro al seno è il tumore più comune nelle donne a livello globale e provoca ogni anno 627.000 decessi ^[1]. Negli ultimi decenni sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento del cancro al seno. Tuttavia, sono disponibili solo terapie limitate per le pazienti con tumori al seno triplo-negativi/basali-like ^[2,3,4]. Lo standard di cura per il trattamento dei tumori al seno ad alto rischio consiste nella chemioterapia neoadiuvante e nella chirurgia, seguite dall’irradiazione post-operatoria di tutto il seno e della parete toracica. Oggi i ricercatori si concentrano sull’ipofrazionamento della radioterapia adiuvante (studio FAST-Forward ^[5]) o sulla combinazione di chemioterapia e radioterapia preoperatoria. L’approccio radioterapico preoperatorio potrebbe migliorare la sopravvivenza libera da malattia e la qualità di vita ^{[6,7,8,9,10,11]}.

L’effetto principale delle radiazioni, in particolare di quelle a basso trasferimento di energia lineare, è l’induzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Durante la radioterapia, i ROS vengono creati dalla radiolisi dell’acqua negli ambienti extracellulari e sono tossici per le cellule tumorali e per i tessuti normali vicini. Circa due terzi dei danni al DNA indotti dalle radiazioni sono attribuiti ai ROS nelle cellule di mammifero ^[12]. La risposta delle cellule ai danni al DNA indotti dalle radiazioni dipende fortemente dalla presenza di ossigeno. Le molecole di ossigeno possono infatti fissare i danni al DNA prodotti dai radicali liberi. Questa è la cosiddetta “ipotesi della fissazione dell’ossigeno” ^[12,13]. In assenza di ossigeno, i radicali del DNA vengono ridotti da composti contenenti gruppi sulfidrilici, che riparano il DNA nella sua forma originale. Secondo questa ipotesi, l’ipossia, definita da bassi livelli di ossigeno nel tumore, è una delle principali cause di fallimento clinico della radioterapia ^[14,15]. L’ipossia è una caratteristica comune del microambiente tumorale. I ROS e l’ipossia sono due fattori con effetti opposti sulla risposta radioterapica del tumore ^[16]. L’ipotesi generalmente accettata affermava che nelle regioni ipossiche del tumore si verificava un minore stress ossidativo a causa della carenza di ossigeno substrato dei ROS. Tuttavia, recenti evidenze hanno rivelato che in condizioni di ipossia le cellule generano più ROS, soprattutto attraverso il metabolismo mitocondriale ^{[17,18,19,20]}.

Un tratto distintivo delle cellule tumorali è la capacità di alterare il proprio metabolismo, fornendo l’energia e i metaboliti necessari per la crescita e la sopravvivenza in condizioni di limitazione dei nutrienti e dell’ossigeno. Tuttavia, in presenza di _O2, le cellule tumorali adattano il loro metabolismo alla glicolisi, deviando l’ossidazione mitocondriale del piruvato verso la produzione di lattato ^[21,22]. Questo effetto viene definito effetto Warburg. Rapporti recenti indicano che l’effetto Warburg è implicato nella resistenza allo stress citotossico indotto dalla chemioterapia o dalla radioterapia ^{[23,24,25,26,27]}. In questo modo, i metodi di trattamento che bloccano o riducono il metabolismo glicolitico possono aumentare la sensibilità delle cellule tumorali alla radioterapia.

In condizioni di ipossia, l’hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1α) causa un aumento dell’espressione delle piruvato deidrogenasi chinasi (PDK1-4) ^[28]. Questi enzimi sono responsabili della commutazione del metabolismo nei mitocondri regolando lo stato di fosforilazione (cioè lo stato di attività) della piruvato deidrogenasi (PDH), che è una delle principali proteine gatekeeper tra la glicolisi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS). Il dicloroacetato (DCA), una piccola molecola inibitrice della PDK, può invertire l’effetto Warburg attivando la PDH e reindirizzando il metabolismo del piruvato nei mitocondri. L’inibizione della PDK da parte del DCA è utilizzata per trattare l’acidosi lattica e le malattie mitocondriali ereditarie ^[29,^30]. Nel complesso, queste osservazioni hanno portato a considerare il DCA come un potenziale farmaco antitumorale ^[30,31].

È stato dimostrato che il DCA aumenta la radiosensibilità delle cellule tumorali del colon e della prostata, nonché del carcinoma esofageo a cellule squamose e del glioblastoma ^{[32,33,34,35]}. Tuttavia, non sono state condotte ricerche simili su cellule di cancro al seno. Il principale meccanismo di radiosensibilizzazione in questi modelli è stato attribuito allo stress ossidativo. Allo stesso tempo, anche l’arresto del ciclo cellulare nella fase G2-M e una ridotta capacità di riserva mitocondriale hanno contribuito agli effetti radiosensibilizzanti. Sulla base dei risultati precedentemente descritti, sono attualmente in corso due studi clinici (uno nel carcinoma della testa e del collo e uno nel glioblastoma) che studiano gli effetti antitumorali del DCA combinato con il trattamento radioterapico ^[36^,37]. Tutte le ricerche precliniche sono state condotte in condizioni aerobiche, ma non sono disponibili dati sugli effetti del trattamento con DCA in condizioni di ipossia. Pertanto, nel presente studio, abbiamo innanzitutto esaminato l’ipotesi che il DCA abbassi il lattato e commuti il metabolismo da un fenotipo glicolitico all’OXPHOS. Successivamente, abbiamo determinato se il DCA può radiosensibilizzare le cellule di cancro al seno ipossiche e abbiamo esaminato ulteriormente i meccanismi sottostanti. I risultati di questo studio possono avere importanti implicazioni per gli studi clinici volti a utilizzare gli inibitori della PDK per migliorare la risposta alla radioterapia nelle pazienti affette da cancro al seno.

Risultati

L’elevata espressione di PDK1 e PDK3 nelle pazienti con carcinoma mammario triplo-negativo (TNBC) e basale (Basal-Like Breast Cancer) è correlata a una firma genica correlata all’ipossia
In primo luogo, utilizzando il portale online e pubblicamente accessibile cBioPortal for Cancer Genomics, abbiamo analizzato i livelli di mRNA dei quattro diversi isomeri di PDK, ovvero PDK1, PDK2, PDK3 e PDK4, in dati derivati da pazienti provenienti dal dataset di tumori primari del cancro al seno TCGA (PanCancer Atlas and Cell 2015)^[38,39]. Abbiamo evidenziato un aumento significativo (p < 0,0001) dell’espressione di PDK1 e PDK3 nei TNBC rispetto ai non-TNBC e nei tumori al seno di tipo basale rispetto ad altri sottotipi come i tumori al seno luminali A, luminali B e arricchiti di HER2 (Figura 1a-c). In particolare, l’upregulation di PDK1 e PDK3 nelle pazienti con carcinoma mammario potrebbe essere correlata a punteggi di ipossia Ragnum e Buffa più elevati ^[40,41] (Figura 1d). Questi punteggi di ipossia si basano sull’espressione differenziale di specifici geni correlati all’ipossia e sono liberamente accessibili attraverso il cBioPortal for Cancer Genomics. L’osservata upregulation di PDK1 e PDK3 nei tumori al seno simili al basale e la loro correlazione con un fenotipo ipossico (che è legato all’attivazione di un programma trascrizionale HIF1α-dipendente), suggerisce che l’uso di inibitori di PDK potrebbe servire come un’interessante modalità terapeutica per la radiosensibilizzazione ipossica ^[42,43,44].

**Figura 1.** L’aumento dell’espressione dell’mRNA di PDK1 e PDK3 è correlato alle firme geniche legate all’ipossia nei tumori al seno triplo-negativi e basali.(a) Espressione di PDK1-4 mRNA (RNA-seq) nel sottotipo di tumore al seno non triplo negativo (non-TNBC) rispetto ai casi TNBC.(b) Espressione di PDK1-4 mRNA (RNA-seq) in diversi sottotipi di cancro al seno classificati dalla classificazione Pam50 del dataset TCGA (luminale A, luminale B, HER2+ e basale).(c) Numero di campioni nel dataset TCGA che hanno uno *z-score* di z > 2 per PDK1-4 in diversi sottotipi di cancro al seno classificati dal sistema di classificazione Pam50.(d) Il Buffa hypoxia score (a sinistra) e il Ragnum hypoxia score (a destra) sono correlati con la sovraespressione(z >2) di PDK1-4 mRNA. **** p < 0.0001.

IlDCA ha ridotto la PDH fosforilata, i livelli di lattato extracellulare e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR)
Abbiamo iniziato i nostri esperimenti in vitro eseguendo saggi di vitalità (Figura S1a,b) per determinare le proprietà di inibizione della crescita del DCA. Il DCA ha ridotto la vitalità cellulare in modo dose-dipendente nelle cellule tumorali EMT6 e 4T1, indipendentemente dallo stato di _O2 (Figura S1a). Un saggio di proliferazione ha inoltre mostrato che aumentando le concentrazioni di DCA si è osservato un passaggio da un ritardo nella crescita a effetti citostatici e persino citotossici (Figura S1b).

Successivamente, abbiamo analizzato l’influenza del DCA sull’attività di PDK1-4 e sul metabolismo delle cellule TNBC. La PDH è una proteina chiave della glicolisi e dell’OXPHOS mitocondriale, ovvero catalizza la decarbossilazione del piruvato in acetil-CoA. La PDH è inibita attraverso la fosforilazione (su Ser293) da parte della PDK, e questa inibizione può essere invertita attraverso la de-fosforilazione da parte della piruvato deidrogenasi fosfatasi (PDP) ^[45,^46] (Figura 2a). A dosi di tossicità accettabili (30 mM, 45 mM e 60 mM), abbiamo valutato l’effetto del DCA sull’attività della PDK misurando i livelli di PDH fosforilata (p-PDH), il lattato nel mezzo extracellulare e l’ECAR delle cellule in tempo reale (Figura 2b-e). Tutte e tre le dosi di DCA hanno ridotto la quantità di p-PDH nelle cellule EMT6 e 4T1 in modo dose-dipendente sia in condizioni ossigenate che ipossiche. La diminuzione della p-PDH è stata significativa per tutte le dosi di DCA nelle EMT6, mentre nelle 4T1 solo 45 mM e 60 mM hanno ridotto significativamente la p-PDH in condizioni di ipossia (Figura 2b,c). Valutando l’effetto di dosi inferiori di DCA, abbiamo riscontrato che nelle cellule EMT6 la quantità di p-PDH inizia a diminuire quando vengono trattate con 3 mM DCA e nelle cellule 4T1 quando vengono trattate con 10 mM DCA (Figura S2a,b). La quantità di lattato nel mezzo è risultata elevata in condizioni ipossiche rispetto a quelle aerobiche in entrambe le linee cellulari, a sostegno di un aumento netto del turnover glicolitico nelle cellule prive di _O2^[47,48]. In accordo con i risultati del Western blot, il trattamento con DCA ha portato a una diminuzione dose-dipendente del lattato nel mezzo per entrambe le linee cellulari (Figura 2d). Sebbene la riduzione del rilascio di lattato sia stata drastica in condizioni aerobiche, una riduzione dose-dipendente della produzione del prodotto glicolitico finale è stata osservata anche in ipossia. Infine, il DCA, a partire da una dose di 7,5 mM, ha causato una riduzione tempo-dipendente dell’ECAR sia nell’EMT6 che nel 4T1 (Figura 2e). Il calo iniziale dell’ECAR dopo il trattamento con dosi inferiori a 30 mM di DCA è stato compensato dopo 2,5 ore in EMT6. In 4T1, abbiamo osservato lo stesso effetto con dosi di DCA inferiori a 15 mM. Questi risultati indicano che il trattamento di linee cellulari TNBC murine con DCA inibisce la fosforilazione di PDH e riduce l’entità della glicolisi sia in condizioni aerobiche che ipossiche.

**Figura 2.** Il dicloroacetato (DCA) riduce la piruvato deidrogenasi (PDH) fosforilata, il lattato nel mezzo extracellulare e l’ECAR delle cellule TNBC.(a) Schema che mostra l’influenza del DCA sulla piruvato deidrogenasi chinasi (PDK) e gli effetti a valle.(b) Western blot rappresentativo di p-PDH (Ser293) e PDH totale in cellule 4T1 e EMT6 dopo trattamento con DCA (30 mM, 45 mM e 60 mM) in condizioni aerobiche e ipossiche.(c) Espressione relativa normalizzata di p-PDH (Ser293) in cellule 4T1 e EMT6 dopo trattamento con DCA (30 mM, 45 mM e 60 mM) in condizioni aerobiche e ipossiche.(d) Dopo il trattamento con DCA alle concentrazioni indicate in condizioni aerobiche o ipossiche, il lattato è stato misurato con il saggio del L-lattato.(e) L’ECAR delle cellule EMT6 e 4T1 è stato misurato nel tempo dopo l’iniezione di concentrazioni indicate di DCA utilizzando l’analizzatore Seahorse. Il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) è stato espresso come percentuale rispetto al controllo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

IlDCA induce la produzione di ROS nelle cellule tumorali ipossiche
L’inibizione della PDK e l’attivazione della PDH sono associate all’aumento dei ROS intracellulari ^[49,50]. I ROS hanno un’importanza fondamentale nel generare danni al DNA in seguito a radiazioni. Abbiamo esaminato i livelli di ROS nelle cellule EMT6 e 4T1 in condizioni aerobiche e ipossiche utilizzando la sonda _CM-H2DCFDA. Come mostrato nella Figura 3a,b, il DCA ha innescato una produzione di ROS dose-dipendente sia nelle EMT6 che nelle 4T1. In condizioni aerobiche, solo la dose più alta (60 mM) di DCA ha generato un aumento significativo dei ROS fino a cinque volte rispetto al controllo per le cellule EMT6. Nelle cellule 4T1, in condizioni aerobiche, non è stata rilevata alcuna significativa upregulation dei ROS. L’aumento dei ROS è stato parzialmente contrastato dall’aggiunta dello scavenger dei ROS N-acetilcisteina (NAC). In condizioni di ipossia, abbiamo dimostrato un aumento dose-dipendente dei ROS fino a 15 volte nelle cellule EMT6 e fino a 5 volte nelle cellule 4T1; la dose più bassa di DCA ha effettivamente portato a un aumento significativo dei ROS in entrambi i tipi di cellule (Figura 3b).

Abbiamo pensato che l’aumento della produzione di ROS in condizioni di ipossia potesse derivare dagli effetti combinati dell’alterazione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (dovuta alla riduzione dell’_O2 come accettore finale di elettroni) e del metabolismo ossidativo forzato del piruvato guidato dal DCA. Utilizzando l’analizzatore Seahorse, abbiamo scoperto che il DCA non ha avuto alcun impatto sulla respirazione basale e sulla produzione di ATP, ma ha ridotto significativamente la capacità respiratoria massima nelle cellule tumorali EMT6 e 4T1 (Figura 3c). Un’altra possibilità è che il DCA aumenti i livelli di NAD(P)H, il che è legato a una maggiore produzione di ROS. Abbiamo visto che in condizioni aerobiche, il trattamento con DCA ha avuto un aumento dose-dipendente di NAD(P)H nelle cellule EMT6 e 4T1 (Figura 3d). In condizioni di ipossia, abbiamo dimostrato un possibile aumento di NAD(P)H nelle cellule EMT6 trattate con 60 mM di DCA, ma nessun aumento nelle cellule 4T1 (Figura 3d). Insieme ai dati sui ROS di cui sopra, questi risultati suggeriscono che, sebbene il metabolismo mitocondriale sia ancora preservato, un aumento locale della produzione di ROS in seguito all’esposizione al DCA può alterare l’integrità e la funzione dei mitocondri.

**Figura 3.** Il DCA induce la produzione di ROS nelle cellule ipossiche sovraccaricando il metabolismo mitocondriale. Le cellule EMT6 e 4T1 sono state trattate con DCA per una notte alle concentrazioni indicate e la N-acetilcisteina (NAC) (10 mM) è stata aggiunta 1 ora prima e durante il trattamento. La generazione di ROS è stata misurata mediante citometria a flusso utilizzando la sonda CM-H2DCFDA in condizioni aerobiche(a) e ipossiche(b).(c) Le misure del tasso di consumo di ossigeno (OCR) sono state ottenute nel tempo con un analizzatore Seahorse utilizzando il test di stress mitocondriale. Per estrarre informazioni dettagliate sulla catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri, sono stati aggiunti in sequenza inibitori specifici composti da oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A. Da questi risultati sono stati calcolati l’OCR mitocondriale basale, l’OCR legato all’ATP e l’OCR massimo.(d) Il NAD(P)H è stato misurato mediante citometria a flusso utilizzando un sensore di NAD(P)H JZL1707 in condizioni aerobiche e ipossiche. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Laradiosensibilità del DCA nelle cellule ipossiche è mediata dai ROS
In primo luogo, abbiamo esaminato la radioresistenza delle cellule indotta dall’ipossia. Abbiamo riscontrato una radioresistenza gravemente compromessa confrontando le condizioni ipossiche con quelle aerobiche, con un rapporto di potenziamento dell’ossigeno di 2,7 e 2,3 per le cellule tumorali EMT6 e 4T1, rispettivamente (Figura 4a). In questo contesto, abbiamo osservato che il trattamento con DCA ha causato un piccolo effetto di radiosensibilizzazione intrinseca nelle cellule EMT6 ma non in quelle 4T1 (Figura 4b). È interessante notare che, in linea con i risultati della generazione di ROS in condizioni di ipossia, il DCA 60 mM ha superato in modo significativo (p < 0,05) la radioresistenza ipossica con rapporti di potenziamento di 2,3 e 1,5 a 60 mM per le cellule tumorali EMT6 e 4T1, rispettivamente (Figura 5a). L’effetto radiosensibilizzante è stato annullato dalla NAC sia nelle cellule EMT6 che in quelle 4T1 (Figura 5b). La causa principale della morte cellulare indotta dalle radiazioni dai ROS è l’induzione di rotture a doppio filamento nel DNA (ds-DNA) ^[12,51]. Abbiamo quindi esaminato il danno al ds-DNA dopo il trattamento con DCA quantificando lo stato di fosforilazione di γH2AX in condizioni di ipossia. Come mostrato nella Figura 5c, il DCA ha aumentato la formazione di danni al ds-DNA sia nell’EMT6 che nel 4T1 in modo dose-dipendente.

**Figura 4.** Il DCA ha piccoli effetti radiosensibilizzanti sulle cellule tumorali aerobiche. Le cellule EMT6 e 4T1 sono state trattate con DCA per una notte alle concentrazioni indicate.(a) Radiosensibilità delle cellule EMT6 e 4T1 in condizioni aerobiche o ipossiche.(b) Effetto radiosensibilizzante del DCA in condizioni aerobiche.

**Figura 5.** Il DCA radiosensibilizza le cellule tumorali ipossiche attraverso l’upregolazione dei ROS. Le cellule EMT6 e 4T1 sono state trattate con DCA per una notte alle concentrazioni indicate.(a) L’effetto radiosensibilizzante del DCA in condizioni di ipossia è stato valutato mediante il saggio di formazione delle colonie.(b) Il pretrattamento di NAC (10 mM e 20 mM) ha invertito l’effetto radiosensibilizzante di diverse concentrazioni di DCA a 15 Gy per EMT6 e 20 Gy per 4T1.(c) Le rotture del DNA a doppio filamento sono state analizzate mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione gammaH2AX. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

IlDCA radiosensibilizza le colture cellulari 3D (sferoidi)
I risultati di cui sopra ci hanno portato a verificare se il DCA potesse anche migliorare la radiosensibilità di modelli di colture cellulari tridimensionali (3D) (Figura 6a-c) che imitano meglio le proprietà fisico-chimiche del microambiente tumorale, compresi i gradienti di ossigeno. Utilizzando sferoidi ottenuti da colture cellulari EMT6 e 4T1, abbiamo misurato la crescita degli sferoidi dopo il trattamento con DCA e la radioterapia (Figura 6a). Il trattamento con DCA da solo ha provocato un piccolo ritardo nella crescita delle cellule EMT6, ma non ha alterato la crescita degli sferoidi 4T1 (Figura 6b). Un’irradiazione di 8 Gy ha ridotto la crescita degli sferoidi tumorali, un effetto ulteriormente accentuato dalla combinazione con il trattamento con DCA (Figura 6a,c). Da notare che, mentre gli effetti citotossici sono stati osservati negli sferoidi 4T1 (come rivelato dagli aloni di cellule morte), gli effetti citostatici sono stati osservati negli sferoidi EMT6 (Figura 6a).

**Figura 6.** Il trattamento con DCA e radiazioni a 8 Gy riduce la crescita degli sferoidi tumorali EMT6 e 4T1.(a) Immagini rappresentative e(b,c) crescita tempo-dipendente degli sferoidi EMT6 e 4T1 dopo il trattamento con DCA alle concentrazioni indicate e in combinazione con la radioterapia a 8 Gy.

La combinazione di DCA e radioterapia non ritarda la crescita tumorale in vivo
Abbiamo poi esaminato se il beneficio in vitro della combinazione di DCA e radioterapia potesse essere convalidato in vivo (Figura S3a-d). Topi iniettati con cellule di carcinoma mammario EMT6 o 4T1 sono stati esposti a radiazioni singole (12 Gy o 15 Gy, rispettivamente) (Figura S3a,c) o frazionate (5*4 Gy o 5*6 Gy, rispettivamente) (Figura S3b,d). Le dosi di radiazioni singole e frazionate per tipo di tumore sono simili in termini di dose biologica efficace (BED) e differiscono in funzione della radiosensibilità intrinseca delle linee cellulari utilizzate. È importante notare che l’iniezione di DCA sia i.p. che i.t. per 10 giorni è stata sicura senza indurre una tossicità evidente (Figura S4a-d). L’irradiazione da sola ha ritardato la crescita tumorale in EMT6 per sette giorni con un singolo frazionamento e per quattro giorni con l’irradiazione frazionata (Figura S3a,b). Nei tumori 4T1, le radiazioni hanno ritardato la crescita del tumore per cinque giorni con un singolo frazionamento e per 10 giorni con un frazionamento, come previsto (Figura S3c,d). Il DCA (300 mg/kg), iniettato per via intraperitoneale (ip) o intratumorale (it), non ha ritardato la crescita tumorale e nemmeno la combinazione di DCA e radiazioni (Figura S3a-d). Abbiamo poi verificato se il trattamento con DCA potesse indurre ipossia nei tumori (Figura S3e,f). Sebbene l’entità dell’ipossia evidenziata dal pimonidazolo non sia stata alterata nei tumori EMT6, è stata osservata una tendenza alla diminuzione dell’ipossia in risposta al DCA nei tumori 4T1.

Discussione

Lo scopo di questo studio è stato quello di esaminare se il DCA, mirando al metabolismo mitocondriale, potesse sensibilizzare le cellule di tumore mammario TNBC/basal-like alla radioterapia. La maggior parte dei tumori al seno TNBC e basal-like sono tumori aggressivi per i quali le opzioni terapeutiche sono limitate e la prognosi è infausta ^[2,3,4]. Questi tumori presentano un fenotipo glicolitico potenziato che supporta la loro prognosi sfavorevole ed è inoltre correlato alla radioresistenza ^[52]. Nello studio attuale, abbiamo riscontrato che i livelli di mRNA di due delle quattro isoforme PDK (PDK1 e PDK3) sono upregolati nei sottotipi di tumore al seno TNBC e basal-like. La sovraespressione delle PDK è stata rilevata in numerosi campioni di tumori umani ^{[42,53,54,55,56,57,58,59,60,61]} e molte linee cellulari tumorali presentano una sostanziale upregolazione delle isoforme PDK ^[50,62,63]. È stato riportato che la sovraespressione di PDK è associata a una prognosi sfavorevole in diversi tipi di tumore ^{[53,54,55,56,57,58,59,60,61]}. La sovraespressione delle PDK nelle cellule tumorali è influenzata da diversi fattori di trascrizione, come HIF1 ^[28,64]. HIF1 sopprime attivamente l’OXPHOS transattivando direttamente i geni che codificano PDK1 e PDK3. Le PDK a loro volta fosforilano e inattivano la PDH ^[42]. Pertanto, l’upregulation delle PDK nel cancro può essere ricondotta immediatamente sia alle mutazioni trasformanti sia al microambiente tumorale ipossico. Coerentemente con questi risultati, abbiamo osservato che l’upregulation dell’mRNA di PDK1 e PDK3 è correlata a profili genici legati all’ipossia. La riprogrammazione metabolica, con il bersaglio degli enzimi PDK, per passare dalla glicolisi all’OXPHOS, appare quindi come una promettente via terapeutica per il trattamento dei tumori al seno con opzioni terapeutiche limitate.

Il risultato principale del nostro studio è che l’inibitore PDK DCA può ridurre l’attività glicolitica delle cellule di cancro al seno in presenza di ossigeno ma anche in condizioni di ipossia ^[29]. Abbiamo scoperto che il DCA abbassa la quantità di PDH fosforilata e innesca una diminuzione dose-dipendente dei livelli di lattato extracellulare e di ECAR nelle cellule aerobiche e ipossiche. Abbiamo quindi combinato DCA e radioterapia, ipotizzando che, invertendo il fenotipo glicolitico e indirizzando più piruvato verso l’ossidazione mitocondriale, le cellule tumorali potessero produrre più ROS e diventare più sensibili alle radiazioni. Effetti intrinseci di radiosensibilizzazione del DCA sono stati riportati in cellule di glioblastoma ^[34,35], di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) ^[65,66], di cancro del colon-retto ^[35], di cancro della prostata ^[32]e di medulloblastoma radioresistente ^[67]. I meccanismi proposti sono l’arresto del ciclo cellulare nella fase G2-M, la creazione di ulteriori danni al DNA e la morte cellulare consecutiva in risposta all’aumento della produzione di ROS mitocondriali. Nello studio attuale, abbiamo scoperto che, mentre sono stati osservati effetti radiosensibilizzanti minimi con la più alta concentrazione non tossica di DCA in condizioni aerobiche, il DCA ha fortemente radiosensibilizzato le cellule di cancro al seno ipossiche, sia in 2D che in sferoidi 3D. Sebbene in teoria i ROS siano associati a meccanismi ossidativi, esiste una collaborazione tra ipossia e ROS nei tumori. L’ipossia aumenta la generazione di ROS attraverso il prolungamento della vita dei radicali semi-chinoni; reciprocamente, i ROS aiutano le cellule tumorali ad adattarsi all’ipossia attraverso la stabilizzazione di HIF1-α ^[16,^68]. Tuttavia, gli insulti extracellulari possono rompere questa partnership innescando un’eccessiva produzione di ROS, che compromette la respirazione mitocondriale e quindi diminuisce la frazione ipossica nei tumori^[16,69,70]. In questo contesto, il triossido di arsenico inibisce il consumo di ossigeno delle cellule tumorali attraverso un aumento dei ROS intracellulari, con conseguente aumento della risposta radioelettrica ^[71]. Anche la soppressione della glicolisi aumenta la risposta radioattiva. Ciò può avvenire tramite ritonavir (inibitore del trasportatore di glucosio), 2-deossiglucosio (inibitore dell’esochinasi) e lonidamina (inibitore dell’esochinasi), che sono in fase di studio clinico in diversi tipi di cancro ^{[72,73,74,75]}. Un’altra possibilità è che dopo il trattamento con DCA si creino ROS a causa dell’induzione della NADPH ossidasi ^[76]. Tuttavia, non sono state trovate prove dirette per concludere che il DCA possa upregolare la NADPH ossidasi ^[77]. Abbiamo osservato un aumento dose-dipendente di NAD(P)H in condizioni aerobiche, ma non in condizioni di ipossia nelle cellule EMT6 e 4T1. Pertanto, ipotizziamo che l’aumento di NAD(P)H e l’upregolazione delle NADPH ossidasi svolgano solo un ruolo minore nell’aumento dei ROS in condizioni di ipossia. A nostro avviso, il meccanismo primario degli effetti di radiosensibilizzazione osservati deriva molto probabilmente dall’aumento di molte volte della produzione di ROS (fino a 15 volte) dopo il trattamento con DCA in condizioni di ipossia.

In linea con la letteratura, abbiamo dimostrato la necessità di concentrazioni sovrafisiologiche di DCA per suscitare alterazioni dell’attività metabolica, aumento della formazione di ROS e radiosensibilizzazione ^[29]. La nostra ipotesi centrale è che questi effetti siano la conseguenza dell’inibizione della PDK prodotta dal DCA ^[78]. Tuttavia, le concentrazioni necessarie per indurre i risultati misurati sono diverse volte superiori alla costante di inibizione (Ki) della PDK1-4. È da notare che il DCA esiste fisiologicamente come anione, è relativamente impermeabile alla membrana nonostante le sue piccole dimensioni e quindi richiede il trasportatore mitocondriale del piruvato per l’assorbimento mitocondriale^[79,80]. Tuttavia, la coniugazione del DCA con un trasportatore lipofilo ha migliorato il trasporto mitocondriale. Il valore di IC50 del DCA è stato ridotto da millimolare a micromolare, ben all’interno dell’intervallo Ki della PDK1-4 ^[81]. Il DCA imita l’efficace inibizione di PDK1-4 da parte del siRNA e il DCA aggiunto al PDK siRNA non ha avuto effetti aggiuntivi ^{[49,50,60,82,83,84,85,86,87,88]}. Inoltre, una piccola molecola simile al DCA potrebbe influenzare direttamente o indirettamente altri bersagli cellulari e molecolari. Una recente ricerca ha rilevato che il trattamento con DCA ha aumentato la concentrazione di tutti gli intermedi TCA, ma non ha influenzato l’assorbimento del glucosio o la glicolisi ^[89]. Altri ricercatori hanno dimostrato che il DCA può aumentare la biosintesi di CoA de novo. Poiché alte concentrazioni di CoA possono essere tossiche per le cellule, questo effetto metabolico potrebbe essere parzialmente responsabile della tossicità delle cellule tumorali mediata dal DCA^[90]. Recenti ricerche hanno introdotto una nuova ipotesi, suggerendo che l’efficacia del DCA contro il cancro possa derivare dalla sua capacità di antagonizzare l’acetato. Alti livelli di acetato possono aumentare la sintesi di DNA, RNA e proteine. Inoltre, può essere associato alla resistenza ai farmaci antitumorali ^[91]. Infine, i ricercatori hanno scoperto che il DCA può attivare la via di segnalazione AMPK, portando a una cascata di effetti metabolici e antitumorali a valle ^[92,93]. Tuttavia, la nostra ipotesi rimane quella che, in condizioni di ipossia, il passaggio del piruvato nei mitocondri provochi un aumento dei livelli di ROS, con conseguente radiosensibilizzazione delle cellule tumorali. Non siamo riusciti a ricapitolare questi effetti in vivo e sono necessari ulteriori lavori per determinare come tradurre gli effetti radiosensibilizzanti del DCA in compartimenti tumorali ipossici. Si possono escludere problemi di farmacocinetica legati alla somministrazione di DCA in vivo e la dose di DCA utilizzata (150 mg/kg) rientra ampiamente nelle dosi utilizzate in letteratura ^[29]. La dose umana equivalente alla nostra dose di DCA utilizzata in vivo è di 12 mg/kg/d, ben all’interno della zona di tollerabilità utilizzata negli studi clinici. Una possibile spiegazione del fallimento dei nostri esperimenti in vivo è che è necessaria una dose più elevata di DCA per avere un effetto radiosensibilizzante in vivo. Negli ultimi 30 anni, il DCA è stato somministrato con discreto successo come farmaco sperimentale per il trattamento del diabete di tipo 2, dell’iperlipoproteinemia acquisita e congenita, dell’ischemia miocardica, dell’acidosi lattica acquisita e congenita e, più recentemente, del cancro ^[29,^30]. Diversi studi di fase I/II stanno studiando la sicurezza del DCA e la sua attività come agente antitumorale. Il DCA viene assorbito rapidamente e può persino attraversare la barriera emato-encefalica. Due studi di fase I hanno esaminato la sicurezza del DCA orale in pazienti con tumori cerebrali maligni ricorrenti o metastasi al cervello da tumori del sistema nervoso non centrale ^[94,95]. Questi studi hanno indicato che il DCA è generalmente ben tollerato dai pazienti. Una spiegazione alternativa per la sconcertante differenza tra gli effetti in vitro e in vivo è in realtà più probabilmente legata ai cambiamenti nei fenotipi metabolici quando le cellule tumorali vengono iniettate (ectopicamente) in vivo. Infatti, l’aumento della radiosensibilità in vitro da parte del DCA si ottiene in condizioni di ipossia e di elevato metabolismo glicolitico, cosicché il passaggio da glicolisi a ossifosfato può essere osservato al momento del trattamento con DCA, insieme a un’ulteriore aumento dei ROS.

L’estensione limitata dell’ipossia nei tumori in vivo può quindi riflettere una capacità limitata del DCA di indurre un cambiamento che è già presente nei tumori ben ossigenati e largamente dipendenti dall’OXPHOS. Sono necessarie ulteriori indagini per verificare gli effetti radiosensibilizzanti del DCA in modelli di tumore mammario di topo caratterizzati da angiogenesi limitata e frazioni ipossiche elevate.

In conclusione, abbiamo dimostrato che il DCA supera la radioresistenza ipossica delle cellule di cancro al seno in sistemi 2D e 3D, che può essere attribuita principalmente all’aumento dei ROS. È notevole che il passaggio dal metabolismo glicolitico a quello ossidativo indotto dal DCA crei anche uno stress ossidativo in condizioni di ipossia. Il DCA è stato utilizzato per molti anni per trattare condizioni metaboliche e malattie mitocondriali ereditarie. Nell’ultimo decennio, il DCA è stato ampiamente riproposto come farmaco antitumorale con dati preclinici promettenti, case report e studi clinici, come descritto in precedenza. Gli attuali risultati preclinici indicano che sono necessari ulteriori approfondimenti sul potenziale antitumorale del DCA, considerando che le cellule tumorali ipossiche non sono risparmiate dall’inibitore PDK che può indurre uno stress ossidativo letale, in particolare se associato alla radioterapia.

Materiali e metodi

Analisi della coorte del cancro al seno TCGA
I profili di espressione dell’mRNA di PDK1-4 (RNA Seq V2 RSEM o log RNA Seq V2 RSEM) sono stati interrogati dal sito web cBioPortal sotto forma di dati trasformati in z-score ^[38,39]. I dati interrogati sono stati valutati da 1084 casi di cancro al seno pubblicamente disponibili del TCGA PanCancer Atlas e da 817 casi di cancro al seno del database TCGA Cell 2015. Per il set di dati TCGA Cell 2015, l’analisi di PDK1-4 è stata eseguita confrontando la sottopopolazione triplo-negativa con il resto dei casi di cancro al seno. Il cancro al seno triplo negativo è stato determinato da uno stato “negativo” per i punteggi immunoistochimici dei geni del recettore degli estrogeni (ER), del recettore del progesterone (PR) e del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) (in totale 83 casi). Nel database TCGA PanCancer Atlas, l’analisi dell’espressione di PDK1-4 è stata eseguita in diverse categorie Pam50. Pam50 è una firma di 50 geni che classifica il cancro al seno in cinque sottotipi molecolari intrinseci: Luminale A, Luminale B, arricchito di HER2, Basale e Normale. L’espressione dell’mRNA del tumore al seno TCGA e i dati clinici sono stati analizzati direttamente sul sito web cBioPortal o scaricati per ulteriori analisi. L’analisi del punteggio di ipossia di Buffa e Ragnum dei campioni in cui PDK1-4 ha un’espressione di z-score superiore a 2 è stata effettuata direttamente sul sito web cBioPortal.

Linee cellulari e sostanze chimiche
La linea cellulare di adenocarcinoma mammario murino EMT6 è stata gentilmente fornita da Edith Lord (University of Rochester, Cancer Center, New York) e le cellule 4T1 sono state ottenute dalla American Type Culture Collection. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in terreno Roswell Park Memorial Institute 1640 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) integrato con il 10% di siero fetale bovino (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria). Per tutti i trattamenti delle cellule è stato utilizzato il tampone HEPES. Le sostanze chimiche sono state ottenute da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), salvo diversa indicazione

Trattamenti
EMT6 e 4T1 sono state fatte crescere fino alla confluenza e trattate con DCA per 16 ore alle concentrazioni indicate. La N-acetilcisteina (NAC) è stata aggiunta a 10 mM o 20 mM alle colture sia 1 ora prima che durante il trattamento con DCA. Successivamente, le colture sono state utilizzate per ulteriori analisi come descritto di seguito. Il trattamento è stato eseguito in condizioni aerobiche o ipossiche. L’ipossia è stata indotta dall’incubazione in un gas bilanciato azoto/diossido di carbonio contenente l’1% di ossigeno ^[96]

Test MTT
La citotossicità del DCA è stata valutata mediante il test MTT come descritto altrove ^{<a href=”#97″>[97,</a><a href=”#98″>98].</a> In breve, le cellule sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti e trattate con le concentrazioni indicate. Dopo il trattamento, il terreno è stato aspirato e sono stati aggiunti 50 µL di reagente MTT (5 mg/mL) per 1,5 h. Successivamente, sono stati aggiunti 200 µL di solvente MTT (19:1 DMSO/HCL) e mescolati per dissolvere i cristalli di formazan generati all’interno delle cellule. L’assorbanza è stata misurata alla lunghezza d’onda di 540 nm utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La vitalità cellulare è stata determinata normalizzando le cellule trattate rispetto a quelle di controllo non trattate.</p&gt
Saggio di crescita cinetica L’influenza del DCA sulla proliferazione delle cellule EMT6 e 4T1 è stata valutata utilizzando un saggio di crescita cinetica. Le cellule sono state fatte crescere fino alla confluenza in piastre di coltura a 96 pozzetti e trattate con DCA alle concentrazioni indicate in 6 repliche. Le microfotografie sono state scattate ogni due ore utilizzando un imager per cellule vive Incucyte (Essen Biosciences, Newark, Regno Unito) e la confluenza delle colture è stata misurata utilizzando il software Incucyte (Incucyte ZOOM 2018A, Essen Biosciences) su 80 h in coltura.
Western Blot Le analisi Western blot sono state eseguite come precedentemente descritto <a href=”#99″>[99]</a>. In breve, le cellule sono state lisate in un tampone triton-X all’1% integrato con un inibitore della fosfatasi (P5726), un inibitore della proteasi (P8340) e leupeptina trifluoroacetato (L2023). I lisati sono stati centrifugati e la concentrazione proteica è stata determinata con il test delle proteine DC Bio-Rad (Bio-Rad 500-0116). Quantità equivalenti di proteine sono state caricate su un gel di acrilammide risolvente al 12%. Il trasferimento delle proteine è stato condotto per una notte a 4 °C utilizzando una membrana di nitrocellulosa (0,45 µM, Thermo 88018, Thermo Fisher Scientific). Le membrane sono state bloccate con BSA al 5% in TBS e lavate (TBST). Le membrane bloccate sono state marcate con l’anticorpo primario durante la notte a 4 °C. Gli anticorpi primari sono stati marcati con anticorpi secondari nel vicino infrarosso (IRDyes 680 RD o 800 CW, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA), rilevati e quantificati con Odyssey Fc Imaging System (LI-COR Biosciences). Gli anticorpi primari erano: fosfo-PDH (ABS204, MERCK, Darmstadt, Germania), PDH totale (C54G1, cell signaling), antibeta ACTIN (A1978) e antialfa TUBULIN (T9026).
Saggio del lattato Dopo il trattamento, è stato eseguito il saggio del L-lattato, secondo le istruzioni del produttore. In breve, il surnatante delle cellule è stato prelevato e introdotto nella miscela di reazione master. Successivamente, è stato effettuato un periodo di incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente e al buio. Successivamente, è stata misurata l’assorbanza a 570 nm ed è stata calcolata la quantità di L-lattato nel mezzo. Inoltre, le cellule sono state lisate e la quantità totale di proteine è stata esaminata con il BCA protein assay (23227, Thermo Fisher); questa fase è stata eseguita per normalizzare i valori di lattato alla quantità di proteine nella cellula.
Profilo metabolico Seahorse Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono stati determinati utilizzando un analizzatore Seahorse XF96 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) come precedentemente riportato <a href=”#100″>[100]</a>. In breve, 1,5 × 105 cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti. Le cellule sono state poi trattate con DCA, per tutta la notte (per le misurazioni OCR) o per 3 ore (durante la corsa Seahorse, per l’ECAR). Le cellule sono state equilibrate in terreno Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) non tamponato con 2 mM di glutammina e 10 mM di glucosio a 37 °C in un incubatore privo di CO2 e poi misurate con un analizzatore Seahorse. Per estrarre informazioni dettagliate sulla catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri, sono stati aggiunti in sequenza inibitori specifici costituiti da oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A. L’ECAR è stato normalizzato al livello basale.
Produzione di ROS Il livello intracellulare di ROS è stato rilevato utilizzando il 5-(6)-clorometil-2′,7′-diclorodiidro-fluoresceina diacetato (CM-H2DCFDA), una sonda fluorescente sensibile all’ossidazione (Abcam, Cambridge, Regno Unito) come precedentemente descritto <a href=”#97″>[97]</a>. In breve, dopo il trattamento, le cellule sono state colorate con 5 μM CM-H2DCFDA a 37 °C per 30 minuti. L’intensità media della fluorescenza è stata misurata da un citometro a flusso FACSCanto (BD Bioscience, Franklin lakes, NJ, USA) e analizzata dal software Flowjo (BD Bioscience).
Misurazione del NAD(P)H Il livello intracellulare di NAD(P)H è stato rilevato utilizzando il kit di analisi citometrica a flusso Cell MeterTM intracellulare NADH/NADPH (AAT BioQuest, Sunnyvale, CA, USA), secondo le istruzioni del produttore. In breve, dopo il trattamento, le cellule sono state colorate con il sensore NAD(P)H JZLA707 a 37 °C per 45 minuti. L’intensità media della fluorescenza è stata misurata con un citometro a flusso FACSCanto (BD Bioscience) e analizzata con il software Flowjo (BD Bioscience).
Saggio di irradiazione e clonogenicità Dopo il trattamento, le cellule sono state irradiate alle dosi indicate su un Linac da 6 MV (Varian Truebeam STx, Palo Alto, CA, USA; BrainLAB AG, Feldkirchen, Germania) e riseminate in piastre a 6 pozzetti per la formazione di colonie. Prima della semina, le cellule sono state contate e normalizzate rispetto alle condizioni di controllo. Dopo 7-12 giorni, le colture sono state fissate con cristalvioletto e sono state contate le colonie (>50 cellule). Le frazioni di sopravvivenza (SF) sono state adattate al modello lineare-quadratico utilizzando il software GraphPad Prism 8 (GraphPad Prism Software Inc, San Diego, CA, USA). La radiosensibilizzazione è stata valutata al livello di 0,1 frazioni di sopravvivenza.
Colture cellulari tridimensionali (3D) (sferoidi) Sferoidi sono stati preparati con cellule EMT6 e 4T1 seminando 4000 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco (Corning, Corning, NY, USA). Il DCA è stato aggiunto al terreno di coltura quando gli sferoidi avevano un diametro di circa 500 µm. In seguito, gli sferoidi sono stati irradiati a 8 Gy e il trattamento è stato lavato con terreno fresco, rinfrescato ogni 3 giorni. La crescita degli sferoidi è stata monitorata con il sistema IncuCyte Live Cell Imaging System (Essen Bioscience) per 10 giorni.
Modello tumorale di topo Le cellule tumorali 4T1 e EMT6 (0,5 × 106) sono state inoculate nell’arto posteriore sinistro di topi Balb/c (femmine, 7-9 settimane di età; Charles River Laboratories, L’Arbresle Cedex, Francia). Quando i tumori hanno raggiunto circa 150 mm3, i topi sono stati randomizzati e trattati per 10 giorni consecutivi con DCA 300 mg/kg (intraperitoneale o intratumorale). I topi sono stati irradiati con una dose singola di 12 Gy (tumori EMT6) o 15 Gy (tumori 4T1) o con uno schema di irradiazione frazionata di 5*4 Gy (tumori EMT6) e 5*6 Gy (tumori 4T1) quando i tumori hanno raggiunto circa 150 mm3. Le radiazioni sono state erogate con un Linac da 6 MV (Varian Truebeam STx). Durante l’intero corso dell’esperimento, i tumori sono stati misurati con un calibro elettronico e il volume del tumore è stato calcolato con la formula: Volume = (Lunghezza × Larghezza2) × 0,5. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico per l’uso di animali da laboratorio della Vrije Universiteit Brussel (dossier etico n: 16-552-2 (18/4/2017) e 18-552-2 (1/6/2018) 
Colorazione con pimonidazolo su sezioni tumorali I tumori sono stati inoculati come descritto nella parte 4.13. Dopo il trattamento, il pimonidazolo (60 mg/kg; Hypoxyprobe) è stato iniettato i.v. nella vena della coda. I tumori sono stati escissi 1,5 ore dopo, pesati, congelati a caldo e conservati in fiale di plastica a -80 °C. Le sezioni tumorali (5 µm) sono state quindi sottoposte a immunocolorazione utilizzando un anticorpo di coniglio anti-Pimo (Hypoxyprobe, Burlington, MA, USA), che è stato colorato con un anticorpo FITC anti-coniglio (Abcam). I vetrini tumorali sono stati montati con liquido di montaggio (DAKO mounting medium, Agilent) miscelato con dapi (Sigma-Aldrich) e coperti con un coprioggetto. Le immagini sono state acquisite con microscopia confocale a fluorescenza (EVOS FL, Thermo Fisher) e analizzate con ImageJ.
Statistiche Tutte le analisi sono state eseguite con GraphPad Prism 8.4.3. I dati sono espressi come media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti, salvo diversa indicazione. Per le analisi statistiche sono stati utilizzati il test t non comparato, l’ANOVA a una via seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett e l’ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Dunnett, Sidak o Tukey: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.
<h2>Materiale complementare</h2&gt
I materiali di supporto sono disponibili all’indirizzo https://www.mdpi.com/1422-0067/21/24/9367/s1.
<h2>Contributi dell’autore</h2&gt
Concettualizzazione, S.d.M., I.D. e H.J.; cura dei dati, S.d.M., C.C., K.L.L. e H.V.; indagine, S.d.M.; metodologia, T.G.; supervisione, I.D., H.J., O.F. e M.D.R.; visualizzazione, S.d.M.; stesura della bozza originale, S.d.M.; revisione ed editing, I.D., C.C., H.W., M.V.D.G., L.K., O.F. e M.D.R. Tutti gli autori hanno discusso i risultati e contribuito alla stesura del manoscritto finale. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione pubblicata del manoscritto.
<h2>Finanziamento</h2&gt
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma strategico di ricerca “Societal Benefit of Markerless Stereotactic Body Radiotherapy: a Statistical Support based on Quantitative Imaging” (Zwaartepunt, SRP 53, 2019-2024) del consiglio di ricerca della Vrije Universiteit Brussel.
<h2>Riconoscimenti</h2&gt
Gli autori ringraziano Valeri Verovski per i preziosi e costruttivi suggerimenti.
<h2>Conflitti di interesse</h2&gt
Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse.
<h2>Nota dell’editore:</h2&gt
MDPI rimane neutrale rispetto alle rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e alle affiliazioni istituzionali.
<h2>Abbreviazioni</h2&gt
<figure class=”wp-block-table”><table><tbody><tr><td>DCA</td><td>Dicloroacetato</td></tr><tr><td>ECAR</td><td>Tasso di acidificazione extracellulare</td></tr><tr><td>NAC</td><td>N-acetil-cisteina</td></tr><tr><td>OCR</td><td>Tasso di consumo di ossigeno</td></tr><tr><td>OXPHOS</td><td>Fosforilazione ossidativa</td></tr><tr><td>PDH</td><td>Piruvato deidrogenasi</td></tr><tr><td>PDK</td><td>Piruvato deidrogenasi chinasi</td></tr><tr><td>PDP</td><td>Piruvato deidrogenasi fosfatasi</td></tr><tr><td>ROS</td><td>Specie reattive dell’ossigeno</td></tr><tr><td>TBNC</td><td>Cancro al seno triplo-negativo al seno</td></tr></tbody></table></figure&gt
<h2>REFERENZE</h2&gt
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