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Bo Li1,*, Xinzhe Li1,*, Zhenhong Ni1, Yan Zhang1, Yijun Zeng1, Xiaohuan Yan2, Yan Huang3, Jintao He4, Xilin Lyu1, Yaran Wu1, Yuting Wang1, Yingru Zheng2, Fengtian He1

1 Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University,
Chongqing 400038, Cina
2 Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Daping Hospital and Research Institute of Surgery, Third Military Medical
University, Chongqing 400042, Cina
3 Centro oncologico, Ospedale di Daping e Istituto di Ricerca di Chirurgia, Terza Università Medica Militare, Chongqing 400042,
Cina
4 Battaglione 17 di studenti, Collegio di Medicina Preventiva, Terza Università Medica Militare, Chongqing 400038, Cina
* Questi autori hanno contribuito in egual misura a questo lavoro


Corrispondenza:
Yingru Zheng, e-mail: [email protected]
Fengtian He, e-mail: [email protected]


Ricevuto: 24 gennaio 2016
Accettato: 09 luglio 2016
Pubblicato: 19 luglio 2016

Abstract

Sia il dicloroacetato (DCA) che la metformina (Met) hanno mostrato una promettente efficacia antitumorale regolando il metabolismo delle cellule tumorali. Tuttavia, l’autofagia protettiva mediata dal DCA e l’accumulo di lattato indotto dalla Met limitano rispettivamente il loro potenziale antitumorale. Pertanto, il superamento delle relative carenze migliorerà i loro effetti terapeutici. Nel presente studio, abbiamo scoperto che DCA e Met inibiscono sinergicamente la crescita e aumentano l’apoptosi delle cellule di cancro ovarico. È interessante notare che per la prima volta abbiamo rivelato che il Met sensibilizzava il DCA attenuando drasticamente la proteina Mcl-1 indotta dal DCA e l’autofagia protettiva, mentre il DCA sensibilizzava il Met attenuando notevolmente l’accumulo eccessivo di lattato e il consumo di glucosio indotti dal Met. Gli esperimenti in vivo su topi nudi hanno inoltre dimostrato che DCA e Met sopprimono sinergicamente la crescita di xenotrapianti di tumori ovarici. Questi risultati possono aprire la strada allo sviluppo di nuove strategie per il trattamento del tumore ovarico basate sull’uso combinato di DCA e Met.


Parole chiave: dicloroacetato, metformina, Mcl-1, metabolismo del cancro, cancro ovarico


INTRODUZIONE

La mortalità del carcinoma ovarico è al primo posto tra i vari tipi di tumori ginecologici. Attualmente, le chemioterapie a base di platino e taxolo sono ancora il paradigma standard in aggiunta alla chirurgia, ma i loro effetti collaterali sono gravi ed è emersa anche la chemioresistenza [1-2]. Pertanto, è urgente esplorare nuove strategie come alternative alla chemioterapia tradizionale. Negli ultimi anni, le crescenti evidenze hanno dimostrato che il cancro è una sorta di anomalia metabolica, che lo spinge in prima linea regolando il metabolismo del cancro per inibire la crescita tumorale [3]. Il bersaglio delle vie metaboliche chiave uccide in modo significativo numerose cellule tumorali, comprese quelle del cancro ovarico [4-5]. Tra i vari farmaci metabolici, il dicloroacetato (DCA) e la metformina (Met) hanno mostrato affascinanti prospettive grazie alle loro funzioni positive nella terapia del cancro.

Come agente mirato ai mitocondri, il DCA può inibire l’attività della piruvato deidrogenasi chinasi (PDK) e successivamente aumentare l’attività della piruvato deidrogenasi (PDH), promuovendo il flusso di carboidrati nei mitocondri e quindi aumentando l’ossidazione aerobica del glucosio. Questo effetto inverte la disfunzione mitocondriale e riattiva l’apoptosi mitocondri-dipendente in diverse cellule tumorali [6-9]. Contemporaneamente, il DCA inibisce la glicolisi e riduce l’accumulo di lattato, distruggendo il microambiente tumorale acidificato (il microambiente acidificato è generalmente favorevole alla sopravvivenza del tumore) [10]. Sebbene il DCA abbia mostrato prospettive promettenti nella lotta contro i tumori, è stato riportato che il DCA induce l’autofagia protettiva nelle cellule del cancro del colon, che a sua volta ostacola la sua capacità apoptotica [11]. Finora, non è ancora chiaro se vi sia un altro determinante resistente associato all’apoptosi quando il DCA ripristina l’apoptosi mitocondriale.

Il Met è un farmaco tradizionale della terapia di prima linea per il diabete di tipo 2. Negli ultimi anni, sempre più evidenze indicano che il Met può anche ridurre il rischio di cancro in diversi studi epidemiologici [12]. Met sopprime la crescita tumorale attraverso l’induzione dell’arresto del ciclo, la promozione dell’apoptosi e la soppressione dell’autofagia [13-15]. Inoltre, Met può sensibilizzare alcuni farmaci chemioterapici come paclitaxel, erlotinib, ecc. [16-17]. Inoltre, l’effetto antitumorale di Met è sempre più legato al metabolismo del glucosio nel cancro [18]. Nonostante i numerosi vantaggi ottenuti negli studi clinici, il Met è ostacolato per ulteriori applicazioni perché potrebbe portare all’accumulo di lattato [19]. È di grande interesse sapere se questo svantaggio possa essere superato combinando altri farmaci metabolici per rendere il Met più ampiamente utilizzato in chemioterapia.

Dati i loro potenziali effetti di compensazione reciproca, abbiamo cercato di scoprire se il DCA e il Met possono sinergizzare l’uno con l’altro per aumentare la citotossicità nelle cellule di cancro ovarico. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il DCA e il Met possono indurre in modo collaborativo l’apoptosi nelle cellule di cancro ovarico. Il Met ha sensibilizzato il DCA attenuando drasticamente la Mcl-1 indotta dal DCA e l’autofagia protettiva, mentre il DCA ha sensibilizzato il Met attenuando notevolmente l’accumulo eccessivo di lattato e il consumo di glucosio indotti dal Met. Gli esperimenti in vivo su topi nudi hanno inoltre dimostrato che DCA e Met sopprimono sinergicamente la crescita di xenotrapianti di tumori ovarici. Questi risultati suggeriscono che questa strategia terapeutica potrebbe essere una scelta promettente per una futura terapia oncologica mirata basata sul metabolismo.

RISULTATI

DCA e Met inducono sinergicamente l’apoptosi nelle cellule di carcinoma ovarico
Per verificare se esiste un effetto sinergico tra DCA e Met nel sopprimere la crescita delle cellule di carcinoma ovarico, le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state co-trattate con DCA e Met o ciascuna da sola. Come mostrato nelle Figure 1A-1C, il cotrattamento con DCA e Met ha represso più efficacemente la crescita delle cellule di carcinoma ovarico rispetto a ciascuno di essi da solo, e la combinazione di 40mM DCA e 10mM Met ha potuto inibire la vitalità cellulare fino al 50% rispetto al controllo. Abbiamo quindi scelto 40mM DCA e 10mM Met negli esperimenti successivi. Analogamente, l’effetto di inibizione sinergica è stato osservato anche in cellule di cancro al collo dell’utero (HeLa e SiHa), cellule di cancro al polmone non a piccole cellule (A549 e GLC-82) e cellule di carcinoma epatocellulare umano (HepG2) (Figura S1A-1D), suggerendo che il sinergismo tra DCA e Met può essere in qualche misura universale. Inoltre, DCA e Met hanno indotto sinergicamente l’apoptosi nelle cellule di carcinoma ovarico, come dimostrato dall’analisi in citometria a flusso della doppia colorazione con annexina V-FITC (isotiocianato di fluoresceina) e PI (ioduro di proodio) (Figura 1D), dalla colorazione Hoechst dei corpi apoptotici (Figura 1E), dall’analisi in Western blot della PARP scissa (poli ADP-ribosio polimerasi, un marcatore dell’apoptosi) (Figura 1F) e dal saggio dell’attività della caspasi3 (Figura 1G).

Figura 1: Il dicloroacetato (DCA) e la metformina (Met) inducono sinergicamente l’apoptosi nelle cellule di cancro ovarico. A, B. Le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state trattate con DCA e Met alle dosi indicate per 48 ore, quindi la vitalità cellulare è stata misurata con il saggio CCK8. C. Le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state co-trattate con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuna da sola per 48 ore, quindi la vitalità cellulare è stata misurata con il saggio CCK8. D. Dopo il trattamento come in (C) per 24 ore, le cellule sono state colorate con annexina V-FITC/PI. Quindi è stata calcolata la percentuale di cellule apoptotiche mediante citometria a flusso. E. Dopo il trattamento come in (D), il nucleo delle cellule è stato colorato con Hoechst 33258 e quindi osservato al microscopio a fluorescenza. Sono state mostrate le immagini rappresentative e i tipici corpi apoptotici sono stati contrassegnati da frecce bianche. F, G. Dopo il trattamento come in (D), il clivaggio di PARP è stato valutato mediante Western blot (F) e l’attivazione della caspasi3 è stata misurata mediante saggio dell’attività della caspasi3 (G). NC, controllo negativo; *, P<0.05; **, P<0.01.

Met sensibilizza il DCA attraverso l’attenuazione della Mcl-1 indotta dal DCA
Per esplorare il meccanismo con cui Met sensibilizza il DCA a indurre apoptosi, abbiamo esaminato l’espressione dei membri cruciali della famiglia antiapoptotica Bcl-2, tra cui Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-xL [20]. Come mostrato nella Figura 2A, il DCA da solo ha aumentato significativamente il livello della proteina Mcl-1 (ma non delle proteine Bcl-2 e Bcl-xL) nelle cellule di carcinoma ovarico, che è stato marcatamente attenuato dal Met. Il silenziamento di Mcl-1 mediante siRNA ha migliorato l’inibizione della vitalità cellulare mediata da DCA (Figura 2B) e ha aumentato l’apoptosi indotta da DCA (Figura 2C-2E). Inoltre, l’espressione ectopica di Mcl-1 ha attenuato drasticamente l’effetto sensibilizzante della Met al DCA sulla vitalità cellulare e sull’apoptosi (Figura 2F-2I). Questi risultati indicano che Mcl-1 è un nuovo fattore di resistenza al DCA e che Met sensibilizza il DCA attraverso la downregolazione di Mcl-1.

Figura 2: Met sensibilizza i DCA attraverso la diminuzione di Mcl-1 indotta dai DCA. A. Le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state co-trattate con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuna da sola per 24 ore, quindi Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 sono state rilevate mediante Western blot. B-E. Dopo la trasfezione con Mcl-1 siRNA o siRNA di controllo per 12 ore, le cellule sono state trattate con 40 mM DCA o PBS di controllo per altre 24 ore. Quindi la vitalità cellulare è stata rilevata con il saggio CCK8 (B), la percentuale di cellule apoptotiche è stata calcolata con la citometria a flusso (annexina V-FITC/PI) (C), i livelli di Mcl-1 e di PARP clivato sono stati esaminati con il Western blot (D) e l’attività della caspasi3 è stata misurata con il saggio di attività della caspasi3 (E). F-I. Dopo la trasfezione con il plasmide che esprime Mcl-1 o con il plasmide di controllo per 12 ore, le cellule sono state co-trattate con 40 mM DCA e 10mM Met per altre 24 ore. Quindi sono state analizzate la vitalità cellulare (F), la percentuale di cellule apoptotiche (G), i livelli di Mcl-1 e di PARP clivato (H) e l’attività della caspasi3 (I) come in (B-E). siNC, siRNA per il controllo negativo; siMcl-1: siRNA per Mcl-1; *,P<0,05; **,P<0,01.

Met attenua la Mcl-1 indotta dal DCA attraverso l’inibizione della traduzione di Mcl-1
Per chiarire a quale livello il DCA induce Mcl-1, è stato esaminato in primo luogo l’mRNA di Mcl-1. Come mostrato nella Figura 3A, il DCA non ha avuto alcun effetto evidente sull’espressione di Mcl-1 mRNA. Successivamente, la proteina Mcl-1 è stata analizzata in presenza o in assenza dell’inibitore traslazionale cicloeximide (CHX). Come mostrato nelle Figure 3B e 3C, il CHX ha diminuito in modo tempo-dipendente la proteina Mcl-1 al basale (ma non quella indotta dal DCA), indicando che il DCA aumenta la stabilità della proteina Mcl-1. È stato riportato che ERK fosforilata (p-ERK) e p-JNK possono stabilizzare Mcl-1 attraverso la fosforilazione di Mcl-1 su Thr163 [21-22], quindi abbiamo indagato se p-ERK/p-JNK è coinvolta nella regolazione di Mcl-1 indotta da DCA. Come mostrato nella Figura 3D, il trattamento con DCA ha aumentato significativamente p-ERK (ma non p-JNK) e p-Mcl-1Thr163 nelle cellule di cancro ovarico. Inoltre, l’inibitore di MEK1/2 U0126 è stato in grado di attenuare drasticamente la Mcl-1 e la p-Mcl-1Thr163 indotte dal DCA e di rafforzare notevolmente la PARP clivata (Figura 3E). Questi risultati indicano che p-ERK (ma non p-JNK) è un mediatore della Mcl-1 indotta dal DCA. Studi precedenti hanno dimostrato che il DCA aumenta le specie reattive dell’ossigeno (ROS) [23] e che i ROS sono un induttore chiave di p-ERK [24], quindi abbiamo esaminato il livello di ROS con DCFH-DA. Come mostrato nella Figura S2A, il DCA ha aumentato la generazione di ROS, suggerendo che l’induzione di ROS può essere un meccanismo attraverso il quale il DCA aumenta l’attivazione di p-ERK.

Figura 3: Met attenua la Mcl-1 indotta da DCA attraverso l’inibizione della traduzione di Mcl-1. A. Dopo il co-trattamento con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuno da solo per 24 ore, il livello di mRNA di Mcl-1 è stato esaminato mediante qPCR e i dati sono stati espressi come variazione in termini di pieghe rispetto al controllo. B, C. Dopo il trattamento con 40 mM DCA o con il controllo PBS per 24 ore, è stato aggiunto 100μM CHX (inibitore traslazionale) ai tempi indicati prima di raccogliere le cellule. Quindi l’espressione di Mcl-1 è stata rilevata mediante Western blot (B). L’intensità delle bande proteiche è stata quantificata con il software Quantity One della Bio-Rad Company e i rapporti Mcl-1/β-actina sono stati mostrati in (C). D. Le cellule sono state trattate con 40 mM DCA o PBS per 24 ore, quindi i livelli di p-ERK, p-JNK, p-Mcl-1 e Mcl-1 totale sono stati determinati mediante Western Blot. E. Dopo essere state pretrattate con 10μM U0126 (inibitore di MEK1/2) o con il controllo veicolo DMSO per 2 h, le cellule sono state trattate con 40 mM DCA o PBS per altre 24 h. Quindi i livelli di p-Mcl-1, p-ERK, Mcl-1 totale e PARP clivata sono stati analizzati mediante Western blot. F. Le cellule sono state trattate come in (A) e poi il livello di p-ERK è stato misurato mediante Western blot. G. Dopo essere state trattate come in (A) per 22 ore, le cellule sono state incubate con 10μM MG132 (inibitore del proteasoma) o DMSO per altre 2 ore. Quindi il livello della proteina Mcl-1 è stato analizzato mediante Western blot. H. Le cellule sono state trattate come in (A), quindi il livello di PAPR clivato e p-mTOR è stato valutato mediante Western blot. I. Dopo essere state pretrattate con DMSO o 2μM PP242 (inibitore di mTOR) per 2 h, le cellule sono state trattate con 40 mM DCA o PBS per altre 24 h. Quindi il livello di p-mTOR, p-4EBP1, Mcl-1 e PARP clivata sono stati analizzati mediante Western blot. n.s., nessuna significatività; **,P<0,01.

Inoltre, Ser159 è strettamente correlato con la stabilità di Mcl-1 e questo sito è principalmente fosforilato da GSK-3β [25], quindi abbiamo verificato se GSK-3β è anche coinvolto nella regolazione della stabilizzazione di Mcl-1 indotta da DCA. Come mostrato nella Figura S2B, il DCA ha aumentato la fosforilazione della GSK-3β, ma non ha avuto alcun effetto sulla GSK-3β totale. Inoltre, il DCA ha aumentato la fosforilazione di Akt (una molecola di segnale a monte della GSK-3β) e l’inibitore di Akt MK-2206 2HCl ha attenuato drasticamente la fosforilazione della GSK-3β indotta dal DCA, l’aumento di Mcl-1 e la resistenza all’apoptosi (Figura S2C). Questi risultati indicano che la fosforilazione p-Akt-mediata di GSK-3β promuove la stabilizzazione di Mcl-1 indotta da DCA.

Successivamente, abbiamo esaminato se Met può attenuare la Mcl-1 indotta da DCA inibendo p-ERK/p-Akt. Come mostrato nella Figura 3F e nella Figura S2D, il Met non è stato in grado di sopprimere la p-ERK e la p-Akt indotte dal DCA, insieme ai risultati della Figura 3A, indicando che il Met non riduce la Mcl-1 indotta dal DCA né a livello trascrizionale né a livello post-traslazionale. Abbiamo poi analizzato se il Met attenua la Mcl-1 indotta dal DCA a livello traslazionale con l’inibitore del proteasoma MG132. Come mostrato nella Figura 3G, quando le cellule sono state trattate con controllo, DCA, Met o combinazione, i livelli proteici di Mcl-1 erano ugualmente elevati in presenza di MG132 rispetto al DMSO, indicando che Met attenua Mcl-1 indotta da DCA attraverso l’inibizione della traduzione di Mcl-1. È stato riportato che l’attivazione di mTOR promuove la traduzione di Mcl-1 [26], quindi abbiamo analizzato p-mTOR dopo il cotrattamento con Met e DCA. Come previsto, Met ha ridotto notevolmente il livello di p-mTOR (Figura 3H) e l’inibitore di mTOR PP242 ha avuto un effetto simile a quello di Met nel promuovere l’apoptosi (Figura 3I). In base ai dati riportati nella Figura 3 e nella Figura S2, possiamo concludere che il DCA aumenta la regolazione di Mcl-1 attraverso la fosforilazione di ERK e GSK-3β, mentre il Met sopprime la traduzione di Mcl-1 attraverso l’inibizione di p-mTOR.


IlMet diminuisce l’autofagia protettiva indotta dal DCA
Studi precedenti hanno dimostrato che l’autofagia svolge un ruolo importante nella resistenza terapeutica del DCA nelle cellule di cancro del colon [11], quindi abbiamo esaminato il ruolo dell’autofagia nelle cellule di cancro ovarico dopo il trattamento con DCA e/o Met. Come mostrato nella Figura 4A, il DCA ha promosso in modo dose-dipendente il livello di MAP1LC3-II (LC3-II), il marcatore dell’autofagia. L’inibizione dell’autofagia mediante clorochina (CQ) o il silenziamento di ATG7 hanno aumentato drasticamente l’apoptosi e la citotossicità indotte dal DCA (Figura 4B-4D, Figura S3A-3D), indicando che il DCA induce un’autofagia protettiva nelle cellule di cancro ovarico. Per indagare in via preliminare il meccanismo dell’autofagia indotta dal DCA, abbiamo analizzato i cambiamenti dell’mRNA di 7 geni correlati all’autofagia nelle cellule trattate con DCA. Come mostrato nella Figura S3E, il DCA ha drammaticamente aumentato il livello di mRNA di ATG7 nelle cellule di cancro ovarico, suggerendo che ATG7 potrebbe essere coinvolto nell’autofagia protettiva indotta dal DCA. Successivamente, abbiamo riscontrato che il Met ha ridotto notevolmente la LC3-II indotta dal DCA (Figura 4E-4G), indicando che il Met potrebbe attenuare l’autofagia protettiva indotta dal DCA. In sintesi, si può affermare che l’indebolimento dell’autofagia protettiva indotta dal DCA è importante anche per l’effetto sensibilizzante del Met nei confronti del DCA.

Figura 4: Met riduce l’autofagia protettiva indotta da DCA. A. Le cellule SKOV3 sono state trattate con le concentrazioni indicate di DCA, quindi i livelli di LC3B-I/II sono stati rilevati mediante Western blot. B, C. Dopo essere state trasfettate con il plasmide che esprime GFP-LC3 per 12 ore, le cellule SKOV3 sono state trattate con 40 mM di DCA per altre 24 ore in presenza o in assenza dell’inibitore dell’autofagia CQ (20 mM). Quindi sono state osservate al microscopio a fluorescenza le punteggiature verdi fluorescenti di GFP-LC3 (che si sono verificate al momento dell’induzione dell’autofagia) (B). Successivamente, i dati di (B) sono stati quantificati ed espressi come percentuale di cellule contenenti 5 o più punti GFP-LC3 (C). D. Le cellule SKOV3 sono state trattate con 40 mM DCA per 24 ore in presenza o in assenza di CQ (20 mM), quindi i livelli di LC3-I/II e di PARP clivata sono stati esaminati mediante Western blot. E, F. Dopo essere state trasfettate con il plasmide che esprime GFP-LC3 per 12 ore, le cellule SKOV3 sono state co-trattate con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuna da sola per 24 ore. Quindi le punteggiature verdi fluorescenti di GFP-LC3 sono state fotografate (E) e quantificate (F) come in (B e C). G. Le cellule SKOV3 sono state cotrattate con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuna da sola per 24 ore, quindi i livelli di LC3-I/II e di PARP clivata sono stati rilevati mediante Western blot. *p<0,05; **, P<0,01.

IlDCA allevia il consumo di glucosio e la produzione di lattato indotti da Met
Per chiarire se il DCA può superare la carenza di Met, sono state analizzate le variazioni di lattato e glucosio. Come mostrato nelle Figure 5A-5C, la Met ha aumentato la produzione di lattato e il consumo di glucosio, che sono stati notevolmente attenuati dal DCA. Inoltre, sono stati misurati il tasso di consumo di ossigeno cellulare (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Come mostrato nelle Figure 5D-5F, il Met ha ridotto il rapporto OCR/ECAR, che è stato drasticamente attenuato dal DCA, rivelando che il DCA può sopprimere la glicolisi indotta dal Met attraverso il recupero della respirazione mitocondriale. Poiché il DCA è un inibitore delle PDK che fosforila e inibisce l’attività della PDH [9], abbiamo esaminato il livello di p-PDH. Come mostrato nella Figura 5G, la Met ha aumentato il livello di p-PDHE1α (una subunità della PDH), che è stato nettamente invertito dal DCA. Il silenziamento della PDH con un siRNA ha attenuato significativamente la produzione di lattato indotta dal Met (Figura 5H, 5I). L’espressione ectopica di PDK1 e PDK2 ha aumentato la fosforilazione di PDHE1α e ha attenuato l’apoptosi indotta dal cotrattamento con DCA e Met (Figure 5J, 5K), insieme ai dati delle Figure 5G-5I, indicando che il DCA può sensibilizzare il Met attraverso l’inibizione della via PDK/PDH nell’uccidere le cellule di cancro ovarico.

Figura 5: Il DCA attenua il consumo di glucosio e la produzione di lattato indotti dal Met. A. Le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state co-trattate con 40 mM di DCA e 10 mM di Met o ciascuna da sola per i tempi indicati, quindi sono state misurate separatamente le concentrazioni di glucosio nei terreni di coltura. B, C. Dopo il cotrattamento con 40 mM DCA e 10 mM Met o ciascuno da solo per 24 ore, il colore dei terreni di coltura è stato fotografato (B) e le concentrazioni di L-lattato nei terreni sono state analizzate (C). D-F. Dopo il trattamento come in (B), l’OCR (D) e l’ECAR (E) delle cellule sono stati misurati con il kit XF Cell Mito Stress Test e il tasso di respirazione mitocondriale (OCR/ECAR) è stato calcolato (F). G. Le cellule sono state trattate come in (B), quindi i livelli di PDHE1α totale e p-PDHE1α su Ser293 sono stati rilevati mediante Western blot. H, I. Dopo aver trasfettato per 12 ore il siRNA per PDH o il siRNA di controllo, le cellule SKOV3 sono state trattate con 10mM Met o PBS. Quindi sono stati fotografati i colori dei terreni di coltura (H) e sono state analizzate le concentrazioni di L-lattato nei terreni (I). J, K. Dopo la cotrasfissione con i vettori di espressione di PDK1 e PDK2 (pcDNA3.1- PDK1, PDK2) o con il vettore di controllo pcDNA3.1 per 12 ore, le cellule sono state cotrattate con 40 mM DCA e 10 mM Met per altre 24 ore. Quindi la vitalità cellulare è stata determinata mediante il saggio CCK8 (J) e i livelli di PDHE1α totale, p-PDHE1α su Ser293 e PARP clivata sono stati analizzati mediante Western blot. siNC, siRNA per il controllo negativo; siPDH: siRNA per PDH; *,P<0.05; **,P<0.01.

DCA e Met reprimono in modo collaborativo la crescita delle cellule di carcinoma ovarico in vivo
Come mostrato nelle Figure 6A e 6B, il co-trattamento con DCA e Met ha soppresso in modo più efficiente la crescita di xenotrapianti di carcinoma ovarico in topi nudi rispetto al trattamento con DCA o Met da soli. L’analisi Western blot ha mostrato che DCA e Met hanno aumentato in modo sinergico la PARP clivata e hanno downregolato Mcl-1 e p-PDHE1α negli xenotrapianti (Figura 6C-6D). Questi risultati suggeriscono che DCA e Met possono inibire in modo collaborativo la crescita delle cellule di carcinoma ovarico in vivo attenuando le reciproche carenze.

Figura 6: DCA e Met reprimono in modo collaborativo la crescita delle cellule di carcinoma ovarico in vivo. A-D. 5×106 cellule SKOV3 in 150 μL di PBS sono state impiantate nell’ascella destra di ciascun topo nudo. Quando si sono formati tumori palpabili, i topi sono stati randomizzati in 4 gruppi (n = 6 per gruppo). Quindi i topi sono stati sottoposti a iniezioni intraperitoneali quotidiane di DCA (50 mg/kg/d) più Met (100 mg/kg/d) o di ciascuno da solo per 8 giorni, prendendo il PBS come controllo. Le dimensioni dello xenotrapianto tumorale sono state monitorate ogni giorno (volume = larghezza2×lunghezza×1/2) (A). Dopo l’escissione dai topi, i tumori xenotrapiantati sono stati fotografati (A) e i loro volumi sono stati mostrati in (B). I livelli di PARP clivata, Mcl-1, PDHE1α totale e p-PDHE1α sono stati misurati mediante Western blot (C) e sono stati calcolati i rapporti delle proteine corrispondenti rispetto alla β-actina (D). *p<0,05; **, P<0,01.

DISCUSSIONE

È stato confermato che la maggior parte dei tumori solidi è caratterizzata dall'”effetto Warburg”, in base al quale essi utilizzano la glicolisi per la produzione di energia anche se l’ossigeno è sufficiente. Puntare su questo fenomeno anomalo ha aperto la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro il cancro, oltre ai tradizionali farmaci citotossici. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il co-trattamento con DCA e Met (due agenti associati al metabolismo) può reprimere più efficacemente la crescita delle cellule di cancro ovarico rispetto a ciascuno di essi da solo in vitro e in vivo. Il Met attenua la Mcl-1 indotta dal DCA e l’autofagia protettiva, mentre il DCA allevia l’accumulo eccessivo di lattato e il consumo di glucosio indotti dal Met. I benefici reciproci dei due agenti contribuiscono a un’intensa apoptosi per uccidere più efficacemente le cellule di cancro ovarico. Il modello di funzionamento di DCA e Met in combinazione è stato illustrato nella Figura 7.

Figura 7: Il modello di lavoro per la sensibilizzazione sinergica di DCA e Met nelle cellule di cancro ovarico. Il DCA può indurre la proteina anti-apoptotica Mcl-1 e l’autofagia protettiva, che a sua volta inibisce l’apoptosi indotta dal DCA nelle cellule di cancro ovarico. Il Met può provocare l’accumulo di lattato e un elevato consumo di glucosio, ostacolando l’uccisione delle cellule di cancro ovarico. Il DCA e il Met possono indurre sinergicamente l’apoptosi delle cellule di cancro ovarico superando le reciproche carenze.

Nonostante gli studi in corso da anni, i fattori chiave che possono ostacolare l’effetto pro-apoptotico del DCA non sono ancora chiari. I nostri risultati hanno mostrato che Mcl-1 è un fattore di resistenza cruciale contro l’apoptosi indotta dal DCA nelle cellule di carcinoma ovarico e il cotrattamento con Met e DCA ha ridotto Mcl-1 e aumentato l’apoptosi. Tuttavia, il cotrattamento ha portato a un aumento di Bcl-xL (Figura 2A), che potrebbe essere un meccanismo di compensazione per mantenere la sopravvivenza delle cellule. Un fenomeno simile è stato riportato anche in uno studio precedente [27] (Lo studio dimostra che l’inibitore di Bcl-2/xL ABT-263 induce l’apoptosi delle cellule tumorali e al tempo stesso aumenta la Mcl-1). Inoltre, l’aumento di Bcl-xL indotto dal cotrattamento era presente solo nella linea cellulare SKOV3 (ma non nella OVCAR3), suggerendo che questo effetto potrebbe essere specifico per la cellula. Naturalmente, resta ancora da determinare il meccanismo dettagliato attraverso il quale il cotrattamento con Met e DCA upregola Bcl-xL. Ulteriori studi hanno rivelato che il DCA ha indotto l’accumulo di Mcl-1 attraverso l’attivazione di ERK e Akt, che hanno protetto Mcl-1 dalla degradazione mediata dal proteasoma. Questi risultati suggeriscono che l’inibizione di ERK e Akt può essere una buona strategia per sensibilizzare il DCA nel trattamento del cancro ovarico. Tuttavia, recentemente è stato riportato un risultato contrastante, secondo cui il DCA diminuisce il livello di Mcl-1 nelle cellule di AML [28] e di cancro colorettale [29]. Le discrepanze suggeriscono che la relazione tra DCA e Mcl-1 potrebbe essere ampiamente diversa in contesti diversi.

L’autofagia è un processo catabolico volto a riciclare metaboliti essenziali, come aminoacidi e lipidi, per ricostituire la riserva bioenergetica in presenza di privazione di nutrienti o di altri stress drammatici [30-31]. In questo studio, abbiamo rivelato che il DCA ha indotto un’autofagia protettiva nelle cellule di carcinoma ovarico e l’ATG7 potrebbe svolgere un ruolo in questo processo (Figura S3E), ma il meccanismo dettagliato deve essere ulteriormente studiato. Inoltre, abbiamo scoperto che Met sensibilizza il DCA sopprimendo l’autofagia protettiva indotta dal DCA. Coerentemente con i nostri risultati, Met può reprimere l’autofagia dipendente da GRP78 per potenziare l’effetto anti-mieloma del bortezomib [15] e inibire l’autofagia indotta dal 2DG per sensibilizzare il 2DG nelle cellule di cancro alla prostata [32]. Tuttavia, il meccanismo o i meccanismi dettagliati con cui Met sopprime l’autofagia protettiva devono essere ulteriormente studiati.

Il Met è stato riconosciuto come agente singolo o sensibilizzante nella terapia del cancro, ma uno svantaggio notevole è che il Met promuove il consumo di glucosio e accelera l’accumulo di lattato, facilitando la glicolisi aerobica dipendente dal cancro. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il DCA può attenuare drasticamente questo effetto collaterale. Il DCA può inibire fortemente l’attività delle PDK e del suo downstream p-PDHE1α, portando a un rimodellamento metabolico che riutilizza la fosforilazione ossidativa e provoca un minore accumulo di lattato e consumo di glucosio. Tra i quattro tipi di isoenzimi PDK, il DCA funziona principalmente attraverso l’inibizione di PDK2 e PDK1 [33]. Come previsto, la sovraespressione contemporanea di PDK2 e PDK1 ha aumentato la fosforilazione di PDHE1α, ha abolito la funzione sensibilizzante del DCA e ha parzialmente annullato l’effetto letale del DCA più Met nelle cellule di cancro ovarico. Nel complesso, i nostri risultati indicano che il DCA sensibilizza la funzione antitumorale del Met attraverso l’inibizione dell’attività delle PDK. Tuttavia, va notato che il DCA può sensibilizzare il Met aumentando lo stress ossidativo indotto dal Met nelle cellule di cancro al seno [34]. Ciò significa che il meccanismo di sinergizzazione del DCA nei confronti del Met è molto complicato e necessita di studi approfonditi.

In sintesi, abbiamo dimostrato che il DCA e il Met possono sopprimere sinergicamente la crescita delle cellule di carcinoma ovarico, il che potrebbe aprire la strada allo sviluppo di nuove strategie per il trattamento del carcinoma ovarico basate sull’uso combinato di DCA e Met.

MATERIALI E METODI

Linee cellulari e reagenti
Le linee cellulari, tra cui SKOV3, OVCAR3, HeLa, SiHa, GLC-82, A549 e HepG2, sono state acquistate dall’American Type Culture Collection (ATCC) e sono state coltivate in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), streptomicina (100 mg/mL) e penicillina (100 U/mL) a 37°C in un incubatore umido al 5% diCO2. DCA e cicloeximide (CHX) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA). Met, U0126, MG132 e Hoechst 33258 sono stati acquistati dalla Beyotime Company (Shanghai, Cina). MK2206 è stato acquistato da Selleck Company (Shanghai, Cina). Il kit per il dosaggio dell’attività della caspasi-3 e il kit per il dosaggio delle specie reattive dell’ossigeno sono stati acquistati da Beyotime Company (Shanghai, Cina). Annexin V-FITC e PI sono stati acquistati da BD Bioscience (BD, NJ, USA). I siRNA per Mcl-1, ATG7, PDH e il siRNA di controllo sono stati acquistati da GenePharma (Shanghai, Cina). I plasmidi di espressione pCMV e pcDNA3.1, pCMV-Mcl-1, pcDNA3.1-PDK1 e pcDNA3.1-PDK2 sono stati acquistati da Obio Technology (Shanghai, Cina).

Western blot
Sono stati preparati lisati di cellule intere e il Western blot è stato eseguito come precedentemente descritto [35]. Gli anticorpi per la β-actina e il PDHE1α sono stati prodotti da Abcam Company (San Francisco, CA, USA), gli anticorpi per Bcl-2 e Mcl-1 sono stati prodotti da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) e gli anticorpi per PARP, BCL-xL, GSK-3β, p-ERK (Thr202/Tyr204), p-JNK (Thr183/Tyr185), p-Mcl-1 (Thr163), p-Akt (Ser473), p-4EBP1, p-mTOR e p-GSK-3β (Ser9) sono stati prodotti da Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). L’anticorpo contro p-PDHE1α (Ser293) è stato prodotto da EMD Millipore (Billerica, MA, USA).


Trasfezione cellulare
Le cellule SKOV3 e OVCAR3 sono state coltivate al 60%-70% di confluenza in piastre a 6 pozzetti. Il siRNA o il plasmide di espressione sono stati miscelati con 10 μL di lipofectamina 2000 in Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) per ogni pozzetto secondo il protocollo del produttore. Dopo essere state incubate con le miscele per 6 ore, le cellule sono state coltivate in DMEM con il 10% di FBS per altre 6 ore. Quindi le cellule sono state sottoposte al trattamento corrispondente.

Saggio di vitalità cellulare
Il saggio di vitalità cellulare è stato eseguito utilizzando il kit CCK-8 (Dojindo, Shanghai, Cina) come precedentemente descritto [27]. In breve, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (2×103 cellule/pozzetto) in triplicato e incubate per 12 ore. Poi le cellule sono state sottoposte a diversi trattamenti o al controllo del veicolo per 48 ore, seguite dall’aggiunta di 10 μl di soluzione CCK-8 in ogni pozzetto. Dopo l’incubazione a 37°C per 1,5 ore, il valore di OD450nm è stato determinato con un lettore di micropiastre.

Citometria a flusso
Le cellule di cancro ovarico sono state incubate con annexina V-FITC e PI secondo le istruzioni del produttore (BD, 561012). Quindi l’apoptosi è stata analizzata con un citometro a flusso.

Colorazione Hoechst
Dopo essere state trattate per 24 ore, le cellule sono state colorate con Hoechst 33258 (Beyotime, Shanghai, Cina) a 10μg/mL per 10 minuti al buio. Successivamente, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e fotografate al microscopio afluorescenza.

Saggio dell’attività della caspasi 3
L’attività della caspasi 3 è stata esaminata con il kit Caspase3 Activity Assay (Beyotime, C1115) come precedentemente descritto [36]. In breve, le cellule di controllo e quelle trattate sono state raccolte, lavate con PBS freddo e risospese in 50 μl di tampone di lisi cellulare raffreddato per 15 minuti in ghiaccio. Quindi i lisati sono stati centrifugati (20.000 g, 10 min, 4°C) e i surnatanti sono stati raccolti immediatamente per il dosaggio dell’attività della caspasi3.

Misurazione dei ROS intracellulari totali
I ROS intracellulari totali sono stati analizzati con il ROS Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Cina) come precedentemente descritto [37].

Isolamento dell’RNA, PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)
L’RNA totale è stato estratto dalle cellule con il reagente TRIzol (ComWin Biotechnology, Pechino, Cina) e il cDNA first-strand è stato sintetizzato utilizzando la trascrittasi M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La qPCR è stata eseguita con QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Promega, Shanghai, Cina). I livelli relativi di mRNA dei geni target sono stati calcolati con il metodo2-ΔΔCt.

Analisi della proteina verde fluorescente (GFP)-MAP1LC3
Dopo essere state trasfettate con il vettore di espressione GFP-MAP1LC3 (GFP-LC3) per 12 ore, le cellule sono state sottoposte ai trattamenti indicati per altre 24 ore e poi fissate con formaldeide al 4% per 10 minuti. Successivamente, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e osservate al microscopio a fluorescenza.

Rilevazione di L-lattato e glucosio
Le cellule sono state trattate in pozzetti da 6, quindi il mezzo è stato raccolto e le concentrazioni di L-lattato e glucosio sono state determinate separatamente utilizzando L-Lactate Assay Kit (Eton Bioscience, San Diego, CA, USA) e Glucose Colorimetric/Fluorometic Assay Kit (BioVision, Milpitas, CA, USA).

Analisi della bioenergetica cellulare
Le cellule sono state poste in piastre XF96 e lasciate crescere per una notte. Poi i terreni sono stati sostituiti con terreni XF96 1 ora prima del test. Rotenone/antimicina A, FCCP e oligomicina sono stati diluiti in terreno XF96 e caricati nella cartuccia di accompagnamento per ottenere concentrazioni finali di 0,5μM, 0,5μM e 1,0μM, rispettivamente. Le iniezioni dei farmaci nel mezzo di coltura sono avvenute ai punti temporali specificati. L’OCR (pmol/min) e l’ECAR (mpH/min) sono stati monitorati con il kit XF Cell Mito Stress Test (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA) utilizzando gli analizzatori di flusso extracellulare Seahorse Bioscience XFe e XF.

Studio sugli animali
I topi nudi femmina di sei settimane sono stati acquistati da Beijing Huafukang Bioscience (Pechino, Cina) e sono stati alloggiati e curati secondo le linee guida del Comitato per la cura e l’etica degli animali della Third Military Medical University (Chongqing, Cina). 5×106 cellule SKOV3 in 150 μL di PBS sono state impiantate nell’ascella destra di ciascun topo nudo. Quando si sono formati tumori palpabili, i topi sono stati randomizzati in 4 gruppi (n = 6 per gruppo). Quindi i topi sono stati sottoposti a iniezioni intraperitoneali quotidiane di DCA (50 mg/kg/d) più Met (100 mg/kg/d) o ciascuno da solo per 8 giorni, assumendo il PBS come controllo. Le dimensioni del tumore xenotrapiantato sono state monitorate ogni giorno con un calibro scorrevole e il volume è stato stimato con la seguente formula: volume = larghezza2×lunghezza×1/2. Dopo l’escissione dai topi, i tumori xenotrapiantati sono stati fotografati e le proteine corrispondenti sono state esaminate mediante Western blot.

Analisi statistica
I dati sono stati espressi come media ± SD. Per l’analisi della varianza sono stati utilizzati l’ANOVA a una via e il t-test. P<0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

RICONOSCIMENTI

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81472436 e 81272865) e dalla Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2012jjB10025).

CONFLITTI DI INTERESSE

Non sono stati rivelati potenziali conflitti di interesse.

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