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Margaret O James*,1 e Peter W Stacpoole2,3

1 Dipartimento di Chimica Medicinale, Università della Florida, Gainesville, FL 32610-0485, USA
2 Dipartimento di Medicina, College of Medicine, Università della Florida, Gainesville, FL 32610-0485, USA
3 Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Università della Florida, Gainesville, FL 32610-0485, USA


Corrispondenza: Tel: +1 352 273 7707 Email: [email protected]

Presentato: 16 dicembre 2015
Accettato: 17 febbraio 2016
Pubblicato: 4 maggio 2016

Abstract

Il farmaco sperimentale dicloroacetato (DCA) è un regolatore metabolico che è stato utilizzato con successo per trattare malattie metaboliche acquisite e congenite e, recentemente, tumori solidi. Il suo uso clinico ha evidenziato problemi nella selezione delle dosi appropriate. La somministrazione cronica di DCA porta all’inibizione del suo metabolismo e a un potenziale accumulo a livelli che provocano effetti collaterali. Questo perché la conversione del DCA in gliossilato è catalizzata da un enzima, la glutatione transferasi zeta 1 (GSTZ1-1), che viene inattivato dal DCA. Gli SNP nel gene GSTZ1 determinano l’espressione di varianti polimorfiche dell’enzima che differiscono per attività e velocità di inattivazione da parte del DCA in condizioni fisiologiche: queste proprietà determinano una notevole variazione tra le persone nella farmacocinetica del DCA.


Parole chiave: dicloroacetato; GSTZ1; farmacogenetica


Uso clinico del dicloroacetato

Per essere una molecola così semplice, il DCA ha un portafoglio farmacologico straordinariamente ricco e diversificato, che risale a quasi un secolo fa [1,2]. Tuttavia, il suo uso moderno come farmaco sperimentale è iniziato nel 1970, quando è stata scoperta la sua capacità selettiva di abbassare i livelli di glucosio nel sangue negli animali diabetici, ma non in quelli non diabetici [3] e successivamente confermata nell’uomo [4]. Negli anni ’70 e ’80 sono state identificate molte proprietà metaboliche del DCA che riguardano il metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tuttavia, la maggior parte dei suoi effetti farmacologici può essere ricondotta ad alcuni siti e meccanismi d’azione fondamentali. In primo luogo, il DCA è un inibitore non competitivo dell’enzima del reticolo endoplasmatico HMG CoA reduttasi, che catalizza la fase limitante della biosintesi del colesterolo. L’effetto inibitorio del DCA è stato osservato sia nel fegato dei roditori [5] che nei leucociti umani [6]; probabilmente è alla base della riduzione associata al farmaco del colesterolo totale e delle lipoproteine a bassa densità (LDL) nei pazienti con ipercolesterolemia familiare omozigote negativa per il recettore LDL [7] e della sua designazione come primo prodotto orfano per questa rara malattia. In secondo luogo, il DCA inibisce la sintesi epatica de novo dei trigliceridi nei roditori non diabetici [5] e riduce i livelli circolanti di trigliceridi e di lipoproteine a bassissima densità nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 [4]. Inoltre, riduce i corpi chetonici nel sangue in ratti con chetoacidosi diabetica indotta sperimentalmente [8,9]. I meccanismi precisi alla base di questi effetti sulla sintesi e sull’ossidazione dei lipidi sono sconosciuti. In terzo luogo, il DCA stimola la PDC mitocondriale, che ossida irreversibilmente il piruvato ad acetil coenzima A (acetil CoA) [10], una proprietà condivisa da alcuni altri acidi grassi alogenati a catena corta [11]. È la capacità del DCA di alterare l’attività della PDC che ha generato di gran lunga le maggiori ricerche sperimentali e cliniche su questa insolita molecola.

La PDC è regolata a livello post-traduzionale principalmente dalla fosforilazione reversibile di uno o più di tre residui di serina sulla subunità E1α del primo enzima PDH della PDC che decarbossila il piruvato [12]. Quattro chinasi PDH (PDK1-4) e due fosfatasi PDH (PDP 1 e 2) svolgono questo aspetto regolatorio della PDC nell’uomo, in cui l’enzima fosforilato è cataliticamente inattivo. Le PDK sono espresse in modo differenziato nei tessuti, sebbene la PDK2 sia espressa in modo ubiquitario [13]. Il piruvato, il substrato della reazione PDC, inibisce le PDK legandosi a una piccola tasca nell’N-terminus della chinasi, con conseguente stimolazione dell’attività della PDC. Al contrario, l’accumulo dei prodotti della reazione, acetil CoA e NADH, determina l’attivazione delle PDK e l’inibizione della PDC. Anche il DCA, un analogo strutturale del piruvato, si attacca al sito di legame del piruvato, determinando l’inibizione delle PDK con un ordine di inibizione pari a PDK2>PDK1˜PDK4>>PDK3 [13]. L’esposizione cronica ai farmaci in vitro [14,15] e in vivo [16] può stabilizzare la PDC e diminuirne il turnover, fornendo un secondo meccanismo con cui il DCA aumenta l’attività del complesso e una spiegazione per i suoi effetti farmacologici prolungati dopo la sospensione del farmaco [4].

Sebbene il DCA sia un inibitore relativamente debole della PDK (Ki 0,2 mM per la PDK2), i suoi effetti su aspetti del metabolismo intermedio sono profondi e si riferiscono direttamente al ruolo centrale che la PDC svolge nella regolazione della selezione del carburante e della bioenergetica delle cellule eucariotiche [17,18]. Il DCA non è ancora un farmaco sperimentale approvato dalla FDA statunitense. Tuttavia, continua a essere ampiamente studiato come modulatore metabolico per diversi disturbi metabolici congeniti e acquisiti, sulla base della sua azione stimolante sulla PDC (Tabella 1).

ProprietàMeccanismoRif.
Aumento dell’OXPHOS e della bioenergetica↓ PDK ↑ PDC[2,10]
Diminuzione della glicemia a digiuno o nel diabete↓ PDK ↑ PDC[4]
Diminuzione del lattato nel sangue e nel liquor↓ PDK ↑ PDC[19]
Diminuzione del colesterolo totale e LDL nel sangue↓ HMG CoA reduttasi → ↓ sintesi del colesterolo[6,7]
Diminuzione dei trigliceridi e del colesterolo VLDL nel sangue↓ sintesi di TG epatici → ↓ sintesi di VLDL[4]
Inversione dell’effetto Warburg nel cancro, nella PAH e in altre condizioni proliferative↓ PDK ↑ PDC[20]
Tabella 1. Proprietà farmacologiche del dicloroacetato.

CSF: Liquido cerebrospinale; HMG CoA: Idrossimetilglutaril coenzima A; LDL: Lipoproteine a bassa densità; OXPHOS: Ossidative phosphorylation; PAH: Pulmonary arterial hypertension; PDC: Pyruvate dehydrogenase complex; PDK: Pyruvate dehydrogenase kinase; TG: Trigliceridi; VLDL: Lipoproteine a bassissima densità.

Farmacocinetica e clearance

Il DCA orale viene assorbito rapidamente e ha una biodisponibilità che si avvicina all’unità sia dopo somministrazione orale che parenterale [21,22]. Il farmaco può essere rilevato nel plasma degli esseri umani entro 15 minuti da una dose orale di 50 mg/kg. In soggetti precedentemente naive, il DCA per via orale o endovenosa ha un’emivita plasmatica di circa 1 ora [23]. Il tasso di metabolismo tra le specie sane è: topo>ratto>uomo≥cane [22-25].

Le prime indagini farmacocinetiche sul DCA per via endovenosa in dose singola hanno descritto una cinetica non lineare a dosi ≥35 mg/kg [26]. In seguito è stato riscontrato che il tasso di clearance plasmatica del farmaco diminuiva al momento della somministrazione endovenosa ripetuta di 50 mg/kg di peso corporeo in adulti gravemente malati con acidosi lattica [27,28]. La clearance plasmatica ritardata del farmaco somministrato per via orale alla dose di 50 mg/kg è stata osservata anche in adulti sani, che hanno avuto bisogno di settimane o mesi prima di raggiungere il tasso di clearance originale con una seconda dose [22].

I principali progressi nella comprensione di questa insolita caratteristica della farmacocinetica del DCA sono stati ottenuti grazie a ricerche probanti sulla sua tossicologia clinica. Il DCA cronico può causare una neuropatia periferica reversibile in tutte le specie [21,23], un effetto osservato clinicamente per la prima volta 25 anni fa in un ragazzo di 16 anni che aveva ricevuto 50 mg/kg/die per circa 4 mesi [7]. Al contrario, in uno studio randomizzato e controllato (RCT) su 43 bambini piccoli con vari tipi di malattie mitocondriali primarie (età media all’ingresso: 5,6 anni), il DCA orale somministrato alla dose di 12,5 mg/kg ogni 12 ore per 6 mesi è stato ben tollerato e non ha causato cambiamenti negativi nella conduzione elettrica dei nervi periferici, rispetto al placebo [29], anche se è stato riscontrato un certo declino asintomatico nella conduzione nervosa con un’esposizione più lunga al farmaco [30]. Al contrario, un RCT su 30 adolescenti e adulti più anziani (età media di ingresso: 30 anni) con una malattia mitocondriale genetica, esposti alla stessa dose e allo stesso schema di dosaggio utilizzati nello studio pediatrico, è stato interrotto prematuramente a causa del peggioramento o della nuova insorgenza di neuropatia periferica [31], una complicanza comune delle malattie mitocondriali [32,33]. Quando è stata confrontata la cinetica del DCA in queste due popolazioni di pazienti, si è scoperto che la clearance plasmatica del DCA cronico era nettamente più lenta nel gruppo più anziano [34], un dato confermato da studi sui ratti [34,35]. Questi risultati hanno indotto a studiare l’enzimologia della biotrasformazione del DCA.

Importanza della glutatione transferasi zeta 1 nella biotrasformazione del DCA

I piccoli acidi carbossilici sono spesso glucuronidati [36] o convertiti nei loro derivati del coenzima A e poi in coniugati aminoacidici [37], ma non ci sono prove che il DCA formi un glucuronide, un derivato del coenzima A o un coniugato aminoacidico [2, James MO, dati non pubblicati]. Il DCA è invece un substrato per un insolito enzima GST, il GSTZ1-1, che lo converte in gliossilato in una reazione che richiede ma non consuma glutatione (GSH) [38,39]. Come altre GST, GSTZ1-1 è attiva nella forma dimerica e l’enzima attivo è un omodimero. La declorazione del DCA per formare gliossilato, catalizzata da GSTZ1-1, è l’unica via del metabolismo primario del DCA osservata nel fegato [35]. Oltre a catalizzare il metabolismo del DCA, GSTZ1-1, noto anche come MAAI, ha un’importante funzione fisiologica nel catabolismo della tirosina, dove isomerizza il maleilacetoacetato (MAA) e il maleilacetone (MA) in fumarilacetoacetato e fumarilacetone in reazioni che richiedono ma non consumano GSH (Figura 1) [40,41]. La biotrasformazione del DCA in gliossilato termina le sue attività farmacologicamente e terapeuticamente importanti, già discusse in precedenza, quindi l’attività di GSTZ1-1 controlla la durata d’azione del DCA.

Figura 1.ruolo di GSTZ1/MAAI nel metabolismo del dicloroacetato e del catabolita della tirosina maleilacetoacetato e maleilacetone.
Il metabolita inattivo del DCA, il gliossilato, viene ulteriormente metabolizzato in anidride carbonica, glicina e ossalato. Il fumarilacetone e il fumarilacetoacetato sono ulteriormente metabolizzati dalla fumarilacetoacetato idrolasi. DCA: dicloroacetato: GSH: Glutatione; MA: Maleilacetone; MMA: Maleyacetoacetato.

Il fegato è il principale sito di espressione di GSTZ1-1, dove si trova sia nel citosol che nella matrice mitocondriale [38,42]. Studi sugli animali hanno dimostrato livelli molto bassi di espressione di GSTZ1-1 nel rene, nel cuore, nel tratto gastrointestinale e nel cervello [43]. Il ruolo dei tessuti extraepatici nel metabolismo del DCA nelle persone non è stato esplorato in dettaglio, tuttavia uno studio ha dimostrato che il DCA non è stato eliminato dal sangue durante la fase anepatica di pazienti sottoposti a trapianto di fegato a cui è stato somministrato DCA per contrastare l’acidosi lattica, indicando che non si è verificato alcun metabolismo [44]. La fase anepatica era di breve durata (media: 73 minuti), quindi i dati erano limitati, tuttavia questo studio suggerisce un ruolo minore dei tessuti diversi dal fegato nell’eliminazione del DCA, almeno per una singola dose.

Inibizione del GSTZ1-1 da parte del DCA
Studi condotti su animali e con proteine umane ricombinanti GSTZ1-1 hanno dimostrato che il motivo per cui dosi multiple di DCA vengono eliminate molto più lentamente rispetto a una singola dose è che il DCA è un inibitore del GSTZ1-1 basato sul meccanismo [25,34,45-47]. Durante la biotrasformazione del DCA, si formano addotti alla proteina GSTZ1-1 che inattivano la proteina e presumibilmente ne innescano la proteolisi [48,49]. La somministrazione di DCA ai ratti porta alla perdita dell’attività e dell’espressione di GSTZ1-1 in modo dipendente dalla dose e dal tempo: la perdita della funzione di GSTZ1-1 era più pronunciata e persisteva più a lungo nei ratti adulti rispetto ai giovani [34,35]. Questo effetto dell’età sulla perdita della funzione di GSTZ1-1 in seguito alla somministrazione di DCA è stato osservato nelle persone, con i bambini che hanno mostrato un aumento minore dell’emivita plasmatica e una diminuzione minore della clearance rispetto agli adulti [34]. Oltre a influenzare la farmacocinetica del DCA, la perdita di GSTZ1-1 (MAAI) determina l’accumulo dei substrati fisiologici MA e, presumibilmente, MAA, entrambi molecole reattive in grado di formare addotti con le macromolecole cellulari [34,45]. L’inibizione della MAA porta anche alla deviazione del carbonio della tirosina verso la formazione di succinilacetone. Questa molecola inibisce un passaggio prossimale nella sintesi dell’eme, causando l’accumulo della molecola reattiva δ-aminolevulinato (δ-ALA). Sia il MA che il δ-ALA aumentano nel sangue e/o nelle urine di esseri umani esposti cronicamente al DCA [34]: il significato clinico tossicologico di questo effetto non è ancora stato dimostrato.

Altri metaboliti del DCA

L’unico altro metabolita primario noto del DCA è l’acido monocloroacetico (MCA), che è stato occasionalmente trovato in tracce nel sangue dopo la somministrazione di DCA [34]. L’MCA sembra formarsi dal DCA nei globuli rossi [34]. Non ci sono prove della formazione di MCA dal DCA nel fegato. Ai fini pratici, la conversione del DCA in gliossilato determina la farmacocinetica dell’eliminazione del DCA, pertanto la conoscenza dei fattori che influenzano la velocità e l’entità del metabolismo del DCA catalizzato da GSTZ1-1 nelle persone è importante per un dosaggio sicuro ed efficace dei pazienti.

Per quanto riguarda gli effetti del trattamento con DCA, il gliossilato può essere ulteriormente metabolizzato in anidride carbonica attraverso un enzima carboligasi, in glicina da uno o più enzimi aminotransferasi o può essere ossidato in ossalato [35]. L’evidenza di tutte e tre le vie è stata ottenuta da studi in cui ai ratti è stato somministrato DCA [35]. Di queste vie, solo la formazione di ossalato potrebbe essere potenzialmente deleteria per un paziente, ma nel ratto la formazione di ossalato era una via minore [35]. I pazienti adulti in condizioni critiche con acidosi lattica, trattati con DCA per via endovenosa o con placebo in uno studio clinico randomizzato e controllato, sono stati valutati per la presenza di calcoli di ossalato e di tossicità correlata all’ossalato; non sono state riscontrate differenze tra i gruppi DCA e placebo [50]. Analogamente, la somministrazione orale di DCA per diversi anni in uno studio su bambini con forme congenite di acidosi lattica non ha evidenziato calcoli di ossalato o tossicità [51].

Varianti polimorfiche di GSTZ1

Si sospettava che la GSTZ1 umana (NM_145870) presentasse varianti alleliche fin dalla sua scoperta [52]. Studi successivi hanno rivelato SNP nelle regioni codificanti e non codificanti del gene. Stiamo ancora imparando a conoscere gli effetti, se ci sono, della maggior parte di questi SNP sull’espressione, la stabilità e l’attività di GSTZ1 con il DCA. Si tratta di un’area di indagine attiva, poiché questi fattori hanno un impatto sulla farmacocinetica e, in ultima analisi, sull’uso sicuro del DCA. Sono stati presi in considerazione gli SNP che determinano cambiamenti aminoacidici nella proteina espressa, nonché gli SNP che sembrano influenzare la traduzione di GSTZ1 e, in ultima analisi, i livelli di espressione della proteina enzimatica.

Varianti nella sequenza aminoacidica della proteina enzimatica espressa
Sono stati identificati tre SNP comuni nella regione codificante di GSTZ1 [53,54], che sono stati osservati dare origine a cinque aplotipi (Tabella 2). Questi cinque aplotipi si trovano nelle persone con frequenze variabili, a seconda dell’etnia (Figura 2), tuttavia la variante più frequentemente riscontrata in tutte le popolazioni studiate finora, presente in circa il 50% delle persone, è GSTZ1C [54-56]. Questo aplotipo viene anche definito EGT, evidenziando la variante degli aminoacidi nelle posizioni 32, 42 e 82 della proteina dell’enzima [54,55]. Attualmente, le informazioni sull’incidenza dei cinque aplotipi comuni in popolazioni diverse da quella caucasica sono relativamente scarse. Le proteine umane ricombinanti GSTZ1A-1A, 1B-1B, 1C-1C e 1D-1D sono state studiate con il DCA come substrato ed è stato riscontrato che GSTZ1A-1A (KRT/KRT) aveva un’attività superiore rispetto alle altre varianti [54,57]. GSTZ1F è una variante rara (Tabella 2) e le proprietà della proteina ricombinante non sono state studiate. Un individuo può essere omo- o eterozigote per questi aplotipi. Per gli eterozigoti, non è noto se una variante sia espressa in modo preferenziale a livello proteico, tuttavia le frazioni di citosol epatico preparate da individui portatori della variante GSTZ1A su un allele hanno un’attività in vitro con DCA più elevata rispetto a quelli senza questo allele [56], suggerendo la possibilità di un’espressione preferenziale della proteina dell’enzima della variante KRT.

Figura 2.il grafico mostra i dati combinati di tre studi che includevano caucasici, uno con soggetti australiani (n = 128) e gli altri due con caucasici-americani (n = 429), e due studi che includevano afro-americani, ispanici-americani e asiatici-americani[54-56].
E: acido glutammico; G: glicina; K: lisina: M: Metionina; T: Treonina.
Variante Posizione del nucleotide Posizione dell’amminoacido Percentuale nella popolazione (%)†
94124245324282
GSTZ1AAACLys (K)Arg (R)Thr (T)1-10
GSTZ1BAGCLys (K)Gly (G)Thr (T)25-35
GSTZ1CGGCGlu (E)Gly (G)Thr (T)45-55
GSTZ1DGGTGlu (E)Gly (G)Met (M)10-20
GSTZ1FAGTLys (K)Gly (G)Met (M)<1
Tabella 2.
Le varianti polimorfiche GSTZ1-1 umane e la loro frequenza approssimativa nella popolazione.

†L’incidenza di ciascun aplotipo varia a seconda del gruppo etnico, vedi Figura 2 e [54-56].
Glu (E): acido glutammico; Gly (G): Glicina; Lys (K): Lisina: Met (M): Metionina; Thr (T): Treonina.

.

Studi con le proteine ricombinanti umane GSTZ1A-1A, 1B-1B, 1C-1C e 1D-1D hanno esaminato anche l’attività con il substrato fisiologicamente importante, il MA [54]. I tassi di metabolismo del MA hanno mostrato un andamento diverso dalle attività misurate con il DCA come substrato, in quanto la variante GSTZ1C-1C (EGT/EGT) presentava l’attività più elevata con il MA e GSTZ1A-1A quella più bassa [54].

Oltre alle varianti comunemente riscontrate descritte sopra, esistono prove di altre due varianti della sequenza codificante. Una di queste è stata trovata nel database delle etichette di sequenza espresse ed è stata denominata GSTZ1E [54], tuttavia questa variante, che avrebbe la prolina al posto della leucina in posizione 23, non è stata trovata nelle persone. Un’altra variante è stata trovata in un volontario per studi di farmacocinetica del DCA. Questa persona, eterozigote per KGT/KGM (1B/1F), eliminava anche una singola dose di DCA in modo estremamente lento; il sequenziamento del DNA della persona ha rivelato un nuovo SNP nell’esone cinque di GSTZ1, che risultava in metionina invece che in valina in posizione 99 della proteina [55]. In base alla struttura cristallina di GSTZ1B [58], la posizione 99 si trova in un fascio α-elico. Nonostante la ricerca di questa variante in campioni di fegato che mostravano una bassa attività con il DCA [56], non sono ancora stati identificati altri individui con questo polimorfismo.

Polimorfismi della regione promotrice
Dieci SNP in campioni di DNA genomico di soggetti africani ed europei australiani sono stati trovati in una regione che si estende per 1500 nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione di GSTZ1, che si presume essere la regione promotrice del gene [59]. Due di questi SNP, -1002G>A e -289C>T, sono stati associati rispettivamente a una diminuzione e a un aumento dell’attività del promotore, valutata in cellule HepG2. Studi successivi condotti su DNA prelevato da campioni di fegato hanno dimostrato che nei caucasici-americani, ma non negli afroamericani, l’allele A dello SNP rs 7975, che determina l’espressione di lisina anziché di acido glutammico in posizione 32 della proteina, era in linkage disequilibrium con l’allele A dello SNP della regione promotrice -1002 G>A, rs7160195, e determinava una ridotta espressione della proteina GSTZ1-1 con lisina (K) in posizione 32 [60]. L’espressione ridotta è stata osservata negli eterozigoti e negli omozigoti per GSTZ1A (KRT), GSTZ1B (KGT) e GSTZ1F (KGM) nei caucasici-americani [60]. Non è stato riscontrato alcun effetto sull’espressione delle varianti GSTZ1-1 contenenti K in campioni di fegato studiati da afroamericani. Per ragioni non ancora chiare, non sono state riscontrate differenze nei livelli di mRNA di GSTZ1 tra gli aplotipi, evidenziando uno scollamento tra i risultati relativi all’espressione della proteina e dell’mRNA [60]. Il riscontro di una minore espressione della proteina GSTZ1-1 per gli aplotipi contenenti K nei caucasici suggerisce che in questi individui (eccetto quelli con KRT) i tassi di metabolismo iniziale del DCA saranno ridotti. Inoltre, questo solleva la possibilità che i caucasici con aplotipi contenenti K trattati con DCA sperimentino una risintesi meno efficiente della proteina GSTZ1-1, portando a un’eliminazione ancora più lenta rispetto alle persone senza questo aplotipo.

Influenza delle varianti GSTZ1 sulla farmacocinetica del DCA nelle persone

Partendo dal presupposto che gli effetti collaterali del trattamento cronico con DCA sono legati all’accumulo del DCA stesso o dei substrati endogeni reattivi per la GSTZ1, MAA e MA, esiste un argomento convincente per cui l’uso clinico sicuro del DCA dovrebbe essere guidato dalla comprensione della variabilità dell’eliminazione del farmaco nelle persone durante il trattamento cronico. Il dosaggio del DCA potrebbe quindi essere ridotto in coloro che presentano un’eliminazione lenta, pur mantenendo livelli ematici efficaci. Se fosse possibile prevedere chi eliminerà lentamente il DCA, in base al suo patrimonio genetico, si potrebbe somministrare un test diagnostico per ottenere il genotipo di GSTZ1 e la dose potrebbe essere basata sul genotipo. Ciò sarebbe meno costoso che misurare ripetutamente i livelli di DCA nel sangue. A tal fine, la farmacocinetica del DCA è stata studiata in volontari umani e in pazienti. In uno studio su volontari umani, i partecipanti sono stati genotipizzati e la farmacocinetica del DCA è stata studiata dopo una singola dose di 25 mg/kg o cinque dosi giornaliere consecutive di 25 mg/kg/die [55]. Come mostrato nella Tabella 3, le persone con almeno una variante EGT di GSTZ1 hanno mostrato una maggiore clearance del DCA dopo cinque dosi rispetto a coloro che non avevano EGT nel loro genotipo. La Figura 3 illustra la cinetica di eliminazione del DCA dal plasma in un metabolizzatore rapido e uno lento di DCA di questo studio [55]. Risultati simili sono stati riscontrati in pazienti con malattia mitocondriale genetica che hanno ricevuto 12,5 mg/kg di DCA ogni 12 ore per 6, 12 o 30 mesi [55,61]. Questo lavoro mostra anche che i livelli di MA escreti nelle urine, un’altra misura della ridotta attività di GSTZ1/MAAI, erano più elevati nei volontari e nei pazienti senza EGT nel loro genotipo (Tabella 3).

Figura 3.cinetica plasmatica del dicloroacetato (25 mg/kg/die) e biotrasformazione inCO2. Tutti i pannelli mostrano le concentrazioni plasmatiche di 13C-DCAnelle 24 ore successive alla somministrazione orale di 25 mg/kg di 1,2-13C-DCA. In ogni pannello è mostrato anche l’andamento temporale dell’accumulo di 13CO2 nel respiro espirato come percentuale della dose di 13C-DCAsomministrata. (A e B) mostrano i dati relativi a 1 e 5 giorni rispettivamente di un metabolizzatore veloce di DCA omozigote per GSTZ1C (EGT/EGT). (C e D) mostrano i dati di un metabolizzatore molto lento di DCA, eterozigote per GSTZ1F/1B (KGM/KGT) e con la variante rara V99M, rispettivamente per 1 e 5 giorni[55].
conc: Concentrazione; DCA: dicloroacetato.

Sunject, durata del trattamento con DCAClearance plasmatica, mml/min Escrezione di maleilacetone, μg/g creatinina Rif.
Portatore di EGTPortatore di EGT non portatorePortatore di EGTPortatore di EGT non portatore
Volontari, 5 giorni2.22 ± 0.72 (7)0.73 ± 0.84* (5)Non rilevato7.2 ± 4.1*[55]
Pazienti, 12 mesi2.16 ± 0.99 (4)0.91, 0.17[55]
Pazienti, 6 mesi1.90 ± 1.13 (11)0.53 ± 0.35* (6)1.2 ± 0.96.9 ± 2.6*[61]
Pazienti, 30 mesi2.08 ± 1.10 (11)0.67 ± 0.45* (6)1.9 ± 1.15.5 ± 1.2*[61]
Tabella 3. dati di volontari che hanno assunto dicloroacetato, 25 mg/kg/die, e di pazienti con malattie genetiche mitocondriali a cui sono stati somministrati 12,5 mg/kg/12 h, che mostrano la clearance plasmatica e l’escrezione urinaria di maleilacetone.

I valori riportati sono la media ± la deviazione standard (n) o i valori individuali dove n < 3.
*Significativamente diverso dai portatori di EGT, p < 0,05.
L’origine etnica dei volontari era la seguente:
portatori di EGT: quattro caucasici-americani, due afroamericani, un asiatico-americano; non portatori di EGT: cinque caucasici-americani. Le etnie dei pazienti non erano disponibili.
DCA: dicloroacetato.

L’analisi dei dati degli studi sulla farmacocinetica del DCA nei volontari ha suggerito che, come riscontrato in vitro (vedi sotto), i soggetti portatori della variante GSTZ1A, che codifica per KRT, su un allele mostrano una clearance iniziale del DCA più rapida rispetto agli altri. Queste persone hanno anche mostrato un maggiore declino della clearance dopo cinque dosi. Il rapporto di clearance dalla prima alla quinta dose è stato di 3,6 ± 0,8 (media ± errore standard della media, n = 5) nei soggetti con la variante per GSTZ1C (che codifica per EGT) ma non per GSTZ1A, ed è stato di 18,2 ± 9,3 (n = 5) in quelli con la variante GSTZ1A su almeno un allele. Un individuo omozigote per GSTZ1A ha mostrato la variazione maggiore dalla prima alla quinta dose, con un calo della clearance da 16,7 a 0,31 ml/min [55]. La differenza nella variazione media della clearance non era statisticamente significativa, a causa dell’elevata variabilità nel gruppo omo- o etero-zigote per GSTZ1A, tuttavia ha evidenziato una tendenza in accordo con gli studi in vitro sulla suscettibilità dei diversi aplotipi all’inattivazione da parte del DCA.

Studiin vitro sul metabolismo del DCA

Ulteriori approfondimenti sul ruolo del genotipo nel metabolismo del DCA sono stati ottenuti da studi sull’espressione e sull’attività di GSTZ1 con il DCA nel citosol e nei mitocondri del fegato umano.

Ontogenesi dell’attività
Studi condotti con citosol di fegato umano preparato da un gruppo di 230 campioni di fegato di donatori che coprono un intervallo di età compreso tra il 42° giorno di gestazione e gli 84 anni hanno mostrato un’espressione e un’attività di GSTZ1 molto basse o non rilevabili nel periodo prenatale e nelle prime 2 settimane di vita: in seguito, l’attività e l’espressione aumentano gradualmente [56]. L’espressione e l’attività raggiungono i livelli dell’adulto all’età di 7 anni, ma è stata riscontrata una notevole variabilità interindividuale. La misurazione dell’attività con DCA e dell’espressione della proteina GSTZ1 in questi campioni ha rivelato che i campioni di individui con la variante GSTZ1A su un allele avevano un rapporto attività/espressione più alto rispetto a tutti gli altri (Figura 4). Ciò concorda con i risultati ottenuti con la GSTZ1A-1A umana ricombinante espressa, che ha mostrato un’attività più elevata con il DCA per questa variante [54], e con gli studi di farmacocinetica condotti su volontari, in cui gli individui con un gene GSTZ1A avevano una rapida eliminazione iniziale del DCA [55]. Sebbene lo studio sullo sviluppo abbia mostrato che l’attività nei bambini di età inferiore ai 7 anni era inferiore a quella degli adulti, considerando le maggiori dimensioni del fegato dei bambini rispetto alla massa corporea, l’attività con il DCA per chilogrammo di peso corporeo è simile negli adulti e nei bambini di età compresa tra 2 mesi e 7 anni [56].

Figura 4.frazioni di citosol di fegato umano provenienti da individui omozigoti o eterozigoti per GSTZ1A (triangoli rossi) hanno mostrato un’attività più elevata con il dicloroacetato rispetto al livello di espressione della proteina dell’enzima rispetto a tutti gli altri genotipi (triangoli verdi e cerchi neri) [56].

Effetto del cloruro sull’inattivazione di GSTZ1 da parte del DCA
In apparente contrasto con l’osservazione che la proteina KRT è associata a un più rapido metabolismo del DCA in vitro [56] e a una più rapida eliminazione di una singola dose di DCA [55], è la scoperta che i soggetti con la variante GSTZ1A su un allele hanno mostrato una maggiore riduzione della clearance dopo dosi ripetute di DCA rispetto agli omozigoti per GSTZ1C. Le recenti scoperte sull’effetto del cloruro sull’inattivazione di GSTZ1-1 potrebbero spiegare queste discrepanze. È stato riscontrato che il cloruro protegge la GSTZ1-1 dall’inattivazione da parte del DCA a concentrazioni fisiologicamente rilevanti nel fegato [62,63], tuttavia la GSTZ1-1 nel citosol epatico dei soggetti eterozigoti per la GSTZ1A era meno protetta dall’inattivazione da parte del cloruro fisiologico (38 mM) rispetto ai soggetti con altre varianti alleliche della GSTZ1 (Tabella 4). L’effetto del cloruro è stato tale che gli enzimi GSTZ1-1 nei fegati di individui con la variante GSTZ1A su un allele sono stati inattivati due volte più rapidamente di quelli con altri aplotipi. Il meccanismo esatto dell’effetto del cloruro non è ancora stato determinato, ma questo fenomeno è una spiegazione della maggiore perdita di clearance del DCA in seguito a somministrazione cronica nelle persone con una o più copie della variante GSTZ1A. Come già detto, la minore espressione dell’enzima negli individui caucasici con la lisina (K) in posizione 32 della proteina contribuisce probabilmente alla bassissima clearance.

.

AplotipoEC50 mMEmivita di inattivazione, h senza Cl-Emivita di inattivazione, h con 38 mM Cl-
EGT/EGT15 ± 3.1 (3)0.53, 0.495.73, 5.02
KRT/EGT36 ± 2.2 (3)0.38, 0.382.66, 2.37
EGM/EGM16.95.55
Tabella 4.influenza dell’aplotipo sull’effetto del cloruro nel proteggere GSTZ1-1 dall’inattivazione del dicloroacetato.

L’EC50 è la concentrazione di cloruro che ha protetto metà della GSTZ1 citosolica dall’inattivazione dopo l’incubazione per 2 ore con Na DCA, 0,5 mM.

Conclusione

Grazie alla sua capacità di inibire la PDH chinasi, il DCA trova applicazione nel trattamento del cancro e delle malattie metaboliche. In seguito alla somministrazione cronica di DCA alle persone, il suo metabolismo e la sua eliminazione si riducono. La ragione di questa riduzione della clearance dopo dosi multiple di DCA è che l’unico enzima noto per metabolizzare il DCA, il GSTZ1-1, viene inattivato durante il metabolismo del DCA. L’inibizione del GSTZ1-1 da parte del DCA, basata su questo meccanismo, determina un rallentamento della clearance non solo del DCA, ma anche dei substrati endogeni MAA e MA; resta da chiarire se l’accumulo di DCA e/o di cataboliti reattivi della tirosina sia alla base della neuropatia periferica reversibile che si verifica in alcuni pazienti. Un’altra possibile causa irrisolta della neuropatia è il modesto aumento di ∂-ALA che segue il trattamento cronico con DCA. Pertinente per la comprensione della farmacocinetica del DCA è il fatto che il gene GSTZ1 presenta varianti polimorfiche in tutte le popolazioni umane finora studiate. Le proprietà delle proteine enzimatiche delle varianti GSTZ1-1 differiscono per quanto riguarda la capacità di metabolizzare il DCA e i substrati endogeni MAA e MA, soprattutto in caso di somministrazione cronica. Mentre tutte le varianti GSTZ1-1 sono inattivate dal DCA, una variante, che ha la lisina al posto dell’acido glutammico in posizione 32 e l’arginina al posto della glicina in posizione 42 della proteina, viene inattivata più rapidamente delle altre varianti in presenza di concentrazioni fisiologiche di cloruro. Nei caucasici, ma non nelle persone di etnia africana, le varianti di GSTZ1 che hanno la lisina in posizione 32 sono legate a un SNP della regione promotrice del gene GSTZ1 che determina una ridotta espressione della proteina GSTZ1-1; questo può anche presentarsi come fenotipo di metabolizzatore lento. La comprensione dei fattori che influenzano la farmacocinetica del DCA in caso di somministrazione cronica è necessaria per selezionare la giusta dose e il giusto intervallo di dosaggio per somministrare questo farmaco ai pazienti in modo sicuro ed efficace.

Prospettive future

Dagli studi condotti finora è chiaro che l’aplotipo GSTZ1 è un fattore importante che determina la clearance del DCA. Una maggiore comprensione della regolazione dell’enzima in condizioni fisiologiche e in presenza di DCA porterà in futuro a un uso più sicuro ed efficace del farmaco. Restano da esplorare diverse questioni. Negli eterozigoti, una variante della proteina è espressa in modo preferenziale? Gli studi sull’attività che mostrano una maggiore attività con il DCA per le frazioni di citosol epatico di individui eterozigoti per GSTZ1A/GSTZ1C suggeriscono che la variante 1A (KRT) della proteina enzimatica sia preferenzialmente espressa negli eterozigoti, ma ciò non è stato dimostrato. Questa domanda ha implicazioni pratiche, poiché la variante 1A viene inattivata più rapidamente della variante 1C. È opportuno somministrare una dose inferiore di DCA ai soggetti che probabilmente elimineranno il DCA più lentamente della media in caso di somministrazione cronica? Se sì, dovrebbero essere tutti coloro che non sono omozigoti o eterozigoti per GSTZ1C? Ai caucasici con almeno una variante contenente K (KRT, KGT, KGM) dovrebbero essere somministrate dosi inferiori di DCA rispetto a quelli di etnia africana, perché esprimono meno GSTZ1-1? Qual è l’evidenza della bassa espressione delle varianti contenenti K in altre popolazioni? Esistono differenze di popolazione nei modelli di distribuzione degli aplotipi principali? Gli effetti delle differenze farmacogenetiche sono gli stessi nei bambini e negli adulti? I bambini che assumono DCA in genere eliminano il farmaco più rapidamente degli adulti, ma i possibili effetti farmacogenetici non sono stati studiati a fondo. Sono necessarie ulteriori ricerche per rispondere a queste domande, in modo da garantire un dosaggio sicuro ed efficace del DCA.

Divulgazione di interessi finanziari e concorrenti

Il lavoro degli autori discusso in questo manoscritto è stato finanziato in parte dal Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti 1RO1 GM 099871, in parte dalla Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders dell’Università del Maryland, Baltimora e Università di Miami (NO1 HD90011) e in parte dal premio NIH/NCATS Clinical and Translational Science dell’Università della Florida UL1 TR000064. Gli autori non hanno altre affiliazioni o coinvolgimenti finanziari rilevanti con organizzazioni o enti che abbiano interessi o conflitti finanziari con l’argomento o i materiali discussi nel manoscritto, a parte quelli resi noti.
Per la stesura di questo manoscritto non è stata utilizzata alcuna assistenza alla scrittura.

Riassunto

  • La selezione di una dose efficace ma non tossica di dicloroacetato (DCA) è importante per l’uso clinico a lungo termine del DCA nel trattamento del cancro e di altre malattie metaboliche.
  • Il gene per il singolo enzima che metabolizza questo farmaco, GSTZ1-1, presenta polimorfismi che determinano fenotipi di metabolizzatori lenti e rapidi dopo un trattamento a lungo termine con DCA.
  • Gli SNP della regione codificante del gene GSTZ1 danno origine a cinque aplotipi comuni, con frequenze variabili nelle popolazioni. Gli individui omozigoti per il più comune, GSTZ1C, sono metabolizzatori rapidi. Vi sono indicazioni che gli aplotipi che codificano per le proteine GSTZ1-1 con K in posizione 32 siano metabolizzatori lenti, ma altri fattori che contribuiscono al metabolismo lento in seguito a dosi multiple di DCA non sono del tutto noti.
  • Un SNP della regione promotrice in persone di etnia caucasica ma non africana è legato a un SNP della regione codificante che determina la sostituzione della lisina con l’acido glutammico in posizione 32 della proteina GSTZ1 ed è associato a una ridotta espressione della proteina dell’enzima nel fegato.
  • In presenza di DCA, la stabilità dell’enzima GSTZ1-1 varia con la concentrazione di cloruro. La variante dell’enzima GSTZ1A (KRT) viene inattivata più rapidamente della variante comune GSTZ1C (EGT) in presenza di concentrazioni fisiologiche di cloruro nel fegato.

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