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Zheng Yang1, Kin Y. Tam1

1 Faculté des sciences de la santé, Université de Macao, Taipa, Macao, Chine.

Correspondance : Kin Y. Tam
Faculté des sciences de la santé, Université de Macao, Taipa, Macao, Chine
Tél : +853-88224988
Fax : +853-88222314.
Courriel : [email protected]

Reçu : 15 avril 2016
Révisé : 27 juillet 2016
Accepté : 2 août 2016

Résumé

La glycolyse a été observée comme un processus prédominant pour la plupart des cellules cancéreuses pour utiliser le glucose, ce qui a été appelé « effet Warburg ». Le ciblage d’enzymes critiques, telles que la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK) qui régule de manière inverse le processus de glycolyse, pourrait être une approche prometteuse à travailler seul ou en combinaison avec d’autres traitements pour la thérapie du cancer. Les inhibiteurs de l’EGFR pour le traitement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) sont appliqués depuis des décennies dans les pratiques cliniques avec un grand succès, mais leurs avantages cliniques ont également été quelque peu entravés par la résistance acquise croissante. La thérapie par association de médicaments est une stratégie efficace pour faire face à ce défi. Dans cette étude, nous avons utilisé le dichloroacétate (DCA), un inhibiteur de la PDK largement considéré, en association avec l’erlotinib et le géfitinib, deux inhibiteurs de l’EGFR bien connus, et nous avons démontré que l’application du DCA en association avec l’erlotinib ou le géfitinib atténuait significativement la viabilité des cellules NSCLC mutantes de l’EGFR (NCI-H1975 et NCI-H1650) de manière synergique. Ce résultat synergique semble être un effet combiné dans la promotion de l’apoptose, plutôt qu’une co-suppression des voies de signalisation EGFR ou PDK. De plus, nous avons montré que le traitement combiné ne présentait pas d’effet synergique dans d’autres lignées cellulaires NSCLC sans mutations de l’EGFR (A549 ou NCI-H460). L’ensemble de ces observations suggère que le ciblage combiné de l’EGFR et de la PDK dans les cellules de NSCLC exerce des effets synergiques en fonction de la mutation de l’EGFR.


Mots clés : Pyruvate Déshydrogénase Kinase ; Dichloroacétate ; Récepteur du facteur de croissance épidermique ; Erlotinib ; Gefitinib ; Combinaison de médicaments

Copyright © 2016 Elsevier B.V. Tous droits réservés.


INTRODUCTION

Le cancer du poumon s’est classé au premier rang chez les hommes et au cinquième rang chez les femmes des cas de cancer nouvellement diagnostiqués et des décès liés au cancer dans le monde selon les dernières statistiques (Jemal et al., 2011), plus de 80 % des patients entrant dans la catégorie du cancer du poumon non à petites cellules, ou NSCLC (Ke et al., 2015). Les stratégies traditionnelles de traitement du NSCLC ont souvent eu recours à des chimiothérapies avec une mono-application ou une administration combinée de produits chimiques à base de platine ou d’autres produits cytotoxiques. Cependant, les taux de réponse objective de ces stratégies étaient généralement insatisfaisants, la survie globale médiane étant généralement inférieure à un an (Schiller et al., 2002, Pao et Chmielecki, 2010).

Une mutation de l’EGFR a été détectée chez environ 30 % des patients atteints de CBNPC, qui ont souvent bien répondu à la thérapie ciblée (Pao et Chmielecki, 2010). Cela a permis une large application des petits inhibiteurs moléculaires de la tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR-TKis), qui ont connu un succès considérable au cours des dernières décennies (Hanahan et Weinberg, 2011), comme l’illustrent l’Erlotinib et le Gefitinib (Duttaet Maity, 2007). Cependant, une résistance acquise est généralement apparue lorsque les patients ont été traités par des inhibiteurs de l’EGFR, avec plusieurs mécanismes identifiés tels que la mutation originelle ou induite du point chaud T790M, l’activation de la signalisation secondaire comme l’amplification de MET ou la mutation de PI3K, ou la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) (Maione et al., 2015). Il est décevant de constater que les applications combinées d’inhibiteurs du R-EGF et de chimiothérapies ont entraîné une augmentation des effets indésirables, plutôt que l’avantage escompté d’une prolongation de la survie globale des objets traités (Yan et al., 2015).

Le métabolisme des cellules cancéreuses est un domaine émergent basé sur la découverte et l’étude de plus d’un demi-siècle de l' »effet Warburg » (Ngo et al., 2015), selon lequel les cellules cancéreuses ont tendance à métaboliser le glucose par glycolyse, au lieu de la phosphorylation oxydative, pour générer de l’énergie (Lu et al., 2015). Ce phénomène a suscité de nombreuses études axées sur les enzymes clés du métabolisme du glucose, telles que les transporteurs de glucose (GLUT), l’hexokinase2 (HK2), la pyruvate kinase M2 (PKM2), la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK), la lactate déshydrogénase-A (LDHA) et la glutaminase, ce qui a conduit au développement de plusieurs inhibiteurs ciblant des enzymes spécifiques pour la thérapie anticancéreuse (Butler et al., 2013). En tant qu’inhibiteur de la PDK, le dichloroacétate (DCA) peut atténuer la progression du cancer dans de nombreux types de cancers différents en régulant à la baisse la phosphorylation de la pyruvate déshydrogénase (p-PDH) qui était contrôlée par la PDK (Kankotia et Stacpoole, 2014). Bien que plusieurs études de combinaison impliquant l’application du DCA pour le traitement du NSCLC aient été rapportées, la majorité d’entre elles se sont concentrées sur la chimiothérapie cytotoxique classique, à savoir l’utilisation combinée du DCA et d’un médicament à base de platine (Garon et al., 2014, Olszewski et al., 2010). On ignore encore si l’association du DCA et de l’EGFR-TKi dans les CBNPC mutés par l’EGFR peut exercer un effet synergique sur la thérapie anticancéreuse.

Dans cette étude, nous avons démontré que l’application combinée d’inhibiteurs de l’EGFR (soit Erlotinib ou Gefitinib) avec le DCA inhibait de manière synergique la croissance des cellules NCI-H1975 et NCI-H1650. De plus, nous avons exploré les mécanismes possibles des effets combinés des inhibiteurs de l’EGFR et de la PDK. Nous avons constaté que ces combinaisons ne peuvent montrer une synergie que dans les lignées cellulaires NCI-H1975 et NCI-H460, les lignées cellulaires NSCLC mutantes EGFR, mais pas dans A549 ou NCI-H460, les lignées cellulaires NSCLC de type sauvage EGFR.

Matériel et méthodes

Lignées cellulaires et réactifs
Les lignées cellulairesNSCLC, NCI-H1975, NCI-H1650 et A549, ont été achetées auprès de l’ATCC, tandis que NCI-H460 a été aimablement offerte par le professeur Thomas Y.C. Leung (Département de biologie appliquée et de technologie chimique, Faculté des sciences appliquées et des textiles, Université polytechnique de Hong Kong). Les cellules A549 ont été cultivées dans du F-12K/DMEM 1:1 (Gibco), tandis que les autres lignées cellulaires ont été maintenues dans du RPMI 1640 (Gibco), avec un supplément de 10 % de sérum bovin fœtal (Gibco), dans une atmosphère humidifiée avec 5 % deCO2 à 37 °C.

Le DCA a été acheté chez Sigma et dissous dans du DMSO à 1 % dans du PBS comme solution mère (1,6 M), qui a ensuite été diluée à diverses concentrations pour former les solutions de travail finales contenant 0,1 % de DMSO dans l’ensemble du milieu pour le traitement des cellules. L’Erlotinib et le Gefitinib, tous deux de SelleckChem, ont été initialement dissous dans du DMSO (Sigma) pour former la solution mère à la concentration de 160 mM, puis dilués à la concentration individuelle des milieux de travail comme celle du DCA. Les anticorps primaires comprenant la p-PDH et la PDH (Abcam) provenaient de Cell Signaling Technology. L’α-Tubuline a été obtenue auprès d’Invitrogen.

Test de viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire de chaque cellule individuelle traitée ou non traitée après le temps de traitement indiqué a été évaluée par le test MTT. En bref, les cellules individuelles de chaque lignée cellulaire ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits 24 heures avant le chargement des composés. Après la période indiquée (24 h, 48 h et 72 h, respectivement), les milieux de culture avec les composés ont été jetés et 100 μl de milieux entiers frais contenant 0,5 mg/ml de MTT (bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2-H-tétrazolium, Sigma) ont été ajoutés. Après 4 h d’incubation à 37 °C, le solvant a été retiré et 100 μl de DMSO ont été ajoutés dans chaque puits, à l’aide d’une légère agitation pour dissoudre les cristaux de formazan. La valeur de la D.O. de chaque puits a été mesurée à 570 nm par le lecteur de microplaques SpectraMax M5 (Molecular Devices).

Calcul de l’indice de combinaison (CI)
La valeur de l’IC a été inscrite pour l’évaluation synergique de la viabilité cellulaire entre la combinaison et chacun des groupes individuels, qui a été calculée en fonction de la fraction de cellules cancéreuses affectées (Fa) sur la base de l’équation Chou-Talalay (Chou et Talalay, 1984) : CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2, où (D)1 et (D)2 indiquent les doses appliquées pour obtenir une réponse nécessaire en association, et (Dx) désigne les doses de médicaments individuels nécessaires pour obtenir une réponse similaire. Les analyses des valeurs de l’IC ont été effectuées à l’aide du logiciel CalcuSyn (Biosoft), l’IC<1, l’IC=1 et l’IC>1 indiquant respectivement les effets synergiques, additifs et antagonistes.

Test de formation de colonies
Les quatre lignées cellulaires NSCLC ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, chaque puits contenant 200 à 800 cellules dans 2 ml de milieu. Le milieu contenant les composés individuels ou en combinaison a été ajouté 24 heures après l’inoculation des cellules pour un traitement continu de 3 jours, puis remplacé par un milieu sans médicament tous les 3 jours. 15 jours après l’ensemencement des cellules, les colonies cellulaires ont été fixées dans de l’éthanol à 95 % pendant 15 minutes, colorées par du Crystal Violet à 0,1 % (Sigma) et séchées. Les colonies comportant plus de 100 cellules ont été considérées comme positives.

Test Western blotting
Les cellules NCI-H1975 et A549 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et traitées avec des milieux contenant un composé unique ou une combinaison pendant des périodes définies. Les cellules traitées ont été incubées dans un tampon de lysat cellulaire (Cell Signaling Technology) en agitant doucement pendant 15 minutes, puis centrifugées à 12 000 tr/min à 4 °C pendant 15 minutes supplémentaires. La concentration en protéines de chaque échantillon dans le surnageant a été évaluée par le Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo) et équilibrée au même niveau, suivi d’une dénaturation des protéines de 8 min avec le tampon de chargement SDS à 100 °C. Les protéines de l’échantillon ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE, transférées sur une membrane filtrante en nitrocellulose (Whatman), bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 2 h, brumisées avec les anticorps primaires souhaités pendant la nuit, puis avec des IgG secondaires anti-lapin ou anti-souris liées à la HRP (Cell Signaling Technology) pendant 2 h. Les membranes ont finalement été scannées dans un système d’imagerie Chemidoc® MP (Bio-Rad) après 2 min d’incubation dans le substrat Clarity Western ECL (Bio-Rad).

Test de cytométrie en flux
Les cellulesNCI-H1975et A549 ont été ensemencées et traitées comme décrit dans la section précédente. Les cellules traitées ont été détachées du fond des plaques avec Trypsin-EDTA (Gibco) et lavées avec du PBS deux fois. Les détections apoptotiques ont été réalisées à l’aide du kit de détection apoptotique FITC Annexin-V (Biolegend). En bref, les échantillons cellulaires récoltés ont été suspendus dans 500 μl de tampon de liaison contenant 5 μl d’Annexin V-FITC et 10 μl d’iodure de propidium (PI) pendant 15 min avant l’analyse FACS sur un cytomètre de flux Accuri C6 (BD). Les échantillons cellulaires pour la mesure du potentiel de la membrane mitochondriale (MMP) ont été incubés dans 1 ml de milieu entier contenant 2 μM de JC-1 (5,5,6,6-tétrachloro-1,1,3,3-tétraéthylbenzimidazolycarcocyanine iodure, Sigma) pendant 15 min, suivis d’un lavage et d’une remise en suspension dans du PBS pour l’analyse FACS.

Analyse statistique
Toutes les données ont été présentées sous forme de moyenne±S.D. La CI50 des composés individuels au point de temps indiqué a été réalisée par GraphPad 5.1 (Prism). Les comparaisons statistiques entre les différents groupes d’échantillons ont été effectuées via Excel 2010 en utilisant le test t de Student. Une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

L’erlotinib, le géfitinib et le DCA ont atténué la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires NCI-H1975 et A549 NSCLC
Nous avons cherché à déterminer les effets anti-prolifération cellulaire in vitro des trois composés sélectionnés dans les lignées cellulaires NCI-H1975, NCI-H1650, A549 et NCI-H460 NSCLC. Les cellules ont été traitées avec une dilution en série diminuée de 2 fois de chaque composé pendant 24 h, 48 h ou 72 h, respectivement. La viabilité des cellules a été évaluée par le test MTT. Comme le montre la figure 1, l’Erlotinib, le Gefitinib ou le DCA ont entraîné une diminution significative de la viabilité cellulaire dans les quatre lignées cellulaires de manière dose et temps-dépendante. On peut constater que la variabilité des données de la CI50 semble être plus faible à 72 h pour la plupart des lignées cellulaires (voir tableau 1). À partir de là, nous avons donc choisi 72 h comme point final pour le traitement combiné.

Fig. 1. Les inhibiteurs de l’EGFR et le DCA ont diminué la viabilité cellulaire dans les NSCLC. Les cellules NCI-H1975, NCI-H1650, A549 et NCI-H460 ont été exposées soit à l’Erlotinib, au Gefitinib ou au DCA pendant 24 (-), 48 (■) et 72 (▲) h, respectivement, tandis que la viabilité cellulaire de chaque traitement a été déterminée par le test MTT.
NCI-H1975NCI-H1650A549NCI-H460
Erlotinib (μM)24 h27.33±15.0652.69±0.80N/AN/A
48 h9.45±1.4818.67±0.6659.66±3.0628.72±3.29
72 h5.04±0.0111.42±0.1013.14±3.7032.66±3.32
Géfitinib (μM)24 h16.22±8.3747.30±3.9841.96±3.3826.19±1.98
48 h9.09±1.9118.97±0.6220.66±2.957.74±0.37
72 h6.15±0.1815.61±1.156.97±0.2221.86±0.09
DCA (mM)24 h29.51±3.2531.09±4.1050.25±6.89N/A
48 h19.56±6.3116.84±4.5331.35±1.0037.26±0.47
72 h16.60±4.4615.81±0.2613.55±2.3238.47±0.35
Tableau 1. IC50 des inhibiteurs de l’EGFR et du DCA dans la diminution de la viabilité cellulaire dans les NSCLC. Les lignées cellulaires ont été exposées à l’Erlotinib, au Gefitinib ou au DCA pendant 24, 48 et 72 heures, respectivement, et la viabilité cellulaire de chaque traitement a été déterminée par le test MTT. La CI50 de chaque composé a été calculée par Prism GraphPad 5.1. Les moyennes±S.D. de deux puits répétés sont présentées. N/A fait référence à des données non disponibles, car même la concentration de charge la plus élevée des composés ne peut atteindre jusqu’à 50 % d’inhibition de la viabilité cellulaire.

Les stratégies combinées ont supprimé la viabilité cellulaire de manière synergique et ont inhibé la formation de colonies de manière significative dans les cellules NCI-H1975 et NCI-H1650, mais ne fonctionnent pas aussi bien dans les cellules A549 et NCI-H460
Pour déterminer la réponse synergique in vitro à l’association d’inhibiteurs de l’EGFR et de DCA, nous avons utilisé deux stratégies combinées, à savoir Erlotinib avec DCA et Gefitinib avec DCA, avec six points de concentration de traitement individuels pour chaque composé, qui ont conféré une viabilité cellulaire entre environ IC80 et IC20 dans un rapport fixe. Les effets de la combinaison ont été évalués à l’aide du test MTT. Comme le montre la figure 2, les deux combinaisons, Erlotinib et DCA et Gefitinib et DCA, ont clairement montré une synergie dans les lignées cellulaires NCI-H1975 et NCI-H1650, où les valeurs de CI dans tous les groupes combinés étaient inférieures à 1 (figures 2A et B). Pour les lignées cellulaires A549 et NCI-H460, bien que tous les groupes combinés dans deux stratégies aient montré une valeur Fa élevée par rapport à leurs applications uniques, les valeurs CI de certains groupes combinés étaient supérieures à 1 (Fig. 2C et D), ce qui suggère que les stratégies combinées dans les lignées A549 et NCI-H460 n’ont pas fonctionné aussi bien que dans les lignées NCI-H1975 et NCI-H1650.

Fig. 2. Le traitement combiné a atténué la viabilité cellulaire de manière synergique dans la lignée cellulaire NCI-H1975 et NCI-H1650. Des cellules de CPNPC ont été traitées par Erlotinib/Gefitinib ou DCA seul, ou en association dans un rapport de concentration fixe pendant 72 h dans les lignées cellulaires NCI-H1975(A), NCI-H1650(B), A549(C) et NCI-H460(D). Les moyennes±S.D. de quatre puits répétés dans deux études distinctes sont indiquées. Les valeurs de l’IC ont été calculées par CalcuSyn (Biosoft). Les valeurs de CI inférieures à 1 ont été considérées comme une synergie.

Fig. 2 (C & D)

Afin de déterminer si l’association peut atténuer la formation de colonies de cellules cancéreuses, nous avons ensemencé ces quatre lignées cellulaires dans des plaques à 6 puits et les avons traitées avec de l’Erlotinib, du Gefitinib ou du DCA à des concentrations permettant d’obtenir une inhibition des colonies d’environ 40 % pendant 3 jours, ou avec leurs associations. 15 jours après l’ensemencement des cellules, les colonies comptant plus de 100 cellules ont été comptées, et les données sont illustrées à la figure 3. Le traitement combiné d’Erlotinib et de DCA a réprimer de manière significative la formation de colonies dans les cellules NCI-H1975 et NCI-H1650, mais pas dans les cellules A549 et NCI-H460, ce qui indique que la stratégie de combinaison peut fonctionner uniquement dans les cellules NCI-H1975 et NCI-H1650, les cellules NSCLC mutantes de l’EGFR.

Fig. 3. L’association Erlotinib/Gefitinib et DCA a diminué la formation de colonies dans les cellules NCI-H1975 et NCI-H1650 de manière synergique. Des cellules NCI-H1975, NCI-H1650, A549 et NCI-H460 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, et des mono- ou combo-médicaments à leurs concentrations individuelles (Erlotinib à 10, 40, 20, 30 μM, respectivement dans quatre lignées cellulaires ; Gefitinib à 20 μM dans toutes les lignées cellulaires ; DCA à 20, 10, 40, 35 μM, respectivement dans quatre lignées cellulaires) ont été appliqués 24 heures après l’ensemencement des cellules pendant 3 jours continus. Les colonies ont été observées 15 jours après le placage(A) et plus de 100 cellules de colonies ont été calculées comme statistiques de données(B). Les moyennes±S.D. de six puits répétés sont présentées. ** L’astérisque indique une signification statistique de P<0,05, tandis que n.s. indique P>0,05 sans signification.

L’erlotinib/le géfitinib et le DCA ont agi indépendamment dans leurs voies de signalisation ciblées dans la lignée cellulaire NCI-H1975
Pour étudier l’effet possible de l’association dans les voies de signalisation, nous avons réalisé une analyse par western blotting pour étudier les événements de phosphorylation pertinents dans les cellules NCI-H1975 et A549 NSCLC à des points de temps définis pendant le traitement par l’association médicamenteuse. Comme le montre la figure 4, dans la lignée cellulaire NCI-H1975 mutante EGFR, l’Erlotinib ou le Gefitinib ont supprimé le niveau d’EGFR phosphorylé ainsi que d’AKT phosphorylé et d’ERK1/2 phosphorylé, deux protéines clés situées en aval de la signalisation de l’EGFR, mais n’ont pas diminué le niveau de PDH phosphorylé. Le DCA, quant à lui, a inhibé la phosphorylation de la PDH de manière significative, mais n’a pas réussi à diminuer le niveau de protéines clés phosphorylées dans la signalisation de l’EGFR dans le NCI-H1975 (Fig. 4A et B). Cependant, dans les cellules A549 EGFR de type sauvage NSCLC, l’Erlotinib et le Gefitinib n’ont pas affecté la signalisation en aval de l’EGFR, par exemple l’AKT phosphorylé et l’ERK phosphorylé, alors que le DCA a atténué de manière significative la PDH phosphorylée (Fig. 4C et D). Il est intéressant de noter que le DCA semble pouvoir activer l’AKT en élevant son niveau de phosphorylation au fil du temps dans les deux études indépendantes (fig. 4C et D). Ces données suggèrent que l’Erlotinib et le DCA agissent indépendamment sur leur voie de signalisation respective.

Fig. 4. Phosphorylation des protéines dans les voies de signalisation EGFR et PDK après traitement par l’Erlotinib, le Gefitinib ou le DCA dans des cellules NSCLC en culture. Les lignées cellulaires NCI-H1975(A et B) et A549(C et D) ont été traitées par l’Erlotinib, le Gefitinib ou le DCA, ou en association, pendant 4, 8 et 12 heures, respectivement. Les lysats cellulaires ont été soumis à un Western blotting pour la qualification des protéines clés dans la signalisation de l’EGFR et de la PDK.

L’association de l’Erlotinib et du DCA a considérablement augmenté l’apoptose cellulaire dans les cellules NCI-H1975, mais pas dans les cellules A549
Pour expliquer l’effet synergique de l’Erlotinib et du DCA sur la viabilité cellulaire, nous avons cherché à savoir s’ils favorisaient ensemble l’apoptose cellulaire. Comme le montre la figure 5, les résultats du western blotting ont démontré que l’association a entraîné une activation significative de la Caspase3 et de son substrat, la PARP clivée, après 8 heures de traitement dans les cellules NCI-H1975 (figure 5A), alors qu’aucune activation évidente de la Caspase3 ou de la PARP n’a été observée dans les cellules A549 (figure 5B). Une analyse FACS plus poussée a montré que l’association de l’erlotinib et du DCA a favorisé l’apoptose d’une proportion beaucoup plus grande de cellules NCI-H1975 que chaque composé seul après que les cellules ont été traitées pendant 12 heures (fig. 5C), tandis que l’association n’a pas réussi à provoquer l’apoptose des cellules A549, que ce soit en monothérapie ou en association (fig. 5D). Ces résultats indiquent que la combinaison de l’induction apoptotique cellulaire par l’érotinib et le DCA n’est viable que dans les cellules NCI-H1975, les cellules mutantes de l’EGFR, mais pas dans les cellules A549, les cellules NSCLC de type sauvage de l’EGFR.

Fig. 5. L’association d’Erlotinib et de DCA a renforcé l’induction de l’apoptose de manière synergique dans les cellules NCI-H1975 et non dans les cellules A549. Les lignées cellulaires NCI-H1975(A) et A549(B) ont été prétraitées avec de l’Erlotinib ou du DCA, ou en combinaison, pendant des périodes définies, puis les cellules ont été lysées et suivies d’un transfert de western comme décrit précédemment. Pour la détection de l’apoptose par FACS, les cellules NCI-H1975(C) et A549(D) traitées avec des composés individuels ou en association pendant une période donnée ont été récoltées et soumises à un FACS. Les moyennes±S.D. de trois échantillons provenant d’études séparées sont indiquées. * dénote une signification statistique de P<0,05 tandis que ** dénote P<0,01.

Diminution significative de la MMP dans la stratégie combinée par rapport à la monothérapie dans le NCI-H1975
Pour confirmer davantage l’effet significatif du traitement combiné sur l’apoptose cellulaire, nous avons utilisé le test JC-1 pour déterminer si le traitement peut entraîner une diminution de la MMP, l’une des caractéristiques de l’apoptose cellulaire. Comme le montre la figure 6, les données FACS étaient cohérentes avec les résultats de l’apoptose cellulaire décrits dans la section 3.4. On constate que l’association a entraîné une diminution significative de la MMP après 8 et 12 heures de traitement par rapport à l’application unique d’Erlotinib ou de DCA dans les cellules NCI-H1975 (voir figure 6A). Pour les cellules A549, la diminution de la MMP n’a été détectée qu’après l’application du DCA (voir figure 6B).

Fig. 6. L’association d’Erlotinib et de DCA a entraîné une diminution synergique de la MMP dans la lignée cellulaire NCI-H1975 plutôt que dans la lignée cellulaire A549. Les lignées cellulaires NCI-H1975(A) et A549(B) ont été exposées à l’Erlotinib ou au DCA, ou à leur combinaison, pendant des périodes définies, respectivement. Les cellules ont été récoltées, colorées avec JC-1 et analysées par FACS. Les moyennes±S.D. de trois échantillons provenant d’études séparées sont indiquées. * dénote une signification statistique de P<0,05 tandis que ** dénote P<0,01.

Discussion

Pour vérifier notre hypothèse selon laquelle la combinaison d’inhibiteurs de l’EGFR avec l’inhibiteur de la PDK, le DCA, pourrait exercer un effet anticancéreux synergique sur les cellules de NSCLC, nous avons appliqué le test MTT pour évaluer la viabilité cellulaire. Les résultats obtenus dans cette étude étaient en bon accord avec l’hypothèse. Plus précisément, nous avons montré que les inhibiteurs de l’EGFR (Erlotinib ou Gefitinib) associés au DCA ont atténué de manière synergique la viabilité des cellules NCI-H1975 et NCI-H1650, avec des valeurs d’IC <1 à différents niveaux de dose des combinaisons de composés, et ont réduit de manière significative la formation de colonies de cellules cancéreuses (Fig. 2, Fig. 3). Ces effets synergiques n’ont pas été observés dans les lignées cellulaires A549 ou NCI-H460 (lignées cellulaires de CBNPC de type sauvage EGFR), ce qui indique que la stratégie de combinaison ne supprime probablement la progression cellulaire de manière synergique que dans les CBNPC porteurs d’une mutation EGFR.

Velpula et al. (2013) ont signalé que l’administration d’Erlotinib ou de Gefitinib atténuait le niveau d’expression de p-EGFR et de PDK1 dans les cellules U251 et 5310, tandis que l’application de DCA dans ces deux cellules diminuait également l’expression de p-EGFR et de PDK1. Il est plausible que l’effet combiné des inhibiteurs d’EGFR et de PDK puisse être attribué à la co-suppression de la signalisation d’EGFR ou de PDK. En gardant cette idée à l’esprit, nous avons effectué une analyse par western blotting pour évaluer les altérations du niveau de protéines dans ces deux voies de signalisation. Il a été démontré que l’Erlotinib et le Gefitinib inhibaient tous deux la phosphorylation de l’EGFR ainsi que la phosphorylation de deux de ses protéines de signalisation en aval classiques, à savoir AKT et ERK. Parallèlement, bien que l’inhibiteur PDK DCA ait légèrement atténué l’expression de PDK1, la phosphorylation de PDH, une enzyme clé responsable de la conversion du pyruvate en acétyl-CoA pour le cycle de l’acide citrique au lieu de lancer la glycolyse (Kankotia et Stacpoole, 2014), a été significativement supprimée lors de l’application de DCA (Fig. 4). Apparemment, l’Erlotinib/Gefitinib et le DCA n’ont pas eu d’effet de diaphonie ni d’effet inhibiteur additif sur la signalisation de l’autre dans les cellules NCI-H1975. Nos données suggèrent que l’effet anticancéreux synergique de l’association médicamenteuse sur les cellules NCI-H1975 ne dépend pas uniquement des voies de signalisation EGFR ou PDK.

Pour trouver d’autres mécanismes possibles de l’effet combiné, nous avons porté notre attention sur l’induction de l’apoptose. Il a été signalé que l’erlotinib est capable d’induire l’apoptose des cellules NCI-H1975 (Nie et al., 2015), et le DCA a également conféré l’apoptose cellulaire dans plusieurs cellules cancéreuses différentes (Madhok et al., 2010, Wong et al., 2008). Étant donné que le clivage de la Caspase3 et de son substrat de clivage cible, la PARP, sont deux éléments impliqués dans l’apoptose cellulaire (Zhang et al., 2015), nous avons d’abord examiné le niveau d’activation de la Caspase3 et de la PARP dans les cellules NCI-H1975 lorsqu’elles ont été traitées avec de l’Erlotinib ou du DCA seul ainsi qu’avec la combinaison. Nos résultats suggèrent que la PARP clivée de 89 kDa augmente de manière dépendante du temps lorsque l’Erlotinib ou le DCA sont traités seuls. Il est important de noter que le traitement combiné a montré une activité significativement plus élevée de la PARP par rapport aux composés appliqués seuls. L’expression de la Caspase3 clivée à 17 kDa, qui a atteint son maximum à 8 heures, a présenté une forte augmentation lorsque les cellules NCI-H1975 ont été traitées par l’association d’Erlotinib et de DCA (Fig. 5A). Ces résultats indiquent que l’effet de la combinaison est probablement dû à l’effet additif dans la promotion de l’apoptose cellulaire. Cela a été confirmé par l’analyse par cytométrie en flux des cellules doublement colorées par l’Annexin-V et le PI. Ces observations étaient cohérentes avec l’analyse de l’activation de la Caspase3 et de la PARP, dans laquelle le traitement combiné a entraîné une induction modérée mais distincte de l’apoptose cellulaire lorsque les cellules NCI-H1975 ont été traitées pendant 12 heures, comparativement à l’application d’Erlotinib ou de DCA seuls (figure 5B). Toutefois, ni l’activation de la Caspase3/PARP ni l’induction synergique de l’apoptose cellulaire n’ont été observées dans la lignée cellulaire A549 (fig. 5A et B), ce qui donne à penser que la promotion de l’apoptose pourrait être le mécanisme possible de l’effet combiné de l’erlotinib et du DCA sur les cellules de CPNPC mutantes du R-EGF.

Le processus d’apoptose cellulaire peut être divisé en une série d’étapes, telles que le changement de la morphologie cellulaire, la perte du potentiel de la membrane mitochondriale, l’altération de la perméabilité, la fragmentation de l’ADN et ainsi de suite (Fiandalo et Kyprianou, 2012). La diminution de la MMP a été rapportée par plusieurs études comme la conséquence du traitement DCA dans les cellules cancéreuses (Emadi et al, 2015). Des études antérieures ont démontré que l’Erlotinib entraînait la perte de MMP dans les NSCLC (Qian et al., 2009). Afin d’étudier si la combinaison peut affecter de manière significative la MMP dans les NCI-H1975, nous avons exploité le test mitoprobe JC-1 pour évaluer le niveau de MMP après le traitement par Erlotinib, DCA ou la combinaison. Comme le montre la figure 6, l’association a entraîné une diminution significative de la MMP après 8 et 12 heures de traitement des cellules NCI-H1975 (mais pas des cellules A549), ce qui suggère que l’effet combiné de l’apoptose cellulaire induite est associé à la dépolarisation du potentiel de la membrane mitochondriale.

En résumé, nous avons démontré que l’utilisation combinée d’un inhibiteur de l’EGFR, à savoir l’Erlotinib ou le Gefitinib, et d’un inhibiteur de la PDK, le DCA, présentait un effet anticancéreux synergique dans les cellules NCI-H1975 et NCI-H1650. La promotion collaborative de l’apoptose cellulaire a été identifiée comme l’un des mécanismes probables de l’effet combiné. En particulier, l’application combinée d’Erlotinib et de DCA a non seulement activé Caspase3 et PARP mais a également diminué MMP de manière significative. En outre, nos résultats indiquent que l’effet combiné pourrait n’être apparent que dans les cellules de NSCLC présentant des mutations de l’EGFR sur la base de nos résultats actuels. D’autres évaluations sont en cours dans notre laboratoire pour confirmer cette observation dans un plus grand nombre de lignées cellulaires de NSCLC.

Conflit d’intérêt

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt pour cet article.

Rôle de la source de financement

Ce travail a été soutenu par le Fonds de développement des sciences et des technologies, Macao S.A.R (FDCT) (référence du projet n° 086/2014/A2) et l’Université de Macao (subvention n° MRG021-TKY-2015-FHS).

Remerciements

Nous remercions le soutien financier du Fonds de développement de la science et de la technologie, Macao S.A.R (FDCT) (référence du projet n° 086/2014/A2) et de l’Université de Macao (subvention n° MRG021-TKY-2015-FHS). Nous remercions le professeur Thomas Y.C. Leung (PolyU, HK) pour les échantillons de cellules NCI-H460. Nous remercions le Dr Xiaohui Hu pour les discussions utiles et la relecture du manuscrit.

RÉFÉRENCES

1 Butler et al., 2013 E.B. Butler, Y. Zhao, C. Muñoz-Pinedo, J. Lu, M. Tan Staller le moteur de la résistance : cibler le métabolisme du cancer pour surmonter la résistance thérapeutique Cancer Res., 73 (2013), p. 2709-2717
2 Chou et Talalay, 1984 T.C. Chou, P. Talalay Analyse quantitative des relations dose-effet : les effets combinés de plusieurs médicaments ou inhibiteurs d’enzymes Adv. Enzym. Regul., 22 (1984), pp. 27-55
3 Dutta et Maity, 2007 P.R. Dutta, A. Maity Réponses cellulaires aux inhibiteurs de l’EGFR et leur pertinence pour la thérapie du cancer Cancer Lett., 254 (2007), pp. 165-177
4 Emadi et al. 2015 A. Emadi, M. Sadowska, B. Carter-Cooper, V. Bhatnagar, I. van der Merwe, M.J. Levis, E.A. Sausville, R.G. Lapidus Perturbation de l’état oxydatif cellulaire induit par le dichloroacétate et le trioxyde d’arsenic pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë Leuk. Res., 39 (2015), p. 719-729
5 Fiandalo et Kyprianou, 2012 M.V. Fiandalo, N. Kyprianou Contrôle des caspases : protagonistes de l’apoptose des cellules cancéreuses Exp. Oncol, 34 (2012), p. 165-175
6 Garon et al. 2014 E.B. Garon, H.R. Christofk, W. Hosmer, C.D. Britten, A. Bahng, M.J. Crabtree, C.S. Hong, N. Kamranpour, S. Pitts, F. Kabbinavar, C. Patel, E. von Euw, A. Black, E.D. Michelakis, S.M. Dubinett, D.J. Slamon Le dichloroacétate doit être envisagé avec une chimiothérapie à base de platine dans les tumeurs hypoxiques plutôt qu’en monothérapie dans le cancer du poumon non à petites cellules avancé J. Cancer Res. Clin. Oncol, 140 (2014), p. 443-452
7 Hanahan et Weinberg, 2011 D. Hanahan, R.A. Weinberg Signes distinctifs du cancer : la prochaine génération Cell, 144 (2011), pp. 646-674
8 Jemal et al. 2011 A. Jemal, F. Bray, M.M. Center, J. Ferlay, E. Ward, D. Forman Statistiques mondiales sur le cancer CA : Cancer J. Clin., 61 (2011), pp. 69-90
9 Kankotia et Stacpoole, 2014 S. Kankotia, P.W. Stacpoole Dichloroacétate et cancer : nouvelle maison pour un médicament orphelin ? Biochim. Biophys. Acta, 1846 (2014), p. 617-629
10 Ke et al. 2015 E.E. Ke, Q. Zhou, Y.L. Wu Paradigmes émergents dans les traitements ciblés pour les patients asiatiques atteints de NSCLC Expert Opin. Pharmacother, 16 (2015), p. 1167-1176
11 Lu et al., 2015 J. Lu, M. Tan, Q. Cai L’effet Warburg dans la progression tumorale : le métabolisme oxydatif mitochondrial comme mécanisme anti-métastase Cancer Lett. 356 (2015), p. 156-164
12 Madhok et al., 2010 B.M. Madhok, S. Yeluri, S.L. Perry, T.A. Hughes, D.G. Jayne Le dichloroacétate induit l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses colorectales Br. J. Cancer, 102 (2010), pp. 1746-1752
13 Maione et al., 2015 P. Maione, P.C. Sacco, A. Sgambato, F. Casaluce, A. Rossi, C. Gridelli Surmonter la résistance aux thérapies ciblées dans le NSCLC : approches actuelles et application clinique Ther. Adv. Med. Oncol, 7 (2015), p. 263-273
14 Ngo et al., 2015 H. Ngo, S.M. Tortorella, K. Ververis, T.C. Karagiannis L’effet Warburg : aspects moléculaires et possibilités thérapeutiques Mol. Biol. Rep. 42 (2015), p. 825-834
15 Nie et al., 2015 P. Nie, W. Hu, T. Zhang, Y. Yang, B. Hou, Z. Zou Induction synergique de l’apoptose médiée par l’erlotinib par le resvératrol dans les cellules cancéreuses pulmonaires non à petites cellules humaines par la régulation négative de la survivine et la régulation positive de PUMA Physiologie cellulaire, biochimie, 35 (2015), p. 2255-2271
16 Olszewski et al., 2010 U. Olszewski, T.T. Poulsen, E. Ulsperger, H.S. Poulsen, K. Geissler, G. Hamilton Cytotoxicité in vitro des combinaisons de dichloroacétate avec des composés de platine anticancéreux Clin. Pharmacol. 2 (2010), pp. 177-183
17 Pao et Chmielecki, 2010 W. Pao, J. Chmielecki Traitement rationnel et biologiquement fondé du cancer du poumon non à petites cellules mutant EGFR Nat. Rev. Cancer, 10 (2010), pp. 760-774
18 Qian et al. 2009 X. Qian, J. Li, J. Ding, Z. Wang, W. Zhang, G. Hu L’erlotinib active les voies de mort mitochondriale liées à la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la lignée cellulaire A549 de cancer du poumon humain non à petites cellules Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, 36 (2009), p. 487-494
19 Schiller et al., 2002 J.H. Schiller, D. Harrington, C.P. Belani, C. Langer, A. Sandler, J. Krook, J. Zhu, D.H. Johnson Comparaison de quatre régimes de chimiothérapie pour le cancer du poumon non à petites cellules avancé N. Engl. J. Med., 346 (2002), pp. 92-98
20 Velpula et al., 2013 K.K. Velpula, A. Bhasin, S. Asuthkar, A.J. Tsung Le ciblage combiné de PDK1 et EGFR déclenche la régression du glioblastome en inversant l’effet Warburg Cancer Res., 73 (2013), p. 7277-7289
21 Wong et al., 2008 J.Y. Wong, G.S. Huggins, M. Debidda, N.C. Munshi, I. De Vivo Le dichloroacétate induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses de l’endomètre Gynecol. Oncol, 109 (2008), p. 394-402
22 Yan et al., 2015 H. Yan, H. Li, Q. Li, P. Zhao, W. Wang, B. Cao L’efficacité de l’association synchrone de la chimiothérapie et des EGFR TKIs pour le traitement de première ligne du NSCLC : une analyse systématique PLoS One, 10 (2015), p. e0135829
23 Zhang et al., 2015 L. Zhang, F. Dai, P.L. Sheng, Z.Q. Chen, Q.P. Xu, Y.Q. Guo.. Le 3,4,4′-trihydroxy-trans-stilbène, analogue du resvératrol, induit l’apoptose et l’autophagie dans les cellules cancéreuses pulmonaires non à petites cellules humaines in vitro Acta Pharmacol. Sin. 36 (2015), p. 1256-1265

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