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Yong Won Choi1, In Kyoung Lim*

1 Département de biochimie et de biologie moléculaire, Projet de transformation et de restauration cellulaire BK21, École de médecine de l’Université d’Ajou, Suwon 443-721, République de Corée
* Département de biochimie et de biologie moléculaire, École de médecine de l’Université d’Ajou, San 5 Woncheon-dong, Yeongtonggu, Suwon 443-721, République de Corée ; tél : +82 31 219 5051 ; fax : +82 31 219 5059. Adresse électronique : [email protected] (I.K. Lim).


Reçu : 29 octobre 2013
Accepté : 20 janvier 2014
Révisé : sous forme révisée le 8 janvier 2014
Publié/disponible en ligne : 27 janvier 2014

Résumé

Pour étudier la sensibilisation à la cytotoxicité de la metformine, des cellules cancéreuses ont été traitées avec du dichloroacétate (DCA), un inhibiteur de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK). La cytotoxicité de la metformine dépendait principalement de la disponibilité du glucose et du pouvoir réducteur généré par la voie du pentose phosphate, tandis que le cotretraitement au DCA renforçait la cytotoxicité de la metformine en reprogrammant le métabolisme du glucose par l’inhibition de la PDK et l’augmentation de la respiration mitochondriale . Le cotre traitement au DCA a provoqué la mort des cellules plutôt que leur survie, malgré des conditions de glucose et de GSH élevés. En conclusion, le DCA a sensibilisé la cytotoxicité de la metformine en reprogrammant le métabolisme du glucose en partie de la glycolyse aérobie à l’oxydation mitochondriale, comme le montrent les mesures de la consommation de glucose, de la libération de lactate et du rapport entre le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire.


Mots clés : Dichloroacétate de metformine (DCA), stress oxydatif, privation de glucose, teneur en glutathion

© 2014 Publié par Elsevier Ireland Ltd.


INTRODUCTION

De plus en plus de preuves indiquent que les perturbations métaboliques des cellules cancéreuses, telles que la glycolyse aérobie ou l’addiction à la glutamine, sont inévitables pour la carcinogenèse au-delà de l’épiphénomène [13], [31], et d’énormes efforts ont été déployés pour trouver des cibles médicamenteuses et des produits chimiques candidats sur le métabolisme du cancer [5], [30]. Sur la base des données épidémiologiques, précliniques et cliniques, la metformine, un biguanide utilisé pour le traitement du diabète sucré, est devenue l’un des médicaments les plus attrayants et les plus prometteurs pour le métabolisme du cancer. Bien que le mécanisme de la metformine ne soit pas entièrement élucidé, la fonction intracellulaire de la metformine est connue pour inhiber le complexe I de la chaîne respiratoire [8], [21]. Actuellement, de nombreuses preuves indiquent que l’activation de l’AMPK est un nœud principal des effets antitumoraux de la metformine [3], [16],[23], par conséquent, les cellules cancéreuses LKB1-/- sont plus résistantes à la cytotoxicité induite par la metformine dans le système de culture in vitro [22], [34]. En revanche, il a été démontré que l’activation de l’AMPK protège les cellules cancéreuses du stress énergétique via la régulation de l’homéostasie du NADPH [12]. Par conséquent, les cellules cancéreuses LKB1-/- sont plus sensibles au stress métabolique induit par la phénformine dans le modèle de cancer du poumon chez la souris [24]. Dans le contexte de la confusion, il existe des rapports indiquant que les effets antitumoraux de la metformine dépendent de la concentration de glucose dans le milieu de culture [11], [17], [25]; la privation de glucose augmente considérablement la cytotoxicité de la metformine [17], tandis que l’activation de l’AMPK induite par la metformine est inefficace dans des conditions de glucose élevé (25 mM) [25]. Par conséquent, une compréhension approfondie du mécanisme biochimique de la cytotoxicité de la metformine doit être clarifiée avant d’utiliser la metformine comme agent anticancéreux axé sur le métabolisme du glucose.

L’effet Warburg, fréquemment observé dans les cellules cancéreuses, est important non seulement pour la production d’énergie mais aussi pour le maintien d’un statut réduit dans un microenvironnement tumoral hostile. Le glucose est la principale source de pouvoir réducteur, le NADPH, via la voie du pentose phosphate [1], [9], [22]. En effet, la mort des cellules cancéreuses médiée par le 2-désoxyglucose(2DG) dépend principalement du stress oxydatif intolérable en plus de la crise énergétique [15]. Sur la base du concept selon lequel l’augmentation de la glycolyse protège les cellules cancéreuses du stress oxydatif, on pense que l’augmentation de la glycolyse par la metformine est capable de protéger les cellules du stress oxydatif mitochondrial résultant de l’inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire [35]. Nous avons donc cherché à savoir si le stress mitochondrial induit par la metformine pouvait être augmenté par le stress oxydatif dû à l’épuisement du GSH en cas de privation de glucose ou au traitement par H2O2 dans des conditions de glucose suffisant. Sur la base des rapports indiquant que l’inhibition de la glycolyse par le 2-DG renforce les effets cytotoxiques de la metformine [2], [6], [14] et que le dichloroacétate (DCA) réduit la glycolyse en activant la pryruvate déshydrogénase (PDH) [32] ainsi que le métabolisme oxydatif et l’activité antitumorale [20].

Nous avons exploré dans cette étude les effets du DCA sur la cytotoxicité de la metformine et la régulation du métabolisme du glucose. Contrairement aux effets de la metformine seule, le traitement combiné des cellules cancéreuses par la metformine et le DCA a augmenté de manière significative l’activité de la PDH, mais pas la glycolyse, rétablissant ainsi la respiration mitochondriale dans les cellules cancéreuses. La reprogrammation du métabolisme du glucose était étroitement associée à un stress oxydatif sévère. En résumé, la reprogrammation de la glycolyse aérobie par le DCA en oxydation mitochondriale a augmenté le stress mitochondrial et cellulaire induit par la metformine, suffisant pour induire une mort cellulaire massive malgré un taux de glucose élevé.

Matériel et méthodes

Cellules et réactifs
Les cellules HeLa, MCF7 et MDA-MB-231 ont été cultivées dans du DMEM (Gibco) contenant du glucose (0-25 mM) complété par 10% de sérum bovin fœtal et 100 U/mL de gentamycine à 37 °C et 5% deCO2. La metformine, le dichloroacétate (DCA), la l-buthionine-sulfoximine (BSO), le H2O2, le monoéthylester de glutathion (GSH-MEE) et la N-acétyl-l-cystéine (NAC) ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Le trolox provient de Biomol International, L.P., et le diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA), le rouge MitoSOX, l’iodure de propidium (PI) et la calcéine AM proviennent de Molecular Probes (Eugene, OR).

Mesure de la viabilité cellulaire et test de formation de colonies sur gélose molle
La viabilité cellulaire après divers traitements pendant les temps indiqués a été évaluée par exclusion du colorant bleu trypan (Sigma-Aldrich). Pour ce test, 4 ×104 cellules ont été placées dans des plaques à 12 puits et traitées avec des produits chimiques le jour suivant. Les cellules ont été trypsinées et mélangées à du bleu trypan à 0,4 % (1:1). Le pourcentage de cellules viables représente le nombre de cellules non colorées/nombre de cellules totales × 100. La mort cellulaire a également été mesurée par le kit de dosage de la libération de lactatedéshydrogénase (LDH) selon le protocole du fabricant (Takara, Japon). Pour le test de formation de colonies sur agar mou, les cellules HeLa (1,5 ×103) ont été placées dans une solution d’agarose à 0,6 % et superposées sur un lit d’agarose à 1,0 % avant d’être traitées avec différentes concentrations de metformine, de DCA ou des deux en combinaison. Les colonies supérieures à 125 μm en 2 semaines ont été comptées comme positives.

Mesure des niveaux de ROS cellulaires
Les ROS intracellulaires et mitochondriaux ont été mesurés à l’aide d’une sonde fluorescente sensible à l’oxydation, le diacétate de dichlorodihydroflourescin (H2DCF-DA) et le MitoSOX Red (Invitrogen), respectivement. Les cellules HeLa traitées par la metformine, le DCA ou les deux pendant les temps indiqués ont été incubées avec le DCF-DA (20 μM) ou le MitoSOX (5 μM) pendant 10 min à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et soumises à la cytométrie en flux (BD FACSCanto II, BD Biosciences, San Jose, CA) pour l’acquisition et l’analyse. L’intensité de la fluorescence a également été déterminée par microscopie à fluorescence.

Mesure des niveaux de glutathion cellulaire
Pour déterminer le statut redox du glutathion intracellulaire, les niveaux de glutathion réduit et oxydé (GSH, GSSG) ont été analysés selon la méthode décrite précédemment [29]. Pour déterminer le glutathion total, les cellules ont été récoltées et mises en suspension dans de l’acide sulfosalicylique à 1%. Après avoir éliminé les agrégats par centrifugation à 8000g pendant 10 min, les surnageants ont été appliqués pour le dosage. La réaction a été lancée en ajoutant le surnageant (1 μg) à une plaque de microtitration à 96 puits contenant 200 μl de mélange de dosage [125 mM NaPO4, pH 7,5, 0,3 mM NADPH, 6 mM 5,50-dithiobis(acide 2-nitrobenzoïque) (DNTB ; Sigma, St. Louis, MO), 0,12 U de glutathion réductase], et le taux de réduction maximal du DNTB par le GSH a été obtenu en mesurant l’absorbance à 405 nm. La quantité de glutathion total a été calculée à partir de la courbe d’étalonnage utilisant le GSH standard (Sigma). Pour obtenir le niveau de GSSG, les cellules ont été prétraitées avec de la 2-vinylpyridine pour priver le GSH existant, et le surnageant (50 μg) a été traité selon le même protocole que celui du glutathion total.

Dosage de l’activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH)
L’activité de la PDH a été mesurée à l’aide du kit de dosage en microplaque de l’activité enzymatique de la PDH (Abcam, Cambridge, MA) conformément au protocole. Les cellules ont été lysées dans le tampon d’échantillonnage fourni avec le kit, et les protéines cellulaires totales à une concentration de 5 mg/ml ont été chargées en trois exemplaires sur la microplaque précouverte d’anticorps anti-PDH de capture et incubées pendant 3 h à température ambiante. Après lavage des échantillons, le mélange réactionnel a été ajouté, et l’absorbance du produit de la réaction de la réduction de NAD+ en NADH couplée au colorant rapporteur a été mesurée à 450 nm pendant 50 min à intervalles de 0,5 min à l’aide du spectrophotomètre de microplaque Eon (BioStack, Winooski, VT). L’activité PDH a été calculée à partir de la pente de la courbe mOD par temps (min) (ΔmOD/min) et normalisée par rapport au groupe témoin.

Analyse de la consommation de glucose et de la production de lactate
Des cellulesHela(1 ×104/ml) cultivées dans du DMEM avec 25 mM de glucose ont été traitées avec de la metformine, du DCA ou les deux. Après 48 h, les concentrations de glucose et de lactate dans les milieux ont été mesurées par le système bioanalytique multiparamétrique YSI 7100. Les milieux sans culture cellulaire ont été utilisés pour mesurer la concentration initiale de glucose et de lactate. Consommation de glucose = (concentration en glucose des milieux sans culture cellulaire) – (concentration en glucose des milieux du groupe traité). Production de lactate = (concentration de lactate dans les milieux du groupe traité) – (concentration de lactate dans les milieux sans culture cellulaire).

Mesure des taux de phosphorylation oxydative et de glycolyse
Le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) ont été mesurés à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire Seahorse Bioscience (North Billerica, MA) XF24 [33]. Ainsi, les cellules HeLa ont été ensemencées dans des microplaques XF 24 puits (1 ×104) et incubées à 37 °C pendant 24 avant d’être traitées avec de la metformine, du DCA ou les deux pendant 12 h. Ensuite, les cellules ont été lavées et équilibrées avec du DMEM complété avec du GlutaMax-1 (200 mM), du glucose (25 mM), du chlorure de sodium (32 mM) et du rouge de phénol sans bicarbonate à 37 °C pendant 1 h dans un incubateur sansCO2. L’OCR (pmol/min) et l’ECAR (mpH/min) ont été mesurés 3 fois pendant 3 min chacun. Après l’expérience, le nombre de cellules a été compté pour la normalisation.

Analyse immunoblot
Les lysats cellulaires (40 μg) préparés dans un tampon RIPA avec des inhibiteurs de phosphatase ont été séparés sur SDS-PAGE avant d’être transférés sur une membrane PVDF (Millipore Corp). Les blots ont été hybridés avec des anticorps primaires et visualisés par le système ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Les anticorps ont été achetés, anti-p-PDH (S293) chez Calbiochem, anti-PARP et anti-PDH chez Abcam, anti-Caspase 3 chez Cell signaling, anti-cycline D1, anti-cycline E et anti-β-actine chez Santa Cruz Biotechnology.

Analyse statistique
Les données numériques ont été présentées sous forme de moyenne ± SD des déterminations indépendantes. Le test tindépendant ou l’ANOVA ont été appliqués, et les comparaisons multiples ont été évaluées par Tukey HSD. Les valeurs P inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

Résultats

La cytotoxicité de la metformine est récupérée par le glucose disponible
Pour comprendre les voies biochimiques régulant la mort des cellules cancéreuses induite par la metformine, des cellules HeLa maintenues dans du DMEM avec 5,5 mM de glucose ont été traitées avec de la metformine (5 mM) en même temps que l’ajout quotidien de glucose (0-2 mM) pendant 72 heures. L’ajout de glucose a augmenté de manière significative la viabilité des cellules traitées à la metformine (Fig. 1A, #p < 0,05 et *p < 0,001 par rapport à l’absence d’ajout), conformément aux rapports précédents [11], [17], [25]. Lorsque des cellules HeLa maintenues dans un milieu contenant 5-25 mM de glucose ont été incubées avec 0-10 mM de metformine pendant 72 h, la mort cellulaire induite par la metformine dépendait de la concentration de glucose dans le milieu de culture. En particulier, des conditions de glucose élevées (25 mM) ont protégé de manière significative la cytotoxicité de la metformine, quelle que soit la concentration de metformine (Fig. 1B). La mort cellulaire induite par 10 mM de metformine a été protégée par 25 mM de glucose dans le milieu de culture non seulement dans les cellules HeLa mais aussi dans les cellules de cancer du sein MCF7 et MDA-MB231, alors que 5,5 mM de glucose n’a pas réussi à protéger les cellules de l’effet toxique (Fig. 1C), observé au microscope à contraste de phase. Ces résultats indiquent que l’équilibre entre les concentrations de metformine et de glucose dans les milieux de culture est important pour la régulation de la cytotoxicité de la metformine.

Fig. 1. La cytotoxicité de la metformine a été récupérée par la disponibilité du glucose dans les milieux de culture. (A) Régulation de la mort cellulaire induite par la metformine (Met) par l’ajout de glucose au milieu de culture. Les cellules HeLa ont été maintenues dans du DMEM contenant 5,5 mM de glucose, et les cellules ont été traitées avec 5 mM de Met avec ajout quotidien de glucose (0-2 mM) pendant 72 h. Notez l’inhibition significative de la cytotoxicité induite par la metformine par l’ajout de glucose (1 et 2 mM, #p < 0,05 et *p < 0,001 vs. 0 mM). (B) Protection de la mort cellulaire induite par la metformine en fonction de la concentration de glucose. Des cellules HeLa cultivées dans les concentrations indiquées de glucose ont été traitées avec de la metformine (0-10 mM) pendant 72 h, et les cellules viables ont été comptées par la méthode d’exclusion au bleu trypan. On note une récupération significative de la mort cellulaire induite par le Met en présence d’une concentration élevée de glucose (25 mM) dans le milieu de culture, quelle que soit la concentration de metformine. Seule la metformine 10 mM a légèrement réduit le nombre de cellules viables. #p<0,05 et *p<0,001 vs. 0 mM. (C) Résultats de microscopie à contraste de phase de cellules cancéreuses (MCF7, MDA-MB-231 et HeLa) incubées avec 10 mM de metformine avec les concentrations habituelles et élevées de glucose (5,5 mM et 25 mM, respectivement) pendant 72 h. Notez la différence significative de la mort cellulaire en fonction de la concentration de glucose, non seulement dans les cellules HeLa mais aussi dans les cellules cancéreuses du sein MCF7 et MDA-MB-231.

La cytotoxicité de la metformine est régulée par les changements redox médiés par le GSH
Comme la metformine augmente le niveau de ROS mitochondrial en inhibant le complexe I de la chaîne respiratoire [8], [21], [36], nous avons donc cherché à savoir si le stress oxydatif mitochondrial induit par la metformine était suffisamment grave pour induire la mort des cellules cancéreuses dans des conditions d’insuffisance de glucose. Des cellules HeLa maintenues dans un milieu contenant du glucose ont été traitées avec 5 mM de metformine, puis les niveaux de superoxyde mitochondrial et de ROS cellulaires totaux ont été évalués en utilisant le MitoSox Red et le DCFDA, respectivement (Fig. 2A). En effet, la metformine a augmenté les niveaux de ROS mitochondriaux et cellulaires totaux de manière dépendante de la concentration de metoformine, cependant, la fluorescence du MitoSox Red était plus élevée que celle du niveau de ROS cellulaire total dans les cellules HeLa (Fig. 2B). Comme prévu, le niveau de ROS cellulaire induit par la metformine était significativement plus élevé dans les conditions sans glucose que dans les milieux contenant du glucose (Fig. 2C). Ces données appuient fortement le rapport [15] selon lequel la privation de glucose réduit le pool de glutathion cellulaire (GSH + GSSG). Par conséquent, lorsque le pool de glutathion a été mesuré, la réduction du GSH par rapport au GSSG était plus significative dans la condition sans glucose (p = 0,000) en réponse à la metformine, cependant, le contenu total de glutathion a été maintenu sans augmentation significative du GSSG dans les milieux contenant du glucose (5,5 mM) (Fig. 2D), indiquant que le glucose dans les milieux de culture a joué un rôle important dans la génération de GSH. Pour étudier la régulation de la cytotoxicité de la metformine par le stress redox en cas de privation de glucose, des antioxydants ont été utilisés. Le traitement des cellules HeLa avec de la glutamine 10 mM ou de la N-acétyl-l-cystéine (NAC) seule a réduit de manière significative la mort cellulaire observée dans les milieux sans glucose sans ajout de metformine (Fig. 2E, p = 0,000 et p = 0,004 par rapport à l ‘absence de traitement, respectivement), cependant, le même traitement n’a pas réussi à améliorer la cytotoxicité de la metformine (5 mM) dans les milieux sans glucose. D’autre part, le traitement combiné de glutamine et de NAC a pu protéger les cellules HeLa de la cytotoxicité de la metformine (5 mM) (Fig. 2E, p = 0,000). Pour confirmer directement si le glutathion réduit joue un rôle dans l’inhibition de la cytotoxicité de la metformine, une forme de GSH perméable aux cellules (GSH-MEE) a été utilisée. L’ajout de GSH-MEE a réduit de manière significative la mort des cellules HeLa, par rapport à celles du véhicule témoin, même dans des conditions sans glucose (Fig. 2F). Ces données révèlent un effet synergique de la privation de glucose dans la cytotoxicité de la metformine via le stress oxydatif par déplétion du GSH.

Fig. 2. La cytotoxicité de la metformine a été atténuée en modifiant les niveaux redox avec du glutathion réduit. (A) Résultats de la microscopie à fluorescence révélant les générations de superoxyde mitochondrial et de H2O2 cellulaire en réponse à la metformine. Les cellules HeLa traitées avec de la metformine (5 mM) ont été visualisées par microscope à fluorescence après incubation avec le MitoSox Red et le DCFDA pendant 30 minutes. Les fluorescences rouge et verte indiquent le superoxyde mitochondrial et le H2O2 cellulaire total, respectivement (MFI : intensité moyenne de fluorescence). (B) La metformine a augmenté les radicaux superoxyde légèrement plus que H2O2 dans les cellules HeLa. Les cellules ont été traitées avec les concentrations indiquées de metformine pendant 8 h, puis incubées avec le MitoSox Red et le DCFDA pendant 30 min. Les intensités moyennes relatives de fluorescence du MitoSox Red et du DCF ont été mesurées par cytométrie de flux. Notez l’augmentation du superoxyde et de H2O2 après le traitement à la metformine(#p<0,05 et *p<0,001 vs Met 0 mM). (C) Génération supplémentaire de H2O2 cellulaire dans des conditions sans glucose (Glc). Des cellules HeLa ont été incubées avec de la metformine (0-5 mM) avec et sans glucose dans le milieu de culture pendant 8 h, puis les cellules ont été traitées avec du DCFDA pendant 30 min. L’intensité moyenne relative de la fluorescence du DCF a été mesurée par cytométrie en flux. Notez la génération significative de H2O2 dans les cellules traitées par la metformine dans un milieu sans glucose par rapport à celles du milieu contenant 5,5 mM de glucose(p = 0,010 par rapport au traitement par Met 1 mM, et p = 0,000 par rapport au traitement par Met 5 mM). (D) Le glucose (Glc) comme source de glutathion réduit dans les cellules cancéreuses. Des cellules HeLa ont été traitées avec de la metformine (0-5 mM) avec ou sans 5,5 mM de glucose dans le milieu de culture pendant 8 h. Les concentrations de glutathion total (GSH + GSSG) et de glutathion oxydé (GSSG) ont été mesurées par la méthode de recyclage DTNB [5,5-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque)]. Dans les conditions sans glucose, le traitement avec la metformine (1 et 5 mM) a réduit de manière significative le glutathion total ainsi que la production de GSSG(p1et p2= 0,000), tandis que l’ajout de glucose (5,5 mM) a augmenté de manière significative le niveau de glutathion total sans production de GSSG, indiquant la génération de GSH dans les milieux de culture avec 5,5 mM de glucose indépendamment de la concentration de metformine. Bien que le traitement avec 5 mM de Met ait clairement réduit le niveau de glutathion total par rapport au contrôle(p = 0,000 entre Met 0 mM et 5 mM), le niveau de production de GSSG était négligeable. (E) Protection de la mort cellulaire induite par la metformine par le traitement combiné avec la glutamine (Gln) et la NAC malgré une condition sans glucose. Les cellules ont été traitées avec 5 mM de metformine avec un prétraitement à la glutamine (10 mM) ou à la NAC (10 mM) pendant 1 h, puis le degré de mort cellulaire a été examiné par le kit de détection de la cytotoxicité LDH. Le prétraitement à la glutamine ou à la NAC a significativement réduit la libération de LDH dans les conditions sans glucose sans traitement à la metformine(p = 0,000 et p = 0,004, respectivement). En revanche, le traitement à la glutamine ou à la NAC seule n’a pas réussi à protéger la mort cellulaire induite par le Met 5 mM, cependant, le co-traitement à la glutamine et à la NAC a significativement empêché la mort cellulaire malgré la condition sans glucose(p = 0,000). (F) L’ajout de GSH perméable à la membrane a empêché la mort cellulaire induite par la metformine dans les cellules HeLa dans des conditions sans glucose. Les cellules ont été traitées avec de la méformine (0-5 mM) pendant 12 h avec ou sans ester monoéthylique de glutathion (GSH-MEE, 10 mM) dans des conditions sans glucose, puis un dosage de la libération de LDH a été effectué pour dépister le taux de mort cellulaire. On note une réduction significative de la libération de LDH dans les cellules traitées avec 2,5 mM et 5 mM de metformine par l’ajout de GSH-MEE, *p< 0,001 par rapport au véhicule témoin. (Pour l’interprétation des références aux couleurs dans la légende de cette figure, le lecteur est renvoyé à la version web de cet article)

L‘augmentation du stress oxydatif aggrave la cytotoxicité de la metformine malgré un taux de glucose élevé
Pour vérifier si les cellules exposées à la metformine deviennent plus vulnérables au stress, des cellules HeLa maintenues avec 25 mM de glucose ont été traitées avec 5 mM de metformine et H2O2 pendant 12 heures. Un traitement unique avec H2O2 ou 5 mM de metformine n’a pas induit de mort cellulaire significative, cependant, le traitement combiné de metformine avec H2O2 (plus de 500 μM) a nettement augmenté la mort cellulaire, mesurée par la libération de LDH (Fig. 3A). Non seulement l’H2O2 exogène mais aussi l’épuisement du pool de glutathion par le BSO, inhibiteur de la synthèse du GSH, ont également entraîné un niveau significatif de cytotoxicité de la metformine. L’incubation avec de la metformine (10 mM) ou du BSO 4 mM seul pendant 48 heures n’a pas montré de signe significatif de mort cellulaire dans des conditions de glucose élevé (25 mM), tel qu’évalué par la coloration Calcein AM (Fig. 3B panneau de gauche). Cependant, le traitement combiné de la metformine et du BSO a augmenté de manière significative la mort cellulaire positive à l’iodure de propidium, lorsqu’elle a été contrôlée par exclusion au bleu trypan. Le BSO (1 mM) a significativement sensibilisé la cytotoxicité de la metformine 1 mM dans des conditions de glucose élevé (25 mM) (Fig. 3B panneau de droite). Nos résultats sont bien confirmés par des études antérieures selon lesquelles le GSH est l’antioxydant biologique le plus abondant et le plus important contre le stress oxydatif dans les cellules cancéreuses [7], [10].

Fig. 3. La cytotoxicité de la metformine a été aggravée par le changement des niveaux d’oxydoréduction avec l’exposition au H2O2 ou la déplétion du GSH malgré une condition de glucose élevé. (A) Aggravation de la mort cellulaire induite par la metformine par l’ajout de H2O2. Après traitement avec 5 mM de metformine pendant 12 h, les cellules HeLa ont ensuite été incubées avec ou sans H2O2 (∼1000 μM) pendant 8 h avant observation sous microscope à contraste de phase et dosage de la libération de LDH pour mesurer le degré de mort cellulaire. Le peroxyde d’hydrogène a significativement aggravé la mort cellulaire induite par la metformine au-delà de 500 μM(*p< 0,001 vs contrôle). (B) Sensibilisation de la mort cellulaire induite par la metformine par déplétion du GSH avec l-buthionine-S,R-sulphoximine (BSO, 0-4 mM) malgré une condition de glucose élevée. Les cellules HeLa ont été traitées avec 10 mM de metformine avec ou sans BSO et ensuite colorées avec Calcein AM et iodure de propidium (PI) pour montrer les cellules viables et mortes, respectivement (panneau de gauche). La viabilité cellulaire a été déterminée par la méthode d’exclusion au bleu trypan (panneau de droite). Notez la sensibilisation de la mort cellulaire en fonction de la concentration de BSO malgré une faible concentration de méformine (1 mM) dans des conditions de glucose élevé (25 mM). La réduction de la viabilité cellulaire était accrue en fonction des concentrations de BSO ainsi que de la metformine, #p< 0,05, *p< 0,001 vs BSO 0 mM. (Pour l’interprétation des références aux couleurs dans la légende de cette figure, le lecteur est renvoyé à la version web de cet article)

Ledichloroacétate augmente la respiration mitochondriale par l’intermédiaire de l’activation de la pyruvate déshydrogénase
Comme la PDH détermine le sort du métabolisme du glucose soit dans les mitochondries, soit dans le cytosol, il est très probable que l’augmentation de l’activité de la PDH puisse accroître la respiration mitochondriale plutôt que la glycolyse aérobie dans les cellules cancéreuses. Nous avons donc cherché à savoir si la glycolyse induite par la metformine était régulée par le DCA, un inhibiteur de la PDH kinase (PDK). Lorsque les cellules HeLa ont été traitées avec de la metformine, l’activité de la PDH a été significativement réduite de manière dose-dépendante (Fig. 4A). Le traitement à la metformine a clairement augmenté la phosphorylation de PDH-E1a, indiquant une activation de la PDK par opposition à l’inhibition de la PDH (Fig. 4B). D’autre part, le traitement au DCA a réduit de façon significative la phosphorylation de la PDH-E1a induite par la metformine sur le résidu S293 indépendamment du traitement à la metformine, ce qui indique l’augmentation ou le maintien de l’activité de la PDH par le DCA (Fig. 4C). En effet, le DCA a augmenté significativement l’activité de la PDH (p = 0,005), contrairement à l’inhibition significative par la metformine (p = 0,000), par rapport au contrôle. De plus, le co-traitement du DCA avec la metformine a rétabli de manière significative l’activité de la PDH inhibée par la metformine (p = 0,000) jusqu’au niveau de contrôle (Fig. 4D) ; le DCA a antagonisé l’effet de la metformine sur l’activité de la PDH. Pour évaluer la régulation des changements métaboliques par le DCA ou la metformine, les taux de consommation de glucose et de production de lactate ont été mesurés dans les milieux de culture ; le traitement par le DCA a réduit de façon significative la consommation de glucose (p = 0,000), contrairement à l’augmentation significative par la metformine (p = 0,000, Fig. 4E). Cependant, le changement était insignifiant dans le cas d’un cotretraitement par la metformine et le DCA (p = 0,125 par rapport au contrôle), ce qui confirme à nouveau la relation antagoniste entre le DCA et la metformine. De plus, la libération de lactate (Fig. 4F) par le DCA ou la metformine seuls a révélé le même schéma que celui de la vitesse de consommation du glucose (Fig. 4E), suggérant le changement du métabolisme du glucose de la glycolyse aérobie induite par la metformine à l’oxydation mitochondriale par le cotre traitement au DCA. Lorsque le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) ont été mesurés par l’analyseur XF24, le rapport OCR/ECAR était significativement augmenté par le traitement au DCA (p = 0,000), représentant une augmentation de la respiration mitochondriale, mais diminué par la metformine (p = 0,009) par rapport au contrôle. En effet, le cotraitement de la metformine avec le DCA a considérablement rétabli la respiration mitochondriale par rapport à la metformine seule (p = 0,000), même si elle était un peu plus faible que celle du DCA seul (p = 0,04). Dans l’ensemble, le co-traitement de la metformine avec le DCA a reprogrammé le métabolisme du glucose en partie de la glycolyse aérobie à l’oxydation mitochondriale (Fig. 4G).

Fig. 4. Le dichloroacétate a rétabli l’activité de la pyruvate déshydrogénase inhibée par la metformine et la respiration mitochondriale, tout en diminuant la consommation de glucose. (A) Inhibition de l’activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH) par la metformine dans des conditions de glucose élevé. Des cellules HeLa incubées avec de la metformine (0-5 mM) pendant 24 h ont été soumises à un test d’activité PDH en utilisant le kit de Mitoscience. Notez l’inhibition significative de l’activité PDH par plus de 1 mM de metformine, #p< 0,05 et *p< 0,001 par rapport au contrôle sans traitement. (B) Analyse par immunoblot révélant la phorylation de la sous-unité PDH-E1a par le traitement à la metformine pendant 6 h. Noter l’augmentation de la phosphorylation de PDH-E1a sur le résidu S293 par le traitement à la metformine. (C) Analyse par immunoblotage révélant l’inhibition significative de la phosphorylation de la PDH-E1a par le cotraitement à la metformine et au dichloroacétate (DCA) pendant 12 h. Noter les effets contrastés de la metformine et du DCA sur la phosphorylation de la PDH-E1a, indiquant l’inhibition de la PDH kinase (PDK) par le DCA, par opposition à une augmentation significative par la metformine. En même temps, les données ont montré une récupération significative de la phosphorylation de la PDH inhibée par la metformine par un co-traitement avec le DCA. (D) Récupération de l’activité de la PDH inhibée par la metformine par co-traitement avec le DCA dans les cellules HeLa. La metformine elle-même a inhibé de façon significative l’activité de la PDH, cependant, le DCA seul et le cotre traitement par le DCA et la metformine ont atténué de façon significative l’activité de la PDH inhibée par la metformine. p = 0 ,02 et p = 0 ,000 dans le Met + DCA par rapport au DCA seul et au Met seul, respectivement. (E et F) Inhibition de la consommation de glucose (E) et de la production de lactate (F) induites par la metformine par le traitement au DCA dans les cellules HeLa. Les cellules ont été traitées avec de la metformine (5 mM) et du DCA (20 mM) pendant 24 h. Pour confirmer les changements du taux glycolytique, la consommation de glucose et la production de lactate ont été mesurées par le système bioanalytique multiparamétrique YSI 7100. On note des augmentations significatives de la consommation de glucose et de la production de lactate dans les cellules traitées à la metformine(p = 0,000 par rapport au contrôle), alors que les niveaux ont été significativement réduits par le co-traitement au DCA (p = 0,000 par rapport au DCA seul et au Met seul). (G) Le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) ont été mesurés par l’analyseur XF24. Le taux de respiration mitochondriale (OCR/ECAR) était significativement augmenté par le traitement au DCA seul(p = 0,000 par rapport au contrôle) par opposition à la diminution significative par le traitement à la metformine(p = 0,009 par rapport au contrôle). Cependant, la respiration mitochondriale inhibée par la metformine a été récupérée de manière significative par le cotretraitement avec le DCA par rapport à celles des traitements par la metformine ou le DCA seul(p = 0,000 par rapport à la metformine seule et p = 0,040 par rapport au DCA seul).

Ledichloroacétate augmente le stress oxydatif et la cytotoxicité de la metformine dans des conditions d’hyperglycémie
Pour étudier l’effet de la reprogrammation métabolique médiée par le DCA sur le niveau de ROS cellulaire, des analyses FACS utilisant le MitoSox Red et le DCFDA ont été utilisées. Le co-traitement de cellules HeLa avec de la metformine et du DCA a augmenté les niveaux de superoxyde mitochondrial et de ROS cellulaire total par rapport à chaque traitement (Fig. 5A), ce qui suggère que la reprogrammation métabolique pourrait aggraver le stress oxydatif par le DCA. Pour évaluer si la génération de ROS augmentée par le DCA accroît ou non la cytotoxicité de la metformine, on a compté la viabilité des cellules après le traitement par la metformine, le DCA ou les deux. Contrairement au niveau négligeable de mort cellulaire causé par le DCA seul (∼20 mM), le cotraitement du DCA avec la metformine a réduit de façon marquée la viabilité malgré des conditions de glucose élevé (Fig. 5B). Afin d’évaluer l’effet de l’augmentation des ROS sur la mort cellulaire, des antioxydants, NAC ou trolox, ou un prooxydant, BSO, ont été prétraités avant le co-traitement par la metformine et le DCA. En effet, les antioxydants ont réduit de manière significative la libération de LDH dans le milieu, alors qu’elle a été augmentée par le prétraitement au BSO (Fig.5C), indiquant une régulation significative de la cytotoxicité de la metformine via la modulation du stress oxydatif par le DCA. Un tel effet synergique de la cytotoxicité a également été observé dans d’autres cellules cancéreuses, MDA-MB-231, EJ et MCF7 (données non présentées). De plus, le cotraitement de la metformine et du DCA a inhibé de manière significative la synthèse de la cycline D1 et de la cycline E ainsi que le clivage de PARP (Fig. 5D et E), indiquant une réduction de la prolifération cellulaire et l’induction de l’apoptose. Enfin, le cotretraitement a réduit de manière significative la croissance des cellules HeLa indépendante de l’ancrage par rapport aux traitements individuels et au contrôle (Fig. 5F).

Fig. 5. Le co-traitement par la metformine et le dichloroacétate a augmenté le stress oxydatif et la mort des cellules cancéreuses dans des conditions de glucose élevé. (A) Le co-traitement au DCA a augmenté la génération de ROS induite par la metformine. Les cellules HeLa traitées avec du DCA (20 mM) ou de la metformine (5 mM) pendant 24 heures ont été analysées par FACS après pré-incubation avec MitoSox et DCFDA. On note une augmentation significative des niveaux de ROS par le co-traitement avec la metformine et le DCA(p = 0,000 par rapport à la metfomin seule). (B) Monocouches de cellules HeLa traitées par DCA ou metformine pendant 72 h (panneau de gauche). La viabilité cellulaire a été mesurée par la méthode d’exclusion au bleu trypan ( panneau de droite). Notez l’aggravation significative de la mort cellulaire par le co-traitement avec la metformine et le DCA(*p< 0,001). Cependant, il n’y a pas eu de cytotoxicité par le DCA seul jusqu’à 20 mM. (C) Régulation de la libération de LDH par l’ajout d’antioxydants ou de piégeurs de GSH. Les cellules HeLa ont été traitées avec du metfromin (5 mM) et du DCA (20 mM) soit avec du NAC (1 mM), du trolox (100 μM) ou du BSO (1 mM) pendant 48 h, puis la LDH libérée dans le milieu de culture a été déterminée. On note une réduction significative de la libération de LDH par les antioxydants, la NAC ou le trolox, alors qu’elle est significativement augmentée par le traitement au BSO, indiquant la régulation de la mort cellulaire médiée par la metformine et le DCA par la modulation du niveau de ROS. (D) Analyse par immunoblot révélant une perte significative de l’expression de la cycline D1 et de la cycline E par le traitement à la méformine et au DCA, ce qui suggère l’inhibition de la prolifération cellulaire dans les cellules par le cotretraitement. (E) Analyse par immunoblotage montrant les clivages de PARP et de caspase 3 uniquement dans le cas du cotretraitement par la metformine et le DCA, indiquant une mort cellulaire significative après le cotretraitement. (F) Test de formation de colonies sur gélose molle. Des cellules HeLa traitées avec du DCA et/ou de la metformine ont été soumises à un test de tumorigenèse in vitro, puis les colonies ont été colorées avec du cristal violet au bout de 2 semaines de test. Noter l’inhibition significative de la formation de colonies uniquement dans le groupe ayant reçu le DCA et la metformine en co-traitement. * p < 0.001.

Discussion

Nous avons présenté des preuves que la reprogrammation du métabolisme du glucose par le traitement des cellules HeLa avec la méformine et le dicholoroacétate a augmenté la mort cellulaire par la régulation à la hausse du niveau de ROS en augmentant l’oxydation mitochondriale plutôt que la glycolyse aérobie (Fig. 6). Le DCA a été utilisé comme agent pour promouvoir la phosphorylation oxydative plutôt que la glycolyse et pour reprogrammer le métabolisme du glucose médié par la metformine. Le DCA active la PDH via l’inhibition de la PDK, ce qui permet de convertir le pyruvate en acétyl-CoA au lieu du lactate. Comme mécanisme biochimique de la sensibilisation des cellules cancéreuses à la cytotoxicité de la metformine induite par la privation de glucose, nous avons démontré que le stress oxydatif induit par la metformine était aggravé dans des conditions de privation de glucose (Fig. 2C). En effet, la metformine a consommé du glutathion de façon beaucoup plus importante que l’utilisation basale (Fig. 2D), alors qu’elle était beaucoup moins importante en présence de glucose (5,5 mM). Bien que le prétraitement des cellules HeLa avec la NAC ait bloqué de manière significative la mort cellulaire dans des conditions sans glucose, la supplémentation en cystéine par la NAC sans glutamine était insuffisante pour maintenir le niveau de glutathion afin de supporter le stress oxydatif induit par la metformine (Fig. 2E). Ce phénomène peut être soutenu par l’étude selon laquelle la glutamine est importante pour la carboxylation réductrice dans les cellules tumorales avec des mitochondries défectueuses [19]. Par conséquent, l’ajout de glutamine à la NAC a réduit de manière significative la cytotoxicité de la metformine dans des conditions sans glucose (Fig. 2E).

Dans des conditions de glucose élevé (25 mM), la metformine 10 mM n’a présenté qu’un léger effet tumoraliste, mais pas de mort cellulaire significative (Fig. 3B). En revanche, 2,5 mM de metformine ont induit une mort cellulaire significative sous une concentration de glucose de 5,5 mM (Fig. 1B), ce qui indique que le glucose est une source importante de pouvoir réducteur. Par conséquent, l’ajout de 1-2 mM de glucose était suffisant pour bloquer la cytotoxicité de la metformine au niveau habituel de glucose (Fig. 1A), ce qui suggère que la cytotoxicité de la metformine pourrait être insuffisante pour induire la mort cellulaire dans des conditions physiologiques de glucose. Cependant, le traitement à la metformine a augmenté de manière significative les ROS mitochondriaux dans la condition de non-limitation du glucose. Il n’existe encore aucun rapport sur la génération de ROS mitochondriaux dans le contexte de la cytotoxicité de la metformine. Ici, nous avons observé que 1 mM de metformine augmentait déjà significativement le superoxyde mitochondrial ainsi que les ROS cellulaires (Fig. 2B), ce qui a induit un gonflement mitochondrial dans les cellules cancéreuses et le gonflement n’était pas irréversible (Fig. supplémentaires S1A et S1B). Néanmoins, l’augmentation des ROS mitochondriaux ne semble pas être suffisante pour augmenter les ROS cellulaires totaux et les dommages oxydatifs. Les cellules cancéreuses exposées à la metformine tentent de minimiser les dommages oxydatifs pour maintenir la viabilité cellulaire par l’induction de la glycolyse aérobie et la production de NADPH. Cette notion peut être partiellement soutenue par le fait que l’épuisement du pouvoir réducteur par le BSO ou le H2O2 exogène a augmenté la cytotoxicité de la metformine malgré la condition de glucose élevé (Fig. 3). Les cellules cancéreuses peuvent résister au stress oxydatif par la glycolyse aérobie et la quantité de GSH peut être maintenue principalement par le NADPH produit par la voie des pentoses phosphates [12].

L’activité antitumorale du DCA a été démontrée in vitro [4] et dans des modèles de souris in vivo [27], [28], et chez les patients atteints de glioblastome [18], cependant, la valeur IC50 du DCA est relativement élevée (>17 mM, 48 h) pour induire la mort cellulaire. De plus, il n’y a pas de spécificité des cellules tumorales dans les lignées cellulaires cancéreuses testées [26], et le DCA est sélectivement actif contre les cellules présentant un défaut dans les mitochondries, comme les cellules rho(0) ou les cellules HCT116 p53 null avec déficience du complexe IV. Nous avons également observé que le DCA 20 mM seul n’a pas réussi à induire une mort cellulaire efficace, mais que l’association avec la metformine a permis d’obtenir une synergie de l’activité anti-tumorale du DCA 10 mM (Fig. 5B et F).

Lorsque les cellules ont été traitées avec de la metformine, l’activité de la PDH a été considérablement inhibée par sa phospholytation sur le résidu Ser293 (Fig. 4C) sans aucun changement significatif de l’expression de l’ARNm de la PDK (données non présentées), ce qui indique une modification posttranscriptionnelle. Bien que nous n’ayons pas pu définir le mécanisme d’inhibition de l’activité de la PDH induite par la metformine, la diminution de l’activité de la PDK par le DCA a augmenté le stress oxydatif induit par la metformine en réprimant la phosphorylation de la PDH (Fig. 4), ce qui indique l’inhibition de l’activité de la PDK par le DCA, mais l’augmentation de la phosphorylation oxydative en même temps que le stress redox. En accord avec les résultats ci-dessus, le DCA a restauré de manière significative la respiration mitochondriale inhibée par la metformine en partie (Fig. 4F) et a fortement augmenté la génération de ROS mitochondriaux induite par la metformine (Fig. 5A). Le rôle protecteur des antioxydants contre le traitement combiné de la metformine et du DCA nous a amenés à conclure que le DCA peut potentialiser la cytotoxicité de la metformine par la reprogrammation et l’augmentation du stress oxydatif (Fig. 5C).

En résumé, la cytotoxicité induite par la metformine était renforcée par la privation de glucose. Même dans des conditions d’hyperglycémie, un stress supplémentaire lié aux ROS par une déplétion de GSH ou une insulte exogène de H2O2 a augmenté la cytotoxicité de la metformine ainsi que la respiration mitochondriale. Nous concluons que la reprogrammation du métabolisme du glucose par le DCA, de la glycolyse aérobie à la respiration oxydative, aggrave le stress oxydatif induit par la metformine et sensibilise la cytotoxicité de la metformine dans les cellules cancéreuses (Fig. 6).

Fig. 6. La reprogrammation du métabolisme du glucose par le co-traitement avec la metformine et le dicholoroacétate augmente la mort cellulaire plutôt que la survie cellulaire en aggravant le stress oxydatif. Le traitement des cellules cancéreuses avec une faible concentration de metformine (Met) augmente la glycolyse aérobie en inhibant la pyruvate déshydrogénase (PDH) et le complexe mitochondrial 1 (mComplex I), ce qui entraîne la production de H2O2 cellulaire et de superoxyde mitochondrial. Cependant, le niveau de ROS est insuffisant pour induire la mort cellulaire, et peut plutôt stimuler la prolifération des cellules cancéreuses. En revanche, le co-traitement de cellules cancéreuses par la metformine et le DCA inhibe significativement la PDH kinase (PDK), augmentant ainsi l’activité de la PDH ainsi que le taux de consommation d’oxygène (OCR) via le cycle TCA dans les mitochondries. L’altération du métabolisme du glucose augmente l’éclatement oxydatif, ce qui peut favoriser la mort des cellules cancéreuses plutôt que leur survie malgré des conditions de glucose élevé. Les conditions augmentant le niveau de glutathion réduit peuvent protéger les cellules du stress oxydatif.

Conflit d’intérêt

Il n’y a aucun intérêt financier concurrent lié à ce travail.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du Programme national de R&D pour la lutte contre le cancer, Ministère de la Santé et du Bien-être, République de Corée (131280).

Annexe A. Matériel supplémentaire

Les données supplémentaires associées à cet article sont disponibles, dans la version en ligne, à l’adresse http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2014.01.015.

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