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Xiao Lu,1,* Dong Zhou,1,* Bing Hou,1 Quan-Xing Liu,1 Qian Chen,2 Xu-Feng Deng,1,3 Zu-Bin Yu,1 Ji-Gang Dai,1 Hong Zheng1

1 Département de chirurgie thoracique, Hôpital Xinqiao, Troisième université médicale militaire, Chongqing, République populaire de Chine
2 Institut de pathologie et Centre du cancer du Sud-Ouest, Hôpital du Sud-Ouest, Troisième université médicale militaire, Chongqing, République populaire de Chine
3 Département de chirurgie cardiothoracique, Premier hôpital populaire de Zunyi, Guizhou, République populaire de Chine
*Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail

Correspondance : Hong Zheng ; Ji-Gang Dai
Département de chirurgie thoracique, Hôpital Xinqiao, Troisième université médicale militaire, n° 183, rue Xinqiao, district de Shapingba, Chongqing 400037, République populaire de Chine
Tél : +86 23 6877 4724
Fax : +86 23 6877 4724
Courriel : [email protected] ; [email protected]

Reçu : 14 septembre 2020
Accepté : 4 décembre 2020
Publié : 9 décembre 2020

Résumé

Contexte : La chimiothérapie reste la principale stratégie adjuvante du traitement du cancer ; cependant, l’émergence de la multirésistance aux médicaments est une source de préoccupation. Il a été démontré que l’autophagie a un rôle protecteur contre les médicaments chimiothérapeutiques dans les cellules cancéreuses, et l’inhibition de l’autophagie est généralement considérée comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Cependant, le manque d’inhibiteurs efficaces et spécifiques de l’autophagie limite son application.
Objectif : L’objectif de cette étude était d’explorer l’effet du DCA, un petit agent moléculaire antitumoral, sur la régulation de l’autophagie et la chimiosensibilisation dans les cellules de NSCLC.
Méthodes : Nous avons étudié la régulation de l’autophagie du dichloroacétate (DCA) par microscopie confocale laser et par western blotting dans les lignées cellulaires A549 et H1975. Le test MTT et la cytométrie de flux ont été réalisés pour explorer l’efficacité de la chimiosensibilisation du DCA. Les résultats ont été vérifiés à l’aide d’un modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris nude et l’immunohistochimie a été appliquée pour évaluer le niveau d’apoptose cellulaire et d’autophagie in vivo après le traitement.
Résultats : Nous avons découvert que le DCA, qui présente des propriétés antitumorales dans divers modèles de carcinome, induit l’apoptose des cellules de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) en inhibant l’autophagie des cellules cancéreuses. En outre, Perifosine, un inhibiteur d’AKT, peut considérablement affaiblir la capacité d’induction de l’apoptose par le DCA. Les résultats indiquent que la voie AKT-mTOR, un régulateur négatif principal de l’autophagie, est impliquée dans l’inhibition de l’autophagie induite par le DCA. Ensuite, nous avons détecté l’efficacité de l’inhibition de l’autophagie par le DCA. Utilisé en co-traitement avec le médicament chimiothérapeutique paclitaxel (PTX), le DCA a considérablement réduit l’autophagie cellulaire, augmenté l’apoptose et inhibé la prolifération des cellules A549 et H1975. Les résultats de l’expérience de xénogreffe démontrent que le co-traitement de PTX et de DCA peut diminuer de manière significative la prolifération cellulaire in vivo et prolonger la survie des souris.
Conclusion : Nos résultats suggèrent que le DCA peut inhiber l’autophagie cellulaire induite par les chimiothérapies, offrant une nouvelle voie pour la sensibilisation à la chimiothérapie du cancer.


Mots clés : DCA, autophagie, multirésistance aux médicaments, cancer du poumon non à petites cellules, paclitaxel, souris nude xénogreffées, chimiosensibilisation


INTRODUCTION

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est l’une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez l’homme et la femme, avec une incidence supérieure à l’incidence combinée des cancers du sein, du col de l’utérus et colorectal[1,2]. Bien que la chimiothérapie reste le moyen le plus important de traitement adjuvant pour les patients cancéreux inopérables et les patients subissant une intervention chirurgicale, les avantages cliniques des chimiothérapies postopératoires à base de platine et de paclitaxel sont modestes, en particulier dans le cas du CBNPC avancé. Dans le même temps, les effets indésirables des médicaments sont devenus plus graves et une résistance aux médicaments est également apparue[3]. Par conséquent, il est urgent de trouver de nouvelles stratégies pour remplacer/compléter la chimiothérapie traditionnelle.

Ces dernières années, de plus en plus de preuves ont montré que les cellules tumorales produisent de préférence de l’énergie pour la croissance et la division cellulaire par le biais du processus glycolytique et de la fermentation lactique. Les taux de métabolisme anaérobie et de glycolyse dans les cellules tumorales malignes à croissance rapide sont nettement plus élevés que ceux des cellules normales. Cette reprogrammation du métabolisme énergétique est connue sous le nom d’effet Warburg, et peut être exploitée comme cible thérapeutique pour inhiber la croissance tumorale. Parmi les nombreux médicaments qui ciblent le métabolisme, le dichloroacétate (DCA) a montré un excellent potentiel en raison de sa contribution positive au traitement du cancer[4,5]

Un autre mécanisme complètement altéré dans les cellules cancéreuses est l’autophagie, un système de dégradation cellulaire homéostatique responsable de la dégradation des organelles cellulaires ou des protéines endommagées ou inutiles[6]. Au cours de l’autophagie, la cargaison cellulaire destinée à être dégradée est enfermée dans un autophagosome, une vésicule à double membrane. L’autophagosome chargé fusionne en douceur avec un lysosome pour former un autolysosome, où le matériel cellulaire livré est dégradé par diverses enzymes hydrolytiques lysosomales. Le processus d’autophagie a fait l’objet de nombreuses recherches. Il est de plus en plus évident que l’altération de l’activité d’autophagie est associée à la formation et à la progression des tumeurs[7-9]. Comme l’autophagie joue un rôle protecteur dans les cellules cancéreuses contre les médicaments chimiothérapeutiques, la suppression de l’autophagie pendant la chimiothérapie a été considérée comme une nouvelle stratégie thérapeutique[10-12

]. Bien que l’efficacité et la faisabilité de la chloroquine dans le traitement du cancer aient été démontrées, les effets secondaires indésirables pourraient constituer un problème pour le traitement clinique. La découverte et l’utilisation d’autres inhibiteurs de l’autophagie dans le traitement du cancer seraient d’une grande importance clinique[13-15]

Le DCA est un agent ciblant les mitochondries qui agit comme un commutateur métabolique, inversant le métabolisme anormal des cellules cancéreuses de la glycolyse anaérobie à l’oxydation aérobie du glucose en réduisant l’activité de la PDK1 mitochondriale et en augmentant la viabilité de la PDH. Ainsi, le DCA augmente les espèces réactives de l’oxygène mitochondrial, induisant ainsi l’apoptose des cellules tumorales malignes sans affecter les cellules normales[16,17]. Cependant, l’action régulatrice du DCA pour l’autophagie dans le cancer du poumon n’est toujours pas claire. Dans cette étude, nous avons démontré que le DCA inhibait la prolifération cellulaire et renforçait l’apoptose des cellules tumorales par la régulation négative de l’autophagie, augmentant ainsi l’efficacité de la mort cellulaire lorsqu’il est utilisé en cotre traitement avec des agents chimiothérapeutiques.

Matériel et méthodes

Culture cellulaire et réactifs
Les cellules A549 d’adénocarcinome pulmonaire humain ont été cultivées dans le milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium avec 10% de sérum bovin fœtal, et les cellules H1975 dans le milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 avec 10% de sérum bovin fœtal dans un incubateur humidifié avec 95% d’air et 5% deCO2 à 37°C. Les lignées cellulaires A549 (TCHu150) et H1975 (TCHu193) ont été achetées auprès de la Library of Typical Culture of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, République populaire de Chine). Après que les cellules se soient développées le long de la paroi de la boîte de culture, de la trypsine à 0,25 % (HyClone, Buckinghamshire, UK) a été utilisée pour les détacher et les sous-cultiver. Les réactifs utilisés dans cette étude étaient le DCA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Paclitaxel (PTX ; Sigma-Aldrich), Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum [CDDP] ; Sigma-Aldrich), adénovirus (GFP-RFP-LC3 ; Hanbio, Shanghai, République populaire de Chine), TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling ; Promega, Fitchburg, WI, USA), APC-Annexin V, iodure de propidium (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA), et kit MTT (Sangon Biotech, Shanghai, République populaire de Chine). Les anticorps étaient LC3-I/II, p62, PARP (tous Abcam, Cambridge, UK), β-actine (Sigma-Aldrich), mTOR/p-mTOR (Sigma-Aldrich), et Ki-67 (Biovisualab, Shanghai, République populaire de Chine).

Microscopie par immunofluorescence
Des cellules (1×105) ont été inoculées dans une plaque à 24 puits et incubées pendant la nuit. Avant l’expérience, les cellules ont été infectées par un adénovirus contenant des structures tandem GFP-RFP-LC3. 24 heures après l’infection, les milieux ont été changés et les cellules ont été traitées avec 25 mM de DCA ou une solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; Sigma Aldrich) pendant 24 heures. Pour l’immunomarquage, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % et lavées avec du PBS. Les cellules ont été incubées avec du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole ; Beyotime Biotechnology, Shanghai, République populaire de Chine) pendant 5 minutes et lavées trois fois avec du PBS. Les lamelles ont été montées sur des lames avec un milieu de montage. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope confocal LSM 780 Meta (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Allemagne) et traitées avec le logiciel fourni par le fabricant.

Test d’apoptose
Des cellules (1×105) ont été inoculées dans une plaque à 24 puits et incubées pendant la nuit. Avant les expériences, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de 25 mM de DCA, d’agent chimiothérapeutique plus DCA ou d’autres réactifs pendant 24 h. Les cellules ont été colorées avec de l’APC-Annexin V et de l’iodure de propidium pour mesurer le taux d’apoptose par cytométrie de flux. Chaque expérience a été répétée trois fois.

Western blot
Les cellules ont été lysées sur glace par traitement avec le tampon de lyse RIPA (Sangon Biotech) avec le cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Halt™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pendant 15 min. Les surnageants ont été recueillis après centrifugation. Les concentrations de protéines ont été mesurées à l’aide du kit de dosage des protéines de l’acide bicinchoninique (BCA) (Beyotime Biotechnology). Les échantillons de protéines ont été électrophorés sur des gels de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 10% et transférés sur une membrane Immobilon PVDF. Les membranes ont été sondées pendant une nuit à 4°C avec l’anticorps primaire indiqué, puis incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort. Les bandes ont été visualisées à l’aide d’un tampon de détection de chimioluminescence (Takara, Shiga, Japon), et l’intensité des bandes a été quantifiée par le logiciel fourni par le fabricant.

Test de viabilité cellulaire
Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 96 puits (1 000 cellules dans 100 µL de milieu de culture/puits). Après le traitement médicamenteux, 10 µL de MTT (0,5 mg/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 4 h. Le milieu a ensuite été éliminé, et les cristaux de formazan ont été solubilisés par l’ajout de DMSO (diméthylsulfoxyde ; Sigma-Aldrich). L’absorbance à 570 nm a été mesurée. Les viabilités cellulaires ont été normalisées par rapport à celles du groupe témoin.

Études de xénogreffes tumorales in vivo
Pour ce test, 5×106 cellules ont été injectées par voie sous-cutanée à des souris nudes (BALB/c, grade Specific pathogen free, 4-5 semaines d’âge, achetées au Model Animal Research Center de l’Université de Nanjing, Nanjing, République populaire de Chine). Lorsque la taille de la tumeur a atteint 100 mm3 (15-20 jours), les souris ont été divisées au hasard en 4 groupes (PBS, PTX, DCA, et PTX plus DCA). La dose de PTX était de 20 mg/kg/j, et la dose de DCA était de 100 mg/kg/j. La longueur et la largeur des tumeurs ont été mesurées tous les deux jours sur leurs deux diamètres perpendiculaires (volume calculé = diamètre le plus court2 × diamètre le plus long/2). Le nombre et les dates de décès des souris ont été enregistrés pour calculer le taux de survie. Toutes les manipulations impliquant des souris vivantes ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital Xinqiao et ont suivi la directive chinoise sur le bien-être et l’éthique des animaux de laboratoire, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

Examen histologique
Toutes les tumeurs ont été réséquées après 24 jours pour un examen histopathologique. Des sections (de 4 à 5-μm d’épaisseur) des tissus tumoraux ont été fixées avec du formol à 10 %, puis détectées avec Ki-67, l’anticorps LC3B et le test TUNEL. Les sections ont été lavées trois fois et traitées à la diaminobenzidine pour le développement de la couleur. Des examens histologiques ont été réalisés, et des photographies ont été prises à l’aide d’un microscope optique NanoZoomer 2.0-RS (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japon).

Analyse statistique
Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Une analyse de variance à sens unique et un test t d’échantillon indépendant ont été utilisés pour analyser la variance. Les courbes de survie ont été obtenues par la méthode de Kaplan-Meier, et les comparaisons ont été effectuées par le test de log-rank. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel statistique SPSS 19.0 (SPSS ; IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Les valeurs P<0,05 ou <0,01 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Le DCA a inhibé l’autophagie dans les cellules d’adénocarcinome pulmonaire
Les protéines cytosoliques LC3 et SQSTM (p62) sont des protéines hautement conservées qui sont considérées comme jouant des rôles essentiels pendant les étapes clés de l’autophagie. Pour étudier le rôle du DCA dans la régulation de l’autophagie, nous avons examiné la localisation cellulaire de LC3 à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les cellules A549 et H1975 ont été infectées par un adénovirus codant pour une construction tandem GFP-RFP-LC3 afin de détecter le changement du flux d’autophagie. Une différence dans la sensibilité au pH peut causer les différents degrés d’accumulation des protéines GFP-LC3 et RFP-LC3 dans les autophagosomes neutres et les autolysosomes acides. Après le traitement avec le HBSS, le nombre de points GFP ou RFP-LC3 a augmenté de manière significative, ce qui démontre que la privation de nourriture induite par le HBSS a favorisé de manière significative le flux d’autophagie dans les cellules A549 et H1975. Cependant, le traitement au DCA a réussi à inhiber l’expression des protéines LC3 par rapport au traitement témoin ou au traitement au HBSS dans les cellules A549 et H1975 (Figure 1A et D, p<0,01).

Figure 1 : Le DCA a inhibé l’autophagie dans les cellules cancéreuses pulmonaires humaines. Notes : (A) Les cellules A549 et (D) les cellules H1975 ont été infectées par un adénovirus GFP-RFP-LC3 et incubées 24 heures avant le traitement au DCA. Après traitement avec 25 mM de DCA pendant 24 h, les cellules ont ensuite été colorées avec du DAPI pour déterminer le noyau. L’expression de LC3 a été analysée par microscopie à fluorescence. Les ponctuations de GFP/RFP-LC3 par cellule ont été analysées par ImageJ. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, *p<0,05, **p<0,01. (B) Les cellules A549 et (E) les cellules H1975 ont été traitées avec 12,5 mM, 25 mM ou 50 mM de DCA pendant 24 h, et (C et F) les cellules ont également été traitées avec HBSS, DCA ou coïncidence pendant 24 h. Ensuite, le niveau de LC3B-II et p62 a été analysé par Western blot. La densité relative des protéines liées à l’autophagie a été estimée et comparée statistiquement, et les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviations : DAPI, 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; DCA, dichloroacétate ; HBSS, Hank’s balanced salt solution ; ns, non significatif.

la protéine p62 s’accumule lorsque l’autophagie est inhibée et diminue lorsque l’autophagie est induite. Une analyse par Western blotting a été réalisée pour examiner les niveaux de protéines de p62 et de LC3-II après un traitement au DCA. Nous avons observé une diminution significative des niveaux de LC3 et une augmentation de p62 après le traitement au DCA d’une manière dépendante de la concentration à la fois dans les cellules A549 et H1975 (Figure 1B et E, p<0,01). L’autophagie a été renforcée pendant l’incubation avec le HBSS, ce qui a été inversé lors d’un traitement conjoint avec le DCA (Figure 1C et F, p<0,01). Ensemble, ces résultats indiquent que le flux autophagique dans les cellules A549 et H1975 a été considérablement inhibé par le traitement au DCA.

L’effet de la promotion de l’autophagie sur la mort cellulaire induite par le DCA
Des recherches systématiques sur les effets anticancéreux du DCA ont été effectuées. Tout d’abord, la capacité anticancéreuse du DCA a été examinée in vitro. Les deux cellules ont été incubées pendant 24 h en présence de différentes concentrations de DCA, et l’apoptose et la viabilité des cellules ont été évaluées. Nous avons observé que la capacité anticancéreuse du DCA, telle que reflétée par l’inhibition de la viabilité cellulaire et les taux d’apoptose, augmentait de manière concentration-dépendante dans les cellules A549 et les cellules H1975 (Figure 2A et B, E et F, p<0,01).

Figure 2 : Le traitement au DCA a induit une mort cellulaire puissante par inhibition de l’autophagie. Notes : (A) Les cellules A549 et (C ) les cellules H1975 ont été traitées avec 12,5 mM, 25 mM ou 50 mM de DCA pendant 24 h. (E et G) Les cellules ont été traitées avec HBSS, DCA ou coïncidence pendant 24 h. Ensuite, l’apoptose cellulaire a été analysée par coloration Annexin V-FITC/PI et cytométrie de flux. Les données relatives à l’apoptose sont présentées en tant que moyenne ± SD de trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01). (B) Les cellules A549 et (D) les cellules H1975 ont été traitées avec différentes concentrations de DCA (F et H) ou traitées avec du HBSS, du DCA ou une coïncidence avec du HBSS plus du DCA. La viabilité cellulaire a ensuite été déterminée par le test MTT. Les données sont présentées comme la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviations : DCA, dichloroacétate ; FITC/PI, isothiocyanate de fluorescéine/iodure de propidium ; HBSS, Hank’s balanced salt solution.

Le DCA a activé le commutateur métabolique qui a inversé le métabolisme anormal des cellules cancéreuses, passant de la glycolyse anaérobie à l’oxydation du glucose, ce qui a entraîné un dysfonctionnement des mitochondries et la mort cellulaire. Nos expériences préliminaires ont montré que l’autophagie était considérablement inhibée par le traitement au DCA. Pour déterminer si l’inhibition de l’autophagie médiée par le DCA était impliquée dans l’apoptose, les cellules A549 et H1975 ont été traitées avec du DCA après avoir reçu du HBSS pendant 24 h. L’apoptose cellulaire induite par le DCA était inhibée lorsque les cellules étaient coexposées au HBSS par rapport au traitement DCA seul. Outre la modification du métabolisme anormal, ce résultat confirme que le DCA peut également activer la mort cellulaire en inhibant l’autophagie dans les cellules cancéreuses. Les résultats de la viabilité cellulaire sont conformes à cette conclusion (figure 2C et D, G et H, p<0,05).

L’inhibition de la voie AKT a diminué l’apoptose induite par le DCA
La voie ATK-mTOR a été considérée comme jouant un rôle critique dans la régulation de l’autophagie dans des études antérieures[18-21]. La perifosine[22 ], un réactif chimique empêchant la phosphorylation et l’activation d’AKT, a été utilisée pour étudier si la voie ATK-mTOR est impliquée dans le processus d’inhibition de l’autophagie du DCA. Les cellules ont été cotraitées avec du DCA et de la perifosine pendant 24 h. L’apoptose cellulaire a été presque réduite de moitié dans le groupe de coexistence par rapport au groupe de traitement par DCA, ce qui est cohérent avec les tests de viabilité cellulaire (Figure 3A et B, D et E, p<0,05). Ensuite, nous avons examiné les niveaux des protéines cruciales liées à l’apoptose, PARP et procaspase3. La phosphorylation de l’AKT a été inhibée et les niveaux des protéines liées à l’apoptose ont été significativement réduits dans le groupe de co-traitement (Figure 3C, p<0,05). Ces résultats ont également été obtenus dans les cellules H1975 (Figure 3F, p<0,05).

Figure 3 La voie AKT inhibée diminue la mort cellulaire. Notes : (A) Les cellules A549 et (D) les cellules H1975 ont été traitées avec Perifosine, DCA, ou coïncubation avec DCA plus Perifosine pendant 24 h. Ensuite, l’apoptose cellulaire a été analysée. Les données sont présentées comme la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01). Après traitement par Perifosine, DCA ou coïncubation, (B et E) la viabilité cellulaire a été déterminée par le test MTT. Les expressions des protéines cruciales liées à l’apoptose et des protéines liées à la voie AKT-mTOR des cellules A549 (C ) et des cellules H1975 (F) ont été analysées par Western blot. Les comparaisons des intensités ont été estimées statistiquement et sont présentées comme la moyenne ± SD pour trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviation : DCA, dichloroacétate.

LeDCA augmente la sensibilité du PTX et du CDDP en inversant l’autophagie induite par la chimiothérapie
L’inhibition de l’autophagie est considérée comme une nouvelle stratégie pour améliorer la sensibilité des chimiothérapies[23,24]. Pour étudier si le cotraitement avec le DCA et un agent chimiothérapeutique exerce un effet synergique pour supprimer la croissance cellulaire, des cellules A549 ont été cotraitées avec du DCA et du PTX ou du CDDP. Comme le montrent les figures 4A-C, le traitement par des agents chimiothérapeutiques et le DCA a augmenté les niveaux d’apoptose par rapport au traitement médicamenteux seul ou en association avec le CQ, et les résultats étaient cohérents avec les tests de viabilité cellulaire (p<0,05). Pour déterminer si le DCA peut diminuer l’autophagie induite par le PTX, les cellules ont été traitées par le PTX et le DCA pendant 24 heures et récoltées pour le Western blotting. Les niveaux des protéines liées à l’autophagie ont été examinés. L’expression de LC3 a été nettement augmentée par le traitement au PTX, et elle a été significativement diminuée en cas de co-traitement avec le DCA. Le niveau de la protéine critique liée à l’apoptose, PARP, a été significativement réduit après le co-traitement (Figure 4D-F, p<0,05). Tous ces résultats indiquent que le DCA diminue la résistance des cellules A549 au PTX en inhibant l’autophagie.

Figure 4 : Le DCA a diminué la résistance aux médicaments des cellules tumorales en inhibant l’autophagie. Notes : Les cellules ont été traitées avec du DCA, du CQ, des produits chimiothérapeutiques (PTX ou CDDP) ou une coïncidence (DCA ou CQ plus produits chimiothérapeutiques). Ensuite, les tests d’apoptose cellulaire (A et B) et de viabilité cellulaire (C) ont été analysés. Les données sont présentées comme la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01). (D) Les cellules ont été traitées par PTX, DCA ou coïncubation avec DCA et PTX pendant 24 heures, puis les expressions des protéines cruciales liées à l’apoptose, des protéines liées à la voie AKT-mTOR et des protéines liées à l’autophagie ont été analysées par Western blot. (E et F) Les comparaisons des intensités de p-AKT et de PARP ont été estimées statistiquement et sont présentées comme la moyenne ± SD pour trois expériences indépendantes (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviations : CDDP, cis-diamminedichloroplatine ; CQ, chloroquine ; DCA, dichloroacétate ; PTX, paclitaxel.

LeDCA a potentialisé l’efficacité anticancéreuse du PTX in vivo en inhibant l’autophagie
Étant donné que la co-traitance des cellules avec le PTX et le DCA a augmenté le taux de mort cellulaire in vitro par rapport au traitement avec l’un ou l’autre médicament seul, nous avons également évalué l’efficacité in vivo de la thérapie combinée du DCA et du PTX dans un modèle de tumeur xénogreffe de souris. Une fois que la taille de la tumeur xénogreffée sous-cutanée a atteint 150 mm3, les souris ont été séparées en quatre groupes : contrôle, DCA, PTX, et DCA plus PTX. L’administration de PTX seul n’a pas inhibé de manière significative la croissance de la tumeur, mais le traitement avec PTX plus DCA a clairement inhibé la croissance de la tumeur et a prolongé la survie des souris (Figure 5A, et B, p<0,05). Comme le montre la figure 5C, le temps de doublement de la tumeur des cellules A549 a augmenté de manière significative, passant de 3 jours dans le groupe témoin à 10 jours dans le groupe traité conjointement (p<0,05), et le temps de doublement de la tumeur des cellules H1975 a augmenté de 2,6 à 7,5 jours (figure 5D-F, p<0,05). Ces résultats indiquent que le DCA peut améliorer l’efficacité anticancéreuse in vivo du PTX.

Figure 5 : Inhibition synergique de la prolifération chez les souris traitées par le PTX et le DCA. Notes : 5×106 cellules A549 ou cellules H1975 ont été implantées dans des souris nude. Lorsque le volume de la xénogreffe de tumeur sous-cutanée a atteint 100 mm3, les souris ont été séparées en quatre groupes : contrôle, DCA, PTX, et DCA plus PTX. Ensuite, les souris ont été injectées chaque jour par voie intrapéritonéale avec du DCA (100 mg/kg/j) plus du PTX (20 mg/kg/j) ou chacun séparément, en utilisant du PBS comme contrôle. (A et D) La courbe de croissance des volumes tumoraux a été suivie tous les 3 jours (*p<0,05, **p<0,01). (B et E) Courbes de survie des souris. Les données ont été analysées par le test log-rank. (C et F) Temps de doublement des tumeurs. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviations : DCA, dichloroacétate ; PTX, paclitaxel.

Le traitement par DCA plus PTX a inhibé de manière significative la germination des tumeurs
Pour étudier si le traitement combiné par DCA et PTX entraînait des changements morphologiques caractéristiques de l’apoptose dans les cellules A549 in vivo, toutes les tumeurs ont été récupérées au jour 24, sectionnées, colorées par TUNEL et analysées par immunohistochimie. On a observé une augmentation minime du nombre de cellules positives au TUNEL dans les groupes traités par le DCA ou le PTX par rapport au groupe témoin. Cependant, la proportion de cellules TUNEL-positives dans le groupe de cotretraitement a augmenté de façon spectaculaire par rapport au groupe témoin ou aux groupes de traitement unique (figure 6A).

Figure 6 : Examen immunohistochimique de l’apoptose et de la prolifération tumorales. Notes : (A) Au jour 24, toutes les tumeurs ont été isolées pour un examen histopathologique avec des tests de coloration TUNEL, Ki-67 et LC3B (barre d’échelle = 200 μm). (B) Le ratio de noyaux Ki-67 positifs a été analysé et est présenté sous forme de moyenne ± SD (*p<0,05, **p<0,01).
Abréviations : DCA, dichloroacétate ; PTX, paclitaxel.

Nous avons ensuite examiné l’expression du Ki-67, lié à la prolifération, et de la protéine d’autophagie cruciale LC3B dans les tumeurs par coloration immunohistochimique. L’expression de Ki-67 chez les souris témoins était significativement plus élevée, alors que son expression était fortement réduite dans les tumeurs des animaux recevant le traitement combiné, et l’expression de LC3B était la même que celle de Ki-67. En conclusion, le traitement par DCA plus PTX a significativement augmenté l’apoptose et réduit l’expression de Ki-67 et LC3B in vivo (Figure 6A et B, p<0,01).

Discussion

Avec le développement de la recherche sur le cancer, un nombre croissant de stratégies thérapeutiques ont été appliquées au traitement du cancer du poumon[25-27]. Bien que de nombreux patients atteints de cancer du poumon, en particulier au stade avancé ou progressif, aient bénéficié de l’EGFR-TKI et de l’anticorps PD-1, leur coût est exorbitant pour la plupart des patients. La chimiothérapie conventionnelle reste la principale approche pour traiter le cancer du poumon avancé en Chine. Cependant, la multirésistance aux médicaments est un obstacle difficile à surmonter dans le traitement du cancer ; c’est pourquoi la recherche actuelle se concentre sur la recherche de nouveaux moyens d’améliorer la sensibilité à la chimiothérapie ou de retarder la résistance aux médicaments. Récemment, la régulation de l’autophagie a été considérée comme une cible pour la thérapie anticancéreuse ; de nombreuses preuves ont indiqué que l’inhibition de l’autophagie peut favoriser l’effet suppresseur de tumeurs des chimiothérapies et radiothérapies.[En général, la plupart des carcinomes solides génèrent de l’énergie par la voie glycolytique, qu’il y ait ou non une quantité suffisante d’oxygène ; c’est ce qu’on appelle  » l’effet Warburg « 

[29-31] Le DCA, une petite molécule antitumorale, peut inverser ce mode métabolique des mitochondries, de la respiration anaérobie à la respiration aérobie, provoquant ainsi la mort des cellules tumorales. Cependant, on ignore si le DCA peut être utilisé en combinaison avec d’autres chimiothérapies. Dans cette étude, nous avons constaté que le cotretraitement avec le DCA et le PTX peut être plus efficace pour supprimer la croissance des cellules cancéreuses du poumon in vitro et in vivo. Le DCA a inhibé l’autophagie protectrice employée par les cellules cancéreuses en réponse au traitement par le PTX en activant la phosphorylation de l’AKT et en favorisant la mort cellulaire. L’effet synergique de ces deux agents renforce la mort cellulaire, inhibant ainsi plus efficacement la croissance tumorale.

Comme nous le savons, le métabolisme cellulaire est une cible efficace pour le traitement du cancer,[32] et des preuves accumulées ont démontré les propriétés antitumorales du DCA dans le métabolisme cellulaire. Cependant, les effets du DCA sont controversés, car différents résultats ont été rapportés dans différents modèles de cancer[33,34]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l’association du DCA et du PTX était plus efficace pour inhiber la prolifération cellulaire et renforcer l’apoptose que le PTX seul. Dans le modèle de xénogreffe tumorale sous-cutanée utilisé dans cette étude, le traitement par DCA plus PTX a réduit de 60 % la croissance des cellules A549 injectées dans les souris. Nos données montrent que le DCA exerce de puissants effets anticancéreux et agit en synergie avec le PTX sur les cellules A549. Une polychimiothérapie qui agit en synergie peut améliorer l’efficacité thérapeutique en diminuant la toxicité et la résistance aux médicaments[35]. Dans nos expériences, le DCA a inversé la polyrésistance des cellules A549 en inhibant l’autophagie induite par le PTX et en induisant l’apoptose. Par conséquent, l’ajout du DCA au régime de chimiothérapie pourrait diminuer la perniciosité de la résistance multiple aux médicaments dans le CBNPC.

L’autophagie est une voie métabolique hautement conservée dans laquelle les cellules livrent des protéines séniles ou défectueuses, des organelles et d’autres composants cellulaires aux lysosomes pour qu’ils soient dégradés afin de maintenir l’homéostasie cellulaire[36,37]. De nombreuses preuves montrent que la plupart des agents chimiothérapeutiques ainsi que les rayonnements ionisants induisent l’autophagie, ce qui conduit à la résistance aux médicaments multiples. L’adaptation de l’autophagie facilite la survie des cellules tumorales dans un microenvironnement de stress métabolique accru ou de toxicité médicamenteuse. L’autophagie induite par le stress est une stratégie de protection importante qui peut maintenir la survie des cellules, ce qui entraîne finalement une résistance aux médicaments dans divers types de cellules tumorales[38

]. Dans cette étude, le traitement au DCA a inhibé l’autophagie cellulaire et favorisé l’apoptose. Le RARA, un activateur de l’autophagie, peut rendre les cellules plus résistantes au DCA, ce qui indique que le DCA provoque la mort cellulaire en perturbant le métabolisme des cellules cancéreuses et en inhibant l’autophagie. La voie PI3K-AKT-mTOR est un important régulateur négatif de l’autophagie. Par conséquent, le ciblage de la signalisation PI3K-AKT-mTOR peut constituer une nouvelle stratégie de traitement du cancer. Le DCA favorise sélectivement la phosphorylation de la kinase AKT, inhibant ainsi l’autophagie. Ainsi, l’activation de la voie PI3K-AKT-mTOR par le DCA inhibe l’autophagie induite par le PTX. Le traitement par EGFR-TKIs serait lié au niveau d’autophagie des cellules de cancer du poumon, et l’inhibition de l’autophagie pourrait faciliter les effets antitumoraux des EGFR-TKIs. Il pourrait s’agir d’un nouveau point focal du traitement du cancer du poumon.

Cependant, certains chercheurs affirment que l’autophagie est une « arme à double tranchant » pour les cellules cancéreuses, et qu’elle peut supprimer la survie et la prolifération dans le microenvironnement tumoral[26,39,40]. En outre, l’induction de l’autophagie dans le cancer a également été considérée comme une stratégie de sensibilisation à la chimiothérapie. Les différentes fonctions de l’autophagie dans les cellules cancéreuses pourraient être causées par les différents statuts des cellules cancéreuses ou des types de tumeurs ; ainsi, la compréhension des fonctions sous-jacentes de la régulation de l’autophagie entre les différentes cellules cancéreuses apportera un nouvel éclairage sur la désignation de la stratégie contre la résistance à la chimiothérapie[24]

Il est intéressant de noter que le DCA semble avoir des caractéristiques doubles de régulation de l’autophagie dans différentes cellules tumorales. Lin et al[33] ont signalé que le DCA peut induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses colorectales tout en renforçant l’autophagie en même temps. Il s’ensuit qu’un mécanisme moléculaire plus complexe est impliqué dans la régulation de l’autophagie par le DCA. L’exploration du principe des différents effets du DCA sur l’autophagie nous fournirait de nouvelles idées pour concevoir de nouveaux médicaments de chimiothérapie adjuvante par l’inhibition de l’autophagie.

Conclusion

Nos données ont montré que l’autophagie peut être activée pendant la chimiothérapie, et que l’inhibition de l’autophagie par le DCA peut faciliter la mort cellulaire et améliorer la sensibilité des cellules tumorales aux médicaments de chimiothérapie. En outre, l’autophagie et le métabolisme du cancer ont été impliqués dans une série d’événements tumoraux, tels que le développement de la tumeur, la progression de la tumeur et la chimiothérapie. L’élucidation de la relation entre l’autophagie et le métabolisme[32] dans différentes cellules cancéreuses pourrait nous fournir de nouvelles opportunités pour concevoir des médicaments ciblant ces événements cellulaires importants contre le cancer et la résistance aux médicaments.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81702247) et le projet de science fondamentale et de technologie de pointe de Chongqing pour Zheng (cstc2017jcyjAX0048), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Dai (81472188), et le projet de recherche clinique de l’hôpital Xinqiao pour Yu (2015YLC21).

Divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans le cadre de ce travail.

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