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Sven de Mey 1, Inès Dufait 1, Heng Jiang 1, Cyril Corbet 2, Hui Wang 1, Melissa Van De Gucht 1, Lisa Kerkhove 1, Ka Lun Law 1, Hugo Vandenplas 3, Thierry Gevaert 1, Olivier Feron 2 et Mark De Ridder 1,*

1 Département de Radiothérapie, Universitair Ziekenhuis Brussel, Vrije Universiteit Brussel, 1090 Bruxelles, Belgique ; [email protected] (S.d.M.) ; [email protected] (I.D.) ; [email protected] (H.J.) ; [email protected] (H.W.) ; [email protected] (M.V.D.G.) ; [email protected] (L.K.) ; [email protected] (K.L.L.) ; [email protected] (T.G.))
2 Pôle de Pharmacologie et Thérapeutique (FATH), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), UCLouvain, 1200 Bruxelles, Belgique ; [email protected] (C.C.) ; [email protected] (O.F.)
3 Département d’Oncologie Médicale, Universitair Ziekenhuis Brussel, Vrije Universiteit Brussel, 1090 Bruxelles, Belgique ; [email protected]

Correspondance : [email protected]

Reçu : 14 septembre 2020
Accepté : 4 décembre 2020
Publié : 9 décembre 2020

Résumé

Le métabolisme mitochondrial est une cible attrayante pour la thérapie du cancer. La reprogrammation des voies métaboliques peut potentiellement sensibiliser les tumeurs dont les options de traitement sont limitées, comme le cancer du sein triple négatif (TNBC), à la chimio et/ou à la radiothérapie. Le dichloroacétate (DCA) est un inhibiteur spécifique de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK), qui entraîne une production accrue d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Les ROS sont les principales molécules effectrices des radiations et une augmentation de celles-ci augmente la réponse aux radiations. Dans cette étude, nous avons évalué les effets du DCA et de la radiothérapie sur deux lignées cellulaires TNBC, à savoir EMT6 et 4T1, dans des conditions aérobies et hypoxiques. Comme prévu, le traitement au DCA a diminué la pyruvate déshydrogénase (PDH) phosphorylée et a réduit le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et la production de lactate. Fait remarquable, le traitement au DCA a entraîné une augmentation significative de la production de ROS (jusqu’à 15 fois) dans les cellules cancéreuses hypoxiques mais pas dans les cellules aérobies. De manière cohérente, le DCA a radiosensibilisé les cellules tumorales hypoxiques et les sphéroïdes 3D tout en laissant inchangée la radiosensibilité intrinsèque des cellules tumorales. Nos résultats suggèrent que, bien que décrit comme un médicament favorisant la phosphorylation oxydative (OXPHOS), le DCA peut également augmenter les radiosensibilités hypoxiques. Cette étude ouvre donc la voie au ciblage du métabolisme mitochondrial des cellules cancéreuses hypoxiques, notamment pour lutter contre la radiorésistance.


Mots clés : dichloroacétate ; radiosensibilité hypoxique ; cancer du sein ; espèces réactives de l’oxygène

2020 par les auteurs. Licencié MDPI, Bâle, Suisse. Cet article est un article en accès libre distribué selon les termes et conditions de la licence Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).


INTRODUCTION

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le monde et entraîne chaque année 627 000 décès [1]. Au cours des dernières décennies, des progrès significatifs ont été réalisés dans le traitement du cancer du sein. Cependant, seules des thérapies limitées sont disponibles pour les patientes atteintes de cancers du sein triple négatif/basal-like [2,3,4]. La norme de soins pour le traitement des cancers du sein à haut risque consiste en une chimiothérapie et une chirurgie néoadjuvantes, suivies d’une irradiation postopératoire de tout le sein et de la paroi thoracique. Aujourd’hui, les chercheurs se concentrent sur l’hypofractionnement de la radiothérapie adjuvante (essai FAST-Forward [5]) ou sur la combinaison de la chimiothérapie avec la radiothérapie préopératoire. L’approche de la radiothérapie préopératoire pourrait améliorer la survie sans maladie et la qualité de vie [6,7,8,9,10,11].

Le principal effet des rayonnements, en particulier des rayonnements à faible transfert d’énergie linéaire, est l’induction d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Pendant la radiothérapie, les ROS sont créés par la radiolyse de l’eau dans les environnements extracellulaires, qui sont toxiques pour les cellules tumorales et les tissus normaux voisins. Environ deux tiers des dommages à l’ADN induits par les rayonnements sont attribués aux ROS dans les cellules de mammifères [12]. La réponse des cellules aux lésions de l’ADN induites par les rayonnements dépend fortement de la présence d’oxygène. Les molécules d’oxygène peuvent en effet réparer les dommages à l’ADN produits par les radicaux libres. C’est ce qu’on appelle « l’hypothèse de la fixation de l’oxygène » [12,13]. En l’absence d’oxygène, les radicaux d’ADN sont réduits par des composés contenant des groupes sulfhydryles, qui réparent l’ADN dans sa forme originale. Selon cette hypothèse, l’hypoxie, définie par de faibles niveaux d’oxygène dans la tumeur, est l’une des principales causes d’échec clinique de la radiothérapie [14,15]. L’hypoxie est une caractéristique commune du microenvironnement tumoral. Les ROS et l’hypoxie sont deux facteurs ayant des effets opposés sur la radioréponse de la tumeur [16]. Selon l’hypothèse généralement admise, le stress oxydatif est moindre dans les régions hypoxiques de la tumeur en raison de la pénurie d’oxygène, substrat des ROS. Cependant, des preuves récentes ont révélé que dans des conditions hypoxiques, les cellules génèrent plus de ROS, principalement via le métabolisme mitochondrial [17,18,19,20].

L’une des caractéristiques des cellules tumorales est leur capacité à modifier leur métabolisme, en leur fournissant l’énergie et les métabolites nécessaires à leur croissance et à leur survie dans des conditions de limitation des nutriments et de l’oxygène. Cependant, en présence d’O2, les cellules cancéreuses adaptent également leur métabolisme à la glycolyse, en détournant l’oxydation mitochondriale du pyruvate vers la production de lactate [21,22]. Cet effet est connu sous le nom d’effet Warburg. Des rapports récents indiquent que l’effet Warburg est impliqué dans la résistance au stress cytotoxique induit par la chimiothérapie ou la radiothérapie [23,24,25,26,27]. Ainsi, les méthodes de traitement qui bloquent ou réduisent le métabolisme glycolytique peuvent augmenter la sensibilité des cellules tumorales à la radiothérapie.

Dans des conditions hypoxiques, le facteur inductible de l’hypoxie 1-alpha (HIF1α) provoque une augmentation de l’expression des pyruvate déshydrogénase kinases (PDK1-4) [28]. Ces enzymes sont responsables du changement de métabolisme dans les mitochondries en régulant l’état de phosphorylation (c’est-à-dire l’état d’activité) de la pyruvate déshydrogénase (PDH), qui est une protéine de barrière majeure entre la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS). Le dichloroacétate (DCA), une petite molécule inhibitrice de la PDK, peut inverser l’effet Warburg en activant la PDH et en réorientant le métabolisme du pyruvate vers la mitochondrie. L’inhibition de la PDK par le DCA est utilisée pour traiter l’acidose lactique et les maladies mitochondriales héréditaires [29,30]. Dans l’ensemble, ces observations ont conduit à considérer le DCA comme un médicament anticancéreux potentiel [30,31].

Il a été démontré que le DCA améliore la radiosensibilité des cellules cancéreuses du côlon et de la prostate ainsi que des tumeurs du carcinome épidermique de l’œsophage et du glioblastome [32,33,34,35]. Aucune recherche similaire n’a encore été menée sur les cellules du cancer du sein. Le principal mécanisme de radiosensibilisation dans ces modèles a été attribué au stress oxydatif. En même temps, l’arrêt du cycle cellulaire à la phase G2-M et une capacité de réserve mitochondriale réduite ont également contribué aux effets de radiosensibilisation. Sur la base des résultats décrits précédemment, deux essais cliniques (l’un sur le carcinome de la tête et du cou et l’autre sur le glioblastome) portant sur les effets antitumoraux de la combinaison du DCA et de la radiothérapie sont actuellement en cours [36,37]. Toutes les recherches précliniques ont été réalisées dans des conditions aérobies, mais aucune donnée sur les effets du traitement par DCA dans des conditions hypoxiques n’est disponible. Par conséquent, dans la présente étude, nous avons d’abord examiné l’hypothèse selon laquelle le DCA réduit le lactate et fait passer le métabolisme d’un phénotype glycolytique à une OXPHOS. Ensuite, nous avons déterminé si le DCA peut radiosensibiliser les cellules cancéreuses hypoxiques du sein et nous avons examiné les mécanismes sous-jacents. Les résultats de cette étude peuvent avoir des implications importantes pour les essais cliniques visant à utiliser les inhibiteurs de la PDK pour améliorer la radioréponse des patientes atteintes d’un cancer du sein.

Résultats

L‘expression élevée de PDK1 et PDK3 dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) et dans le cancer du sein basal est corrélée à une signature génétique liée à l’hypoxie
Tout d’abord, en utilisant le cBioPortal for Cancer Genomics en ligne et accessible au public, nous avons analysé les niveaux d’ARNm des quatre différents isomères de PDK, à savoir PDK1, PDK2, PDK3 et PDK4, dans des données issues de patients provenant de l’ensemble de données sur les tumeurs primaires du cancer du sein TCGA (PanCancer Atlas and Cell 2015) [38,39]. Nous avons montré un gain significatif (p < 0,0001) dans l’expression de PDK1 et PDK3 dans le TNBC par rapport au non-TNBC et dans les cancers du sein de type basal par rapport aux autres sous-types tels que les cancers du sein luminaux A, luminaux B et enrichis en HER2 (Figure 1a-c). Notamment, l’augmentation de PDK1 et PDK3 chez les patientes atteintes d’un cancer du sein pourrait être corrélée à des scores d’hypoxie Ragnum et Buffa plus élevés [40,41] (Figure 1d). Ces scores d’hypoxie sont basés sur l’expression différentielle de gènes spécifiques liés à l’hypoxie et peuvent être consultés gratuitement sur le portail cBioPortal for Cancer Genomics. La régulation à la hausse observée de PDK1 et PDK3 dans les cancers du sein de type basal et leur corrélation avec un phénotype hypoxique (qui est lié à l’activation d’un programme transcriptionnel dépendant de HIF1α), suggère que l’utilisation d’inhibiteurs de PDK pourrait servir de modalité thérapeutique attrayante à des fins de radiosensibilisation hypoxique [42,43,44].

Figure 1. L’expression régulée à la hausse de l’ARNm de PDK1 et PDK3 est corrélée aux signatures génétiques liées à l’hypoxie dans les cancers du sein triple négatif et basal-like.(a) Expression de l’ARNm de PDK1-4 (RNA-seq) dans les cas de cancer du sein non triple négatif (non TNBC) par rapport aux cas TNBC.(b) Expression de l’ARNm PDK1-4 (RNA-seq) dans différents sous-types de cancer du sein classés par la classification Pam50 de l’ensemble de données TCGA (luminal A, luminal B, HER2+ et Basal).(c) Nombre d’échantillons dans le jeu de données TCGA qui ont un z-score de z > 2 pour PDK1-4 dans différents sous-types de cancer du sein classés par le système de classification Pam50.(d) Le score d’hypoxie de Buffa (à gauche) et le score d’hypoxie de Ragnum (à droite) sont en corrélation avec la surexpression(z >2) de l’ARNm PDK1-4. **** p < 0.0001.

Le DCA a diminué la PDH phosphorylée, les niveaux de lactate extracellulaire et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR)
Nous avons commencé nos expériences in vitro en effectuant des tests de viabilité (Figure S1a,b) afin de déterminer les propriétés d’inhibition de la croissance du DCA. Le DCA a réduit la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante dans les cellules cancéreuses EMT6 et 4T1, indépendamment de l’état de l’O2 (figure S1a). Un test de prolifération a également montré que l’augmentation des concentrations de DCA nous a permis d’observer un passage d’un retard de croissance à des effets cytostatiques et même cytotoxiques (figure S1b).

Ensuite, nous avons étudié l’influence du DCA sur l’activité de PDK1-4 et le métabolisme des cellules TNBC. La PDH est une protéine clé de la glycolyse et de l’OXPHOS mitochondriale, ce qui signifie que la PDH catalyse la décarboxylation du pyruvate en acétyl-CoA, qui limite le taux. La PDH est inhibée par phosphorylation (sur Ser293) par la PDK, et cette inhibition peut être inversée par déphosphorylation par la phosphatase de la pyruvate déshydrogénase (PDP) [45,46] (Figure 2a). À des doses de toxicité acceptables (30 mM, 45 mM et 60 mM), nous avons évalué l’effet du DCA sur l’activité de la PDK en mesurant les niveaux de PDH phosphorylée (p-PDH), le lactate dans le milieu extracellulaire et l’ECAR des cellules en temps réel (Figure 2b-e). Les trois doses de DCA ont diminué la quantité de p-PDH dans les cellules EMT6 et 4T1 de manière dose-dépendante dans des conditions oxygénées et hypoxiques. La diminution de la p-PDH était significative pour toutes les doses de DCA dans les cellules EMT6, alors que dans les cellules 4T1, seules 45 mM et 60 mM ont diminué significativement la p-PDH dans des conditions hypoxiques (figure 2b,c). En évaluant l’effet de doses plus faibles de DCA, nous avons constaté que la quantité de p-PDH commence à diminuer dans les cellules EMT6 lorsqu’elles sont traitées avec 3 mM de DCA et dans les cellules 4T1 lorsqu’elles sont traitées avec 10 mM de DCA (Figure S2a,b). La quantité de lactate dans le milieu était élevée dans des conditions hypoxiques par rapport à des conditions aérobies dans les deux lignées cellulaires, soutenant une augmentation nette du renouvellement glycolytique dans les cellules privées dO2 [47,48]. En accord avec les résultats du Western blot, le traitement au DCA a conduit à une diminution dose-dépendante du lactate dans le milieu pour les deux lignées cellulaires (Figure 2d). Bien que la réduction de la libération de lactate ait été spectaculaire dans des conditions aérobies, une réduction dose-dépendante de la production du produit final glycolytique a également été observée en hypoxie. Enfin, le DCA, à une dose de 7,5 mM, a provoqué une réduction dépendante du temps de l’ECAR à la fois chez EMT6 et 4T1 (figure 2e). La chute initiale de l’ECAR après le traitement avec des doses inférieures à 30 mM de DCA a été compensée après 2,5 h chez EMT6. Chez 4T1, nous avons observé le même effet avec des doses de DCA inférieures à 15 mM. Ces résultats indiquent que le traitement de lignées cellulaires murines TNBC par le DCA inhibe la phosphorylation de la PDH et réduit l’ampleur de la glycolyse, tant dans des conditions aérobies qu’hypoxiques.

Figure 2. Le dichloroacétate (DCA) diminue la pyruvate déshydrogénase (PDH) phosphorylée, le lactate dans le milieu extracellulaire et l’ECAR des cellules TNBC.(a) Schéma montrant l’influence du DCA sur les kinases de la pyruvate déshydrogénase (PDK) et les effets en aval.(b) Western blot représentatif de la p-PDH (Ser293) et de la PDH totale dans les cellules 4T1 et EMT6 après traitement au DCA (30 mM, 45 mM et 60 mM) dans des conditions aérobies et hypoxiques.(c) Expression relative normalisée de p-PDH (Ser293) dans les cellules 4T1 et EMT6 après traitement au DCA (30 mM, 45 mM et 60 mM) dans des conditions aérobies et hypoxiques.(d) Après traitement au DCA avec les concentrations indiquées dans des conditions aérobies ou hypoxiques, le lactate a été mesuré avec le dosage du L-lactate.(e) L’ECAR des cellules EMT6 et 4T1 a été mesuré au fil du temps après l’injection des concentrations indiquées de DCA à l’aide de l’analyseur Seahorse. Le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) a été exprimé en pourcentage par rapport au contrôle. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Le DCA induit la production de ROS dans les cellules cancéreuses hypoxiques
L’inhibition de la PDK et l’activation de la PDH sont associées à l’augmentation des ROS intracellulaires [49,50]. Les ROS sont d’une importance capitale dans la production de dommages à l’ADN après irradiation. Nous avons examiné les niveaux de ROS dans les cellules EMT6 et 4T1 dans des conditions aérobies et hypoxiques en utilisant la sonde CM-H2DCFDA. Comme le montre la figure 3a,b, le DCA a déclenché une production de ROS dose-dépendante dans les cellules EMT6 et 4T1. Dans des conditions aérobies, seule la dose la plus élevée (60 mM) de DCA a généré une augmentation significative des ROS jusqu’à cinq fois par rapport au contrôle pour les cellules EMT6. Dans les cellules 4T1, aucune régulation significative des ROS n’a été détectée dans des conditions aérobies. L’ajout de N-acétyl-cystéine (NAC), un piégeur de ROS, a permis de contrecarrer partiellement la régulation des ROS. Dans des conditions hypoxiques, nous avons démontré une augmentation dose-dépendante des ROS atteignant jusqu’à 15 fois dans les cellules EMT6 et jusqu’à 5 fois dans les cellules 4T1 ; la plus faible dose de DCA a en fait conduit à une augmentation significative des ROS sur les deux types de cellules (Figure 3b).

Nous avons pensé que la production accrue de ROS sous hypoxie pouvait résulter des effets combinés de l’altération de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale (due à la réduction de l’O2 comme accepteur final d’électrons) et du métabolisme oxydatif du pyruvate induit par le DCA. En utilisant l’analyseur Seahorse, nous avons constaté que le DCA n’avait aucun impact sur la respiration basale et la production d’ATP, mais qu’il diminuait de manière significative la capacité respiratoire maximale des cellules tumorales EMT6 et 4T1 (figure 3c). Une autre possibilité est que le DCA augmente les niveaux de NAD(P)H, ce qui est lié à une production accrue de ROS. Nous avons constaté que dans des conditions aérobies, le traitement au DCA entraînait une augmentation dose-dépendante du NAD(P)H dans les cellules EMT6 et 4T1 (figure 3d). Dans des conditions hypoxiques, nous avons démontré une possible augmentation du NAD(P)H dans les cellules EMT6 traitées avec 60 mM de DCA, mais aucune augmentation dans les cellules 4T1 (figure 3d). Avec les données ROS ci-dessus, ces résultats suggèrent que, bien que le métabolisme mitochondrial soit toujours préservé, une augmentation locale de la production de ROS lors de l’exposition au DCA peut altérer l’intégrité et la fonction des mitochondries.

Figure 3. Le DCA induit la production de ROS dans les cellules hypoxiques en surchargeant le métabolisme mitochondrial. Des cellules EMT6 et 4T1 ont été traitées au DCA pendant la nuit aux concentrations indiquées, et de la N-acétyl-cystéine (NAC) (10 mM) a été ajoutée 1 h avant et pendant le traitement. La génération de ROS a été mesurée par cytométrie de flux en utilisant la sonde CM-H2DCFDA dans des conditions aérobies(a) et hypoxiques(b).(c) Les mesures du taux de consommation d’oxygène (OCR) ont été obtenues au fil du temps par un analyseur Seahorse en utilisant le test de stress mitochondrial. Pour extraire des informations détaillées sur la chaîne de transport des électrons dans les mitochondries, des inhibiteurs spécifiques composés d’oligomycine, de FCCP, de roténone et d’antimycine A ont été ajoutés séquentiellement. Le RCO mitochondrial basal, le RCO lié à l’ATP et le RCO maximal ont été calculés à partir de ces résultats.(d) Le NAD(P)H a été mesuré par cytométrie en flux en utilisant un capteur de NAD(P)H JZL1707 dans des conditions aérobies et hypoxiques. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

LeDCA radiosensibilise les cellules hypoxiques par l’intermédiaire des ROS
Nous avons d’abord examiné la radiorésistance des cellules induite par l’hypoxie. Nous avons constaté une radioréponse gravement altérée en comparant les conditions hypoxiques aux conditions aérobies, avec un rapport de renforcement de l’oxygène de 2,7 et 2,3 pour les cellules tumorales EMT6 et 4T1, respectivement (figure 4a). Dans ce contexte, nous avons observé que le traitement au DCA provoquait un petit effet de radiosensibilisation intrinsèque dans les cellules EMT6 mais pas dans les cellules 4T1 (figure 4b). Il est intéressant de noter que, conformément aux résultats de la génération de ROS dans des conditions hypoxiques, le DCA 60 mM a surmonté de manière significative (p < 0,05) la radiorésistance hypoxique avec des rapports d’amélioration de 2,3 et 1,5 à 60 mM pour les cellules tumorales EMT6 et 4T1, respectivement (figure 5a). L’effet de radiosensibilisation a été inversé par la NAC dans les cellules EMT6 et 4T1 (figure 5b). La principale cause de la mort cellulaire radio-induite par les ROS est l’induction de cassures double brin dans l’ADN (ADNdb) [12,51]. Nous avons donc examiné les dommages à l’ADN double brin après le traitement au DCA en quantifiant l’état de phosphorylation de γH2AX dans des conditions hypoxiques. Comme le montre la figure 5c, le DCA a augmenté la formation de dommages à l’ADN ds dans les cellules EMT6 et 4T1 de manière dose-dépendante.

Figure 4. Le DCA a de petits effets radiosensibilisants sur les cellules tumorales aérobies. Les cellules EMT6 et 4T1 ont été traitées au DCA pendant la nuit aux concentrations indiquées.(a) Radiosensibilité des cellules EMT6 et 4T1 dans des conditions aérobies ou hypoxiques.(b) Effet de radiosensibilisation du DCA dans des conditions aérobies.

Figure 5. Le DCA radiosensibilise les cellules tumorales hypoxiques par le biais de l’augmentation des ROS. Les cellules EMT6 et 4T1 ont été traitées au DCA pendant la nuit aux concentrations indiquées.(a) L’effet radiosensibilisant du DCA dans des conditions hypoxiques a été évalué par un test de formation de colonies.(b) Le prétraitement de NAC (10 mM et 20 mM) a inversé l’effet radiosensibilisant de différentes concentrations de DCA à 15 Gy pour EMT6 et 20 Gy pour 4T1.(c) Les ruptures d’ADN double brin ont été analysées par cytométrie en flux en utilisant la coloration gammaH2AX. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Le DCA radiosensibilise les cultures cellulaires en 3D (sphéroïdes)
Les résultats ci-dessus nous ont amenés à examiner si le DCA pouvait également améliorer la radiosensibilité des modèles de culture cellulaire en trois dimensions (3D) (figure 6a-c) qui imitent mieux les propriétés physicochimiques du microenvironnement tumoral, notamment les gradients d’oxygène. En utilisant des sphéroïdes obtenus à partir de cultures de cellules EMT6 et 4T1, nous avons mesuré la croissance des sphéroïdes après un traitement au DCA et une radiothérapie (figure 6a). Le traitement au DCA seul a entraîné un léger retard de croissance sur les cellules EMT6 mais n’a pas modifié la croissance des sphéroïdes 4T1 (Figure 6b). Une irradiation de 8 Gy a réduit la croissance des sphéroïdes tumoraux, un effet encore accentué par la combinaison avec le traitement au DCA (Figure 6a,c). Il convient de noter qu’alors que des effets cytotoxiques ont été observés dans les sphéroïdes 4T1 (comme le révèlent les halos de cellules mortes), des effets cytostatiques ont été observés dans les sphéroïdes EMT6 (figure 6a).

Figure 6. Le traitement au DCA et le rayonnement de 8 Gy réduisent la croissance des sphéroïdes tumoraux EMT6 et 4T1.(a) Images représentatives et(b,c) croissance en fonction du temps des sphéroïdes EMT6 et 4T1 après traitement au DCA aux concentrations indiquées et en combinaison avec une radiothérapie de 8 Gy.

La combinaison du DCA et de la radiothérapie ne retarde pas la croissance tumorale in vivo
Nous avons ensuite examiné si l’avantage in vitro de la combinaison du DCA et de la radiothérapie pouvait être validé in vivo (figure S3a-d). Des souris auxquelles on a injecté des cellules de cancer du sein EMT6 ou 4T1 ont été exposées à un rayonnement à fraction unique (12 Gy ou 15 Gy, respectivement) (figure S3a,c) ou fractionné (5*4 Gy ou 5*6 Gy, respectivement) (figure S3b,d). Les doses de rayonnement uniques et fractionnées par type de tumeur sont similaires en termes de dose biologique efficace (DBE) et diffèrent en fonction de la radiosensibilité intrinsèque des lignées cellulaires utilisées. Il est important de noter que l’injection de DCA par voie i.p. ou i.t. pendant 10 jours s’est avérée sûre sans induire de toxicité notable (figure S4a-d). L’irradiation seule a retardé la croissance tumorale dans la lignée EMT6 pendant sept jours avec une seule fraction et quatre jours pour une irradiation fractionnée (figure S3a,b). Dans les tumeurs 4T1, le rayonnement a retardé la croissance tumorale de cinq jours pour une seule fraction et de dix jours pour un rayonnement fractionné, comme prévu (figure S3c,d). Le DCA (300 mg/kg), par injection intrapéritonéale (ip) ou intratumorale (it), n’a pas retardé la croissance de la tumeur, pas plus que l’association du DCA et du rayonnement (figures S3a-d). Ensuite, nous avons validé si le traitement au DCA pouvait induire une hypoxie dans les tumeurs (Figure S3e,f). Bien que l’étendue de l’hypoxie colorée au pimonidazole n’ait pas été modifiée dans les tumeurs EMT6, une tendance à la diminution de l’hypoxie a été observée en réponse au DCA dans les tumeurs 4T1.

Discussion

Le but de cette étude était d’examiner si le ciblage du métabolisme mitochondrial par le DCA pouvait sensibiliser les cellules cancéreuses mammaires TNBC/basal-like à la radiothérapie. La plupart des cancers du sein de type TNBC et basal sont des tumeurs agressives pour lesquelles les options de traitement sont limitées et le pronostic est mauvais [2,3,4]. Ces tumeurs présentent un phénotype glycolytique accru qui contribue à leur mauvais pronostic et qui est en outre corrélé à la radiorésistance [52]. Dans la présente étude, nous avons constaté que les niveaux d’ARNm de deux des quatre isoformes de PDK (PDK1 et PDK3) sont régulés à la hausse dans les sous-types de cancer du sein TNBC et basal-like. La surexpression des PDK a été détectée dans de nombreux échantillons de tumeurs humaines [42,53,54,55,56,57,58,59,60,61], et de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses présentent une régulation élevée des isoformes de PDK [50,62,63]. Il a été signalé que la surexpression de la PDK est associée à un mauvais pronostic dans divers types de tumeurs [53,54,55,56,57,58,59,60,61]. La surexpression des PDK dans les cellules cancéreuses est influencée par plusieurs facteurs de transcription, tels que HIF1 [28,64]. HIF1 supprime activement l’OXPHOS en transactivant directement les gènes codant pour PDK1 et PDK3. Les PDK phosphorylent et inactivent à leur tour la PDH [42]. Ainsi, l’augmentation des PDK dans le cancer peut être attribuée instantanément aux mutations transformatrices et au microenvironnement tumoral hypoxique. Conformément à ces résultats, nous avons observé que la régulation à la hausse des ARNm de PDK1 et PDK3 est corrélée aux profils génétiques liés à l’hypoxie. La reprogrammation métabolique par le ciblage des enzymes PDK, pour passer de la glycolyse à l’OXPHOS, apparaît donc comme une voie thérapeutique prometteuse pour traiter les cancers du sein dont les options thérapeutiques sont limitées.

La principale conclusion de notre étude est que le DCA, un inhibiteur de la PDK, peut réduire l’activité glycolytique des cellules cancéreuses du sein en présence d’oxygène mais aussi en hypoxie [29]. Nous avons constaté que le DCA réduit la quantité de PDH phosphorylée et déclenche une diminution dose-dépendante des niveaux de lactate extracellulaire et de l’ECAR dans les cellules aérobies et hypoxiques. Nous avons ensuite combiné le DCA et la radiothérapie en supposant qu’en inversant le phénotype glycolytique et en dirigeant davantage de pyruvate vers l’oxydation mitochondriale, les cellules tumorales pourraient produire davantage de ROS et devenir plus sensibles aux rayonnements. Des effets de radiosensibilisation intrinsèque du DCA ont été rapportés pour des cellules de glioblastome [34,35], de carcinome pulmonaire non à petites cellules (NSCLC) [65,66], de cancer colorectal [35], de cancer de la prostate [32] et de médulloblastome radiorésistant [67]. Les mécanismes proposés sont l’arrêt du cycle cellulaire dans la phase G2-M, la création de dommages supplémentaires à l’ADN et la mort cellulaire consécutive en réponse à une production accrue de ROS mitochondriaux. Dans la présente étude, nous avons constaté qu’alors que des effets radiosensibilisants minimes ont été observés avec la concentration non toxique la plus élevée de DCA dans des conditions aérobies, le DCA a fortement radiosensibilisé les cellules cancéreuses du sein hypoxiques, à la fois en 2D et en sphéroïdes 3D. Bien qu’en théorie les ROS soient associés à des mécanismes oxydatifs, il existe un partenariat entre l’hypoxie et les ROS dans les tumeurs. L’hypoxie augmente la génération de ROS via la prolongation de la durée de vie des radicaux semiquinones ; réciproquement, les ROS aident les cellules tumorales à s’adapter à l’hypoxie via la stabilisation de HIF1-α [16,68]. Cependant, les insultes extracellulaires pourraient briser ce partenariat en déclenchant une production excessive de ROS, ce qui nuit à la respiration mitochondriale et diminue ainsi la fraction hypoxique dans les tumeurs [16,69,70]. Dans ce contexte, le trioxyde d’arsenic inhibe la consommation d’oxygène des cellules tumorales en augmentant les ROS intracellulaires, ce qui entraîne une meilleure radioréponse [71]. On rapporte également que la suppression de la glycolyse augmente la radioréponse. Cela peut se faire par le biais du ritonavir (inhibiteur du transporteur de glucose), du 2-désoxyglucose (inhibiteur de l’hexokinase) et de la lonidamine (inhibiteur de l’hexokinase), qui font l’objet d’essais cliniques dans différents types de cancer [72,73,74,75]. Une autre possibilité est que des ROS soient créés après un traitement au DCA en raison de l’induction de la NADPH oxydase [76]. Cependant, aucune preuve directe n’a été trouvée pour conclure que le DCA peut réguler à la hausse la NADPH oxydase [77]. Nous avons observé une augmentation dose-dépendante du NAD(P)H dans des conditions aérobies, mais pas dans des conditions hypoxiques dans les cellules EMT6 et 4T1. Nous supposons donc que l’augmentation du NAD(P)H et la régulation positive des NADPH oxydases ne jouent qu’un rôle mineur dans l’augmentation des ROS dans des conditions hypoxiques. À notre avis, le principal mécanisme des effets de radiosensibilisation observés est très probablement le résultat de l’augmentation de la production de ROS (jusqu’à 15 fois) après un traitement au DCA dans des conditions hypoxiques.

Conformément à la littérature, nous avons démontré que des concentrations supraphysiologiques de DCA étaient nécessaires pour provoquer des modifications de l’activité métabolique, une augmentation de la formation de ROS et une radiosensibilisation [29]. Notre hypothèse centrale est que ces effets sont la conséquence de l’inhibition de la PDK produite par le DCA [78]. Cependant, les concentrations nécessaires pour induire les résultats mesurés sont plusieurs fois supérieures à la constante d’inhibition (Ki) de la PDK1-4. Il convient de noter que le DCA existe physiologiquement sous forme d’anion, qu’il est relativement imperméable à la membrane malgré sa petite taille et qu’il nécessite donc le transporteur de pyruvate mitochondrial pour être absorbé par la mitochondrie [79,80]. Cependant, la conjugaison du DCA à un transporteur lipophile a amélioré le transport mitochondrial. Elle a permis de réduire la valeur de la CI50 du DCA, qui est passée d’une valeur millimolaire à une valeur micromolaire faible, ce qui se situe bien dans la plage du Ki de la PDK1-4 [81]. Le DCA imite l’inhibition efficace de PDK1-4 par le siRNA, et le DCA ajouté au siRNA de PDK n’a pas eu d’effets supplémentaires [49,50,60,82,83,84,85,86,87,88]. Ensuite, une petite molécule comme le DCA pourrait affecter directement ou indirectement d’autres cibles cellulaires et moléculaires. Des recherches récentes ont montré que le traitement au DCA augmentait la concentration de chaque intermédiaire du TCA mais n’affectait pas l’absorption du glucose ou la glycolyse [89]. D’autres chercheurs ont montré des preuves suggérant que le DCA peut augmenter la biosynthèse de novo du CoA. Comme des concentrations élevées de CoA peuvent être toxiques pour les cellules, cet effet métabolique pourrait être partiellement responsable de la toxicité des cellules cancéreuses médiée par le DCA [90]. Des recherches récentes ont introduit une nouvelle hypothèse, suggérant que l’efficacité du DCA contre le cancer pourrait provenir de sa capacité à s’opposer à l’acétate. Des niveaux élevés d’acétate peuvent favoriser la synthèse de l’ADN, de l’ARN et des protéines. En outre, il peut être associé à la résistance aux médicaments anticancéreux [91]. Enfin, les chercheurs ont découvert que le DCA pouvait activer la voie de signalisation AMPK, entraînant une cascade d’effets métaboliques et anticancéreux en aval [92,93]. Néanmoins, notre hypothèse reste que dans des conditions hypoxiques, l’acheminement du pyruvate dans les mitochondries provoque une augmentation des niveaux de ROS, ce qui radiosensibilise les cellules cancéreuses. Nous n’avons pas réussi à récapituler ces effets in vivo, et des travaux supplémentaires sont nécessaires pour déterminer comment traduire les effets radiosensibilisants du DCA dans les compartiments tumoraux hypoxiques. Les problèmes de pharmacocinétique liés à l’administration de DCA in vivo peuvent être exclus, et la dose de DCA utilisée (150 mg/kg) est bien en deçà des doses utilisées dans la littérature [29]. La dose équivalente pour l’homme de notre dose de DCA utilisée in vivo est de 12 mg/kg/j, ce qui se situe bien dans la zone de tolérance utilisée dans les essais cliniques. Une explication possible de l’échec de nos expériences in vivo est qu’une dose plus élevée de DCA est nécessaire pour avoir un effet radiosensibilisant in vivo. Au cours des 30 dernières années, le DCA a en effet été administré avec un succès raisonnable en tant que médicament expérimental pour le traitement du diabète de type 2, de l’hyperlipoprotéinémie acquise et congénitale, de l’ischémie myocardique, de l’acidose lactique acquise et congénitale et plus récemment du cancer [29,30]. Plusieurs essais de phase I/II étudient la sécurité du DCA et son activité en tant qu’agent anticancéreux. Le DCA est rapidement absorbé et peut même traverser la barrière hémato-encéphalique. Deux essais de phase I ont examiné la sécurité du DCA par voie orale chez des patients atteints de tumeurs cérébrales malignes récurrentes ou de métastases cérébrales dues à des cancers du système nerveux non central [94,95]. Ces études ont indiqué que le DCA est généralement bien toléré par les patients. Une autre explication de la différence déconcertante entre les effets in vitro et in vivo est en fait plus probablement liée aux modifications des phénotypes métaboliques lorsque les cellules cancéreuses sont injectées (ectopiquement) in vivo. En effet, l’augmentation de la radiosensibilité in vitro par le DCA est obtenue dans des conditions d’hypoxie et de métabolisme glycolytique élevé, de sorte que l’on peut observer le passage de la glycolyse à l’oxyphose lors du traitement par le DCA, ainsi qu’une augmentation supplémentaire des ROS.

L’étendue limitée de l’hypoxie dans les tumeurs in vivo peut donc refléter une capacité restreinte du DCA à induire un changement qui est déjà présent dans les tumeurs bien oxygénées qui dépendent largement de l’OXPHOS. D’autres études sont justifiées pour tester les effets radiosensibilisants du DCA dans des modèles de tumeurs mammaires de souris caractérisés par une angiogenèse limitée et des fractions hypoxiques élevées.

En conclusion, nous démontrons que le DCA surmonte la radiorésistance hypoxique des cellules cancéreuses du sein dans les systèmes 2D et 3D, ce qui peut être principalement attribué à l’augmentation des ROS. Il est remarquable que le passage du métabolisme de la glycolyse à l’oxyphose induit par le DCA crée également un stress oxydatif dans des conditions hypoxiques. Le DCA est utilisé depuis de nombreuses années pour traiter les troubles métaboliques et les maladies mitochondriales héréditaires. Au cours de la dernière décennie, le DCA a été largement reconverti en médicament anticancéreux avec des données précliniques, des rapports de cas et des essais cliniques prometteurs, comme décrit précédemment. Les résultats précliniques actuels indiquent qu’il est nécessaire de poursuivre les recherches sur le potentiel anticancéreux du DCA, étant donné que les cellules tumorales hypoxiques ne sont pas épargnées par l’inhibiteur de la PDK qui peut induire un stress oxydatif mortel, en particulier lorsqu’il est associé à la radiothérapie.

Matériel et méthodes

Analyse de cohorte du cancer du sein TCGA
Les profils d’expression de l’ARNm PDK1-4 (RNA Seq V2 RSEM ou log RNA Seq V2 RSEM) ont été interrogés sur le site Web cBioPortal sous la forme de données transformées en z-score [38,39]. Les données interrogées ont été évaluées à partir de 1084 cas de cancer du sein accessibles au public dans l’atlas PanCancer de la TCGA et de 817 cas de cancer du sein dans la base de données Cell 2015 de la TCGA. Pour l’ensemble de données TCGA Cell 2015, l’analyse de PDK1-4 a été réalisée en comparant la sous-population triple-négative avec le reste des cas de cancer du sein. Le cancer du sein triple négatif a été déterminé par un statut  » négatif  » pour les scores immunohistochimiques des gènes du récepteur d’œstrogène (ER), du récepteur de progestérone (PR) et du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) (total de 83 cas). Dans la base de données TCGA PanCancer Atlas, l’analyse de l’expression de PDK1-4 a été réalisée dans différentes catégories Pam50. Pam50 est une signature de 50 gènes qui classe le cancer du sein en cinq sous-types moléculaires intrinsèques : Luminal A, Luminal B, HER2-enrichi, Basal-like et Normal-like. L’expression de l’ARNm du cancer du sein TCGA et les données cliniques ont été analysées directement sur le site Web du cBioPortal ou téléchargées pour une analyse plus approfondie. L’analyse du score d’hypoxie de Buffa et Ragnum des échantillons où PDK1-4 a une expression d’un z-score supérieur à 2 a été effectuée directement sur le site Web cBioPortal.

Lignées cellulaires et produits chimiques
La lignée cellulaire d’adénocarcinome mammaire murin EMT6 a été aimablement fournie par Edith Lord (Université de Rochester, Cancer Center, New York), et les cellules 4T1 ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection. Toutes les expériences ont été réalisées dans un milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) complété par 10% de sérum bovin fœtal (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Autriche). Le tampon HEPES a été utilisé pour tous les traitements des cellules. Les produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), sauf indication contraire

Traitements
Les cellules EMT6 et 4T1 ont été cultivées jusqu’à confluence et traitées au DCA pendant 16 h aux concentrations indiquées. De la N-acétylcystéine (NAC) a été ajoutée à 10 mM ou 20 mM aux cultures 1 h avant et pendant le traitement au DCA. Ensuite, les cultures ont été utilisées pour d’autres analyses comme décrit ci-dessous. Le traitement a été effectué soit dans des conditions aérobies, soit dans des conditions hypoxiques. L’hypoxie a été induite par une incubation dans un gaz équilibré azote/dioxyde de carbone contenant 1 % d’oxygène [96]

Essai MTT
La cytotoxicité du DCA a été évaluée par l’essai MTT comme décrit ailleurs <a href= »#97″>[97,</a></sup><a href= »#98″><sup>98]</sup>.</a> En bref, les cellules ont été cultivées dans des plaques à 96 puits et traitées avec les concentrations indiquées. Après le traitement, le milieu a été aspiré, et 50 µL du réactif MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés pendant 1,5 h. Ensuite, 200 µL de solvant MTT (19:1 DMSO/HCL) ont été ajoutés et mélangés pour dissoudre les cristaux de formazan générés à l’intérieur des cellules. L’absorbance a été mesurée à une longueur d’onde de 540 nm en utilisant un spectrophotomètre (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La viabilité cellulaire a été déterminée en normalisant les cellules traitées par rapport aux cellules témoins non traitées.</p&gt

<p><strong>Assai de croissance cinétique<br></strong>L’influence du DCA sur la prolifération des cellules EMT6 et 4T1 a été évaluée en utilisant un essai de croissance cinétique. Les cellules ont été cultivées jusqu’à confluence dans des plaques de culture à 96 puits et traitées avec du DCA aux concentrations indiquées dans 6 répétitions. Des photomicrographies ont été prises toutes les deux heures à l’aide d’un imageur de cellules vivantes Incucyte (Essen Biosciences, Newark, Royaume-Uni), et la confluence des cultures a été mesurée à l’aide du logiciel Incucyte (Incucyte ZOOM 2018A, Essen Biosciences) sur 80 h de culture.</p> <p>

<p><strong>Western Blot<br></strong>Les analyses de Western blot ont été réalisées comme décrit précédemment <sup><a href= »#99″>[99]</a></sup>. Brièvement, les cellules ont été lysées dans un tampon triton-X à 1% complété par un inhibiteur de phosphatase (P5726), un inhibiteur de protéase (P8340) et du trifluoroacétate de leupeptine (L2023). Les lysats ont été centrifugés, et la concentration en protéines a été déterminée à l’aide du test de protéine DC de Bio-Rad (Bio-Rad 500-0116). Des quantités équivalentes de protéines ont été chargées sur un gel d’acrylamide à résolution de 12 %. Le transfert des protéines a été effectué pendant la nuit à 4 °C en utilisant une membrane de nitrocellulose (0,45 µM, Thermo 88018, Thermo Fisher Scientific). Les membranes ont été bloquées avec 5% de BSA dans du TBS et lavées (TBST). Les membranes bloquées ont été marquées avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps primaires ont été marqués avec des anticorps secondaires dans le proche infrarouge (IRDyes 680 RD ou 800 CW, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA), détectés et quantifiés à l’aide du système d’imagerie Fc Odyssey (LI-COR Biosciences). Les anticorps primaires étaient : phospho-PDH (ABS204, MERCK, Darmstadt, Allemagne), total-PDH (C54G1, signalisation cellulaire), antibêta ACTIN (A1978), et antialpha TUBULIN (T9026).</p&gt </p><strong>Dosage du lactate<br></strong>Après traitement, le dosage du L-lactate a été réalisé, conformément aux instructions du fabricant. En bref, le surnageant des cellules a été prélevé et introduit dans le mélange de réaction maître. Ensuite, une période d’incubation de 30 minutes a eu lieu à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, l’absorbance a été mesurée à 570 nm, et la quantité de L-lactate dans le milieu a été calculée. En outre, les cellules ont été lysées, et la quantité totale de protéines a été examinée par le dosage des protéines BCA (23227, Thermo Fisher) ; cette étape a été réalisée pour normaliser les valeurs de lactate à la quantité de protéines dans la cellule.</p&gt </p><strong>Profilage métabolique Seahorse<br></strong>Le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) ont été déterminés à l’aide d’un analyseur Seahorse XF96 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) comme indiqué précédemment <sup><a href= »#100″>[100]</a></sup>. En bref, 1,5 × 10<sup>5</sup> cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Les cellules ont ensuite été traitées avec du DCA, soit pendant la nuit (pour les mesures de l’OCR), soit pendant 3 h (pendant l’exécution du Seahorse, pour l’ECAR). Les cellules ont été équilibrées dans un milieu non tamponné Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 2 mM de glutamine et 10 mM de glucose à 37 °C dans un incubateur exempt de CO<sub>2</sub>, puis mesurées à l’aide d’un analyseur Seahorse. Pour extraire des informations détaillées sur la chaîne de transport des électrons dans les mitochondries, des inhibiteurs spécifiques composés d’oligomycine, de FCCP, de roténone et d’antimycine A ont été ajoutés séquentiellement. L’ECAR a été normalisé au niveau basal.</p&gt <p><strong>Production de ROS<br></strong>Le niveau intracellulaire de ROS a été détecté en utilisant le diacétate de 5-(6)-chlorométhyl-2′,7′-dichlorodihydro-fluorescéine (CM-H<sub>2</sub>DCFDA), une sonde fluorescente sensible à l’oxydation (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) comme décrit précédemment <sup><a href= »#97″>[97]</a></sup>. En bref, après le traitement, les cellules ont été colorées avec 5 μM de CM-H2DCFDA à 37 °C pendant 30 min. L’intensité de fluorescence moyenne a été mesurée par un cytomètre en flux FACSCanto (BD Bioscience, Franklin lakes, NJ, USA) et analysée par le logiciel Flowjo (BD Bioscience).</p&gt <p><strong>Mesure du NAD(P)H<br></strong>Le niveau intracellulaire de NAD(P)H a été détecté à l’aide du kit d’analyse cytométrique en flux intracellulaire NADH/NADPH Cell Meter<sup>TM</sup> (AAT BioQuest, Sunnyvale, CA, USA), conformément aux instructions du fabricant. En bref, après le traitement, les cellules ont été colorées avec le capteur de NAD(P)H JZLA707 à 37 °C pendant 45 minutes. L’intensité moyenne de fluorescence a été mesurée par un cytomètre en flux FACSCanto (BD Bioscience) et analysée par le logiciel Flowjo (BD Bioscience).</p&gt </p><strong>Radiation et test clonogénique<br></strong>Après traitement, les cellules ont été irradiées aux doses indiquées sur un Linac 6 MV (Varian Truebeam STx, Palo Alto, CA, USA ; BrainLAB AG, Feldkirchen, Allemagne) et réensemencées dans des plaques 6 puits pour la formation de colonies. Avant l’ensemencement, les cellules ont été comptées et normalisées par rapport aux conditions de contrôle. Après 7-12 jours, les cultures ont été fixées avec du cristal violet et les colonies (>50 cellules) ont été comptées. Les fractions de survie (SF) ont été ajustées au modèle linéaire-quadratique à l’aide du logiciel GraphPad Prism 8 (GraphPad Prism Software Inc, San Diego, CA, USA). La radiosensibilisation a été évaluée au niveau de 0,1 fractions de survie.</p&gt

<p><strong>Cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) (Sphéroïdes)<br></strong>Des sphéroïdes ont été préparés avec des cellules EMT6 et 4T1 en ensemençant 4000 cellules/puits dans une plaque à 96 puits à fixation ultra-faible (Corning, Corning, NY, USA). Le DCA a été ajouté au milieu lorsque les sphéroïdes avaient un diamètre d’environ 500 µm. Ensuite, les sphéroïdes ont été irradiés à 8 Gy, et le traitement a été lavé avec du milieu frais qui a été rafraîchi tous les 3 jours. La croissance des sphéroïdes a été suivie à l’aide du système d’imagerie cellulaire en direct IncuCyte (Essen Bioscience) pendant 10 jours.</p>

<p><strong>Modèle tumoral de souris<br></strong>Les cellules tumorales 4T1 et EMT6 (0,5 × 10<sup>6</sup>) ont été inoculées dans le membre postérieur gauche de souris syngéniques Balb/c (femelles, âgées de 7 à 9 semaines ; Laboratoires Charles River, L’Arbresle Cedex, France). Lorsque les tumeurs ont atteint environ 150 mm<sup>3</sup>, les souris ont été randomisées et traitées pendant 10 jours consécutifs avec 300 mg/kg de DCA (par voie intrapéritonéale ou intratumorale). Les souris ont reçu une dose unique de 12 Gy (tumeurs EMT6) ou 15 Gy (tumeurs 4T1) ou un schéma d’irradiation fractionnée de 5*4 Gy (tumeurs EMT6) et 5*6 Gy (tumeurs 4T1) lorsque les tumeurs ont atteint environ 150 mm3. L’irradiation a été délivrée par un Linac de 6 MV (Varian Truebeam STx). Pendant toute la durée de l’expérience, les tumeurs ont été mesurées à l’aide d’un pied à coulisse électronique, et le volume tumoral a été calculé à l’aide de la formule suivante : Volume = (Longueur × Largeur<sup>2</sup>) × 0,5. Les expériences ont été approuvées par le comité d’éthique pour l’utilisation d’animaux de laboratoire de la Vrije Universiteit Brussel (numéros de dossier éthique : 16-552-2 (18/4/2017) et 18-552-2 (1/6/2018) </p> <p>

<p><strong>Staining au pimonidazole sur des sections de tumeurs<br></strong>Les tumeurs ont été inoculées comme décrit dans la partie 4.13. Après le traitement, du pimonidazole (60 mg/kg ; Hypoxyprobe) a été injecté par voie i.v. dans la veine de la queue. Les tumeurs ont été excisées 1,5 h plus tard, pesées, congelées instantanément et conservées dans des flacons en plastique à -80 °C. Des sections de tumeurs (5 µm) ont ensuite été immunocolorées à l’aide d’un anticorps de lapin anti-Pimo (Hypoxyprobe, Burlington, MA, USA), qui a été coloré avec un anticorps FITC anti-lapin (Abcam). Les lames de tumeur ont été montées avec un liquide de montage (milieu de montage DAKO, Agilent) mélangé à du dapi (Sigma-Aldrich) et recouvertes d’une lamelle. Les images ont été acquises par microscopie confocale à fluorescence (EVOS FL, Thermo Fisher) et analysées avec ImageJ.</p&gt </p><strong>Statistiques</strong><br>Toutes les analyses ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 8.4.3. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± SEM d’au moins trois expériences indépendantes, sauf indication contraire. Le <em>t</em>-test non apparié, l’ANOVA à une voie suivie d’un test de comparaison multiple de Dunnett et l’ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Dunnett, Sidak ou Tukey ont été utilisés pour les analyses statistiques : * <em>p</em> < 0,05, ** <em>p</em> < 0,01, *** <em>p</em> < 0,001, **** <em>p</em> < 0,0001.</p&gt <h2>Matériel complémentaire</h2&gt <p>Des matériaux supplémentaires peuvent être trouvés sur https://www.mdpi.com/1422-0067/21/24/9367/s1.</p&gt <h2>Contributions de l’auteur</h2&gt

<p>Conceptualisation, S.d.M., I.D. et H.J. ; curation des données, S.d.M., C.C., K.L.L. et H.V. ; investigation, S.d.M. ; méthodologie, T.G. ; supervision, I.D., H.J., O.F. et M.D.R. ; visualisation, S.d.M. ; rédaction – version originale, S.d.M. ; rédaction – révision et édition, I.D., C.C., H.W., M.V.D.G., L.K., O.F. et M.D.R. Tous les auteurs ont discuté des résultats et ont contribué au manuscrit final. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version publiée du manuscrit.</p>

<h2>Financement</h2&gt </p>Ce travail a été soutenu par le programme de recherche stratégique  » Bénéfice sociétal de la radiothérapie corporelle stéréotaxique sans marqueur : un support statistique basé sur l’imagerie quantitative  » (Zwaartepunt, SRP 53, 2019-2024) du conseil de la recherche de la Vrije Universiteit Brussel.</p&gt <h2>Remerciements</h2&gt </p> Les auteurs remercient Valeri Verovski pour ses suggestions précieuses et constructives.</p&gt <h2>Conflits d’intérêts</h2&gt <p>Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt potentiel.</p&gt <h2>Note de l’éditeur:</h2&gt <p>Le MDPI reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.</p&gt <h2>Abréviations</h2&gt <figure class= »wp-block-table »><table><tbody><tr><td><td>DCA</td><td>Dichloroacétate</td></tr><tr><td>ECAR</td><td><td>Extracellular acidification rate</td></tr><tr><td>NAC</td><td>N-acétyl-cysteine</td></tr></tr><tr><td>OCR</td><td>Taux de consommation d’oxygène</td></tr><td>OXPHOS</td><td><td>Phosphorylation oxydative</td></tr><td>PDH</td><td>Pyruvate déshydrogénase</td></tr><td>PDK</td><td>Pyruvate déshydrogénase kinase</td><td> déshydrogénase kinase</td></tr><tr><td>PDP</td><td>Pyruvate déshydrogénase phosphatase</td></tr><tr><td>ROS</td><td><td><td>Reactive oxygen species</td></tr><tr><td>TBNC</td><td>Triple-négatif du cancer du sein</td></tr></tbody></table></figure&gt <h2>REFÉRENCES</h2&gt <span id= »1″ class= »referencess blue-text »>1</span> Organisation mondiale de la santé. 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