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Cecilie Abildgaard1, Christina Dahl1, Astrid L Basse2, Tao Ma2 et Per Guldberg1*

1 Centre de recherche de la Société danoise du cancer, Copenhague, Danemark
2 Département de biologie, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark.

Correspondance : [email protected]

Reçu : 14 septembre 2020
Accepté : 4 décembre 2020
Publié : 9 décembre 2020

Résumé

Contexte : Les progrès réalisés dans le traitement du mélanome par l’inhibition ciblée de l’oncogène BRAF sont limités en raison du développement d’une résistance acquise. L’implication de BRAFV600E dans la reprogrammation métabolique des cellules de mélanome fournit une justification pour le ciblage conjoint du métabolisme comme approche thérapeutique.

Méthodes : Nous avons examiné les effets du dichloroacétate (DCA), un inhibiteur de la pyruvate déshydrogénase kinase, sur la croissance et l’activité métabolique de lignées cellulaires de mélanome humain. L’effet combiné du DCA et du vemurafenib, un inhibiteur de BRAF, a été étudié sur des lignées cellulaires de mélanome muté BRAFV600E. Des lignées cellulaires résistantes au vémurafénib ont été établies in vitro et leur sensibilité au DCA a été testée.

Résultats : Le DCA a induit une réduction de l’activité glycolytique et des niveaux d’ATP intracellulaire, et a inhibé la croissance cellulaire. Le co-traitement de cellules de mélanome mutantes BRAFV600E avec du DCA et du vemurafenib a induit une réduction plus importante des niveaux d’ATP intracellulaire et de la croissance cellulaire que l’un ou l’autre des composés seuls. En outre, les cellules de mélanome présentant une résistance acquise in vitro au vémurafénib ont conservé leur sensibilité au DCA.

Conclusions : Ces résultats suggèrent que le DCA potentialise l’effet du vemurafenib par une atténuation coopérative de la production d’énergie. En outre, la démonstration de la conservation de la sensibilité au DCA dans les cellules de mélanome présentant une résistance acquise au vemurafenib pourrait avoir des implications pour le traitement du mélanome.


Mots clés : Dichloroacétate, Mélanome, BRAF, Bioénergétique, Métabolisme, ATP
Abréviations : (Acetyl-CoA) : Acétyl coenzyme A, (AMPK) : Protéine kinase activée par l’AMP, (DCA) : Dichloroacétate, (ECAR) : Taux d’acidification extracellulaire, (HEMn-LP) : Mélanocytes épidermiques humains(IC50) : concentration inhibitrice demi-maximale, (LKB1) : Kinase B1 du foie, (MITF) : Microphthalmia-associated transcription factor, (OCR) : Taux de consommation d’oxygène, (PDH) : Pyruvate déshydrogénase, (PDK) : Pyruvate déshydrogénase kinase

2014 Abildgaard et al. ; licencié BioMed Central Ltd.


Contexte

L’une des caractéristiques du cancer est la reprogrammation du métabolisme cellulaire vers la glycolyse aérobie. Ce modèle métabolique est caractérisé par une augmentation de l’absorption du glucose et une activité glycolytique fortement régulée avec fermentation du glucose en acide lactique au lieu d’une décomposition aérobie complète dans les mitochondries. La glycolyse aérobie, également appelée effet Warburg, ressemble au métabolisme anaérobie des cellules normales, mais se produit dans le contexte d’un apport adéquat en oxygène [1]. La reprogrammation du métabolisme dans les cellules cancéreuses est un processus très complexe et hétérogène, qui repose sur une grande variété de stratégies génétiques et non génétiques visant à surmonter la restriction énergétique [2]-[4].

L’oncogène BRAF V600E, présent dans plus de 50 % des mélanomes [5], a été directement impliqué dans la reprogrammation du métabolisme cellulaire. L’activité constitutive du mutant BRAF réduit l’expression des enzymes oxydatives et le nombre de mitochondries, tout en augmentant l’expression des enzymes glycolytiques et la production d’acide lactique [6], [7]. De plus, un lien moléculaire a été reconnu entre la voie RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK et le point de contrôle du stress énergétique médié par la voie de la kinase B1 du foie (LKB1)-protéine kinase activée par l’AMPK, suggérant un rôle de BRAFV600E dans la médiation de la résistance au stress énergétique [8],[9]. BRAF affecte le métabolisme oxydatif par le biais du contrôle dépendant du facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF) du maître régulateur mitochondrial PGC1α [7]. Des études précédentes ont montré que les mélanomes exprimant PGC1α ont un phénotype plus oxydatif que les mélanomes PGC1α-négatifs [4], [7]. En outre, il a été démontré que BRAFV600E médiait la sénescence induite par l’oncogène par le biais d’une régulation métabolique. Ce mécanisme implique une augmentation de l’activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH) par la suppression de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK) [10]. La PDH contrôle le couplage entre la glycolyse et la respiration mitochondriale en facilitant l’afflux de pyruvate dans les mitochondries, favorisant l’utilisation complète du glucose. L’axe PDK-PDH est souvent dérégulé dans le cancer, où la surexpression de PDK réduit le couplage entre les deux systèmes énergétiques et contribue ainsi à l’effet Warburg [11], [12]. Sur la base de ces résultats, l’inhibition ciblée de la PDK a été proposée comme option thérapeutique pour le mélanome, avec un possible effet synergique des inhibiteurs chimiques de BRAFV600E, tels que le vemurafenib [10],[13].

Le dichloroacétate (DCA) est un inhibiteur des quatre isoformes de la PDK et a déjà été utilisé pour le traitement de l’acidose lactique [14],[15], avec une faible toxicité à des niveaux de dose efficaces [16],[17]. Plusieurs études ont démontré que le DCA inverse l’effet Warburg dans les cellules cancéreuses et affecte négativement leur croissance et leur survie [13],[18]-[21]. Cet effet a été attribué à une normalisation du potentiel de la membrane mitochondriale à partir de l’état hyperpolarisé qui caractérise les cellules cancéreuses. Les changements du potentiel membranaire entraînent la réouverture des canaux anioniques dépendant du voltage et il a été démontré qu’ils introduisaient une re-sensibilisation à l’apoptose, en raison d’une capacité retrouvée à libérer des médiateurs pro-apoptotiques [18]. Nous avons étudié ici l’effet du DCA sur les cellules de mélanome. Plus précisément, nous avons analysé les réponses cellulaires en ce qui concerne le métabolisme, la bioénergétique, la croissance, la prolifération et la mort cellulaire dans des lignées cellulaires de mélanome, des mélanocytes humains primaires et des cellules de mélanome mutantes BRAFV600E présentant une résistance acquise au vemurafenib.

Méthodes

Lescomposés chimiques
DCA
(dichloroacétate de sodium) et 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) ont été achetés chez Sigma-Aldrich et dissous dans du dH2Oà des concentrations de travail de 1 M. Le vémurafenib (PLX4032) a été acheté chez Selleck Chemicals et dissous dans du DMSO à une concentration de travail de 0,05 M.

Culture cellulaire
Les lignées cellulaires de mélanome ED-007, ED-013, ED-024, ED-027, ED-029, ED-034, ED-050, ED-070, ED-071, ED-117, ED-140, ED-179 et ED-196 ont été obtenues à partir de l’European Searchable Tumour line Database (ESTDAB, ED) [22]. La lignée cellulaire de mélanome SK-MEL-28 a été achetée auprès de l’ATCC. Les mélanocytes épidermiques humains primaires (néonataux) provenant de tissus légèrement pigmentés (HEMn-LP) ont été achetés chez Invitrogen. Les lignées cellulaires de mélanome ont été cultivées à 37°C sous 5% deCO2 dans un milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les cellules HEMn-LP ont été cultivées dans les mêmes conditions dans un milieu 254CF complété par 1 % de supplément de croissance des mélanocytes humains (HMGS-2) et du 12-O-tétradécanoyl-phorbol-13-acétate(TPA ; 10 ng/ml). Tous les milieux et suppléments ont été achetés chez Invitrogen.

Analyse métabolique
La caractérisation métabolique a été réalisée sur des lignées cellulaires de mélanome et des mélanocytes humains primaires à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF96 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA), qui effectue des mesures en temps réel du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et du taux de consommation d’oxygène (OCR). Un essai a été conçu pour étudier la capacité des systèmes énergétiques mitochondriaux et glycolytiques. L’ECAR et l’OCR ont été mesurés dans des conditions basales et pendant l’addition successive de cinq modulateurs métaboliques : L’inhibiteur de l’ATP synthase, l’oligomycine (1 μM) ; le perméabilisateur de la membrane mitochondriale, le carbonyl cyanide-4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) (1 μM) ; les inhibiteurs de la respiration mitochondriale, la roténone (1 μM) et l’antimycine A (1 μM) ; et l’inhibiteur glycolytique, le 2-DG (100 mM). Le kit XF Cell Mito Stress, contenant de l’oligomycine, du FCCP, de la roténone et de l’antimycine A, a été acheté auprès de Seahorse Bioscience.

Mesures de l’ATP
Les niveaux intracellulaires d’ATP ont été mesurés à l’aide du système de dosage par luminescence ATPlite, 1 step (Perkin Elmer), une méthode basée sur la réaction de l’ATP avec la luciférase et la D-luciférine. Les cellules ont été ensemencées en triplicatas avec 10 000 cellules par puits et traitées avec les composés indiqués et le véhicule témoin pendant 2 ou 24 heures. La luminescence a été mesurée avec le lecteur de microplaques à luminescence Spectra Max Gemini EM (Molecular Devices) et normalisée aux niveaux de fond.

Test au cristal violet
Un test au cristal violet a été appliqué pour évaluer l’effet des composés étudiés sur la croissance cellulaire. Les cellules ont été ensemencées en double à une densité appropriée, puis traitées avec du DCA, du vemurafenib, les deux composés combinés et le véhicule témoin. Le milieu et les composés de traitement ont été remplacés toutes les 48 heures. L’expérience a été répétée trois fois indépendamment. Pour terminer l’expérience, le milieu et les cellules non attachées ont été retirés, et les cellules restantes ont été lavées dans du PBS et fixées avec du glutaraldéhyde pendant 15 minutes. Les cellules fixées ont été incubées avec une solution de cristal violet (0,1% de cristal violet, 20% CH3OH) pendant 1 heure. La quantité de colorant absorbée par la monocouche, proportionnelle au nombre de cellules viables attachées au fond du puits, a été quantifiée en extrayant la couleur avec de l’acide acétique à 10% et en mesurant l’absorbance à une longueur d’onde de 595 nm. La corrélation linéaire entre l’absorbance et le nombre de cellules a été vérifiée en réalisant une courbe standard. La croissance cellulaire relative a été déterminée en normalisant par rapport aux contrôles non traités après soustraction du bruit de fond (sans cellules).

Essai de prolifération cellulaire
Les cellules de mélanome ont été ensemencées en triplicatas avec 500 à 1 000 cellules par puits et traitées avec du DCA aux concentrations données et le véhicule témoin pendant 96 heures. La prolifération a ensuite été mesurée en détectant le BrdU après 12 heures d’incorporation dans l’ADN cellulaire. La procédure a été menée conformément au protocole fourni avec le kit de test de prolifération cellulaire BrdU (Cell Signaling Technology®).

Détection de l’apoptose par Annexin V-FITC
La détection de l’apoptose a été réalisée à l’aide d’un kit de détection de l’apoptose par Annexin V-FITC (BD Bioscience), conformément au protocole fourni. Les cellules ont été récoltées et lavées deux fois dans du PBS froid. Les cellules ont ensuite été transférées dans un autre tube, essorées et remises en suspension dans un tampon de liaison. À partir de la remise en suspension, 5 ×105 cellules ont été transférées dans des tubes FACS et colorées avec de l’Annexin V-FITC et de l’iodure de propidium (PI). Après 30 minutes d’incubation, la cytométrie de flux a été réalisée sur un instrument Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter). Les cellules non colorées ont été incluses comme contrôle.

Induction de la résistance acquise in vitro au vemurafenib
La résistance acquise au vemurafenib a été induite dans sept cultures dérivées de quatre lignées cellulaires de mélanome BRAFV600E-mutantes et sensibles au vemurafenib (ED-013, ED-071, ED-196 et SK-MEL-28). Les cellules ont été cultivées dans des concentrations croissantes de vemurafenib jusqu’à ce qu’elles croissent régulièrement à une concentration supérieure à la CI50, puis elles ont été maintenues dans un milieu contenant du vemurafenib.

Pyroséquençage
Le pyroséquençage des points chauds de mutation dans BRAF et NRAS a été réalisé sur une plateforme PyroMark Q24 (Qiagen), en utilisant les réactifs PyroMark Gold Q24 (Qiagen). Les séquences d’amorces sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 1: Tableau S1.

Site cibleNom de l’amorceSéquence d’amorce (5′-3′)
BRAF V600EBRAF-F1[Btn]-TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA
BRAF-R1GGCCAAAAATTTAATCAGTGGAA
BRAF-S1CCACTCCATCGAGATTT
NRAS Q61K,L,RNRAS-F1[Btn]-ACCCCCAGGATTCTTACAGAAA
NRAS-R1CGCAAATGACTTGCTATTATTGA
NRAS-S1TCATGGCACTGTACTCTT
Tableau supplémentaire S1

Analyse de l’expression de PGC1α
L’ARN total a été isolé à l’aide du kit RNeasy mini (Qiagen) et l’ADNc a été synthétisé avec le kit de transcriptase inverse SuperScript™ III (Invitrogen). Des oligo dT24 et des hexamères aléatoires ont été utilisés comme amorces pour la synthèse de l’ADNc. L’expression génétique de PGC1α a été déterminée par PCR quantitative en temps réel sur le LightCycler 2.0 de Roche en utilisant le kit LigthCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche). Les séquences d’amorces étaient les suivantes : PPARGC1A_2241F : 5′-GCTGTACTTTTGTGGACGCA-3′ et PPARGC1A_2306R : 5′-GGAAGCAGGGTCAAAGTCAT-3′. L’expression a été normalisée par rapport à l’expression du gène de référence RPLP0. Les séquences d’amorces étaient : RPLP0_433F : 5′-ACTAAAATCTCCAGGGGCACC-3′ et RPLP0_547R : 5′-ATGACCAGCCCAAAGGAGAA-3′. Les deux lignées cellulaires de mélanome ED-050 et SK-MEL-28 ont été incluses comme contrôles positifs et négatifs, respectivement [4].

Analyse statistique
Les différences entre des ensembles de données indépendants ont été déterminées à l’aide du test t de Student. L’ANOVA à échantillons appariés à une voie a été utilisée pour l’analyse statistique de la variance entre les différents traitements (véhicule témoin, DCA, vemurafenib et combinaison de DCA et de vemurafenib). Le test de comparaison multiple HSD (honest significance difference) de Tukey a été utilisé pour déterminer la signification statistique. Le coefficient de corrélation de Pearson a été utilisé pour déterminer la corrélation entre la sensibilité au DCA et les paramètres métaboliques. Une valeur de 1 indiquait une corrélation positive, 0 aucune corrélation, et -1 une corrélation négative.

Les expériences réalisées dans cette étude n’ont impliqué que des lignées cellulaires disponibles dans le commerce et n’ont donc pas nécessité l’approbation d’un comité d’éthique.

Résultats

Caractérisation métabolique des lignées cellulaires de mélanome et des mélanocytes primaires
Le profilage métabolique de 12 lignées cellulaires de mélanome et de mélanocytes humains primaires (HEMn-LP) a été réalisé à l’aide de l’analyseur Seahorse FX96. Cet instrument effectue des mesures en temps réel du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et du taux de consommation d’oxygène (OCR), qui sont des mesures indirectes de l’activité glycolytique et de la respiration mitochondriale, respectivement [23]. Les mesures ont été effectuées dans des conditions basales et lors de l’ajout successif de cinq modulateurs métaboliques (Figure 1A). Par rapport aux mélanocytes normaux, 11 des 12 lignées cellulaires présentaient des taux glycolytiques plus élevés, comme l’indiquent les ECAR glycolytiques basaux plus élevés, ce qui montre que l’effet Warburg est une caractéristique générale des cellules de mélanome. De plus, neuf des lignées cellulaires présentaient des capacités glycolytiques maximales supérieures à celles des mélanocytes (Figure 1B). À quelques exceptions près, il n’y avait pas de différences significatives dans la respiration mitochondriale basale et maximale entre les mélanocytes et les cellules de mélanome (fichier supplémentaire 2 : figure S2). D’après les ratios OCR-to-ECAR (OCR/ECAR ; Figure 1C), la contribution relative de la respiration mitochondriale à la production d’ATP était plus faible dans 10 des lignées cellulaires de mélanome par rapport aux mélanocytes.

Figure S2

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Figure 1. Caractérisation métabolique des lignées cellulaires de mélanome et des mélanocytes primaires. A, profils métaboliques de deux lignées cellulaires de mélanome (ED-013 et ED-179) et de mélanocytes épidermiques humains (HEMn-LP), basés sur des mesures Seahorse XF96. Sont représentées les mesures de l’ECAR (panneau de gauche) et de l’OCR (panneau de droite) pendant l’ajout successif d’oligomycine (1 μM), de FCCP (1 μM), de roténone/antimycine (1 μM/1 μM) et de 2-DG (100 mM). Les données constituent 6 mesures parallèles, et sont représentatives de trois expériences indépendantes. B, valeurs ECAR glycolytiques basales et maximales pour les lignées cellulaires de mélanome et les mélanocytes primaires humains (HEMn-LP). L’ECAR mesuré après l’ajout de 2-DG (ECAR non glycolytique) a été soustrait de toutes les valeurs. La ligne pointillée indique l’ECAR basal des HEMn-LP. C, Rapports entre l’OCR mitochondrial basal et l’ECAR glycolytique basal. D, Couplage ATP représentant la fraction du ROC basal utilisée pour la production d’ATP (fraction inhibée par l’oligomycine). E, Le rapport de contrôle respiratoire, dénotant le rapport entre l’OCR mitochondrial maximal et la fuite de protons (OCR après ajout d’oligomycine).(BE), Les valeurs sont les moyennes de trois mesures indépendantes ± l’écart-type. Le test t de Students a été utilisé pour déterminer les différences entre HEMn-LP et les lignées cellulaires de mélanome (*p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001).

L’efficacité mitochondriale (couplage ATP) et la performance (rapport de contrôle respiratoire) ont été estimées à partir des mesures de deux paramètres de la fonction mitochondriale : la fuite de protons et le RCO mitochondrial maximal [24]. La fuite de protons a été déterminée après l’ajout d’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP synthase, et le RCO mitochondrial maximal a été déterminé après l’ajout de FCCP, un découpleur mitochondrial. Cette analyse a montré un couplage ATP significativement plus faible dans les cellules de mélanome par rapport aux mélanocytes (p < 0,05 ; ED-007 : p = 0,07), suggérant une fuite de protons plus importante et une production d’ATP moins efficace par rapport au niveau de consommation d’oxygène (Figure 1D). En outre, six des lignées cellulaires de mélanome présentaient également des ratios de contrôle respiratoire significativement plus faibles que les mélanocytes (p?<?0,01, Figure 1E), ce qui indique une mauvaise performance mitochondriale.

LeDCA déplace le métabolisme vers la respiration mitochondriale et réduit les niveaux d’ATP
Pour déterminer l’effet du DCA sur le métabolisme des cellules de mélanome, nous avons analysé le panel de 12 lignées cellulaires à l’aide de l’analyseur Seahorse XF96. Après un traitement avec 10 mM de DCA pendant 2 heures, toutes les lignées cellulaires ont répondu par une réduction de l’ECAR et une augmentation de l’OCR (figure 2A), ce qui indique un déplacement vers la respiration mitochondriale. La réponse ECAR était similaire entre les lignées cellulaires, alors qu’il y avait une grande variation dans la réponse OCR (Figure 2A). Les changements relatifs de l’ECAR, de l’OCR et de l’OCR/ECAR en réponse au DCA dépendaient de la concentration (fichier supplémentaire 3: figure S3).

Figure 2. Effets du DCA sur le métabolisme et les niveaux d’ATP. A, changements relatifs de l’OCR mitochondrial basal et de l’ECAR glycolytique induits par le traitement avec 10 mM de DCA pendant 2 heures. B, niveaux relatifs d’ATP après un traitement au DCA (10 ou 20 mM) pendant 24 heures. Une ANOVA à échantillons appariés à une voie a été utilisée pour l’analyse statistique et le test HSD de Tukey a été utilisé pour déterminer la signification statistique (*p < 0,05 ; **p < 0,01).

Pour déterminer si le changement de métabolisme interférait avec l’homéostasie énergétique, nous avons mesuré les niveaux d’ATP dans les cellules de mélanome après traitement avec 0,1, 1 ou 10 mM de DCA pendant 2 heures. Les trois lignées cellulaires testées ont été capables de maintenir les niveaux d’ATP après un traitement avec de faibles concentrations de DCA (0,1-1 mM), alors qu’une tendance à la réduction de l’ATP a été observée dans les cultures traitées avec 10 mM de DCA (fichier supplémentaire 3 : figure S3). Lorsque les cellules ont été traitées avec du DCA (10 ou 20 mM) pendant 24 heures, une diminution significative de l’ATP en fonction de la concentration a été observée (figure 2B), indiquant un épuisement progressif du système métabolique.

Figure S3

LeDCA réduit la croissance des cellules de mélanome indépendamment du statut du conducteur génétique et de l’expression de PGC1α
Pour évaluer une éventuelle application clinique du DCA pour le traitement du mélanome, nous avons étudié ses effets sur différents paramètres de la croissance cellulaire. L’ensemble du panel de lignées cellulaires et de mélanocytes primaires a été traité avec une gamme de concentrations de DCA (0,5-100 mM) pendant 96 heures (voir Figure 3A pour des résultats représentatifs). Toutes les lignées cellulaires ont présenté une réduction de la croissance en fonction de la concentration, avec des valeurs de CI50 comprises entre 9 et 38 mM (tableau 1), contre une valeur de CI50 de 70 mM pour les mélanocytes primaires (p < 0,001). Il n’y avait aucune corrélation entre la réponse au DCA et le statut mutationnel BRAF/NRAS ou les niveaux d’expression de PGC1α (tableau 1).

Lignée cellulaireDCA IC50(mM)4StatutBRAF/ NRASS1Expression de PGC1α2,4
ED-0708.9 ± 0.6***NRASQ61L1.0 ± 0.2
ED-00712.2 ± 2.2***WT30.6 ± 0.0
ED-07112.3 ± 3.6***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-03412.7 ± 1.7***BRAFL597S1.0 ± 0.2
ED-01314.4 ± 2.0***BRAFV600E1.9 ± 0.3
ED-02717.7 ± 2.1***BRAFV600E0.5 ± 0.1
SK-MEL-2820.0 ± 4.5***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-17920.6 ± 1.8***NRASQ61R0.3 ± 0.0
ED-02421.9 ± 1.6***NRASQ61L0.0 ± 0.0
ED-14023.9 ± 2.0***WT0.4 ± 0.1
ED-05024.1 ± 3.1***WT2.7 ± 0.5
ED-02929.7 ± 5.1***BRAFV600K1.3 ± 0.2
ED-19635.8 ± 3.2***BRAFV600E1.5 ± 0.5
ED-11737.6 ± 2.2***BRAFV600E1.2 ± 0.1
HEMn-LP69.1 ± 6.4WT1
ED-013-R112.6 ± 3.0***BRAFV600E
ED-013-R213.6 ± 2.4***BRAFV600E
ED-071-R112.2 ± 0.9***BRAFV600E
ED-071-R213.8 ± 3.7***BRAFV600E
SK-MEL-28-R123.1 ± 4.6***BRAFV600E
SK-MEL-28-R226.2 ± 8.0**BRAFV600E
Tableau 1 Valeurs de la CI 50 du DCA, statut BRAF/NRAS et expression de PGC1α
**p < 0,01 ; ***p < 0,001 par rapport à HEMn-LP.
1LestatutBRAF/NRASest conforme aux résultats publiés[25].
2Par rapport àl’expression de PGC1α dans les mélanocytes normaux.
3Type sauvage.
4Lesvaleurs de la CI 50 duDCAet l’expression de PGC1α représentent les moyennes de trois mesures indépendantes ± l’écart type.
Figure 3. Effets du DCA sur la croissance, la prolifération et l’apoptose. A, Sélection représentative de taches de cristal violet de quatre lignées cellulaires de mélanome (ED-007, ED-070, ED-179 et ED-196) traitées avec des concentrations croissantes de DCA (1-50 mM) pendant 96 heures. B. Prolifération déterminée par l’incorporation de BrdU après traitement au DCA (1 et 10 mM) pendant 96 heures. Une ANOVA à échantillons appariés à une voie a été utilisée pour l’analyse statistique et le test HSD de Tukey a été utilisé pour déterminer la signification statistique (*p < 0,05 ; **p < 0,01). C. Détection de l’apoptose par cytométrie en flux basée sur l’Annexin V et le PI dans les cellules ED-179 et ED-196 après traitement par le DCA à des concentrations inférieures (10 mM) et supérieures (100 mM) à la CI50 pendant 96 heures.

Pour caractériser davantage les effets du DCA sur la croissance cellulaire, nous avons mesuré l’incorporation de BrdU dans les cellules traitées avec 1 ou 10 mM de DCA pendant 96 heures. Comme le montre la figure 3B, les quatre lignées cellulaires testées ont réagi par une réduction de la prolifération, de l’ordre de 11 à 30 % à 1 mM et de 42 à 88 % à 10 mM. Nous avons également mesuré la réponse apoptotique au DCA par analyse cytométrique en flux des taux d’annexine V. À des concentrations de DCA inférieures à la CI50, le nombre de cellules positives à l’annexine V n’a pas augmenté après 96 heures et jusqu’à 3 semaines. En revanche, le traitement avec des concentrations supérieures à la CI50 a augmenté le nombre de cellules positives pour l’annexine V et le PI, ce qui indique une induction de la mort cellulaire déjà après 96 heures (figure 3C).

LeDCA potentialise l’effet du vemurafenib sur les cellules de mélanome mutantes BRAFV600E
Pour savoir si le DCA peut être utilisé pour améliorer l’efficacité des inhibiteurs chimiques de BRAF pour le traitement du mélanome, nous avons testé diverses combinaisons de DCA et de vemurafenib sur la croissance cellulaire. Le traitement de quatre lignées cellulaires mutantes BRAFV600E avec du vemurafenib (0,05-5 μM) pendant 96 heures a révélé des valeurs IC50 de 0,5 à 4,5 μM, ce qui correspond aux données d’études précédentes [26]. En exposant les mélanocytes primaires au même traitement, nous n’avons pas atteint la valeur IC50 pour ces cellules, même avec la plus forte concentration testée (5 μM), confirmant la spécificité du composé.

Lorsque les cellules ont été traitées avec 1 mM de DCA en combinaison avec de faibles concentrations de vemurafenib (<IC50), la réduction de la croissance cellulaire était plus prononcée qu’avec le DCA ou le vemurafenib seul (p < 0,05 ; Figure 4A, B). Le DCA n’a pas potentialisé l’effet du vemurafenib dans les cellules ED-117, ce qui peut être attribué à la résistance inhérente de ces cellules au DCA (IC50 38 mM ; tableau 1). Aux concentrations de la CI50, le DCA et le vémurafénib ont tous deux entraîné une réduction des niveaux d’ATP intracellulaire lorsqu’ils étaient utilisés seuls et une réduction supplémentaire lorsqu’ils étaient utilisés en association, bien que cette réduction ne soit pas statistiquement significative pour toutes les lignées cellulaires (figure 4C).

Figure 4. Effets du traitement combiné avec le DCA et le vemurafenib. A, B, Quatre lignées cellulaires de mélanome (ED-013, ED-071, ED-117 et ED-196) ont été traitées avec du DCA (1 mM), du vemurafenib (50 nM pour ED-071 et ED-117 ; 100 nM pour ED-013 et ED-196) ou la combinaison pendant 2 semaines. A, résultats de la coloration au cristal violet représentatifs de trois expériences indépendantes. B, Quantification des données illustrées en A. C, Niveaux relatifs d’ATP dans les cellules traitées par DCA (IC50), vemurafenib (IC50) ou la combinaison pendant 24 heures. B, C, Les données représentent les moyennes ± l’écart-type de trois mesures indépendantes. Une ANOVA à échantillons appariés à une voie a été utilisée pour l’analyse statistique et le test HSD de Tukey a été utilisé pour déterminer la signification statistique (*p < 0,05 ; **p < 0,01).

Les lignées cellulaires résistantes au vémurafénib ont une meilleure capacité oxydative et conservent leur sensibilité au DCA
Sept cultures de cellules résistantes au vémurafénib ont été générées à partir de quatre lignées cellulaires mutantes BRAFV600E en exposant les cellules à des concentrations croissantes de vémurafénib. Les cellules ont été considérées comme résistantes lorsqu’elles pouvaient être propagées en continu à une concentration de vemurafenib supérieure à la CI50. L’ADN a été isolé des sept cultures et testé pour le gain du nombre de copies de BRAF et les mutations secondaires de NRAS, qui sont deux mécanismes bien décrits de résistance acquise au vemurafenib [27],[28]. Le pyroséquençage a révélé une augmentation du rapport entre BRAF V600E et BRAF WT dans l’une des lignées cellulaires résistantes (ED-013-R2) par rapport à la lignée cellulaire parentale (fichier supplémentaire 4 : figure S4). Aucune altération de BRAF ou NRAS n’a été trouvée dans les autres lignées cellulaires résistantes.

Figure S4

La caractérisation métabolique de deux des lignées cellulaires résistantes (ED-013-R1 et ED-196-R) à l’aide de l’analyseur Seahorse XF96 a montré que les deux lignées cellulaires résistantes présentaient un profil métabolique transformé avec une capacité respiratoire maximale significativement accrue (figure 5A), mais aucune modification de la RCO respiratoire basale, du couplage ATP ou de la RCO non mitochondriale. Il est intéressant de noter que, lorsque la sensibilité au DCA a été testée, les lignées cellulaires résistantes au vémurafénib présentaient toutes des valeurs de CI50 similaires à celles des lignées cellulaires parentales (tableau 1).

Figure 5. Réponse deslignées cellulaires de mélanome résistantes au vemurafenibau DCA. A. Profils métaboliques de deux lignées cellulaires de mélanome résistantes au vemurafenib (ED-013-R1 et ED-196-R) par rapport à leurs lignées cellulaires parentales (ED-013 et ED-196). Les panneaux indiquent le ROC basal et les changements lors de l’ajout successif d’oligomycine (1 μM), de FCCP (1 μM), de roténone/antimycine (1 μM/1 μM) et de 2-DG (100 mM). Les données constituent 6 mesures parallèles et sont représentatives de trois expériences indépendantes. B, Croissance cellulaire relative des lignées cellulaires sensibles au vemurafenib (ED-013, ED-071 et SK-MEL-28) et de leurs sous-cultures résistantes au vemurafenib (désignées R1 et R2) après traitement par DCA (10 mM), vemurafenib (1 μM) ou la combinaison pendant 96 heures. C, niveaux relatifs d’ATP après traitement par le DCA (IC50), le vemurafenib (IC50) ou la combinaison pendant 24 heures.

La figure 5Billustre la sensibilité des lignées cellulaires résistantes au vemurafenib au DCA et au vemurafenib, en tant qu’agents uniques ou en combinaison, par rapport aux lignées cellulaires parentales. La croissance des lignées cellulaires résistantes était légèrement diminuée, non affectée ou même augmentée en présence de vemurafenib après 96 heures, alors que la sensibilité au DCA était similaire à celle des cellules parentales, tant en présence qu’en l’absence de vemurafenib (figure 5B). Des résultats similaires ont été obtenus en mesurant les changements dans les niveaux d’ATP après un traitement avec les mêmes médicaments pendant 24 heures (Figure 5C). L’ensemble de ces données montre que les cellules de mélanome résistantes au vemurafenib ont conservé leur sensibilité au DCA, malgré la modification de leur profil métabolique.

Discussion

La thérapie métabolique ciblée pour le cancer a été principalement axée sur le ciblage de l’approvisionnement en énergie par l’inhibition de la glycolyse. Cependant, la reconnaissance du fait que les mitochondries peuvent contribuer activement à la progression du mélanome a accru l’attention portée au métabolisme oxydatif en tant que cible thérapeutique potentielle [10],[13],[29]. Le DCA favorise l’activation de la PDH par la PDK, inversant la production de lactate en faveur de l’afflux de pyruvate dans les mitochondries [15],[18]. Par ce mécanisme, le DCA améliore le couplage entre la glycolyse et la respiration mitochondriale, ce qui aura un impact plus important sur les cellules présentant un couplage déficient, comme les cellules cancéreuses [18]. Toutes les lignées cellulaires de mélanome examinées dans notre étude ont répondu au DCA par une réduction de la production de lactate et une augmentation de la RCO. Ce déplacement vers la respiration mitochondriale était censé optimiser l’utilisation des substrats et conduire à un rendement énergétique plus efficace, mais il a plutôt conduit à une baisse significative des niveaux d’ATP malgré un couplage ATP mitochondrial non affecté ou même accru. La réduction observée de l’ECAR en réponse au DCA suggère que l’inhibition de la glycolyse pourrait être un facteur important de la privation d’énergie. Un mécanisme d’inhibition de la glycolyse par le DCA n’a pas été décrit précédemment. Cependant, il a été démontré que la pyruvate kinase, le dernier site de production d’ATP dans la voie glycolytique, est régulée négativement par l’acétyl coenzyme A (acétyl-CoA) [30]. Comme l’activation de la PDH augmente directement la formation d’acétyl-CoA [31], cela pourrait expliquer l’inhibition de la glycolyse par le DCA. La similitude structurelle entre le DCA et le pyruvate [32] pourrait également impliquer une inhibition directe de la glycolyse par le DCA, peut-être par un mécanisme de rétroaction allostérique.

La réponse métabolique au DCA s’est accompagnée d’une réduction de la prolifération des cellules de mélanome, indépendamment du statut du pilote génétique et des profils métaboliques de ces cellules. Plusieurs études précédentes ont démontré un effet apoptotique du DCA sur les cellules cancéreuses [13], [18],[19], [32]-[34]. Cependant, conformément à nos résultats, la réponse apoptotique n’a été déclenchée qu’à des concentrations trop élevées pour être cliniquement pertinentes [32]. Afin d’explorer davantage la pertinence clinique du DCA pour le traitement du mélanome, nous avons examiné l’efficacité de cet agent en combinaison avec le vemurafenib, un inhibiteur de BRAF. Ces expériences ont démontré un effet de potentialisation du DCA sur l’inhibition de la croissance des cellules de mélanome mutantes BRAFV600E. À de faibles concentrations de DCA qui, seules, n’avaient aucun effet sur la croissance cellulaire, l’association avec de faibles concentrations de vemurafenib avait un effet réducteur de croissance significativement plus fort que le vemurafenib seul. Cet effet de potentialisation du DCA s’est également traduit par la réduction des niveaux d’ATP. Des analyses biochimiques ont démontré la capacité de BRAFV600E à découpler la voie de détection de l’énergie LKB1-AMPK, favorisant la résistance à la privation d’énergie et empêchant une réponse apoptotique [8],[9]. Le traitement par des inhibiteurs de BRAF rétablit cette voie [35] et peut donc potentialiser la réponse aux composés qui réduisent la production d’ATP. Le DCA et le vémurafénib suppriment tous deux l’activité glycolytique dans les cellules de mélanome et les rendent ainsi plus dépendantes de la respiration mitochondriale [6]. Comme la glycolyse représente une grande partie de la production totale d’énergie dans ces cellules, l’inhibition de ce processus impose une forte demande au système oxydatif pour la production d’ATP. La moindre performance des mitochondries dans les cellules de mélanome pourrait expliquer l’incapacité de ces cellules à maintenir des niveaux d’ATP en présence de DCA et de vemurafenib. L’effet coopératif de ces composés dans la diminution des niveaux d’ATP suggère que le seuil énergétique favorisant l’arrêt de la croissance ou la mort cellulaire dans les cellules de mélanome peut être atteint avec des concentrations plus faibles de vemurafenib en présence de DCA.

Des études antérieures ont examiné la capacité des modulateurs métaboliques à améliorer l’effet thérapeutique des inhibiteurs de BRAF pour le traitement du mélanome. L’association du PLX4720 (un analogue du vémurafénib) avec l’un des deux biguanides antidiabétiques, la metformine et la phenformine, a montré une inhibition synergique de la viabilité des cellules de mélanome [35], [36]. Ces deux agents altèrent la synthèse de l’ATP en inhibant l’activité du complexe I mitochondrial, ce qui entraîne une réduction du rapport ATP/ADP et l’activation de la voie LKB1-AMPK pour supprimer la croissance [35],[36]. Contrairement au DCA, la metformine et la phenformine stimulent toutes deux la glycolyse et la production d’acide lactique [37],[38], ce qui pourrait expliquer les effets stimulant la croissance de la metformine sur certaines lignées cellulaires de mélanome lorsqu’elle est utilisée comme agent unique. En outre, les concentrations auxquelles la metformine était efficace étaient supérieures à un niveau thérapeutiquement pertinent [35]. La phenformine était significativement plus puissante que la metformine [36], mais a été associée à un risque élevé d’acidose lactique [39], et a été retirée du marché pour le traitement du diabète de type 2 dans de nombreux pays. En revanche, il a été démontré ici que le DCA potentialise l’effet du vemurafenib à des concentrations allant jusqu’à 1 mM, et il a été démontré précédemment qu’il avait peu d’effets indésirables lorsqu’il était administré aux patients [17], [19], [40]. Ces résultats laissent entrevoir un potentiel thérapeutique du DCA en tant que co-médicament pour le traitement par le vemurafenib du mélanome mutant BRAFV600E. Ceci a été renforcé par la démonstration que la sensibilité au DCA était conservée dans des lignées cellulaires de mélanome présentant une résistance acquise au vémurafénib. Bien que les cellules résistantes aient présenté un profil métabolique altéré avec une respiration mitochondriale maximale significativement accrue, comme l’ont également montré Corazao-Rozas et al. [41], elles étaient aussi sensibles au DCA que les cellules parentales sensibles au vemurafenib. Par conséquent, le DCA pourrait éventuellement fournir une stratégie pour prévenir l’apparition de sous-populations tolérantes au vemurafenib pendant le traitement initial et ainsi retarder ou prévenir le développement de la résistance.

Conclusions

Nous fournissons ici une compréhension plus élaborée des effets du DCA sur le métabolisme et la croissance des cellules de mélanome. La capacité du DCA à réduire les niveaux d’ATP et la croissance des mélanomes semble potentialiser l’effet du vemurafenib, un médicament déjà utilisé en clinique pour le traitement des mélanomes métastatiques mutants BRAFV600E. Il est important de noter que les cellules de mélanome ayant acquis une résistance au vemurafenib ont conservé leur sensibilité au DCA. Ces résultats devraient encourager la poursuite des recherches sur cette combinaison de médicaments et l’application in vivo du DCA.

Fichiers supplémentaires

Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1.(33K, doc)
Amorces de pyroséquençage pour l’amplification et le séquençage des points chauds de mutation BRAF et NRAS. Les amorces directes, inverses et de séquençage sont désignées par F, R et S, respectivement.

Fichier supplémentaire 2 :Figure S2.(8.5M, tiff)
Valeurs basales et maximales de l’OCR mitochondrial pour les lignées cellulaires de mélanome et les mélanocytes épidermiques humains (HEMn-LP). L’OCR mesuré après l’ajout de roténone/antimycine A (OCR non-mitochondrial) a été soustrait de toutes les valeurs. La ligne pointillée indique l’OCR basal de HEMn-LP. Les valeurs indiquées sont les moyennes de trois mesures indépendantes ± l’écart-type. Le test t de Students a été utilisé pour déterminer les différences entre HEMn-LP et les lignées cellulaires de mélanome (*p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Le ROC mitochondrial maximal pour ED-034 n’a pas été indiqué en raison d’une très grande variation entre quatre expériences indépendantes, allant de 6,19 à 58,36 pmoles/min/1 000 cellules.

Fichier supplémentaire 3 : Figure S3.(12M, tiff)
Réponse métabolique des cellules de mélanome au DCA Réponse relative des niveaux d’ECAR, d’OCR, d’OCR/ECAR et d’ATP après un traitement au DCA (0,1, 1 et 10 mM) pendant 2 h. Les barres d’erreur des trois premiers panneaux représentent les écarts types de trois mesures répétées de six échantillons parallèles. Les barres d’erreur dans le panneau inférieur représentent l’écart type de trois expériences indépendantes. Une ANOVA à échantillons appariés à une voie a été utilisée pour l’analyse statistique et le test HSD de Tukey a été utilisé pour déterminer la signification statistique (*p < 0,05 ; **p < 0,01).

Fichier supplémentaire 4 : Figure S4.(5.6M, tiff)
Statut allélaire de BRAF. Pyroséquençage du site de mutation BRAF c.1799 T > A dans ED-013 et le dérivé résistant au vemurafenib ED-013-R2. L’augmentation du ratio BRAF V600E/BRAF WT dans ED-013-R2 indique un gain du nombre de copies, ce qui pourrait expliquer la résistance au vemurafenib.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Contributions des auteurs

PG et CA ont planifié et organisé l’étude. CA a réalisé la majorité des expériences et le traitement des données. CD a planifié et réalisé le test de prolifération cellulaire et a aidé à interpréter les résultats. AB et TM ont aidé à préparer et à optimiser la conception de l’analyse métabolique sur l’instrument Seahorse XF. CA, AB et TM ont discuté et interprété les résultats de l’analyse métabolique. CA et PG ont rédigé le manuscrit avec les contributions et les révisions de CD, AB et TM. Le manuscrit final a été lu et approuvé par tous les auteurs.

Remerciements

Nous remercions le professeur Karsten Kristiansen (Département de biologie, Université de Copenhague) et le professeur associé Jacob B. Hansen (Département des sciences biomédicales, Université de Copenhague) qui ont fourni l’équipement et l’expertise technique pour l’analyse Seahorse XF. Cette étude a été soutenue par des subventions de la Société danoise du cancer et de la Fondation danoise pour la recherche sur le cancer.

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