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Zaida Torres-Cavazos1, Moisés Armides Franco-Molina2silvia Elena Santana-Krímskaya2, Cristina Rodríguez-Padilla2jorge Ramsy Kawas-Garza1gustavo Hernández-Vidal1gustavo Moreno-Degollado1et Diana Elisa Zamora-Ávila1

1 Posgrado Conjunto de las Facultades de Agronomía y Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nuevo León,
Ave. Universidad S/N, Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N. L., CP 66455, Mexique
2 Laboratorio de Inmunología y Virología, Unidad C, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León,
Ave. Universidad S/N, Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N. L., CP 66455, Mexique


Correspondance : Moisés Armides Franco-Molina ; [email protected]

Reçue : 13 juillet 2020
Révisé : 28 septembre 2020
Accepté : 14 octobre 2020
Publié : 7 novembre 2020

Résumé

Notre objectif principal était d’évaluer l’efficacité de l’argent et du dichloroacétate de sodium comme agents à double fonction à utiliser dans le traitement du mélanome. Cette stratégie est conçue pour augmenter l’activité de ces deux composés qui affectent l’intégrité de l’ADN et la mitochondrie à différents niveaux. De plus, nous avons évalué si le mécanisme de mort cellulaire induit par nos traitements était une mort cellulaire immunogène. Pour évaluer l’efficacité antitumorale, nous avons évalué le volume tumoral et la production du facteur de nécrose tumorale-α, du facteur nucléaire κ B (tous deux par ELISA), et les niveaux d’oxyde nitrique (kit de dosage colorimétrique Nitrate/Nitrite) ; pour la mort cellulaire immunogène, nous avons évalué la libération de motifs moléculaires associés au danger en utilisant l’immunohistochimie et la cytométrie de flux, ainsi qu’un défi in vivo. Nos résultats montrent que la combinaison de l’argent colloïdal et du dichloroacétate de sodium est plus efficace que chaque traitement seul et que le mécanisme antitumoral ne passe pas par la mort cellulaire immunogène. De plus, cette étude peut largement contribuer au développement de nanoparticules d’argent chargées en dichloroacétate et à la conception de formulations pharmacologiques ciblées pour combattre le mélanome ainsi que d’autres types de cancer.


Rédacteur académique : Yanis Toledaño Magaña

Copyright © 2020 Zaida Torres-Cavazos et al. Il s’agit d’un article en accès libre distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet l’utilisation, la distribution et la reproduction sans restriction sur n’importe quel support, à condition que l’œuvre originale soit correctement citée.


INTRODUCTION

Les thérapies ciblées ont augmenté les chances de survie des personnes atteintes de mélanome [1]; cependant, les cellules cancéreuses présentes dans la tumeur favorisent différentes voies métaboliques [2]; en conséquence, la tumeur finit par devenir résistante aux thérapies ciblées, en particulier celles conçues contre une seule cible [3].

Le développement de thérapies à base d’argent est un outil prometteur dans le traitement du cancer. Les ions d’argent et les nanoparticules d’argent induisent un stress oxydatif, un dysfonctionnement de la membrane mitochondriale, des dommages à l’ADN et une augmentation des cytokines [4]. Le mécanisme d’action exact varie en fonction des propriétés physiques et chimiques de la nanoparticule et du type de cancer [5]. En outre, l’utilisation clinique de l’argent colloïdal à des fins bactéricides et antivirales prouve que ce traitement est sûr [6],

7].

Le dichloroacétate de sodium (DCA) est un analogue du pyruvate qui interfère avec la glycolyse associée à la tumeur (effet Warburg), diminue la malignité du cancer et réduit la production de lactate en modifiant les voies métaboliques des cellules cancéreuses [8]. Une diminution du lactate contrecarre l’état acide du microenvironnement tumoral, réduisant ainsi la croissance tumorale et les métastases [8]. Le WZB117, un bis-hydroxybenzoate, le 2-désoxy-d-glucose, la metformine et le DCA réduisent la glycolyse et bloquent l’absorption du glucose dans les cellules cancéreuses. En cas de faible taux de glucose intracellulaire, les voies de biosynthèse, telles que la genèse des nucléotides et des acides aminés, sont interrompues en raison d’un manque de molécules intermédiaires, ce qui met un frein à la prolifération cellulaire. Malgré son utilisation en monothérapie ou en association avec la chimiothérapie, peu ou pas d’effets indésirables ont été signalés [9].

En raison de ces activités, nous avons évalué la mort cellulaire immunogène comme mécanisme d’action possible, en raison du nombre croissant d’études qui démontrent que les modèles moléculaires associés au danger (DAMP) cellulaires et mitochondriaux peuvent être activement libérés lorsqu’ils sont exposés à des stimuli externes [10]. La libération d’alarmines (Hsp70, HSP90, calréticuline, HMGB1, ATP, ADN et ARN) et de néo-antigènes tumoraux induit une réponse immunitaire spécifique à la tumeur qui élimine les cellules cancéreuses vivantes et le tissu tumoral résiduel, évitant ainsi la récidive du cancer [11].

L’objectif principal de cette étude était d’utiliser l’argent et le DCA comme agents à double fonction qui affectent l’intégrité de l’ADN et l’activité des mitochondries afin d’augmenter la réponse antitumorale dans le traitement du mélanome. En outre, cette étude pourrait servir de point de départ pour la prochaine étape de développement d’une formulation pharmacologique ciblée de nanoparticules d’argent chargées de dichloroacétate.

Matériel et méthodes

Réactifs
La solution de pénicilline-streptomycine, la solution de Ficoll-Hypaque, la solution de trypsine-EDTA, le milieu RPMI-1640, le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM/F-12) et la solution antibiotique-antimycotique à 1% ont été obtenus auprès de Life Technologies GIBCO, Grand Island, NY, USA. Le sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Culture cellulaire
La lignée cellulaire de mélanome murinB16F10a été achetée auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Les cellules ont été cultivées et maintenues dans le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco, complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine, à 37 °C et sous une atmosphère de 5 % deCO2.

Viabilité cellulaire
es cellules
(5 ×103 cellules/puits) ont été placées sur des plaques à 96 puits à fond plat et incubées pendant 24 heures à 37°C dans une atmosphère à 5% deCO2. Après incubation, le milieu de culture a été retiré, et de l’Ag (0,8mM à 6:5 × 10-5mM) ou du DCA (75mM/ml à 750mM/ml) dilué dans le même milieu ont été ajoutés. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 4h à 37°C et sous une atmosphère de 5% deCO2. Ensuite, le surnageant a été éliminé, et les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu DMEM/F-12. La viabilité cellulaire a été déterminée par la méthode de la résazurine (bleu alamar), et la cytotoxicité a été exprimée par la concentration d’inhibition de la croissance cellulaire à 50 % (DL50). Les résultats ont été donnés comme la moyenne ± l’écart type (ET) de trois expériences indépendantes. La DL50 de chaque traitement a été utilisée dans les expériences suivantes.

Détermination de la mort cellulaire
Pour déterminer la mort cellulaire, nous avons suivi la méthodologie décrite par Rodríguez-Salazar et al [12]. En bref, les cellules B16F10 (1 ×105) ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et cultivées pendant la nuit dans une atmosphère à 5% deCO2 à 37°C. Les cellules ont été traitées avec AgC (LD50) ou DCA (LD50) ou une combinaison de AgC (LD25) + DCA (LD25) pendant 5h. Après le traitement, les cellules ont été collectées et lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remises en suspension dans 100μlde tampon de liaison 1× (Hepes 0,1M pH 7,4, NaCl 1,4M et CaCl2 25 mM ; Sigma-Aldrich ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) complété par de l’Annexin V conjuguée à l’APC (5μl/échantillon) et de l’iodure de propidium (1μl/échantillon), incubé sur à 4°C et maintenu dans l’obscurité pendant 15 min. L’analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l’aide d’un cytomètre Accuri C6 ; le logiciel BD Accuri C6 version 1.0.264.21 a été utilisé pour l’analyse des données (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Animaux
Des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 et 10 semaines et pesant environ 23 (±2) g ont été achetées auprès des laboratoires Harlan (Mexico City, Mexique). Les souris ont été maintenues à une température de 25-29°C et à un cycle de 12h de lumière et 12h d’obscurité. De la nourriture et de l’eau leur ont été fournies ad libitum. Le protocole expérimental a été approuvé par le comité d’éthique pour l’expérimentation animale de la faculté des sciences biologiques de l’université autonome de Nuevo Leon (San Nicolas de los Garza, Mexique).

Implantation des tumeurs et administration du traitement
Lestumeursont été induites par voie sous-cutanée en injectant 1 x106 cellules B16F10 dans 200 μlde solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Sept jours après la transplantation des cellules B16F10, une masse tumorale notable est apparue, et les souris ont été réparties au hasard en quatre groupes (cinq souris par groupe). Le groupe témoin a reçu uniquement une solution saline. Le groupe DCA a reçu 50mg/kg de DCA, tandis que le groupe Ag a reçu 28mg/kg d’Ag. La solution saline, l’Ag et le DCA ont été administrés par voie péritumorale, quotidiennement, pendant 21 jours. Enfin, le groupe Ag + DCA a reçu les mêmes doses d’Ag et de DCA par voie péritumorale tous les deux jours, en alternant les traitements. La longueur et la largeur de la tumeur ont été mesurées chaque semaine, et le volume de la tumeur a été déterminé à l’aide de l’équation : L x W2, où L est le côté le plus long et W le côté le plus court. Les animaux ont été euthanasiés à la fin de l’étude (21 jours), et les tumeurs ont été excisées pour d’autres expériences.

ELISA pour la sous-unité p65 active de NF-κB
Pour mesurer l’activation de la sous-unité p65 de NF-κB, des extraits nucléaires ont été préparés à partir de 3 x106 cellules tumorales, en utilisant un kit d’extraction nucléaire selon le protocole du fabricant. Les niveaux de concentration de p65 nucléaire ont été déterminés par un test ELISA sensible (TRANS-AM, Active Motif, Rixensart, Belgique).

Production de TNF-α et de NO
Lestumeursont été macérées avec du RPMI et le surnageant recueilli et ajusté à une concentration de protéines par BSA et stocké à -20°C pour évaluation. Le TNF-α a été mesuré dans le surnageant tumoral par des tests immuno-enzymatiques (TNF alpha Mouse ELISA Kit ; Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific ; Viena, Autriche). Toutes les procédures de dosage ont été réalisées conformément au protocole du fabricant.

Le kit de dosage du nitrate/nitrite a été utilisé pour mesurer les niveaux de NO dans les homogénats tissulaires de la tumeur selon le protocole établi par le fabricant (kit de dosage colorimétrique du nitrate/nitrite ; Cayman Chemical, USA).

Immunocytochimie pour la détermination de HMGB1, HSP70 et HSP90
Les cellules (100 x103 cellules/puits) ont été ensemencées sur des lamelles de verre à 37°C et 5% deCO2 pendant 24 heures. Ensuite, les cellules ont été traitées avec Ag LD50 (2,8 x 10-5 mM), DCA LD50 (195 mM), ou Ag + DCA LD50 (2,8 x 10-5mM et 135 mM, respectivement) à 37°C et 5% deCO2 pendant 4 heures. Ensuite, les cellules ont été fixées avec du méthanol, bloquées avec du sérum de cheval normal (2,5%) (Vector Laboratories, ABC Kit) pendant 20 minutes, et incubées pendant 4 heures avec des anticorps monoclonaux de souris de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA) contre HMGB1 (sc-56698), HSP70 (sc-24), ou HSP90 (sc-7947), tous utilisés dans une dilution de 1 :1000. Ensuite, les cellules ont été incubées avec une IgG anti-souris/lapin biotinylée par HRP (Vector Laboratories, ABC Kit) pendant 1 heure et une solution Avidin-DH (Vector Laboratories, ABC Kit) pendant 30 minutes ; le DAB (3,3-diaminobenzidine) a ensuite été ajouté. Le chromogène DAB produit une réaction brune en présence de peroxydase (HRP). Les lames ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline de Mayer, déshydratées dans un gradient alcool-xylol, et montées avec Entellan® (résine synthétique) sur des lames de verre. Les cellules B16F10 non traitées ont été utilisées comme contrôle de l’expression basale de HMGB1, HSP70 et HSP90. L’expression de HMGB1, HSP70 et HSP90 (intensité de la coloration DAB) a été réalisée à l’aide du logiciel Fiji (ImageJ) version 2.0 comme décrit par Patera (2019). Les données sont présentées sous forme de densité optique DAB (=log (intensité max/intensité moyenne)) de cinq sections par lame. Trois expériences indépendantes ont été réalisées.

Cytométrie en flux pour la détermination de la calréticuline
Les cellules (50 x103 cellules/puits) ont été ensemencées sur des plaques à 24 puits à fixation ultra-faible à 37°C et 5% deCO2. Ensuite, les cellules ont été traitées avec Ag LD50 (2,8 x 10-5 mM), DCA LD50 (195 mM), ou Ag + DCA LD50 (2,4 x 10-5 mM et 135 mM, respectivement) à 37°C et 5% deCO2 pendant 4 heures. Ensuite, les cellules ont été récupérées et colorées avec un anticorps polyclonal de calréticuline conjugué à de la phycoérythrine pendant 1 heure à 37°C et 5% deCO2. Les cellules ont été lavées avec du PBS+sérum albumine bovine (BSA) (1 % ) et remises en suspension dans 200μlde PBS. Les événements ont été acquis dans le cytomètre en flux Accouri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Expériences de vaccination antitumoralein vivo
Pour la préparation du lysat cellulaire, nous avons suivi le protocole décrit par Rodríguez-Salazar et al. [12] avec des modifications mineures. En bref, les cellules B16F10 (5 x106) ont été traitées in vitro avec Ag (LD50) ou DCA (LD50) ou la combinaison Ag (LD25) + DCA (LD25) pendant 5h. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 260 × g pendant 10min et lavées deux fois avec du PBS. Enfin, les cellules ont été remises en suspension dans 200μlde PBS et inoculées par voie sous-cutanée dans le flanc gauche de la souris. Après 7 jours, les souris ont été confrontées à 5 x105 cellules B16F10 vivantes resuspendues dans 200 μlde PBS par injection sous-cutanée dans le flanc droit. L’incidence et la croissance tumorales ont été mesurées chaque jour aux deux sites d’injection pendant 30 jours avec un pied à coulisse numérique. Le volume tumoral a été calculé à l’aide de la formule suivante : V = (L x W2)/2, où V est le volume tumoral, L est la longueur de la tumeur et W est la largeur de la tumeur, même formule que celle utilisée précédemment par Rodríguez-Salazar et al [12].

Analyse statistique
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse de variance à sens unique (ANOVA) suivie du test de Dunnett, sauf indication contraire. Une différence statistiquement significative a été considérée à . Toutes les expériences ont été réalisées en triplicata.

Résultats

Le DCA-Ag a diminué la viabilité cellulaire des cellules de mélanome B16F10
Le traitement de l’Ag ou du DCA a induit une diminution de la viabilité cellulaire des cellules B16F10 de manière dose-dépendante par rapport au contrôle (p < 0:01) (Figures 1(a) et 1(b)). La DL25 (2,4 ×105mM) et la DL50 (2,8 ×105) ont été déterminées pour l’Ag (figure 1(a)) ; la DL25 (135mM) et la DL50 (195 mM) ont également été déterminées pour le DCA (figure 1(b)). Des doses plus faibles d’Ag et de DCA ont été nécessaires dans le cadre de la combinatoire pour atteindre la DL25 et la DL50 (figure 1(c)).

Figure 1 : viabilité cellulaire des cellules B16F10. Les cellules B16F10 ont été cultivées dans des plaques à 96 puits (5 ×103 cellules/puits) à 37°C et 5% deCO2 pendant 24 heures. Ensuite, les cellules ont été traitées avec Ag (0 – 6,5 × 10-5 mM), DCA (0-300 mM), ou Ag + DCA (0 – 2,8 × 10-5 mM et 0-195 mM, respectivement) pendant 4 heures. La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide du test à la résazurine ; brièvement, les traitements ont été retirés et les cellules ont été incubées avec le réactif à la résazurine (20 % v/v) pendant 1 heure ; passé ce délai, la fluorescence de la résorufine convertie a été déterminée à une longueur d’onde d’excitation de 530 nm et à une longueur d’onde d’émission de 590. L’augmentation du signal fluorescent a été quantifiée en tant que viabilité cellulaire. Les barres graphiques représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± l’écart-type. La différence statistique (p ≤ 0,05) a été déterminée avec le test post hoc de Dunnett. Il existe une différence statistique entre le contrôle et les barres marquées dans le graphique(∗).

Régression tumorale induite par l’Ag-DCA
L’administration de l’Ag, du DCA et de l’Ag + DCA a induit une régression du volume tumoral (p < 0:05) de manière dépendante du temps, en observant un meilleur effet chez les souris traitées par l’Ag + DCA (Figure 2(a)).

Figure 2 : Régression tumorale chez les souris porteuses de tumeurs de mélanome traitées par Ag + DCA. Des cellules viables B16F10 (0,5 ×106) ont été injectées dans le flanc gauche de souris C57BL/6. Les souris ont été réparties au hasard en 4 groupes expérimentaux : non traités (contrôle) ou traités avec Ag (28mg/kg), CA (500mg/kg), ou Ag ð28mg/kgÞ + DCA (500mg/kg). La croissance tumorale a été suivie quotidiennement jusqu’au sacrifice des souris et déterminée à l’aide de l’équation suivante : volume tumoral =(L × W2)/2, où L est le côté le plus long et W le côté le plus court (a). Des photographies représentatives des tumeurs ou des lésions restantes des souris de chaque groupe sont présentées (b). La barre graphique représente la moyenne ± l’écart-type des taux de TNF-α (c), de NF-κB p65 (d) et d’oxyde nitrique (e) de trois souris par groupe. Il existe une différence statistique (p ≤ 0,05) entre les barres marquées d’un (∗).

Les traitements à l’Ag, au DCA et à l’Ag + DCA ont diminué le TNF-α, le NF-κB et l’oxyde nitrique
Tous les traitements ont diminué de manière significative (p < 0:05) la production de TNF-α (Figure 2(c)), l’activité du NF-κB (Figure 2(d)) et la production d’oxyde nitrique (NO) par rapport au groupe témoin ; aucune différence significative n’a été observée entre les groupes traités (Figures 2(c)-2(e)).

Expression et localisation de HMGB1, HSP70 et HSP90 dans les cellules B16F10 traitées par Ag, DCA ou Ag + DCA
La localisation deHMGB1, HSP70 et HSP90 a été déterminée par microscopie (figure 3(a)). Dans les conditions de contrôle, HMGB1, HSP70 et HSP90 étaient indétectables ou localisés dans le noyau (Figure 3(a)). Le traitement par Ag a mobilisé HSP70 vers le cytoplasme et la membrane cellulaire, le traitement par DCA a mobilisé HMGB1 et HSP70 vers le cytoplasme et la membrane cellulaire, et le traitement combiné AgDCA a mobilisé HMGB1, HSP70 et HSP90 vers le cytoplasme et la membrane cellulaire (Figure 3(a)). Tous les traitements ont augmenté de façon significative (p < 0,05) l’expression de HMGB1 et de HSP70 ; cependant, seuls le DCA et Ag + DCA ont augmenté de façon significative (p < 0,05) l’expression de HSP90, par rapport au témoin (cellules B16F10 non traitées) (figure 3(b)).

Figure 3 : Immunocytochimie des cellules B16F10. Les cellules B16F10 ont été cultivées dans des plaques à 6 puits (100 ×103 cellules/puits) sur des lamelles de verre à 37°C et 5% deCO2 pendant 24 heures. Ensuite, les cellules ont été traitées avec Ag (2,8 × 10-5mM), DCA (195mM), ou Ag + DCA (2,4 × 10-5mMet 135mM, respectivement) pendant 4 heures et fixées avec du méthanol à 100%. Des anticorps primaires pour HMGB1, HSP70 et HSP90 ont été appliqués, suivis par un anticorps secondaire HRP et un kit de substrat ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Les cellules ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline (Vector), montées sur des lames et imagées à 40x. L’expression positive des protéines est mise en évidence par la présence d’une coloration brune dans le noyau cellulaire, le cytoplasme, ou les deux, et quantifiée à l’aide du logiciel d’analyse d’images Fiji (ImageJ) version 2.0. Des images représentatives de trois expériences indépendantes sont présentées (a). Il n’y a pas de différence statistique (p ≤ 0,05) entre les barres marquées du(∗) dans le graphique (b).

Exposition de la calréticuline dans les cellules traitées à l’Ag, au DCA ou à l’Ag + DCA
Les traitements à l’Ag, au DCA et à l’Ag + DCA n’induisent pas d’exposition de la surface de la calréticuline dans les cellules B16F10, par rapport au témoin (cellules B16F10 non traitées) (Figures 4(a) et 4(b)).

Figure 4 : Exposition de la surface de la calréticuline dans les cellules B16F10. Les cellules B16F10 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits (50 ×103 cellules/puits) à 37°C et 5% deCO2 pendant 24 heures. Ensuite, les cellules ont été traitées avec Ag (2,8 × 10-5mM), DCA (19mM), ou Ag + DCA (2,4 × 10-5mMet 135mM, respectivement) pendant 4 heures. L’exposition à la calréticuline a été déterminée par cytométrie de flux. La figure montre (a) des diagrammes à points représentatifs de la taille en fonction de la granularité de la population cellulaire analysée (ci-dessus) et des histogrammes représentatifs du nombre de cellules en fonction de l’intensité de la coloration. (b) Pourcentage de cellules moyen de la coloration positive ± l’écart type de trois expériences indépendantes. Il n’y a pas de différence statistique (p ≤ 0,05) entre les barres, comme déterminé par l’ANOVA à une voie et le test post hoc de Tukey.

Ag, DCA ou Ag + DCA n’induisent pas de mort cellulaire immunogène
Les cellulesB16F10lysées avec Ag, DCA et AgDCA n’empêchent pas l’implantation de tumeurs chez les souris C57BL/6 (figures 5(a)-5(d)).

Figure 5 : Implantation de tumeurs chez les souris vaccinées. Des souris C57BL/6 ont été divisées au hasard en 4 groupes : des souris sans immunisation (contrôle) et des souris immunisées avec des cellules B16F10 (5 ×106) lysées avec de l’Ag (6,5 × 10-5 mM), du DCA (300 mM) ou de l’Ag + DCA (2,8 × 10-5mM et 195 mM, respectivement). Sept jours après l’immunisation, les souris ont été stimulées par 0,5 ×106 cellules viables B16F10 injectées dans le flanc gauche. L’apparence de la tumeur a été surveillée quotidiennement par palpation, et le jour du sacrifice, le volume de la tumeur a été déterminé à l’aide de l’équation suivante : volume de la tumeur =(L ×W2)/2, où L est le côté le plus long et W le côté le plus court. L’image montre le pourcentage de souris sans tumeur (souris sans tumeur) (a), le volume de la tumeur (b) et le poids (c) au jour 12 après le test de provocation, ainsi qu’une souris, une tumeur et des poumons représentatifs de chaque groupe. (d) Il n’y a pas de différence statistique (p ≤ 0,05) entre les barres marquées du (∗) dans le graphique.

Discussion

L’effet cytotoxique de l’argent colloïdal (Ag), du dichloroacétate de sodium (DCA) et de leur combinaison a été évalué contre les cellules de mélanome murin B16F10. Nos résultats montrent que l’argent colloïdal a des effets antiprolifératifs sur les cellules B16F10, comme l’avait déjà signalé notre groupe de recherche [13]. D’autres rapports sur l’activité cytotoxique de l’argent contre les cellules de mélanome font référence aux nanoparticules d’argent, bien que le mécanisme de toxicité proposé reste le même [14]. Le DCA a également présenté un effet antiprolifératif contre les cellules de mélanome. De manière similaire, Rivera-Lazarín et al. ont rapporté une diminution dose-dépendante de la viabilité des cellules B16F10 traitées au DCA [15].

L’activité cytotoxique de l’Ag et du DCA a augmenté lorsqu’ils ont été utilisés comme traitement combiné. Ce résultat était attendu puisque la combinaison de deux ou plusieurs agents est une pierre angulaire du traitement du cancer ; elle permet de cibler simultanément des voies clés et d’obtenir une efficacité accrue [16].

Après avoir observé l’augmentation de l’effet cytotoxique, nous avons évalué si nos résultats étaient corrélés à une activité antitumorale in vivo. Au niveau de la tumeur, la génération de nécrose a été notée ; il convient de mentionner que les lésions ont complètement guéri dans tous les cas d’élimination de la tumeur. Les lésions cutanées peuvent être dues à la surexpression du facteur de nécrose tumorale alpha [17]. Nos résultats ont révélé des niveaux plus élevés de TNF-α dans les mélanomes non traités et une diminution significative de ce facteur en réponse à tous nos traitements. Le TNF-α est corrélé avec l’agressivité des mélanomes et leur potentiel métastatique in vivo [18], et sa surexpression a été rapportée dans les mélanomes primaires avancés par Rossi et al [19].

Il est important de mentionner que le TNF-α est une cytokine pléiotrope, et que ses effets proapoptotiques contre les cellules cancéreuses ont été largement décrits [20]; cependant, les cellules de mélanome résistent à l’apoptose induitepar le TNF-α par le biais du NF-κBet de l’oxyde nitrique [21].

Dans cette étude, nos résultats ont montré une diminution du NF-κBet de l’oxyde nitrique chez les souris traitées par Ag, DCA, ou la combinaison des deux, en corrélation avec la régression tumorale. Wang et al. ont rapporté que NF-κBsupprime l’apoptose médiéepar le TNF-α par l’activation des protéines antiapoptotiques TRAF1, TRAF2, c-IAP1 et c-IAP2 [22]. D’autre part, Salvucci et al. ont signalé la production d’oxyde nitrique dans les cellules de mélanome humain, et le blocage de cette production induit la mort cellulaire dans le mélanome humain [23]. Plus précisément, l’oxyde nitrique inhibe au moins sept caspases par s-nitrosylation [24]

.

Malgré nos observations, il est important de mentionner que le TNF-α, le NF-κBet le NO ont des effets pléiotropiques, et que leur rôle dans le mélanome n’est pas bien compris. Cependant, nous soulignons que nos résultats indiquent que ces molécules diminuent en corrélation avec la régression tumorale et la cicatrisation.

De nombreuses thérapies anticancéreuses ont le potentiel d’induire la mort des cellules cancéreuses, entraînant l’élimination de la tumeur et l’absence de malignité chez le patient. Cependant, seuls les inducteurs de la mort cellulaire immunogène peuvent prévenir la récidive du cancer. Par conséquent, les médicaments qui induisent la mort cellulaire immunogène représentent une innovation récente dans le domaine de l’onco-immunothérapie [25], comme c’est le cas de l’utilisation de l’immunomodulateur IMMUNEPOTENT CRP, qui a récemment démontré cette capacité [12]. Nous avons cherché à évaluer si nos traitements étaient capables d’induire une mort cellulaire immunogène.

La présence d’alarmines in vitro indique la possibilité d’induire une mort cellulaire immunogène [26]. Cependant, malgré l’augmentation des HMGB1, HSP70 et HSP90 (mais pas de la calréticuline) en fonction du traitement, la vaccination de souris avec des cellules B16F10 lysées par Ag, DCA ou la combinaison Ag + DCA n’a pas induit de mort cellulaire immunogène, comme en témoigne l’apparition de tumeurs chez toutes les souris (vaccinées ou non) après provocation par des cellules B16F10 viables. La croissance tumorale indique qu’une réponse immunitaire spécifique n’a pas été induite par les vaccins. Cela pourrait s’expliquer par le fait que le DCA, l’Ag et le DCA + Ag n’induisent pas la libération de DAMPs dans un schéma spatio-temporel coordonné ; ils n’ont donc pas la capacité d’induire des cytokines et une présentation efficace de l’antigène [27].

En conclusion, la combinaison de l’Ag et du DCA a des propriétés antitumorales potentielles contre les cellules de mélanome ; cependant, le mécanisme antitumoral in vivo n’est pas la mort cellulaire immunogène. Des études supplémentaires visant à élucider le mécanisme de mort cellulaire sont importantes afin de concevoir des stratégies et des combinaisons ayant une efficacité clinique contre le mélanome.

Disponibilité des données

Les données associées à ce manuscrit sont disponibles sur demande raisonnable.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêt.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la subvention A1-S-35951 du « Fondo Sectorial de Investigación para la Educación », CONACYT, México. Nous remercions MsC. Alejandra Arreola Triana pour la révision du manuscrit.

RÉFÉRENCES


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