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Tatjana Harting1, Mandy Stubbendorff 2, Saskia Willenbrock1, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek3, Anaclet Ngezahayo3, Hugo Murua Escobar1, Ingo Nolte1

1 Clinique des petits animaux, Université de médecine vétérinaire de Hanovre, Fondation, D-30559 Hanovre
2 Division de médecine clinique III, hématologie, oncologie et médecine palliative, Université de Rostock, D-18057 Rostock
3 Evotec AG, D-22419 Hambourg
4 Institut de biophysique, Université Leibniz, D-30419 Hanovre, Allemagne


Correspondance : Professeur Ingo Nolte, Clinique des petits animaux, Université de médecine vétérinaire de Hanovre, Fondation, Bünteweg 9, D-30559 Hanovre, Allemagne ; Courriel : [email protected]

Reçue : 12 juillet 2016
Accepté : 5 septembre 2016
Publié en ligne : 5 octobre 2016

Résumé

L’effet Warburg décrit la capacité des cellules cancéreuses à produire de l’énergie via la glycolyse aérobie au lieu de la phosphorylation oxydative du pyruvate. Cette déviation du métabolisme mitochondrial inhibe l’apoptose, permettant une prolifération accrue dans des conditions de niveaux d’oxygène réduits. Le dichloroacétate (DCA) a été utilisé avec succès dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines pour réactiver la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L’objectif de cette étude était la caractérisation et la réponse des lignées cellulaires cancéreuses canines après une exposition au DCA. L’effet de 10 mM de DCA a été caractérisé in vitro sur un ensemble de six lignées cellulaires canines dérivées de l’adénocarcinome de la prostate et du carcinome des cellules transitionnelles (TCC). Le nombre de cellules, les niveaux de lactate, l’apoptose, l’expression des protéines apoptotiques, les facteurs de survie et différents miRNA ont été analysés. De plus, l’activité métabolique, l’activité mitochondriale et la prolifération ont été étudiées. Le DCA a diminué de manière significative le nombre de cellules de toutes les lignées cellulaires utilisées, sauf une, et a conduit à une réduction significative de la libération de lactate. Une diminution des niveaux de survivine a été trouvée dans toutes les lignées cellulaires, dont deux ont présenté une réduction significative de l’activité métabolique. Une augmentation des niveaux de miR-375 a été mesurée dans toutes les lignées cellulaires TCC. La réactivation de la pyruvate déshydrogénase et une activité mitochondriale élevée semblent induire la transition de la glycolyse aérobie vers la phosphorylation oxydative. En outre, ces résultats montrent que le traitement au DCA a un effet suppresseur sur la prolifération des cellules cancéreuses canines.


Mots clés : dichloroacétate, adénocarcinome prostatique canin, carcinome cellulaire transitionnel canin, effet Warburg
DOI : 10.3892/ijo.2016.3720


INTRODUCTION

Ces dernières années, les traitements anticancéreux tels que la chimiothérapie, la radiothérapie et la chirurgie, tels qu’ils sont utilisés dans le traitement du cancer chez l’homme, sont devenus plus importants en médecine vétérinaire. Les agents chimiothérapeutiques conventionnels ciblent les cellules qui se divisent, les cellules cancéreuses comme les cellules non néoplasiques, provoquant plusieurs effets secondaires comme la myélosuppression, la diarrhée, les vomissements et l’anorexie [1]. En outre, en raison du stade avancé de la maladie et de la résistance du cancer de la prostate et de la vessie, le traitement est difficile et souvent associé à un mauvais pronostic [2,3]. Par conséquent, de nouvelles alternatives plus efficaces doivent être recherchées.

Le dichloroacétate (DCA), une petite molécule économique, affecte différentes voies métaboliques en inhibant la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK) [4,5]. Cela implique que la pyruvate déshydrogénase (PDH) est potentiellement activée indirectement par le DCA, ce qui entraîne un changement métabolique favorisant l’oxydation du pyruvate en acétyl-co-enzyme-A dans les mitochondries [5]. Malgré cela, au cours des dernières décennies, le DCA a été utilisé dans le traitement d’une multitude de troubles tels que l’acidose lactique congénitale [6,7], l’hypercholestérolémie [8], l’hyperglycémie [9], l’insuffisance cardiaque congestive [10] et, plus récemment, dans la recherche sur le cancer [11-16]. Le DCA a été testé dans différentes approches in vitro dans le domaine de l’oncologie humaine, notamment le cancer colorectal [17,18], le cancer de l’endomètre [14], le carcinome spinocellulaire oral [19 ] et le cancer du sein [20]. Dans un essai clinique analysant des patients atteints de glioblastome et d’autres tumeurs solides, le DCA a réduit la croissance tumorale et l’angiogenèse [15]. À l’exception de plusieurs études portant sur les effets pharmacocinétiques du DCA chez le chien [21-23], il n’existe actuellement aucune publication sur l’effet du DCA dans le cancer canin. Cependant, le DCA a été utilisé avec succès chez des chiens souffrant d’acidose lactique [24] et serait bien toléré chez les chiens [22]. Des effets secondaires graves, tels que la mort et la paralysie, n’ont été observés que dans une étude à long terme portant sur des doses élevées [21].

Dans des conditions aérobies, les cellules non néoplasiques se réfèrent à l’oxydation du glucose via les mitochondries qui oxydent le pyruvate en acétyl-co-enzyme-A [25]. La PDH permet au pyruvate d’entrer dans les mitochondries. La production d’énergie des cellules cancéreuses est principalement déplacée de l’oxydation du glucose vers la glycolyse aérobie, ce qui entraîne une augmentation de la production de lactate cytosolique malgré la présence d’une quantité suffisante d’oxygène [26]. Ce comportement est appelé effet Warburg. Le biochimiste Otto Warburg a été le premier à signaler ces caractéristiques en 1926 et a émis l’hypothèse qu’une défaillance mitochondriale pouvait en être la cause [26]. La cancérogenèse se déclenche de préférence dans les tissus hypoxiques où la consommation de glucose est faible. En conséquence, le facteur 1α inductible par l’hypoxie est activé et entraîne une régulation à la hausse des transporteurs de glucose et de la PDK. L’activation de la PDK entraîne l’inhibition de la PDH et donc de la glycolyse [27,28]. En raison de ce changement métabolique et de la diminution de la dépolarisation mitochondriale, les cellules cancéreuses ont un avantage de survie et ne sont pas affectées par les voies intrinsèques d’apoptose [29,30].

Pour l’évaluation préclinique des médicaments anticancéreux, les expériences in vitro avec des lignées cellulaires sont des approches importantes dans la recherche humaine comme dans la recherche vétérinaire. Les investigations in vitro offrent la possibilité de recevoir plus d’informations sur l’efficacité et la sensibilité de plusieurs entités tumorales [31-33]. Dans cette étude, plusieurs lignées cellulaires établies [34] et nouvelles ont été utilisées.

A notre connaissance, il s’agit de la première étude dans laquelle l’effet du DCA sur les cellules de l’adénocarcinome de la prostate canine et du carcinome des cellules transitionnelles (TCC) a été étudié. L’influence du DCA sur le nombre de cellules, les niveaux de lactate, l’activité mitochondriale, l’apoptose et l’activité métabolique a été déterminée. En outre, l’effet du DCA sur la PDH et sur les protéines impliquées dans l’apoptose a été évalué. L’effet du DCA sur plusieurs microARN (miR) n’a pas été déterminé auparavant. En outre, il n’existe aucune littérature sur l’influence du DCA sur le cancer de la vessie chez l’homme ou en médecine vétérinaire.

Matériel et méthodes

Lignées cellulaires et culture cellulaire

Trois adénocarcinomes de la prostate canins (DT08/46, CT1258, DT15/08) et trois TCC canins (DT08/40, DT15/06, DT15/09) ont été utilisés pour les expériences. Deux lignées cellulaires TCC (DT08/40 et DT15/09) provenaient de tissu prostatique et une TCC (DT15/06) de tissu vésical femelle. Les lignées cellulaires ont été classées comme adénocarcinome de la prostate ou TCC après examen pathohistologique des tissus initiaux. Toutes les lignées cellulaires ont été établies dans la Clinique des petits animaux de l’Université de médecine vétérinaire de Hanovre, en Allemagne. Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des flacons de 75 cm2 (TPP, Faust Lab Science, Klettgau, Allemagne) avec 10 ml de milieu 199 (Gibco™, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne), 10% de sérum de veau fœtal (Hyclone®, Thermo Fisher Scientific), 2% de pénicilline-streptomycine (Biochrom, Berlin, Allemagne), un changement de milieu a été effectué toutes les 48 h. Les cellules ont été laissées croître jusqu’à une densité de 90% avant d’être divisées 1:3. Les cellules ont été incubées à 37°C et 5% deCO2 dans de l’air humidifié. Pour les expériences, les cellules ont été traitées avec 10 mM de DCA (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Allemagne) pendant 48 h. Pour le fractionnement des cellules ou après la période de traitement, les cellules ont été trypsinisées avec TrypLE™ Express (Gibco™, Thermo Fisher Scientific) et le nombre de cellules a été compté avec un Cellometer™ Auto T4 automatisé (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) et comparé au contrôle négatif. Les cellules ont été lavées avec du PBS (Biochrom) et stockées à -80°C pour les examens ultérieurs (RT-PCR quantitative et analyse des protéines). Le DCA a été dissous dans de l’eau désionisée, stérilisé par filtration et le pH a été ajusté à 7,4 avec du NaOH. La dose de 10 mM a été choisie en fonction d’études précédentes sur des cellules HeLa humaines [14]. Même si cette concentration ne peut être atteinte en toute sécurité in vivo, elle a été choisie pour permettre la comparaison avec d’autres études humaines in vitro.

Niveaux de lactate

Pour mesurer les niveaux de lactate, le surnageant de la culture cellulaire a été centrifugé à 1 000 rpm pendant 10 minutes pour éliminer les cellules flottantes et les débris, puis 1,3 ml ont été transférés dans un récipient en fluorure de sodium (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne). Pour éliminer les altérations dues au rouge de phénol et au lactate natif du sérum de veau fœtal, le milieu a été utilisé comme contrôle négatif et déduit des mesures. La détermination colorimétrique du lactate a été effectuée avec le Cobas® C311 (Hitachi, Tokyo, Japon). Pour mettre en relation les niveaux de lactate évalués avec le nombre et le volume des cellules, la teneur totale en lactate a été normalisée par rapport à la concentration protéique intracellulaire qui a été déterminée avec le test Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant.

Activité métabolique

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits (Falcon, Corning, Amsterdam, Pays-Bas) avec 200 μl de milieu 199, 10% de sérum de veau fœtal, 2% de pénicilline-streptomycine et incubées à 37°C et 5% deCO2 humidifié. Le milieu a été changé toutes les 24 h et pour la mesure, 20 μl de MTT (test CellTiter96® Aqueous One Solution, Promega, Mannheim, Allemagne) ont été ajoutés dans chaque puits. L’absorbance a été déterminée après 2 h avec un lecteur de plaques Synergy2 (BioTek, Bad Friedrichshall, Allemagne). Les mesures ont été effectuées toutes les 24 h sur une période de quatre jours. Les données ont été analysées avec le logiciel Gen5™ 1.11 (BioTek) et normalisées par rapport au contrôle négatif du milieu.

Cytométrie en flux

Pour la détermination de l’apoptose,105 cellules ont été cultivées dans une plaque à 6 puits (TPP, Faust Lab Science) avec 4 ml de milieu et traitées avec 10 mM de DCA comme décrit ci-dessus pendant 48 h. Après cette période, les cellules ont été trypsinées et centrifugées avec le milieu contenant les cellules non adhérentes et mortes à 1 000 rpm pendant 6 min. Le surnageant a été jeté et les cellules ont été remises en suspension dans 500 μl de tampon de dosage. La coloration a été réalisée avec 5 μl d’Annexin-FITC et 1 μl de Sytox (kit de détection Annexin V-FITC Plus, PromoCell, Heidelberg, Allemagne). Après une incubation de 5 minutes à température ambiante,104 cellules ont été analysées avec BD FACScalibur™ (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne) et le logiciel CellQuest™ Pro 6.0 (BD Biosciences). L’Annexin et le Sytox ont été détectés dans le FL-1. L’analyse des données a été réalisée avec FlowJo Version 10.0.8r1 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Les portes ont été fixées par la moyenne des contrôles positifs (cellules perméabilisées par la saponine) et des contrôles négatifs de chaque lignée cellulaire (cellules viables non traitées).

Isolement de l’ARN et RT-PCR quantitative

L’ARN total a été isolé à partir de106 cellules à l’aide du kit NucleoSpin Small RNA (Macherey Nagel, Düren, Allemagne) comme décrit dans le protocole du fabricant. L’ADNc a été préparé avec 35 ng d’ARN total par transcription inverse à l’aide du kit de transcription inverse TaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. La quantification relative de l’expression des microARN des cellules traitées par rapport au contrôle négatif a été réalisée avec le cycleur Eppendorf realplex4 (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Allemagne) en utilisant 1.33 μl d’ADNc dans un volume total de 20 μl contenant le mélange maître universel TaqMan® NoAmpErase® UNG (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) et les tests TaqMan® MicroRNA pour Mir-141 (ID 245445_mat), Mir-145 (ID 002278), Mir-375 (ID 000564) achetés chez Thermo Fisher Scientific. La procédure a été maintenue comme décrit dans le protocole du fabricant. Les données ont été normalisées par rapport au gène de référence RNU6B (ID 001093) et l’analyse a été réalisée avec Rest2009 (Qiagen, Hilden, Allemagne).

Analyse des billes magnétiques Luminex

L’analyse de l’expression protéique a été réalisée avec la technologie de billes xMAP® Luminex à l’aide d’un instrument Luminex 200™ (Luminex Corp., Hertogenbosch, Pays-Bas). Les données sont présentées sous forme de quantité totale (pg/ml de survivine) ou de MFI net (autres cibles) et ont été affichées avec le logiciel xPONENT 3.1 (Luminex Corp.). Les résultats des échantillons présentant des valeurs inférieures comme MFI < MFI de fond + 2× l’écart-type ont été exclus de l’analyse. La quantification de la survivine a été réalisée avec le kit ProcartaPlex Human Survivin Simplex (eBioscience, Francfort-sur-le-Main, Allemagne) en utilisant le surnageant de culture cellulaire comme décrit dans le protocole du fabricant. La quantité de survivine a été normalisée par rapport à la concentration en protéines qui a été établie à l’aide du test BCA de Pierce (Thermo Fisher Scientific). Les protéines PDH et apoptotiques (BAD et JNK) ont été détectées à l’aide de tests multiplex de Merck Millipore (Multi-species PDH Complex Magnetic Bead Panel et 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead kit, Darmstadt, Allemagne). Les échantillons ont été traités comme décrit dans les instructions du fabricant. En outre, les échantillons destinés aux mesures de la PDH ont été filtrés à l’aide d’unités de filtration centrifuge ultrafree avec une taille de pore de 0,65 μm (Merck Millipore) à 7 000 tr/min pendant 4 min.

Activité mitochondriale

Les cellules cultivées sur des platines μ à 8 puits (Ibidi, Martinsried, Allemagne) traitées avec et sans 10 mM de DCA ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, lavées trois fois avec du HBSS contenant du calcium et du magnésium et colorées avec 4 μM MitoSox (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) pendant 15 min. Après la coloration, les cellules ont été lavées trois fois avec du HBSS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) et le noyau des cellules a été contre-coloré avec du DAPI (dilution de 1:1 000, Sigma-Aldrich GmbH) pendant 5 min. L’imagerie par fluorescence a été réalisée avec un microscope confocal inversé à balayage laser (Eclipse TE2000-E, Nikon, Düsseldorf, Allemagne) en utilisant un objectif 60× à immersion dans l’eau (Nikon). Les images ont été prises avec le logiciel EZ-C1 1.80 (Nikon). L’excitation a eu lieu avec un laser à diode à 408 nm (DAPI) et avec un laser hélium/néon à 543 nm (MitoSox). La fluorescence cellulaire totale du MitoSox, déduction faite du bruit de fond, a été analysée avec ImageJ et normalisée par rapport au nombre de cellules.

Coloration par immunofluorescence de Ki67 et TUNEL

Les cellules ont été ensemencées, fixées et lavées comme décrit ci-dessus. Après avoir été lavées avec du HBSS, les cellules ont été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,2 % pendant 20 minutes, puis lavées et incubées pendant la nuit avec un anticorps Ki67 polyclonal de lapin, spécifique de la race canine, à une dilution de 1:150 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Pour la coloration, un anticorps monoclonal anti-lapin Alexa Fluor® 555 (Cell Signaling Technology, Leiden, Pays-Bas) a été incubé pendant 1 h avec une dilution de 1:250 et les cellules ont été contre-colorées avec du DAPI (1:1 000) pendant 5 min. Le protocole d’imagerie par fluorescence était le même que celui décrit ci-dessus. La fluorescence totale des cellules a été établie comme décrit ci-dessus. Pour la coloration TUNEL, le kit Apoptag Fluorescein Direct (Merck Millipore) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. L’excitation a eu lieu avec un argonlaser à 488 nm et l’imagerie a été réalisée comme décrit ci-dessus. Le pourcentage de cellules positives au TUNEL a été évalué.

Analyse statistique

L’analyse statistique des données a été réalisée avec le logiciel SAS 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Pour la comparaison de deux moyennes, un test t bilatéral a été utilisé. La valeur de confiance a été fixée à 5 % (P<0,05) et a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Numération cellulaire après traitement au DCA

En comparaison avec les contrôles négatifs non traités, les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate DT08/46 (P<0,0001) et CT1258 (P=0,0122) ont montré un nombre de cellules significativement plus faible après traitement avec 10 mM de DCA pendant 48 h (Fig. 1A). La troisième lignée de cellules prostatiques DT15/08 DCA n’a pas montré une réduction significative (P=0,0748) mais une tendance à une quantité de cellules plus faible, respectivement un taux de prolifération plus faible dans la culture cellulaire native a été observée (Fig. 1A ). Comme le montre la figure 1B, le même effet décroissant du DCA a été observé dans toutes les lignées cellulaires TCC examinées : DT08/40 (P=0,0031), DT15/06 (P=0,0016) et DT15/09 (P=0,0143).

Figure 1 – Effet de 10 mM de DCA sur différentes cellules cancéreuses canines après 48 h. Après exposition au DCA, le nombre de cellules de toutes les lignées cellulaires a diminué de manière significative, à l’exception d’une lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate (DT15/08). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, n=3. La figure montre le nombre relatif de cellules par rapport au contrôle négatif (%). Le contrôle a été fixé à 100 %. L’analyse statistique a été déterminée par un test t bilatéral, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Lignées cellulaires d’adénocarcinome prostatique canin. (B) Lignées cellulaires de carcinome à cellules transitionnelles canines.

Taux de lactate dans le surnageant de la culture cellulaire après l’exposition au DCA
Pour évaluer l’effet de réduction de la libération de lactate du traitement au DCA après 48 heures, on a mesuré la quantité de lactate dans le surnageant de la culture cellulaire, respectivement. Dans toutes les lignées cellulaires des deux entités cancéreuses canines, 10 mM de DCA ont eu un effet significatif de réduction des lactates (Fig. 2).

Figure 2 – Effet du DCA 10 mM sur les niveaux de lactate après 48 h dans le surnageant de la culture cellulaire. Après le traitement au DCA, les niveaux de lactate ont diminué de manière significative dans toutes les lignées cellulaires. Les niveaux de lactate relatifs par rapport au contrôle négatif sont illustrés en tant que moyenne ± SD (%), n=3. Le contrôle a été fixé à 100 %. L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Lignées cellulaires d’adénocarcinome prostatique canin. (B) Lignées cellulaires de carcinome à cellules transitionnelles canin.

Activité métabolique après traitement au DCA sur une période de 96 h

Pour confirmer l’effet négatif sur la prolifération cellulaire, l’activité métabolique comme indicateur de la prolifération et de la viabilité cellulaire a été analysée par des tests MTT. Comme le montre la figure 3A, l’activité métabolique des DT15/08 était significativement réduite par rapport au contrôle négatif respectif après 48 h de traitement au DCA (P=0,0202). Après 96 h de traitement continu au DCA, l’activité métabolique était significative (P=0,007). Un effet similaire a été observé dans la lignée DT08/40 (Fig. 3B) après 96 h (P=0,0025) et dans la lignée DT15/06 (P=0,0419) après 96 h de traitement au DCA (données non présentées). Les lignées cellulaires DT08/46, CT1258 et DT15/09 n’ont montré aucun effet statistiquement significatif du DCA sur l’activité métabolique (données non présentées).

Figure 3 – Influence de 10 mM de DCA sur l’activité métabolique sur une période de 96 h en utilisant le test MTT. L’évaluation statistique a été effectuée par ANOVA, *P<0,05, **P<0,01. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, n=3. (A) Lignée cellulaire d’adénocarcinome prostatique canin DT15/08. Une diminution significative de l’activité métabolique a été observée après 48 h et une nouvelle réduction a été déterminée ≤96 h. (B) Lignée cellulaire de carcinome cellulaire transitionnel canin DT08/40. Au cours du temps, l’activité métabolique a légèrement diminué dans les 24 h et a atteint un niveau significatif après 96 h.
Prolifération après traitement au DCA sur 48 h

La prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires exposées à 10 mM de DCA a été analysée par coloration de Ki67 et visualisée par microscopie confocale à fluorescence. Le DCA a diminué la quantité de Ki67, ce qui indique une réduction de la prolifération cellulaire après 48 h dans toutes les lignées cellulaires évaluées, avec une signification (P<0,05) (Fig. 4).

Figure 4 – Effet de 10 mM de DCA sur la prolifération cellulaire par microscopie confocale à fluorescence après 48 h. Une diminution significative de la quantité de Ki67, indiquant une prolifération, a été déterminée dans toutes les lignées cellulaires. Les images de fluorescence montrent une diminution de la fluorescence totale des cellules positives au Ki67 par rapport au contrôle non traité (A-D). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (%), n=3. Le contrôle a été fixé à 100 %. L’analyse statistique a été réalisée avec un test t bilatéral, *P<0,05. (A) DT15/08 non traité. (B) DT15/08 traité avec 10 mM de DCA. (C) DT15/06 non traité. (D) DT15/06 traité avec 10 mM de DCA. Une diminution de la fluorescence de Ki67 a pu être observée dans DT15/08 ainsi que dans DT15/06. (E) Lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate canine. (F) Lignées cellulaires de carcinome des cellules transitionnelles canines.
Effet du DCA sur l’apoptose

L’effet de 10 mM de DCA sur l’apoptose et la viabilité a été évalué par cytométrie de flux avec Annexin et Sytox. En ce qui concerne l’apoptose et les cellules mortes, aucun effet statistiquement significatif n’a été noté dans aucune des lignées cellulaires (données non présentées). La confirmation des taux d’apoptose par cytométrie en flux a été effectuée par coloration TUNEL afin d’éliminer les effets négatifs de la trypsinisation sur les cellules cultivées. L’imagerie a été réalisée à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence. Les résultats confirment le taux d’apoptose dans toutes les lignées cellulaires traitées au DCA, à l’exception de DT15/06. Une diminution significative du taux d’apoptose a été observée dans les lignées DT15/08 (P=0,022) et DT15/09 (P=0,0265). DT15/06 a montré des valeurs d’apoptose significativement augmentées (P=0,041) (données non présentées). Les autres lignées cellulaires n’ont présenté aucune valeur d’apoptose significative.

Analyse de l’expression de Survivin avec la technologie des billes magnétiques xMAP®

Le DCA a diminué de façon significative la production de survivine dans la lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate DT08/46 (P=0,0053) et dans les lignées cellulaires TCC DT15/06 (P=0,0027) et DT15/09 (P=0,0206). Les lignées cellulaires CT1258 (P=0,0761), DT15/08 (P=0,1551) et DT08/40 (P=0,0598) n’ont montré aucun effet significatif sur la production de survivine (Fig. 5).

Figure 5 – Effet du DCA 10 mM sur l’expression de la survivine dans le surnageant après 48 h. Les niveaux de survivine ont été normalisés par rapport à la concentration de protéines intracellulaires. Par rapport au contrôle respectif, la quantité de survivine a diminué de manière significative dans une lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate (DT08/46) et dans deux lignées cellulaires TCC (DT15/06 et DT15/09). Les autres lignées cellulaires ont également montré une tendance décroissante mais non significative. Les données sont présentées sous forme de moyenne relative par rapport au contrôle négatif ± SD (%), n=3. Le contrôle a été fixé à 100 %. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’un test t bilatéral avec *P<0,05, **P<0,01. (A) Lignées cellulaires d’adénocarcinome prostatique canin. (B) Lignées cellulaires de carcinome à cellules transitionnelles canin.
Analyse de l’expression de Bcl-2-antagonist-of-cell-death (BAD) et de c-jun N-terminal kinases (JNK) avec la technologie des billes magnétiques xMAP

Après 48 heures d’incubation au DCA, la forme phosphorylée et donc inactive de la BAD n’a augmenté de manière significative que chez DT08/46 (P=0,0285), CT1258 (P=0,0039) et DT15/06 (P=0,0235). En outre, aucun effet du DCA n’a pu être observé sur la JNK active phosphorylée, à l’exception de DT08/46 (P=0,0044) qui a affiché des valeurs réduites (données non présentées).

Analyse de l’expression de la pyruvate-déshydrogénase (PDH) avec la technologie des billes magnétiques xMAP

Pour confirmer la diminution des niveaux de lactate comme conséquence d’une glycolyse plus faible, la quantité de PDH phosphorylée (PDH-P) (Ser232, Ser293, Ser300) a été mesurée avec Luminex Magnetic Bead Technology. La diminution des niveaux de PDH-P et donc l’augmentation des enzymes actives sont associées à une augmentation de l’oxydation du pyruvate et du métabolisme de l’acétyl coenzyme A, ce qui entraîne une augmentation de l’activité du cycle TCA [35]. Dans la PDH-P (Ser232), une diminution statistiquement significative par rapport aux contrôles non traités a été observée dans toutes les lignées cellulaires, à l’exception de la DT08/46. Cette lignée cellulaire a montré un niveau de PDH-P (Ser232) plus élevé mais non significatif. La PDH-P au niveau du résidu Ser293 a été significativement affectée par le DCA uniquement dans les lignées cellulaires DT15/08 (P=0,0082) et DT15/06 (P=0,0122). Dans toutes les autres lignées cellulaires, aucun effet n’a pu être observé après le traitement au DCA. La PDH-P à Ser300 a été compromise par le DCA de manière significative dans les lignées DT08/46 (P=0,0060), CT1258 (P=0,0215), DT15/08 (P=0,0002) et DT15/06 (P=0,0097) (Tableau I).

Tableau I

Expression de PDH-P après l’exposition au DCA avec les valeurs moyennes relatives ± SD (%).

Lignée cellulairePDH-P Ser232Valeur PPDH-P Ser293Valeur PPDH-P Ser300Valeur P
Contrôle100100100
Adénocarcinome de la prostate
dT08/46121.2±31.50.2715127.7±27.80.090047.7±28.00.0060b
cT125811.0±5.10.0011b73.7±30.50.274024.3±19.50.0215a
dT15/0818.0±17.60.0026b39.7±19.20.0082b18.4±6.80.0002c
Carcinome à cellules transitionnelles
dT08/4014.3±10.20.0047b84.5±22.80.359448.6±32.10.1090
dT15/0628.2±17.70.0039b72.3±5.40.0122a39.1±10.40.0097b
dT15/0920.5±24.80.0308a99.8±71.30.996734.1±41.00.1085
Tableau I – Expression de PDH-P après exposition au DCA avec valeurs moyennes relatives ± SD (%).
PDH-P, pyruvate déshydrogénase phosphorylée ; Ser, sérine ; DCA, dichloroacétate ; ±, plus moins.
a P<0,05 ;
b P<0,01 ;
c P<0,001 ;
SD, écart-type ; %, pourcentage.
Activité mitochondriale après traitement au DCA

La vérification de l’altération métabolique de l’activité mitochondriale d’oxydation du glucose a été effectuée par la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dérivées des mitochondries. Dans les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate (Fig. 6E), une activité mitochondriale significativement accrue a été observée dans CT1258 (P=0,0153). Les lignées cellulaires DT08/46 (P=0,2829) et DT15/08 (P=0,3082) n’ont présenté aucun effet de diminution après le traitement au DCA. En revanche, le DCA a pu augmenter l’activité mitochondriale de manière significative (P<0,05) dans toutes les lignées cellulaires TCC (Fig. 6F).

Figure 6 – Détermination de l’activité mitochondriale par microscopie confocale à fluorescence après exposition à 10 mM de DCA pendant 48 h. Les ROS dérivés des mitochondries ont été colorés avec MitoSox (rouge) et les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI (bleu). L’activité mitochondriale exprimée par l’augmentation de la production de ROS était significativement accrue dans la lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate CT1258. DT08/46 a montré une diminution significative et DT15/08 aucun effet sur la production de ROS. En revanche, toutes les lignées cellulaires TCC présentaient une augmentation significative des activités mitochondriales (F). En comparaison avec le contrôle négatif, les cellules traitées montrent une fluorescence rouge apparemment plus élevée (A-D). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (%), n=3. Le contrôle a été fixé à 100 %. L’analyse statistique a été réalisée avec un test t bilatéral, *P<0,05. (A) CT1258 non traité. (B) CT1258 traité. (C) DT15/06 non traité. (D) DT15/06 traité. (E) Lignées cellulaires d’adénocarcinome prostatique canin. (F) Lignées cellulaires de carcinome des cellules transitionnelles canines.
RT-PCR quantitative des miRNA

Pour évaluer si les taux de prolifération inférieurs observés sont corrélés à des changements dans les micro-ARN, trois miR impliqués dans la prolifération ou l’apoptose ont été évalués. L’expression du miR-141 a révélé des changements significatifs avec des niveaux réduits dans DT15/08 (P=0,0451) et des niveaux accrus dans DT08/40 (P=0,0135) par rapport aux contrôles non traités, tandis que DT08/46 (P=0,9285) et DT15/06 (P=0,1520) n’ont montré aucune différence par rapport aux contrôles. Dans CT1258 et DT15/09 miR-141 a été downregulated et exclu de l’analyse. DT08/46 (P=0.0322) a montré une expression plus faible et DT15/06 (P=0.0267) ainsi que DT15/09 (P=0.0031) une expression plus élevée de miR-375. La lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate CT1258 n’a montré aucun changement significatif dans tous les microARN examinés, respectivement. L’expression de miR-145 n’a été influencée par le traitement au DCA dans aucune des lignées cellulaires (exclues de l’analyse en raison de valeurs Ct >30). En résumé, les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate ont tendance à présenter une régulation négative de miR-141 (DT15/08) et de miR-375 (DT08/46, DT15/08), les lignées cellulaires de TCC ont présenté une régulation positive des deux (Fig. 7).

Figure 7 – Effet du DCA 10 mM sur l’expression du miR-141 et du miR-375 après 48 h. (A) Expression du microRNA-141. (B) Expression du microARN-375. Le miR-141 était significativement réduit dans la lignée cellulaire d’adénocarcinome de la prostate DT15/08 alors que DT08/46 n’a montré aucun effet observable en comparaison avec le contrôle négatif. Contrairement aux lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate, les lignées cellulaires de TCC DT08/40 et DT15/06 expriment des niveaux plus élevés de miR-141. CT1258 et DT15/09 ont présenté des expressions dérégulées et ont été exclues de l’analyse. L’analyse de l’expression de miR-375 a donné des résultats comparables. Après le traitement au DCA, les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate ont présenté des profils d’expression incohérents. DT08/46 a connu une augmentation significative et CT1258 ainsi que DT15/08 n’ont montré aucun effet sur les niveaux de miR-375. En revanche, les lignées cellulaires de TCC ont montré une expression régulée à la hausse du miR-375, en particulier DT15/06 et DT15/09. L’expression relative est présentée sous forme de moyenne relative ± SD, n=3. L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral, *P<0,05, **P<0,01.

Discussion

Le DCA a réduit le nombre de cellules dans l’adénocarcinome de la prostate et dans les lignées cellulaires de TCC. Cela peut se produire sur la base d’une prolifération réduite ou d’une apoptose accrue. Dans cette étude, un effet de réduction de la prolifération a été observé, indiqué par une diminution de Ki67 dans toutes les lignées cellulaires et des activités métaboliques plus faibles dans DT15/08 et DT08/40. Cette constatation est conforme aux résultats précédents présentés par Bonnet et al dans plusieurs lignées cellulaires humaines [35] et Sun et al dans le cancer du sein [12]. De plus, une diminution de la prolifération cellulaire après exposition au DCA a également été observée dans le carcinome de la prostate humaine [36], le cancer colorectal [37], le cancer du colon [11 ] et le cancer du poumon [38]. Cependant, l’induction d’une apoptose dépendante des mitochondries par le DCA, comme cela a été précédemment rapporté par plusieurs groupes de recherche [14,35,39], n’a pas pu être observée dans cette étude. Cependant, ce phénomène a également été observé par Feuerecker et al dans des cellules de neuroblastome murin et humain (40). Stockwin et al ont signalé que de fortes concentrations de DCA sont nécessaires pour induire l’apoptose [38]. Les résultats incohérents obtenus dans une lignée cellulaire (DT15/06) entre la cytométrie de flux et la coloration TUNEL ne permettent pas d’évaluer si le DCA affecte l’apoptose. Les résultats de l’expression des protéines apoptotiques JNK et BAD sont cohérents avec les effets observés dans toutes les autres lignées cellulaires et appuient l’hypothèse selon laquelle le DCA n’a pas eu d’influence sur l’apoptose dans les cellules cancéreuses canines de la prostate et du TCC.

Le taux de survivine, un inhibiteur de l’apoptose et un promoteur de tumeur [41,42], a diminué de façon significative dans toutes les lignées cellulaires qui présentaient une activité mitochondriale accrue (DT15/06, DT15/09). La diminution des niveaux de survivine est censée induire l’apoptose par les voies intrinsèques en activant la caspase-3 [41] et a été observée dans les lignées cellulaires du cancer de l’endomètre après exposition au DCA [14]. De manière inattendue, une augmentation de l’apoptose n’a pas pu être observée dans ces lignées cellulaires, à l’exception de la lignée DT15/06 (P=0,041) qui a montré une augmentation légère mais inconsistante de la mort cellulaire. Cela conduit à la conclusion que la diminution des niveaux de survivine peut entraîner une diminution de la prolifération. En outre, une dérégulation d’autres gènes impliqués dans l’induction de l’apoptose est concevable et expliquerait pourquoi la diminution des niveaux de survivine n’a pas entraîné d’apoptose.

Le DCA est un inhibiteur de la PDK qui active indirectement la PDH. En raison de la diminution des valeurs de PDH-P, le pyruvate peut être oxydé par les mitochondries [4,5]. Une diminution de la phosphorylation de la PDH a été observée dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines [16,37,43]. Conformément aux résultats publiés dans les lignées cellulaires humaines, cette étude a confirmé la diminution de la phosphorylation de la PDH dans toutes les cellules traitées par le DCA, ce qui est confirmé par la réduction de la libération de lactate dans toutes les lignées cellulaires. Cela indique que le DCA favorise l’oxydation du glucose dans les cellules cancéreuses canines ainsi que dans les cellules cancéreuses humaines. En outre, cette étude a révélé une augmentation des niveaux de ROS dans les mitochondries de toutes les lignées cellulaires, à l’exception de deux lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate. L’augmentation des espèces ROS dans les mitochondries, due à la respiration cellulaire, confirme la diminution des valeurs de PDH-P et la réduction du lactate. Il se pourrait que l’augmentation de l’activité mitochondriale n’entraîne pas l’apoptose, mais une augmentation de la respiration cellulaire empêchant la survie des cellules cancéreuses avec un métabolisme modifié. Cela pourrait expliquer l’augmentation de la viabilité des cellules après l’exposition au DCA. Une viabilité accrue après une exposition au DCA a également été observée par McPherson et al qui ont signalé une augmentation de l’oxydation du pyruvate et de la viabilité des embryons dans un modèle de souris âgée [44].

la régulation à la hausse de miR-375 a été signalée comme ayant des effets anti-prolifération dans de nombreuses cellules telles que le cancer gastrique [45], le cancer du pancréas [46], les cellules de type cardiomyocyte fœtal [47] et le cancer du côlon [48]. Dans la carcinogenèse de la prostate, le microARN-375 a des effets variables selon le phénotype de la tumeur. Costa-Pinheiro et al ont prouvé des effets anti-prolifératifs dans les cellules PC-3 dus à l’upregulation ainsi qu’une augmentation de l’apoptose dans les cellules 22Rv1 suite au knockdown du miR-375 [49]. Nos résultats montrent que la régulation vers le haut ou vers le bas du miR-375 après le traitement au DCA n’est pas constante dans les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate, ce qui est conforme aux conclusions décrites ci-dessus. En comparaison avec les cellules cancéreuses de la prostate, toutes les lignées cellulaires de TCC ont montré des niveaux accrus de miR-375. Il n’existe aucune littérature décrivant les effets du miR-375 dans le cancer de la vessie. Il est possible que ces résultats soient en accord avec les effets anti-prolifératifs qui sont décrits dans de nombreuses autres cellules. Les mêmes résultats ont été observés pour le microARN-141. Une régulation à la hausse du miR-141 a inhibé la prolifération du cancer et la progression du cycle cellulaire dans les cellules de neuroblastome [50]. De plus, le miR-141 est régulé à la baisse dans le cancer de la vessie avec invasion musculaire [51]. Dans notre étude, nous avons constaté que le miR-141 et le miR-375 étaient régulés à la hausse dans toutes les lignées cellulaires de TCC après le traitement au DCA, ce qui indique que ces changements entraînent des taux de prolifération plus faibles. Dans le cancer de la prostate, on rapporte que le miR-141 est régulé à la hausse [52]. Dans cette étude, les niveaux de miR-141 ont légèrement diminué, mais nous supposons que cet effet est trop faible pour affecter les cellules cancéreuses. Cependant, une analyse permettant de déterminer si un lien direct entre le DCA et les modifications des différents microARN est à l’origine des réponses biologiques observées nécessiterait une approche transcriptomique complète.

En conclusion, cette étude montre que les lignées cellulaires cancéreuses canines répondent au traitement par le DCA et que l’effet peut être réduit à une diminution des taux de prolifération, une augmentation de l’oxydation du pyruvate et de l’activité mitochondriale. Les résultats montrent également des différences entre les entités cancéreuses examinées. Ainsi, les lignées cellulaires de TCC semblent réagir de manière constante et sont plus sensibles au traitement par DCA que les lignées cellulaires d’adénocarcinome de la prostate. Par rapport à la plupart des lignées cellulaires humaines, le DCA n’a pas eu d’effet sur l’apoptose, ce qui pourrait signifier que le DCA pourrait être utile pour limiter la croissance tumorale dans le cancer canin, mais pas pour en réduire la taille.

De plus, le DCA peut être avantageux pour sensibiliser les cellules cancéreuses canines à d’autres médicaments anticancéreux et pourrait donc être approprié pour les thérapies combinées [53]. Pour garantir des concentrations plus élevées de DCA dans les tissus cancéreux et éviter les effets secondaires graves et généralisés, une thérapie intralésionnelle, comparable à la chimiothérapie intravésicale chez l’homme [54] et les chiens atteints de TCC [55,56], pourrait être une autre possibilité. La concentration de 10 mM de DCA a été choisie pour permettre la comparaison avec d’autres études humaines in vitro [14,18,37]. Pour les études cliniques, la concentration de DCA doit être réévaluée en ce qui concerne la compatibilité et les effets secondaires négatifs. Il convient donc d’examiner d’autres études avec des concentrations de DCA plus faibles.

Abréviations :

DCAdichloroacétate
PDHpyruvate déshydrogénase
PDKpyruvate déshydrogénase kinase
TCCcarcinome à cellules transitionnelles
ARNacide ribonucléique
PCRréaction en chaîne par polymérase
JNKkinases c-jun N-terminales
BADBcl-2-antagoniste-de-la-mort-cellulaire
ROSespèces réactives de l’oxygène
PBSsolution saline tamponnée au phosphate

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