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Zheng Yang1, Kin Y. Tam1

1 Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Macao, Taipa, Macao, China.

Correspondencia: Kin Y. Tam
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Macao, Taipa, Macao, Chin

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Tel.: +853-88224988
Fax: +853-88222314.
Correo electrónico: [email protected]

Recibido: 15 de abril de 2016
Revisado: 27 de julio de 2016
Aceptado: 2 de agosto de 2016

Resumen

La glucólisis se ha observado como un proceso predominante para la mayoría de las células cancerosas para utilizar la glucosa, que se conoce como «Efecto Warburg». Dirigirse a enzimas críticas, como la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK) que regula inversamente el proceso de la glucólisis, podría ser un enfoque prometedor para trabajar solo o en combinación con otros tratamientos para la terapia del cáncer. Los inhibidores del EGFR para el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) se han aplicado durante décadas en la práctica clínica con gran éxito, pero también sus beneficios clínicos se han visto algo obstaculizados por el aumento de la resistencia adquirida. La terapia farmacológica combinada es una estrategia eficaz para hacer frente a este reto. En este estudio, utilizamos dicloroacetato (DCA), un inhibidor de la PDK ampliamente reconocido, junto con erlotinib y gefitinib, dos conocidos inhibidores del EGFR, y demostramos que las aplicaciones de DCA en combinación con erlotinib o gefitinib atenuaban significativamente la viabilidad de las células de CPNM mutantes del EGFR (NCI-H1975 y NCI-H1650) de forma sinérgica. Este resultado sinérgico parece ser un efecto combinado en la promoción de la apoptosis, más que una co-supresión de las vías de señalización EGFR o PDK. Además, hemos demostrado que el tratamiento combinado no mostró efecto sinérgico en otras líneas celulares de CPNM sin mutaciones del EGFR (A549 o NCI-H460). En conjunto, estas observaciones sugieren que el tratamiento combinado de EGFR y PDK en células de CPNM ejerce efectos sinérgicos de forma dependiente de la mutación de EGFR.


Palabras clave: Piruvato deshidrogenasa cinasa; Dicloroacetato; Receptor del factor de crecimiento epidérmico; Erlotinib; Gefitinib; Combinación de fármacos

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INTRODUCCIÓN

Según las últimas estadísticas, el cáncer de pulmón ocupa el primer lugar en hombres y el quinto en mujeres entre los nuevos casos de cáncer diagnosticados y las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo (Jemal et al., 2011), y más del 80% de los pacientes pertenecen a la categoría de cáncer de pulmón no microcítico o CPNM (Ke et al., 2015). Las estrategias tradicionales para el tratamiento del CPNM a menudo recurrían a quimioterapias con mono-aplicación o administración combinada de productos químicos basados en platino u otros citotóxicos. Sin embargo, las tasas de respuesta objetiva de estas estrategias solían ser insatisfactorias, y la mediana de supervivencia global solía ser inferior a 1 año (Schiller et al., 2002, Pao y Chmielecki, 2010).

La mutación del EGFR se encontró en aproximadamente el 30% de los pacientes con CPNM, que a menudo respondieron bien a la terapia dirigida (Pao y Chmielecki, 2010). Esto permitió una amplia aplicación de pequeños inhibidores moleculares de la tirosina quinasa EGFR (EGFR-TKis), que tuvieron un enorme éxito en las últimas décadas (Hanahan y Weinberg, 2011), como lo ejemplifican Erlotinib y Gefitinib (Duttay Maity, 2007). Sin embargo, la resistencia adquirida solía producirse cuando los pacientes eran tratados con inhibidores del EGFR, con varios mecanismos identificados, como la mutación original o inducida del punto caliente T790M, la señalización secundaria activada como la amplificación de MET o la mutación de PI3K, o la transición epitelial a mesenquimal (EMT) conferida (Maione et al., 2015). Lamentablemente, las aplicaciones combinadas de inhibidores del EGFR con quimioterapias provocaron una mayor incidencia de efectos adversos, en lugar del beneficio esperado de prolongar la supervivencia global de los objetos tratados (Yan et al., 2015).

El metabolismo de las células cancerosas es un campo emergente basado en el descubrimiento y la investigación de más de medio siglo sobre el «efecto Warburg» (Ngo et al., 2015), que establece que las células cancerosas tienden a metabolizar la glucosa a través de la glucólisis, en lugar de la fosforilación oxidativa, para generar energía (Lu et al., 2015). Este fenómeno ha impulsado muchos estudios centrados en enzimas clave en el metabolismo de la glucosa, como los transportadores de glucosa (GLUT), la hexoquinasa 2 (HK2), la piruvato quinasa M2 (PKM2), la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK), la lactato deshidrogenasa A (LDHA) y la glutaminasa, lo que ha llevado al desarrollo de varios inhibidores dirigidos a enzimas específicas para la terapia contra el cáncer (Butler et al., 2013). Como inhibidor de la PDK, el dicloroacetato (DCA) puede atenuar la progresión del cáncer en muchos tipos diferentes de cáncer mediante la regulación a la baja de la fosforilación de la piruvato deshidrogenasa (p-PDH), controlada por la PDK (Kankotia y Stacpoole, 2014). Aunque se han publicado varios estudios de combinación relacionados con la aplicación del DCA para el tratamiento del CPNM, la mayoría de ellos se centraron en la quimioterapia citotóxica clásica, es decir, el uso combinado de DCA y fármacos basados en platino (Garon et al., 2014, Olszewski et al., 2010). Aún se desconoce si la combinación de DCA con EGFR-TKi en CPNM mutados por EGFR puede ejercer un efecto sinérgico en la terapia anticancerosa.

En este estudio, demostramos que la aplicación combinada de inhibidores del EGFR (Erlotinib o Gefitinib) con DCA inhibía sinérgicamente el crecimiento de las células NCI-H1975 y NCI-H1650. Además, exploramos los posibles mecanismos de los efectos combinados de los inhibidores de EGFR y PDK. Descubrimos que estas combinaciones sólo pueden mostrar sinergia en NCI-H1975 y NCI-H460, las líneas celulares de CPNM mutantes del EGFR, pero no en A549 o NCI-H460, las líneas celulares de CPNM de tipo salvaje del EGFR.

Materiales y métodos

Líneas celulares y reactivos
Las líneas celulares de CPNM, NCI-H1975, NCI-H1650 y A549, se adquirieron a ATCC, mientras que NCI-H460 fue un amable obsequio del Prof. Thomas Y.C. Leung (Departamento de Biología Aplicada y Tecnología Química, Facultad de Ciencias Aplicadas y Textiles, Universidad Politécnica de Hong Kong). Las células A549 se cultivaron en F-12K/DMEM 1:1 (Gibco), mientras que las demás líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco), con un suplemento del 10% de suero fetal bovino (Gibco), en una atmósfera humidificada con un 5% deCO2 a 37 °C.

El DCA se adquirió a Sigma y se disolvió en DMSO al 1% en PBS como solución madre (1,6 M), que luego se diluyó a varias concentraciones para formar las soluciones de trabajo finales que contenían DMSO al 0,1% en todo el medio para el tratamiento celular. Erlotinib y Gefitinib, ambos de SelleckChem, se disolvieron inicialmente en DMSO (Sigma) para formar la solución madre con la concentración de 160 mM, y se diluyeron a la concentración individual de medios de trabajo como la del DCA. Los anticuerpos primarios incluyendo p-PDH y PDH (Abcam) eran de Cell Signaling Technology. La α-Tubulina se obtuvo de Invitrogen.

Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular de cada célula individual tratada o no tratada tras el tiempo de tratamiento indicado se evaluó mediante el ensayo MTT. Brevemente, se sembraron células individuales de cada línea celular en placas de 96 pocillos 24 h antes de cargar los compuestos. Tras el periodo de tiempo indicado (24 h, 48 h y 72 h, respectivamente), se desecharon los medios de cultivo con compuestos y se añadieron 100 μl de medios enteros frescos que contenían 0,5 mg/ml de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolio, Sigma). Tras 4 h de incubación a 37 °C, se eliminó el disolvente y se añadieron 100 μl de DMSO a cada pocillo, con ayuda de agitación suave para disolver los cristales de formazán. El valor de D.O. de cada pocillo se midió a 570 nm mediante el lector de microplacas SpectraMax M5 (Molecular Devices).

Cálculo del índice de combinación (IC)
El valor de IC se inscribió para la evaluación sinérgica de la viabilidad celular entre la combinación y cada uno de los grupos individuales, que se calculó en función de la fracción de células cancerosas afectadas (Fa) basándose en la ecuación de Chou-Talalay (Chou y Talalay, 1984): IC=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2, donde (D)1 y (D)2 indican las dosis aplicadas para lograr una respuesta necesaria en combinación, y (Dx) se refiere a las dosis de fármacos individuales necesarias para lograr una respuesta similar. Los análisis de los valores CI se realizaron con el programa informático CalcuSyn (Biosoft); CI<1, CI=1 y CI>1 indican efectos sinérgicos, aditivos y antagónicos, respectivamente.

Ensayo de formación de colonias
Las cuatro líneas celulares de CPNM se sembraron en placas de 6 pocillos con 200-800 células por pocillo en 2 ml de medio. Se añadieron medios con compuestos individuales o en combinación 24 h después de inocular las células para un tratamiento continuo de 3 días, y luego se sustituyeron por medios libres de fármacos cada 3 días. 15 días después de la siembra, las colonias celulares se fijaron en etanol al 95% durante 15 minutos, se tiñeron con Violeta Cristal al 0,1% (Sigma) y se secaron. Las colonias con más de 100 células se contaron como positivas.

Ensayo de Western blotting
Tanto las células NCI-H1975 como las A549 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con medios que contenían un monocompuesto o una combinación durante periodos de tiempo definidos. Las células tratadas se incubaron en tampón de lisado celular (Cell Signaling Technology) con agitación suave durante 15 min, y después se centrifugaron a 12.000 rpm/min a 4 °C durante otros 15 min. La concentración de proteínas de cada muestra en el sobrenadante se evaluó mediante el Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo) y se equilibró al mismo nivel, seguido de una desnaturalización de proteínas de 8 min con tampón de carga SDS a 100 °C. Las proteínas de la muestra se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana filtrante de nitrocelulosa (Whatman), se bloquearon en leche descremada al 5% durante 2 h, se congelaron con los anticuerpos primarios deseados durante la noche, seguidos de anticuerpos secundarios IgG anti-conejo o anti-ratón ligados a HRP (Cell Signaling Technology) durante 2 h. Finalmente, las membranas se escanearon en un sistema de captura de imágenes Chemidoc® MP (Bio-Rad) tras 2 min de incubación en Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad).

Ensayo de citometría de flujo
Se sembraron y trataron célulasNCI-H1975y A549 como se describe en la sección anterior. Las células tratadas se separaron del fondo de las placas con tripsina-EDTA (Gibco) y se lavaron con PBS dos veces. Las detecciones apoptóticas se realizaron utilizando el FITC Annexin-V Apoptotic Detection Kit (Biolegend). En resumen, las muestras celulares cosechadas se suspendieron en 500 μl de tampón de unión que contenía 5 μl de Annexin V-FITC y 10 μl de yoduro de propidio (PI) durante 15 min antes del análisis FACS en un citómetro de flujo Accuri C6 (BD). Las muestras celulares para la medición del potencial de membrana mitocondrial (PMM) se incubaron en 1 ml de medio completo que contenía 2 μM de JC-1 (5,5,6,6-tetracloro-1,1,3,3-tetraetilbenzimidazolycarcocyanine iodide, Sigma) durante 15 min, seguido de un lavado y resuspensión en PBS para el análisis FACS.

Análisis estadístico
Todos los datos se presentaron como la media±DS. La IC50 de los compuestos individuales en el punto temporal indicado se realizó mediante GraphPad 5.1 (Prism). Las comparaciones estadísticas entre los diferentes grupos de muestras se realizaron mediante Excel 2010 utilizando la prueba t de Student. Un valor P inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Erlotinib, Gefitinib y DCA atenuaron la proliferación celular en las líneas celulares de CPNMNCI-H1975 y A549
Intentamos determinar los efectos antiproliferación celular in vitro de los tres compuestos seleccionados en las líneas celulares de CPNM NCI-H1975, NCI-H1650, A549 y NCI-H460. Las células se trataron con diluciones en serie 2 veces menores de cada compuesto durante 24 h, 48 h o 72 h, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 1, Erlotinib, Gefitinib o DCA provocaron una disminución significativa de la viabilidad celular en las cuatro líneas celulares de forma dependiente de la dosis y del tiempo. Puede observarse que las variabilidades de los datos en IC50 parecen ser menores en 72 h para la mayoría de las líneas celulares (véase la Tabla 1). A partir de aquí, seleccionamos 72 h como punto final para el tratamiento combinado.

Fig. 1. Los inhibidores del EGFR y el DCA disminuyeron la viabilidad celular en los CPNM. Las células NCI-H1975, NCI-H1650, A549 y NCI-H460 se expusieron a Erlotinib, Gefitinib o DCA durante 24 (-), 48 (■) y 72 (▲) h, respectivamente, mientras que la viabilidad celular de cada tratamiento se determinó mediante el ensayo MTT.
NCI-H1975NCI-H1650A549NCI-H460
Erlotinib (μM)24 h27.33±15.0652.69±0.80N/AN/A
48 h9.45±1.4818.67±0.6659.66±3.0628.72±3.29
72 h5.04±0.0111.42±0.1013.14±3.7032.66±3.32
Gefitinib (μM)24 h16.22±8.3747.30±3.9841.96±3.3826.19±1.98
48 h9.09±1.9118.97±0.6220.66±2.957.74±0.37
72 h6.15±0.1815.61±1.156.97±0.2221.86±0.09
DCA (mM)24 h29.51±3.2531.09±4.1050.25±6.89N/A
48 h19.56±6.3116.84±4.5331.35±1.0037.26±0.47
72 h16.60±4.4615.81±0.2613.55±2.3238.47±0.35
Tabla 1. IC50 de los inhibidores de EGFR y DCA en la disminución de la viabilidad celular en NSCLCs. Las líneas celulares se expusieron a Erlotinib, Gefitinib o DCA durante 24, 48 y 72 h, respectivamente, mientras que la viabilidad celular de cada tratamiento se determinó mediante el ensayo MTT. La IC50 de cada compuesto se calculó mediante Prism GraphPad 5.1. Se muestra la media±DS de dos pocillos replicados. N/A se refiere a datos no disponibles, ya que incluso la concentración de carga más alta de los compuestos no puede alcanzar hasta el 50% de inhibición de la viabilidad celular.

Las estrategias combinadassuprimieron la viabilidad celular de forma sinérgica e inhibieron la formación de colonias de forma significativa en NCI-H1975 y NCI-H1650, pero no funcionaron tan bien en A549 y NCI-H460
Para determinar la respuesta sinérgica in vitro a la combinación de inhibidores del EGFR con DCA, utilizamos dos estrategias combinadas, a saber, Erlotinib con DCA y Gefitinib con DCA, con seis puntos de concentración de tratamiento individuales para cada compuesto, que conferían una viabilidad anticelular entre alrededor de IC80 y IC20 en una proporción fija. Los efectos de la combinación se evaluaron mediante el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 2, las dos combinaciones, Erlotinib con DCA y Gefitinib con DCA, mostraron claramente sinergia en las líneas celulares NCI-H1975 y NCI-H1650, donde los valores de IC en todos los grupos combinados fueron inferiores a 1 (Fig. 2A y B). Para las líneas celulares A549 y NCI-H460, aunque todos los grupos combinados en dos estrategias mostraron un valor Fa elevado en comparación con sus mono-aplicaciones, los valores CI de algunos grupos combinados fueron superiores a 1 (Fig. 2C y D), lo que sugiere que las estrategias combinadas en A549 y NCI-H460 no funcionaron tan bien como en NCI-H1975 y NCI-H1650.

Fig. 2. El tratamiento combinado atenuó la viabilidad celular de forma sinérgica en las líneas celulares NCI-H1975 y NCI-H1650. Las células NSCLC fueron tratadas con Erlotinib/Gefitinib o DCA solos, o en combinación en una proporción de concentración fija durante 72 h en las líneas celulares NCI-H1975(A), NCI-H1650(B), A549(C) y NCI-H460(D). Se muestra la media±DS de cuatro pocillos replicados en dos estudios separados. Los valores de IC se calcularon mediante CalcuSyn (Biosoft). Los valores de IC inferiores a 1 se consideraron sinérgicos.

Fig. 2 (C y D)

Para explorar más a fondo si la combinación puede atenuar la formación de colonias de células cancerosas, sembramos esas cuatro líneas celulares en placas de 6 pocillos, y las tratamos con Erlotinib, Gefitinib o DCA a concentraciones que alcanzaron alrededor del 40% de inhibición de colonias durante 3 días, o sus combinaciones. 15 días después de la siembra de las células, se contaron las colonias con más de 100 células, con los datos representados en la Fig. 3. El tratamiento combinado de Erlotinib con DCA reprimió significativamente la formación de colonias en NCI-H1975 y NCI-H1650, pero no en A549 y NCI-H460, lo que indica que la estrategia de combinación puede funcionar sólo en NCI-H1975 y NCI-H1650, las células NSCLC mutantes EGFR.

Fig. 3. La combinación de Erlotinib/Gefitinib y DCA disminuyó sinérgicamente la formación de colonias en NCI-H1975 y NCI-H1650. Se sembraron células NCI-H1975, NCI-H1650, A549 y NCI-H460 en placas de 6 pocillos, y se aplicaron mono-fármacos o combo-fármacos a sus concentraciones individuales (Erlotinib a 10, 40, 20, 30 μM, respectivamente en cuatro líneas celulares; Gefitinib a 20 μM en todas las líneas celulares; DCA a 20, 10, 40, 35 μM, respectivamente en cuatro líneas celulares) 24 h después de la siembra durante 3 días continuos. Se observaron colonias 15 días después de la siembra(A) y se calcularon más de 100 células de colonias como datos estadísticos(B). Se muestra la media±DS de seis pocillos replicados. ** denota significación estadística de P<0,05, mientras que n.s. denota P>0,05 sin significación.

Erlotinib/Gefitinib y DCA actuaron de forma independiente en sus vías de señalización diana en la línea celular NCI-H1975
Para investigar el posible efecto de la combinación en las vías de señalización, realizamos análisis de Western blot para estudiar los eventos de fosforilación relevantes en las células NCI-H1975 y A549 de CPNM en puntos temporales definidos durante el tratamiento con el fármaco combinado. Como se muestra en la Fig. 4, en la línea celular NCI-H1975 EGFR mutante, Erlotinib o Gefitinib suprimieron el nivel de EGFR fosforilado, así como de AKT fosforilado y ERK1/2 fosforilado, dos proteínas clave situadas en la corriente descendente de la señalización de EGFR, pero no disminuyeron el nivel de PDH fosforilada. El DCA, por otro lado, inhibió significativamente la fosforilación de la PDH, pero no consiguió disminuir el nivel de proteínas clave fosforiladas en la señalización del EGFR en NCI-H1975 (Fig. 4A y B). Sin embargo, en las células de CPNM A549 EGFR wild type, Erlotinib y Gefitinib no afectaron a la señalización descendente del EGFR, por ejemplo la AKT fosforilada y la ERK fosforilada, mientras que el DCA atenuó significativamente la PDH fosforilada (Fig. 4C y D). Curiosamente, parecía que el DCA puede activar AKT a través de la elevación de su nivel de fosforilación en el tiempo en los dos estudios independientes (Fig. 4C y D). Estos datos sugieren que el erlotinib y el DCA actúan de forma independiente en sus respectivas vías de señalización.

Fig. 4. Fosforilación de proteínas en las vías de señalización EGFR y PDK tras el tratamiento con Erlotinib, Gefitinib o DCA en células NSCLC cultivadas. Las líneas celulares NCI-H1975(A y B) y A549(C y D) fueron tratadas con Erlotinib, Gefitinib o DCA, o en combinación, durante 4, 8 y 12 h, respectivamente. Se realizó Western blot utilizando los lisados celulares para la calificación de proteínas clave en la señalización de EGFR y PDK.

La combinación de erlotiniby DCA mejoró significativamente la apoptosis celular en NCI-H1975, pero no en A549
Para explicar el efecto sinérgico de erlotinib y DCA sobre la viabilidad celular, nos preguntamos si promovían de forma colaborativa la apoptosis celular. Como se muestra en la Fig. 5, los resultados de western blot demostraron que la combinación provocó una activación significativa de la Caspasa3 y su sustrato, la PARP escindida, tras 8 h de tratamiento en NCI-H1975 (Fig. 5A), mientras que no se observó una activación evidente de la Caspasa3 o la PARP en A549 (Fig. 5B). Análisis FACS adicionales mostraron que Erlotinib combinado con DCA promovió una porción mayor relevante de apoptosis celular en NCI-H1975 de forma significativa que cada compuesto por separado después de que las células fueran tratadas durante 12 h (Fig. 5C), mientras que la combinación no consiguió inducir apoptosis celular en células A549 ni en cada uno de los mono-uso ni de forma combinada (Fig. 5D). Estos resultados indicaron que el refuerzo combinado de la inducción apoptótica celular por Erotinib y DCA es viable sólo en NCI-H1975, las células mutantes EGFR, pero no en A549, las células NSCLC de tipo salvaje EGFR.

Fig. 5. La combinación de erlotinib y DCA potenció la inducción de la apoptosis de forma sinérgica en NCI-H1975 en lugar de en A549. Las líneas celulares NCI-H1975(A) y A549(B) fueron pretratadas con Erlotinib o DCA, o en combinación, durante periodos de tiempo definidos, y a continuación las células fueron lisadas y seguidas de western blotting como se ha descrito previamente. Para la detección FACS de la apoptosis, se cosecharon células NCI-H1975(C) y A549(D) tratadas con compuestos individuales o en combinación durante un periodo de tiempo determinado y se realizó FACS. Se muestra la media±DS de tres muestras de estudios separados. * indica una significación estadística de P<0,05, mientras que ** indica P<0,01.

Las MMPdisminuyeron significativamente en la estrategia combinada que en la monoterapia en NCI-H1975
Para confirmar aún más el efecto significativo del tratamiento combinado sobre la apoptosis celular, utilizamos el ensayo JC-1 para determinar si el tratamiento puede conducir a una disminución de las MMP, uno de los signos distintivos de la apoptosis celular. Como se muestra en la Fig. 6, los datos FACS fueron consistentes con los resultados de apoptosis celular descritos en la Sección 3.4.. Se puede observar que la combinación demostró una disminución significativa de las MMP tras 8 y 12 h de tratamiento en comparación con la mono-aplicación de Erlotinib o DCA en células NCI-H1975 (ver Fig. 6A). En el caso de las células A549, sólo se detectó una disminución de MMP cuando se aplicó DCA (véase la Fig. 6B).

Fig. 6. La combinación de erlotinib y DCA disminuyó sinérgicamente las MMP en la línea celular NCI-H1975 más que en la A549. Las líneas celulares NCI-H1975(A) y A549(B) fueron expuestas a Erlotinib o DCA, o en combinación, durante periodos de tiempo definidos, respectivamente. Se cosecharon las células, se tiñeron con JC-1 y se realizaron análisis FACS. Se muestra la media±DS de tres muestras de estudios separados. * indica una significación estadística de P<0,05, mientras que ** indica P<0,01.

Discusión

Para comprobar nuestra hipótesis de que la combinación de inhibidores del EGFR con el inhibidor de PDK, DCA, podría ejercer un efecto anticancerígeno sinérgico en células de CPNM, aplicamos el ensayo MTT para la evaluación de la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en este estudio concuerdan con la hipótesis planteada. En concreto, hemos demostrado que los inhibidores del EGFR (Erlotinib o Gefitinib) junto con el DCA atenuaron sinérgicamente la viabilidad de las células NCI-H1975 y NCI-H1650 con todos los valores de IC <1 a diferentes niveles de dosis de las combinaciones de compuestos, así como disminuyeron significativamente la formación de colonias de células cancerosas (Fig. 2, Fig. 3). Mientras tanto, estos efectos sinérgicos no se manifestaron en las líneas celulares A549 o NCI-H460 (líneas celulares de CPNM con EGFR salvaje), lo que indica que la estrategia de combinación probablemente suprima la progresión celular de forma sinérgica sólo en los CPNM que albergan una mutación del EGFR.

Velpula et al. (2013) informaron de que la administración de Erlotinib o Gefitinib atenuaba tanto el nivel de expresión de p-EGFR como de PDK1 en U251 y 5310, mientras que la aplicación de DCA en estas dos células disminuía también la expresión de p-EGFR y PDK1. Es plausible que el efecto combinado de los inhibidores de EGFR y PDK pueda atribuirse a la co-supresión de la señalización de EGFR o PDK. Con esta idea en mente, llevamos a cabo análisis de western blot para evaluar las alteraciones a nivel proteico en esas dos vías de señalización. Se ha demostrado que tanto Erlotinib como Gefitinib inhiben la fosforilación de EGFR, así como la fosforilación de dos de sus proteínas clásicas de señalización descendente, a saber, AKT y ERK. Mientras tanto, aunque el inhibidor de PDK DCA atenuó ligeramente la expresión de PDK1, la fosforilación de PDH, una enzima clave responsable de convertir el piruvato en Acetil-CoA para el ciclo del ácido cítrico en lugar de iniciar la glucólisis (Kankotia y Stacpoole, 2014), se suprimió significativamente cuando se aplicó DCA (Fig. 4). Aparentemente, Erlotinib/Gefitinib y DCA no actuaron ni de forma cruzada ni con un efecto inhibidor aditivo sobre la señalización de cada uno en las células NCI-H1975. Nuestros datos sugieren que el efecto anticancerígeno sinérgico del tratamiento combinado de fármacos en NCI-H1975 no depende únicamente de las vías de señalización EGFR o PDK.

Para encontrar otros posibles mecanismos del efecto de la combinación, dirigimos nuestra atención a la inducción de la apoptosis. Se informó de que el erlotinib es capaz de inducir la apoptosis de las células NCI-H1975 (Nie et al., 2015), y el DCA también confirió apoptosis celular en varias células cancerosas diferentes (Madhok et al., 2010, Wong et al., 2008). Dado que la escisión de la Caspasa3 y su sustrato de escisión diana PARP son dos elementos implicados en la apoptosis celular (Zhang et al., 2015), primero examinamos el nivel de activación de la Caspasa3 y PARP en NCI-H1975 cuando se trató con Erlotinib o DCA solos, así como con la combinación. Nuestros resultados sugirieron que la PARP escindida de 89 kDa aumentó de forma dependiente del tiempo cuando se trató solo con Erlotinib o DCA. Es importante destacar que el tratamiento combinado mostró una actividad significativamente mayor de PARP en comparación con los compuestos aplicados solos. La expresión de Caspasa3 escindida a 17 kDa, que alcanzó su máximo a las 8 h, presentó un fuerte aumento cuando la célula NCI-H1975 fue tratada con la combinación de Erlotinib y DCA, (Fig. 5A). Estos resultados indicaban que el efecto de la combinación se debía probablemente al efecto aditivo en la promoción de la apoptosis celular. Esto se confirma además por el análisis de citometría de flujo de células teñidas doblemente con Annexin-V y PI. Estas observaciones fueron coherentes con el análisis de activación de Caspase3 y PARP, en el que el tratamiento combinado condujo a una inducción moderada pero distinguible de la apoptosis celular cuando la célula NCI-H1975 se trató durante 12 h en comparación con la aplicación de Erlotinib o DCA solos (Fig. 5B). Sin embargo, en la línea celular A549 no se observó ni la activación de la Caspasa3/PARP ni la inducción sinérgica de la apoptosis celular (Fig. 5A y B), lo que sugiere que la promoción de la apoptosis podría ser el posible mecanismo del efecto combinado de erlotinib y DCA sobre las células NSCLC mutantes EGFR.

El proceso de apoptosis celular podría dividirse en una serie de etapas, como el cambio de la morfología celular, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la alteración de la permeabilidad, la fragmentación del ADN, etc. (Fiandalo y Kyprianou, 2012). Varios estudios han señalado la disminución de las MMP como consecuencia del tratamiento con DCA en células cancerosas (Emadi et al., 2015). En estudios anteriores se demostró que el erlotinib provocaba la pérdida de MMP en los CPNM (Qian et al., 2009). Para investigar si la combinación puede afectar significativamente a las MMP en NCI-H1975, utilizamos el ensayo mitoprobe JC-1 para evaluar el nivel de MMP tras el tratamiento con erlotinib, DCA o la combinación. Como se muestra en la Fig. 6, la combinación condujo a una disminución significativa de MMP en post 8 y 12 h de tratamiento en las células NCI-H1975 (pero no en las células A549), lo que sugiere que el efecto de combinación de la apoptosis celular inducida se asocia con la despolarización del potencial de membrana mitocondrial.

En resumen, hemos demostrado que el uso combinado del inhibidor del EGFR, a saber, Erlotinib o Gefitinib, y el inhibidor de la PDK, DCA, mostró un efecto anticancerígeno sinérgico en las células NCI-H1975 y NCI-H1650. La promoción conjunta de la apoptosis celular se ha identificado como uno de los mecanismos probables del efecto combinado. En particular, la aplicación combinada de erlotinib y DCA no sólo activó la Caspasa3 y la PARP, sino que también disminuyó significativamente la MMP. Además, nuestros resultados indicaron que el efecto de la combinación sólo podría ser evidente en células de CPNM con mutaciones del EGFR, según nuestros resultados actuales. En nuestro laboratorio se están llevando a cabo nuevas evaluaciones para confirmar esta observación en más líneas celulares de CPNM.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en relación con este artículo.

Papel de la fuente de financiación

Este trabajo ha contado con el apoyo del Fondo para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología de Macao S.A.R (FDCT) (proyecto n.º 086/2014/A2) y de la Universidad de Macao (subvención n.º MRG021-TKY-2015-FHS).

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero del Fondo para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología de Macao S.A.R (FDCT) (Proyecto n.º 086/2014/A2) y de la Universidad de Macao (Subvención n.º MRG021-TKY-2015-FHS). Damos las gracias al Prof. Thomas Y.C. Leung (PolyU, HK) por las muestras de células NCI-H460. Damos las gracias al Dr. Xiaohui Hu por sus útiles comentarios y por la revisión del manuscrito.

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