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Yong Won Choi1, In Kyoung Lim *

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Proyecto de Transformación y Restauración Celular BK21, Facultad de Medicina de la Universidad de Ajou, Suwon 443-721, República de Corea
* Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Ajou, San 5 Woncheon-dong, Yeongtonggu, Suwon 443-721, República de Corea; Tel: +82 31 219 5051; fax: +82 31 219 5059. Dirección de correo electrónico: [email protected] (I.K. Lim).


Recibido: 29 de octubre de 2013
Aceptado: 20 de enero de 2014
Revisado: en forma revisada 8 de enero de 2014
Publicado/Disponible en línea: 27 de enero de 2014

Resumen

Para investigar la sensibilización de la metformina-citotoxicidad, las células cancerosas fueron tratadas con dicloroacetato (DCA), un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK). La citotoxicidad de la metformina dependía principalmente de la disponibilidad de glucosa y del poder reductor generado por la vía de las pentosas fosfato, mientras que el cotratamiento con DCA potenciaba la citotoxicidad de la metformina a través de la reprogramación del metabolismo de la glucosa mediante la inhibición de la PDK y el aumento de la respiración mitocondrial . El cotratamiento con DCA provocó la muerte celular en lugar de la supervivencia celular a pesar de las condiciones de glucosa y GSH elevados. En conclusión, el DCA sensibilizó la citotoxicidad de la metformina reprogramando el metabolismo de la glucosa en parte de la glucólisis aeróbica a la oxidación mitocondrial, evidenciada por las mediciones del consumo de glucosa, la liberación de lactato y la relación entre la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular.


Palabras clave: Dicloroacetato de metformina (DCA), Estrés oxidativo, Privación de glucosa, Contenido de glutatión

2014 Publicado por Elsevier Ireland Ltd.


INTRODUCCIÓN

Cada vez hay más pruebas de que las alteraciones metabólicas de las células cancerosas, como la glucólisis aeróbica o la adicción a la glutamina, son inevitables para la carcinogénesis más allá del epifenómeno [13], [31], y se han realizado enormes esfuerzos para encontrar dianas farmacológicas y sustancias químicas candidatas en el metabolismo del cáncer [5], [30]. Basándose en datos epidemiológicos, preclínicos y clínicos, la metformina, una biguanida utilizada para el tratamiento de la diabetes mellitus, se ha convertido en uno de los fármacos más atractivos y prometedores para el metabolismo del cáncer. Aunque el mecanismo de la metformina no está totalmente dilucidado, se sabe que su función intracelular es inhibir el complejo I de la cadena respiratoria [8], [21]. En la actualidad, muchas evidencias indican que la activación de la AMPK es un nodo maestro de los efectos antitumorales de la metformina [3], [16],[23], por lo que las células cancerosas LKB1-/- son más resistentes a la citotoxicidad inducida por la metformina en el sistema de cultivo in vitro [22], [34]. Por el contrario, se ha demostrado que la activación de la AMPK protege a las células cancerosas del estrés energético a través de la regulación de la homeostasis del NADPH [12], por lo que las células cancerosas LKB1-/- son más sensibles al estrés metabólico inducido por la fenformina en el modelo de cáncer de pulmón de ratón [24]. En contextos confusos, existen informes de que los efectos antitumorales de la metformina dependen de la concentración de glucosa en el medio de cultivo [11], [17], [25]; la privación de glucosa aumenta significativamente la citotoxicidad de la metformina [17], mientras que la activación de AMPK inducida por metformina es ineficaz en condiciones de glucosa elevada (25 mM) [25]. Por lo tanto, es necesario comprender en profundidad el mecanismo bioquímico de la citotoxicidad de la metformina antes de utilizar la metformina como agente anticanceroso centrado en el metabolismo de la glucosa.

El efecto Warburg, observado con frecuencia en las células cancerosas, es importante no sólo para la generación de energía, sino también para mantener un estado reducido en un microambiente tumoral hostil. La glucosa es la principal fuente de energía reductora, NADPH, a través de la vía de las pentosas fosfato [1], [9], [22]. De hecho, la muerte de las células cancerosas mediada por la 2-deoxiglucosa(2DG) depende principalmente del estrés oxidativo intolerable, además de la crisis energética [15]. Basándose en el concepto de que el aumento de la glucólisis protege a las células cancerosas del estrés oxidativo, se ha pensado que el aumento de la glucólisis inducido por metformina es capaz de proteger a las células del estrés oxidativo mitocondrial resultante de la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria [35]. Por lo tanto, investigamos si el estrés mitocondrial inducido por metformina puede verse aumentado por el estrés oxidativo debido al agotamiento de GSH en condiciones de privación de glucosa o al tratamiento con H2O2 en condiciones de glucosa suficiente. Basándonos en los informes de que la inhibición de la glucólisis por 2-DG aumenta los efectos citotóxicos de la metformina [2], [6], [14] y que el dicloroacetato (DCA) reduce la glucólisis activando la piruvato deshidrogenasa (PDH) [32 ] junto con el metabolismo oxidativo y la actividad antitumoral [20].

En el presente estudio exploramos los efectos del DCA sobre la citotoxicidad de la metformina y la regulación del metabolismo de la glucosa. A diferencia de los efectos de la metformina sola, el tratamiento combinado de las células cancerosas con metformina y DCA aumentó significativamente la actividad de la PDH, pero no la glucólisis, recuperando así la respiración mitocondrial en las células cancerosas. La reprogramación del metabolismo de la glucosa estaba estrechamente asociada a un estrés oxidativo grave. En resumen, la reprogramación mediada por el DCA de la glucólisis aeróbica a la oxidación mitocondrial aumentó el estrés redox mitocondrial y celular inducido por la metformina, lo que fue suficiente para inducir la muerte celular masiva a pesar del alto nivel de glucosa.

Materiales y métodos

Células y reactivos
Las células HeLa, MCF7 y MDA-MB-231 se cultivaron en DMEM (Gibco) que contenía glucosa (0-25 mM) suplementada con 10% de suero bovino fetal y 100 U/mL de gentamicina a 37 °C y 5% deCO2. La metformina, el dicloroacetato (DCA), la l-butionina-sulfoximina (BSO), el H2O2, el éster monoetílico de glutatión (GSH-MEE) y la N-acetil-l-cisteína (NAC) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El trolox procedía de Biomol International, L.P., y el diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA), el rojo MitoSOX, el yoduro de propidio (PI) y la calceína AM se obtuvieron de Molecular Probes (Eugene, OR).

Medición de la viabilidad celular y ensayo de formación de colonias en agar blando
La viabilidad celular tras diversos tratamientos durante los tiempos indicados se evaluó mediante exclusión del colorante azul tripán (Sigma-Aldrich). Para el ensayo, se sembraron 4 ×104 células en placas de 12 pocillos y se trataron con productos químicos al día siguiente. Se tripsinizaron las células y se mezclaron con azul tripán al 0,4% (1:1). El porcentaje de células viables representa el número de células no teñidas/número de células totales × 100. También se midió la muerte celular por lactato. La muerte celular también se midió mediante el kit de ensayo de liberación de lactatodeshidrogenasa (LDH) según el protocolo del fabricante (Takara, Japón). Para el ensayo de formación de colonias en agar blando, se sembraron células HeLa (1,5 ×103) en una solución de agarosa al 0,6% y se colocaron en capas sobre un lecho de agarosa al 1,0% antes del tratamiento con diferentes concentraciones de metformina, DCA o ambos en combinación. Se contaron como positivas las colonias mayores de 125 μm en 2 semanas.

Medición de los niveles de ROS celulares
Las ROS intracelulares y mitocondriales se midieron utilizando la sonda fluorescente sensible a la oxidación diclorodihidroflourescina diacetato (H2DCF-DA) y MitoSOX Red (Invitrogen), respectivamente. Las células HeLa tratadas con metformina, DCA o ambos durante los tiempos indicados se incubaron con DCF-DA (20 μM) o MitoSOX (5 μM) durante 10 min a 37 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sometieron a citometría de flujo (BD FACSCanto II, BD Biosciences, San Jose, CA) para su adquisición y análisis. La intensidad de fluorescencia se determinó también mediante microscopía de fluorescencia.

Medición de los niveles de glutatión celular
Para determinar el estado redox del glutatión intracelular, se analizaron los niveles de glutatión reducido y oxidado (GSH, GSSG) según el método descrito previamente [29]. Para determinar el glutatión total, se cosecharon las células y se suspendieron en ácido sulfosalicílico al 1%. Tras eliminar los agregados por centrifugación a 8000g durante 10 min, se aplicaron los sobrenadantes para el ensayo. La reacción se inició añadiendo el sobrenadante (1 μg) a una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía 200 μl de mezcla de ensayo [125 mM de NaPO4, pH 7,5, 0,3 mM de NADPH, 6 mM de ácido 5,50-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DNTB; Sigma, St. Louis, MO), 0,12 U de glutatión reductasa], y la tasa máxima de reducción de DNTB por GSH se obtuvo midiendo la absorbancia a 405 nm. La cantidad de glutatión total se calculó a partir de la curva de calibración utilizando GSH estándar (Sigma). Para obtener el nivel de GSSG, las células se pretrataron con 2-vinilpiridina para privarlas del GSH existente, y el sobrenadante (50 μg) se procesó siguiendo el mismo protocolo que para el glutatión total.

Ensayo de la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH)
La actividad de la PDH se midió utilizando el PDH Enzyme Activity Microplate Assay Kit (Abcam, Cambridge, MA) de acuerdo con el protocolo. Las células se lisaron en el tampón de muestra suministrado con el kit, y la proteína celular total a una concentración de 5 mg/ml se cargó por triplicado en la microplaca precubierta con anticuerpo anti-PDH de captura y se incubó durante 3 h a temperatura ambiente. Tras lavar las muestras, se añadió la mezcla de reacción, y la absorbancia del producto de reacción de la reducción de NAD+ a NADH acoplada al colorante informador se midió a 450 nm durante 50 min a intervalos de 0,5 min utilizando el espectrofotómetro de microplacas Eon (BioStack, Winooski, VT). La actividad PDH se calculó a partir de la pendiente de la curva mOD por tiempo (min) (ΔmOD/min) y se normalizó con respecto al grupo de control.

Análisis del consumo de glucosa y la producción de lactato
Las célulasHela(1 ×104/ml) cultivadas en DMEM con 25 mM de glucosa se trataron con metformina, DCA o ambos. Tras 48 h, se midieron las concentraciones de glucosa y lactato en los medios mediante el sistema bioanalítico multiparamétrico YSI 7100. Los medios sin cultivo celular se utilizaron para medir la concentración inicial de glucosa y lactato. Consumo de glucosa = (concentración de glucosa de los medios sin cultivo celular) – (concentración de glucosa de los medios del grupo tratado). Producción de lactato = (concentración de lactato de los medios del grupo tratado) – (concentración de lactato de los medios sin cultivo celular).

Medición de las tasas de fosforilación oxidativa y glucólisis
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se midieron utilizando un analizador de flujo extracelular XF24 de Seahorse Bioscience (North Billerica, MA) [33]. Así, se sembraron células HeLa en microplacas XF de 24 pocillos (1 ×104) y se incubaron a 37 °C durante 24 antes del tratamiento con metformina, DCA o ambos durante 12 h. Posteriormente, se lavaron las células y se equilibraron con DMEM suplementado con GlutaMax-1 (200 mM), glucosa (25 mM), cloruro sódico (32 mM) y rojo fenol sin bicarbonato a 37 °C durante 1 h en una incubadora sinCO2. La OCR (pmol/min) y la ECAR (mpH/min) se midieron 3 veces durante 3 min cada una. Tras el experimento, se contó el número de células para la normalización.

Análisis de inmunoblot
Los lisados celulares (40 μg) preparados en tampón RIPA con inhibidores de la fosfatasa se separaron en SDS-PAGE antes de transferirlos a una membrana de PVDF (Millipore Corp). Los blots se hibridaron con anticuerpos primarios y se visualizaron mediante el sistema ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Los anticuerpos se adquirieron, anti-p-PDH (S293) de Calbiochem, anti-PARP y anti-PDH de Abcam, anti-Caspasa 3 de Cell signaling, anti-ciclina D1, anti-ciclina E y anti-β-actina de Santa Cruz Biotechnology.

Análisis estadístico
Los datos numéricos se presentaron como media ± DE de las determinaciones independientes. Se aplicó la prueba tindependiente o ANOVA, y las comparaciones múltiples se evaluaron mediante Tukey HSD. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Resultados

Lacitotoxicidad de la metfromina se recupera mediante la glucosa disponible
Para comprender las vías bioquímicas que regulan la muerte de las células cancerosas inducida por metformina, las células HeLa mantenidas en DMEM con 5,5 mM de glucosa fueron tratadas con metformina (5 mM) junto con la adición diaria de glucosa (0-2 mM) durante 72 h. El suplemento de glucosa aumentó significativamente la viabilidad de las células tratadas con metformina (Fig. 1A, #p < 0,05 y *p < 0,001 frente a ninguna adición) en buena concordancia con informes anteriores [11], [17], [25]. Cuando las células HeLa mantenidas en medios que contenían 5-25 mM de glucosa se incubaron con 0-10 mM de metformina durante 72 h, la muerte celular inducida por metformina dependió de la concentración de glucosa en los medios de cultivo. Especialmente, la condición de alta glucosa (25 mM) protegió significativamente la citotoxicidad por metformina independientemente de la concentración de metformina (Fig. 1B). La muerte celular inducida por 10 mM de metformina fue protegida por 25 mM de glucosa en el medio de cultivo no sólo en las células HeLa sino también en las células de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB231, mientras que 5,5 mM de glucosa no consiguió proteger a las células del efecto tóxico (Fig. 1C), observado al microscopio de contraste de fases. Los resultados indican que el equilibrio entre las concentraciones de metformina y glucosa en los medios de cultivo es importante para la regulación de la citotoxicidad de la metformina.

Fig. 1. La metformina-citotoxicidad se recuperó por la disponibilidad de glucosa en los medios de cultivo. (A) Regulación de la muerte celular inducida por metformina (Met) mediante la adición de glucosa a los medios de cultivo. Las células HeLa se mantuvieron en DMEM que contenía 5,5 mM de glucosa, y las células se trataron con 5 mM de Met con adición diaria de glucosa (0-2 mM) durante 72 h. Obsérvese la inhibición significativa de la citotoxicidad inducida por metformina mediante la adición de glucosa (1 y 2 mM, #p < 0,05 y *p < 0,001 frente a 0 mM). (B) Protección dependiente de la concentración de glucosa de la muerte celular inducida por metformina. Las células HeLa cultivadas en las concentraciones indicadas de glucosa se trataron con metformina (0-10 mM) durante 72 h, y las células viables se contaron por el método de exclusión con azul tripán. Obsérvese una recuperación significativa de la muerte celular inducida por Met en presencia de una concentración elevada de glucosa (25 mM) en los medios de cultivo, independientemente de la concentración de metformina. Sólo 10 mM de metformina redujo ligeramente el número de células viables. #p<0,05 y *p<0,001 frente a 0 mM. (C) Hallazgos microscópicos de contraste de fase de células cancerosas (MCF7, MDA-MB-231 y HeLa) incubadas con 10 mM de metformina con las concentraciones habituales y altas de glucosa (5,5 mM y 25 mM, respectivamente) durante 72 h. Obsérvese la diferencia significativa de la muerte celular en función de la concentración de glucosa, no sólo en las células HeLa sino también en las células de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB-231.

La citotoxicidad de la metformina está regulada por cambios redox mediados por GSH
Dado que la metformina aumenta el nivel de ROS mitocondrial mediante la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria [8], [21], [36], exploramos si el estrés oxidativo mitocondrial inducido por la metformina era lo suficientemente grave como para inducir la muerte de las células cancerosas en condiciones de glucosa insuficiente. Las células HeLa mantenidas en un medio que contenía glucosa fueron tratadas con 5 mM de metformina y, a continuación, se evaluaron los niveles de superóxido mitocondrial y de ROS celular total utilizando MitoSox Red y DCFDA, respectivamente (Fig. 2A). De hecho, la metformina aumentó los niveles de ROS mitocondriales y celulares totales de forma dependiente de la concentración de metformina, sin embargo, la fluorescencia de MitoSox Red fue mayoritariamente superior a la del nivel de ROS celular total en células HeLa (Fig. 2B). Como era de esperar, el nivel de ROS celular inducido por metformina aumentó significativamente en condiciones de ausencia de glucosa en comparación con los medios que contenían glucosa (Fig. 2C). Estos datos apoyan firmemente el informe [15] de que la privación de glucosa reduce la reserva celular de glutatión (GSH + GSSG). Por lo tanto, cuando se midió la reserva de glutatión, la reducción de GSH en relación con GSSG fue más significativa en la condición sin glucosa (p = 0,000) en respuesta a la metformina, sin embargo, el contenido total de glutatión se mantuvo sin aumento significativo de GSSG en los medios que contenían glucosa (5,5 mM) (Fig. 2D), lo que indica que la glucosa en los medios de cultivo jugó como una fuente importante de generación de GSH. Para investigar la regulación de la citotoxicidad de la metformina por el estrés redox bajo privación de glucosa, se emplearon antioxidantes. El tratamiento de las células HeLa con 10 mM de glutamina o N-acetil-l-cisteína (NAC) por separado redujo significativamente la muerte celular observada en los medios libres de glucosa sin adición de metformina (Fig. 2E, p = 0,000 y p = 0,004 frente a la ausencia de tratamiento, respectivamente), sin embargo, el mismo tratamiento no consiguió mejorar la citotoxicidad por metformina (5 mM) en los medios libres de glucosa. Por otro lado, el tratamiento combinado de glutamina con NAC pudo proteger a las células HeLa de la citotoxicidad de la metformina (5 mM) (Fig. 2E, p = 0,000). Para confirmar directamente si el glutatión reducido desempeñaba un papel en la inhibición de la citotoxicidad por metformina, se empleó una forma de GSH permeable a las células (GSH-MEE). La adición de GSH-MEE redujo significativamente la muerte de las células HeLa, en comparación con las del control con vehículo, incluso en condiciones sin glucosa (Fig. 2F). Los datos revelan un efecto sinérgico de la privación de glucosa en la citotoxicidad de la metformina a través del estrés oxidativo por depleción de GSH.

Fig. 2. La citotoxicidad por metformina se alivió alterando los niveles redox con glutatión reducido. (A) Hallazgos microscópicos de fluorescencia que revelan las generaciones de superóxido mitocondrial y H2O2 celular en respuesta a la meformina. Las células HeLa tratadas con meformina (5 mM) se visualizaron mediante microscopio de fluorescencia tras incubación con MitoSox Red y DCFDA durante 30 min. La fluorescencia roja y verde indican superóxido mitocondrial y H2O2 celular total, respectivamente (IMF: intensidad media de fluorescencia). (B) La metformina aumentó los radicales superóxido ligeramente más que el H2O2 en células HeLa. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de metformina durante 8 h y, a continuación, se incubaron con MitoSox Red y DCFDA durante 30 min. Las intensidades medias relativas de fluorescencia de MitoSox Red y DCF se midieron mediante citometría de flujo. Obsérvese el aumento de superóxido y H2O2 tras el tratamiento con metformina(#p<0,05 y *p<0,001 frente a Met 0 mM). (C) Generación adicional de H2O2 celular en condiciones sin glucosa (Glc). Las células HeLa se incubaron con metformina (0-5 mM) con y sin glucosa en el medio de cultivo durante 8 h, y a continuación las células se trataron con DCFDA durante 30 min. La intensidad de fluorescencia media relativa de DCF se midió mediante citometría de flujo. Obsérvese una generación significativa de H2O2 en las células tratadas con metformina en medios sin glucosa, en comparación con las tratadas con medios que contenían 5,5 mM de glucosa(p = 0,010 frente al tratamiento con Met 1 mM, y p = 0,000 frente al tratamiento con Met 5 mM). (D) Glucosa (Glc) como fuente de glutatión reducido en células cancerosas. Las células HeLa se trataron con metformina (0-5 mM) con o sin 5,5 mM de glucosa en el medio de cultivo durante 8 h. Las concentraciones de glutatión total (GSH + GSSG) y glutatión oxidado (GSSG) se midieron mediante el método de reciclado DTNB [5,5-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico)]. En la condición sin glucosa, el tratamiento con metformina (1 y 5 mM) redujo significativamente el glutatión total junto con la producción de GSSG(p1y p2= 0,000), mientras que la adición de glucosa (5,5 mM) aumentó notablemente el nivel de glutatión total sin producción de GSSG, lo que indica la generación de GSH en el medio de cultivo con glucosa 5,5 mM independientemente de la concentración de metformina. Aunque el tratamiento con 5 mM de Met redujo claramente el nivel de glutatión total respecto al control(p = 0,000 entre Met 0 mM y 5 mM), el nivel de producción de GSSG fue insignificante. (E) Protección de la muerte celular inducida por metformina mediante el tratamiento combinado con glutamina (Gln) y NAC a pesar de la condición sin glucosa. Las células se trataron con 5 mM de metformina junto con un pretratamiento de glutamina (10 mM) o NAC (10 mM) durante 1 h y, a continuación, se examinó el grado de muerte celular mediante el kit de detección de citotoxicidad LDH. El pretratamiento con glutamina o NAC redujo significativamente la liberación de LDH en condiciones sin glucosa y sin tratamiento con metformina(p = 0,000 y p = 0,004, respectivamente). Por el contrario, el tratamiento con glutamina o NAC por sí solo no protegió la muerte celular inducida por 5 mM de Met, sin embargo, el cotratamiento con glutamina y NAC previno significativamente la muerte celular a pesar de la condición sin glucosa( p = 0,000). (F) La adición de GSH permeable a la membrana previno la muerte celular inducida por metformina en células HeLa en condiciones sin glucosa. Las células se trataron con meformina (0-5 mM) durante 12 h con o sin éster monoetílico de glutatión (GSH-MEE, 10 mM) en condiciones de ausencia de glucosa y, a continuación, se realizó un ensayo de liberación de LDH para evaluar la tasa de muerte celular. Obsérvese una reducción significativa de la liberación de LDH en las células tratadas con 2,5 mM y 5 mM de metformina mediante la adición de GSH-MEE, *p< 0,001 frente al control con vehículo. (Para la interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo)

Elaumento del estrés oxidativo agrava la citotoxicidad de la metformina a pesar del alto nivel de glucosa
Para comprobar si las células expuestas a la metformina se vuelven más vulnerables al estrés, las células HeLa mantenidas con 25 mM de glucosa se trataron con 5 mM de metformina junto con H2O2 durante 12 h. Sin embargo, el tratamiento combinado de metformina con H2O2 (más de 500 μM) aumentó notablemente la muerte celular, medida por la liberación de LDH (Fig. 3A). No sólo el H2O2 exógeno, sino también el agotamiento de la reserva de glutatión mediante BSO, un inhibidor de la síntesis de GSH, produjeron un nivel significativo de citotoxicidad por metformina. La incubación con metformina (10 mM) o BSO 4 mM sola durante 48 h no mostró signos significativos de muerte celular en condiciones de glucosa elevada (25 mM) cuando se evaluó mediante tinción con Calceína AM (Fig. 3B panel izquierdo). Sin embargo, el tratamiento combinado de metformina con BSO aumentó significativamente la muerte celular positiva al yoduro de propidio, cuando se monitorizó por exclusión con azul tripán. El BSO (1 mM) sensibilizó significativamente la citotoxicidad de la metformina 1 mM bajo condiciones de glucosa alta (25 mM) (Fig. 3B panel derecho). Nuestros hallazgos están bien apoyados por estudios anteriores que GSH es el antioxidante biológico más abundante e importante contra el estrés oxidativo en las células cancerosas [7], [10].

Fig. 3. La citotoxicidad de la metformina se agravó al cambiar los niveles redox con la exposición a H2O2 o la depleción de GSH a pesar de la condición de glucosa elevada. (A) Agravamiento de la muerte celular inducida por metformina mediante la adición de H2O2. Tras el tratamiento con 5 mM de metformina durante 12 h, las células HeLa se incubaron además con o sin H2O2 (∼1000 μM) durante 8 h antes de la observación con microscopio de contraste de fases y ensayo de liberación de LDH para medir el grado de muerte celular. El peróxido de hidrógeno agravó significativamente la muerte celular inducida por metformina por encima de 500 μM(*p< 0,001 frente al control). (B) Sensibilización de la muerte celular inducida por metformina mediante la depleción de GSH con l-butionina-S,R-sulfoximina (BSO, 0-4 mM) a pesar de la condición de glucosa elevada. Las células HeLa se trataron con 10 mM de metformina con o sin BSO y luego se tiñeron con Calceína AM y yoduro de propidio (PI) para mostrar las células viables y muertas, respectivamente (panel izquierdo). La viabilidad celular se determinó mediante el método de exclusión con azul tripán (panel derecho). Obsérvese la sensibilización dependiente de la concentración de BSO de la muerte celular a pesar de la baja concentración de meformina (1 mM) en condiciones de alta glucosa (25 mM). La reducción de la viabilidad celular aumentó en función de las concentraciones de BSO así como de metformina, #p< 0,05, *p< 0,001 frente a BSO 0 mM. (Para la interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo)

El dicloroacetato aumenta la respiración mitocondrial a través de la activación de la piruvato deshidrogenasa
Dado que la PDH determina el destino del metabolismo de la glucosa en la mitocondria o en el citosol, es muy probable que el aumento de la actividad de la PDH pueda aumentar la respiración mitocondrial en lugar de la glucólisis aeróbica en las células cancerosas. Por lo tanto, investigamos si la glucólisis inducida por metformina estaba regulada por el DCA, un inhibidor de la PDH quinasa (PDK). Cuando las células HeLa fueron tratadas con metformina, la actividad de la PDH disminuyó significativamente de forma dependiente de la dosis (Fig. 4A). El tratamiento con metformina aumentó claramente la fosforilación de la PDH-E1a, lo que indica una activación de la PDK frente a una inhibición de la PDH (Fig. 4B). Por otro lado, el tratamiento con DCA redujo significativamente la fosforilación de PDH-E1a inducida por metformina en el residuo S293 independientemente del tratamiento con metformina, lo que resulta en el aumento o mantenimiento de la actividad de PDH por DCA (Fig. 4C). De hecho, el DCA aumentó significativamente la actividad PDH (p = 0,005), en contraste con la inhibición significativa por metformina (p = 0,000), en comparación con el control. Además, el cotratamiento de DCA con metformina recuperó significativamente la actividad PDH inhibida por metformina (p= 0,000) hasta el nivel de control (Fig. 4D); el DCA antagonizó el efecto de la metformina sobre la actividad PDH. Para evaluar la regulación de los cambios metabólicos por DCA o metformina, se midieron las tasas de consumo de glucosa y producción de lactato en los medios de cultivo; el tratamiento con DCA redujo significativamente el consumo de glucosa (p = 0,000), frente al aumento significativo por metformina (p = 0,000, Fig. 4E). Sin embargo, el cambio fue insignificante por metformina más DCA cotratamiento (p= 0,125 frente a control), lo que confirma una vez más la relación antagónica entre DCA y metformina. Además, la liberación de lactato (Fig. 4F) por DCA o metformina sola reveló el mismo patrón que los de la tasa de consumo de glucosa (Fig. 4E), lo que sugiere el cambio del metabolismo de la glucosa de la glucólisis aeróbica inducida por metformina a la oxidación mitocondrial por el cotratamiento con DCA. Cuando se midieron la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) con el analizador XF24, la relación OCR/ECAR aumentó significativamente con el tratamiento con DCA (p = 0,000), lo que representa un aumento de la respiración mitocondrial, pero disminuyó con la metformina (p = 0,009) en comparación con el control. De hecho, el cotratamiento de metformina con DCA recuperó significativamente la respiración mitocondrial en comparación con la metformina sola (p= 0,000), aunque fue un poco inferior a la del DCA solo (p = 0,04). En conjunto, el cotratamiento de metformina con DCA reprogramó el metabolismo de la glucosa en parte de la glucólisis aeróbica a la oxidación mitocondrial (Fig. 4G).

Fig. 4. El dicloroacetato recuperó la actividad de la piruvato deshidrogenasa inhibida por la metformina y la respiración mitocondrial junto con la disminución del consumo de glucosa. (A) Inhibición mediada por metformina de la actividad piruvato deshidrogenasa (PDH) en condiciones de glucosa elevada. Las células HeLa incubadas con metformina (0-5 mM) durante 24 h fueron sometidas a un ensayo de actividad PDH utilizando el kit de Mitoscience. Obsérvese una inhibición significativa de la actividad PDH por encima de 1 mM de metformina, #p< 0,05 y *p< 0,001 frente al control sin tratamiento. (B) Análisis de inmunoblot que revela la fosforilación de la subunidad PDH-E1a por el tratamiento con metformina durante 6 h. Obsérvese el aumento de la fosforilación de PDH-E1a en el residuo S293 por el tratamiento con metformina. (C) Análisis de inmunoblot que revela la inhibición significativa de la fosforilación de la PDH-E1a por el coteratamiento con metformina y dicloroacetato (DCA) durante 12 h. Obsérvese el contraste de los efectos de la metformina y el DCA sobre la fosforilación de la PDH-E1a, lo que indica la inhibición de la PDH quinasa (PDK) por el DCA, frente al aumento significativo por la metformina. Al mismo tiempo, los datos mostraron una recuperación significativa de la fosforilación de la PDH inhibida por la metformina mediante el cotratamiento con DCA. (D) Recuperación de la actividad PDH inhibida por metformina mediante cotratamiento con DCA en células HeLa. La metformina por sí sola inhibió significativamente la actividad PDH, sin embargo, el DCA solo y el cotratamiento con DCA más metformina aliviaron significativamente la actividad PDH inhibida por metformina. p = 0 .02 y p = 0 .000 en el Met + DCA vs. el DCA solo y el Met solo, respectivamente. (E y F) Inhibición del consumo de glucosa inducido por metformina (E) y de la producción de lactato (F) mediante el tratamiento con DCA en células HeLa. Las células se trataron con metformina (5 mM) y DCA (20 mM) durante 24 h. Para confirmar los cambios de la tasa glucolítica, se midieron el consumo de glucosa y la producción de lactato mediante el sistema bioanalítico multiparamétrico YSI 7100. Obsérvese un aumento significativo del consumo de glucosa y de la producción de lactato en las células tratadas con metformina( p = 0,000 frente al control), mientras que los niveles se redujeron significativamente con el cotratamiento con DCA(p = 0,000 frente a DCA solo y Met solo). (G) La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se midieron con el analizador XF24. La tasa de respiración mitocondrial (OCR/ECAR) aumentó significativamente con el tratamiento de DCA solo(p = 0,000 frente al control) frente a la disminución significativa con el tratamiento de metformina(p = 0,009 frente al control). Sin embargo, la respiración mitocondrial inhibida por la metformina se recuperó significativamente con el cotratamiento con DCA en comparación con los tratamientos con metformina o DCA solos( p = 0,000 frente a Met solo y p = 0,040 frente a DCA solo).

El dicloroacetato aumenta el estrés oxidativo y la citotoxicidad de la metformina en condiciones de glucosa elevada
Para investigar el efecto de la reprogramación metabólica mediada por el DCA en el nivel de ROS celular, se emplearon análisis FACS utilizando MitoSox Red y DCFDA. El tratamiento conjunto de las células HeLa con metformina y DCA aumentó los niveles de superóxido mitocondrial y de ROS celular total más que cada tratamiento (Fig. 5A), lo que sugiere que la reprogramación metabólica podría agravar el estrés oxidativo por DCA. Para evaluar si la generación de ROS aumentada por el DCA incrementa o no la citotoxicidad de la metformina, se contabilizó la viabilidad celular tras el tratamiento con metformina, DCA o ambos. A diferencia del nivel insignificante de muerte celular por DCA solo (∼20 mM), el cotratamiento de DCA con metformina redujo notablemente la viabilidad a pesar de las condiciones de alta glucosa (Fig. 5B). Para evaluar el efecto del aumento de ROS en la muerte celular, se pretrataron antioxidantes, NAC o trolox, o un prooxidante, BSO, antes del cotratamiento con metformina y DCA. De hecho, los antioxidantes redujeron significativamente la liberación de LDH en el medio, mientras que ésta aumentó con el pretratamiento con BSO (Fig. 5C), lo que indica una regulación significativa de la citotoxicidad de la metformina a través de la modulación del estrés oxidativo por el DCA. Este efecto sinérgico de la citotoxicidad también se observó en otras células cancerosas, MDA-MB-231, EJ y MCF7 (datos no mostrados). Además, el cotratamiento de metformina y DCA inhibió significativamente la síntesis de ciclina D1 y ciclina E junto con la escisión de PARP (Fig. 5D y E), lo que indica una reducción de la proliferación celular y la inducción de apoptosis. Por último, el tratamiento conjunto redujo significativamente el crecimiento independiente del anclaje de las células HeLa en comparación con los tratamientos individuales y el control (Fig. 5F).

Fig. 5. El cotratamiento con metformina y dicloroacetato potenció el estrés oxidativo y la muerte de las células cancerosas en condiciones de glucosa elevada. (A) El cotratamiento con DCA potenció la generación de ROS inducida por metformina. Las células HeLa tratadas con DCA (20 mM) o metformina (5 mM) durante 24 h se analizaron mediante FACS tras preincubación con MitoSox y DCFDA. Obsérvese el aumento significativo de los niveles de ROS por el cotratamiento con metformina y DCA(p = 0,000 frente a metfomin solo). (B) Monocapas de células HeLa tratadas con DCA o metformina durante 72 h (panel izquierdo). La viabilidad celular se midió por el método de exclusión con azul tripán (panel derecho). Obsérvese el agravamiento significativo de la muerte celular por el cotratamiento con metformina y DCA(*p< 0,001). Sin embargo, no hubo citotoxicidad por DCA solo hasta 20 mM. (C) Regulación de la liberación de LDH mediante la adición de antioxidantes o secuestradores de GSH. Las células HeLa se trataron con metfromina (5 mM) y DCA (20 mM) o bien con NAC (1 mM), trolox (100 μM) o BSO (1 mM) durante 48 h, y luego se determinó la LDH liberada en los medios de cultivo. Se observa una reducción significativa de la liberación de LDH por los antioxidantes, NAC o trolox, mientras que el tratamiento con BSO la aumentó significativamente, lo que indica que la muerte celular mediada por metformina y DCA se regula mediante la modulación del nivel de ROS. (D) Análisis de inmunoblot que revela una pérdida significativa de la expresión de ciclina D1 y ciclina E por el tratamiento con meformina más DCA, lo que sugiere la inhibición de la proliferación celular en las células por el cotratamiento. (E) Análisis de inmunoblot que muestra la escisión de PARP y caspasa 3 sólo en el cotratamiento con meformina y DCA, lo que indica una muerte celular significativa tras el cotratamiento. (F) Ensayo de formación de colonias en agar blando. Las células HeLa tratadas con DCA y/o metformina se sometieron a un ensayo de tumorigénesis in vitro y, a continuación, las colonias se tiñeron con violeta cristal a las 2 semanas del ensayo. Obsérvese una inhibición significativa de la formación de colonias sólo en el grupo de cotratamiento con DCA y metformina. * p < 0.001.

Discusión

Presentamos evidencias de que la reprogramación del metabolismo de la glucosa mediante el tratamiento de células HeLa con meformina y dicoloroacetato potenciaba la muerte celular a través de la regulación al alza del nivel de ROS mediante el aumento de la oxidación mitocondrial en lugar de la glucólisis aeróbica (Fig. 6). El DCA se empleó como agente para promover la fosforilación oxidativa por encima de la glucólisis y con la intención de reprogramar el metabolismo de la glucosa mediado por metformina. El DCA activa la PDH mediante la inhibición de la PDK, por lo que el piruvato puede convertirse en acetil-CoA en lugar de lactato. Como mecanismo bioquímico de la sensibilización de las células cancerosas a la citotoxicidad inducida por la privación de glucosa, demostramos que el estrés oxidativo inducido por la metformina se agravaba en condiciones de privación de glucosa (Fig. 2C). De hecho, la metformina consumió glutatión mucho más que el uso basal (Fig. 2D), mientras que fue mucho menor en presencia de glucosa (5,5 mM). Aunque el pretratamiento de las células HeLa con NAC bloqueó significativamente la muerte celular en condiciones sin glucosa, el suplemento de cisteína por NAC sin glutamina fue insuficiente para mantener el nivel de glutatión para soportar el estrés oxidativo inducido por la metformina (Fig. 2E). Este fenómeno puede apoyarse en el estudio de que la glutamina es importante para la carboxilación reductora en células tumorales con mitocondrias defectuosas [19]. Por lo tanto, el suplemento de NAC con glutamina redujo significativamente la citotoxicidad por metformina en condiciones sin glucosa (Fig. 2E).

Bajo condiciones de alta glucosa (25 mM), 10 mM de metformina exhibió sólo un leve efecto tumorista, pero no una muerte celular significativa (Fig. 3B). Por el contrario, 2,5 mM de metformina indujeron una muerte celular significativa bajo una concentración de glucosa de 5,5 mM (Fig. 1B), lo que indica que la glucosa es una fuente importante de poder reductor. Por lo tanto, la suplementación con 1-2 mM de glucosa fue suficiente para bloquear la citotoxicidad de la metformina en el nivel habitual de glucosa (Fig. 1A), lo que sugiere que la citotoxicidad de la metformina podría ser insuficiente para inducir la muerte celular en condiciones fisiológicas de glucosa. Sin embargo, el tratamiento con metformina aumentó significativamente las ERO mitocondriales en condiciones de ausencia de limitación de glucosa. Todavía no existe ningún estudio centrado en la generación de ROS mitocondriales en el contexto de la citotoxicidad de la metformina. Aquí, observamos que 1 mM de metformina ya aumentaba significativamente el superóxido mitocondrial junto con las ROS celulares (Fig. 2B), lo que inducía la hinchazón mitocondrial en las células cancerosas y la hinchazón no era irreversible (Figs. suplementarias S1A y S1B). Sin embargo, el aumento de ROS mitocondriales no parece ser suficiente para aumentar el total de ROS celulares y el daño oxidativo. Las células cancerosas expuestas a metformina intentan minimizar el daño oxidativo para mantener la viabilidad celular mediante la inducción de la glucólisis aeróbica y la producción de NADPH. La noción puede ser parcialmente apoyada por el hecho de que el agotamiento del poder reductor por BSO o H2O2 exógeno aumentó la citotoxicidad de la metformina a pesar de la condición de glucosa alta (Fig. 3). Las células cancerosas pueden soportar el estrés oxidativo a través de la glucólisis aeróbica y la cantidad de GSH puede ser mantenida principalmente por el NADPH producido a través de la vía de la pentosa fosfato [12].

La actividad antitumoral del DCA ha sido demostrada in vitro [4] e in vivo en modelos de ratón [27], [28], y en pacientes con glioblastoma [18], sin embargo, el valor IC50 del DCA es relativamente alto (>17 mM, 48 h) para inducir la muerte celular. Además, no existe especificidad de célula tumoral en las líneas celulares de cáncer ensayadas [26], y el DCA es selectivamente activo contra células con defecto en mitocondrias como las células rho(0) o las células HCT116 p53 nulas con deficiencia de complejo IV. También observamos que 20 mM de DCA por sí solo no indujo una muerte celular efectiva, sin embargo, combinado con metformina sinergizó la actividad antitumoral del DCA con 10 mM (Fig. 5B y F).

Cuando las células fueron tratadas con metformina, la actividad de la PDH fue inhibida significativamente a través de su fosfoliación en el residuo Ser293 (Fig. 4C) sin ningún cambio significativo de la expresión del ARNm de la PDK (datos no mostrados), indicando la modificación posttranscripcional. Aunque no pudimos definir el mecanismo de la inhibición de la actividad de la PDH inducida por la metformina, la disminución de la actividad de la PDK por el DCA potenció el estrés oxidativo inducido por la metformina mediante la represión de la fosforilación de la PDH (Fig. 4), lo que indica la inhibición de la actividad de la PDK por el DCA, pero el aumento de la fosforilación oxidativa junto con el estrés redox. De acuerdo con el hallazgo anterior, el DCA restauró significativamente la respiración mitocondrial inhibida por la metformina en parte (Fig. 4F) y aumentó altamente la generación mitocondrial de ROS inducida por la metformina (Fig. 5A). El papel protector de los antioxidantes frente al tratamiento combinado de metformina y DCA nos llevó a concluir que el DCA puede potenciar la citotoxicidad de la metformina a través de la reprogramación y el aumento del estrés oxidativo (Fig. 5C).

En resumen, la citotoxicidad inducida por metformina se vio potenciada por la privación de glucosa. Incluso en condiciones de glucosa elevada, el estrés adicional por ROS debido a la depleción de GSH o al insulto exógeno de H2O2 aumentó la citotoxicidad de la metformina junto con el aumento de la respiración mitocondrial. Concluimos que la reprogramación del metabolismo de la glucosa de la glucólisis aeróbica a la respiración oxidativa mediada por el DCA agrava el estrés oxidativo inducido por la metformina y sensibiliza la citotoxicidad de la metformina en las células cancerosas (Fig. 6).

Fig. 6. La reprogramación del metabolismo de la glucosa mediante el cotratamiento con metformina y dicoloroacetato aumenta la muerte celular en lugar de la supervivencia celular a través del agravamiento del estrés oxidativo. El tratamiento de las células cancerosas con una concentración baja de metformina (Met) aumenta la glucólisis aeróbica mediante la inhibición de la piruvato deshidrogenasa (PDH) y del complejo mitocondrial 1 (mComplex I), lo que da lugar a la generación de H2O2 celular y superóxido mitocondrial. Sin embargo, el nivel de ROS es insuficiente para inducir la muerte celular, y puede más bien estimular la proliferación de las células cancerosas. Por el contrario, el cotratamiento de células cancerosas con metformina y DCA inhibe significativamente la PDH quinasa (PDK), aumentando así la actividad de la PDH junto con la tasa de consumo de oxígeno (OCR) a través del ciclo TCA en las mitocondrias. La alteración del metabolismo de la glucosa aumenta el estallido oxidativo, lo que a su vez puede potenciar la muerte de las células cancerosas en lugar de su supervivencia a pesar de las condiciones de glucosa elevada. Las condiciones que aumentan el nivel de glutatión reducido pueden proteger a las células del estrés oxidativo.

Conflicto de intereses

No hay ningún interés financiero relacionado con este trabajo.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado con una subvención del Programa Nacional de I+D para el Control del Cáncer del Ministerio de Sanidad y Bienestar de la República de Corea (131280).

Apéndice A. Material suplementario

Los datos suplementarios asociados a este artículo pueden encontrarse, en la versión en línea, en http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2014.01.015.

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