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Cecilie Abildgaard1, Christina Dahl1, Astrid L Basse2, Tao Ma2 y Per Guldberg1*

1 Centro de Investigación de la Sociedad Danesa del Cáncer, Copenhague, Dinamarca
2 Departamento de Biología, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca.

Correspondencia: [email protected]

Recibido: 14 de septiembre de 2020
Aceptada: 4 de diciembre de 2020
Publicado: 9 de diciembre de 2020

Resumen

Antecedentes: Los avances en el tratamiento del melanoma mediante la inhibición dirigida del oncogénico BRAF son limitados debido al desarrollo de resistencia adquirida. La implicación de BRAFV600E en la reprogramación metabólica de las células de melanoma justifica la utilización del metabolismo como objetivo terapéutico.

Métodos: Examinamos los efectos del dicloroacetato (DCA), un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa, sobre el crecimiento y la actividad metabólica de líneas celulares de melanoma humano. Se investigó el efecto combinado del DCA y el inhibidor de BRAF vemurafenib en líneas celulares de melanoma con mutación BRAFV600E. Se establecieron líneas celulares resistentes al vemurafenib in vitro y se comprobó su sensibilidad al DCA.

Resultados: El DCA indujo una reducción de la actividad glucolítica y de los niveles intracelulares de ATP, e inhibió el crecimiento celular. El tratamiento conjunto de células de melanoma con mutación BRAFV600E con DCA y vemurafenib indujo una mayor reducción de los niveles de ATP intracelular y del crecimiento celular que cualquiera de los compuestos por separado. Además, las células de melanoma con resistencia adquirida in vitro al vemurafenib conservaron su sensibilidad al DCA.

Conclusiones: Estos resultados sugieren que DCA potencia el efecto de vemurafenib a través de una atenuación cooperativa de la producción de energía. Además, la demostración de la sensibilidad retenida al DCA en células de melanoma con resistencia adquirida al vemurafenib podría tener implicaciones para el tratamiento del melanoma.


Palabras clave: Dicloroacetato, Melanoma, BRAF, Bioenergética, Metabolismo, ATP
Abreviaturas: (Acetyl-CoA): Acetil coenzima A, (AMPK): Proteína quinasa activada por AMP, (DCA): Dicloroacetato, (ECAR): Tasa de acidificación extracelular, (HEMn-LP): Melanocitos epidérmicos humanos, (IC50): Media concentración máxima inhibitoria, (LKB1): Quinasa hepática B1, (MITF): Factor de transcripción asociado a la microftalmia, ( OCR): Tasa de consumo de oxígeno, (PDH): Piruvato deshidrogenasa, (PDK): Piruvato deshidrogenasa quinasa

2014 Abildgaard et al.; con licencia de BioMed Central Ltd.


Antecedentes

Una característica distintiva del cáncer es la reprogramación del metabolismo celular hacia la glucólisis aeróbica. Este patrón metabólico se caracteriza por una mayor captación de glucosa y una actividad glucolítica altamente regulada con fermentación de la glucosa en ácido láctico en lugar de una descomposición aeróbica completa en las mitocondrias. La glucólisis aeróbica, también denominada efecto Warburg, se asemeja al metabolismo anaeróbico de las células normales, pero se produce en el contexto de un suministro adecuado de oxígeno [1]. La reprogramación del metabolismo en las células cancerosas es un proceso muy complejo y heterogéneo, impulsado por una amplia variedad de estrategias genéticas y no genéticas para superar la restricción energética [2]-[4].

El oncogén BRAF V600E, presente en más del 50% de los melanomas [5], se ha implicado directamente en la reprogramación del metabolismo celular. La actividad constitutiva del BRAF mutante reduce la expresión de enzimas oxidativas y el número de mitocondrias, al tiempo que aumenta la expresión de enzimas glucolíticas y la producción de ácido láctico [6],[7]. Además, se ha reconocido un vínculo molecular entre la vía RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK y el punto de control del estrés energético mediado por la vía de la quinasa hepática B1 (LKB1)-proteína quinasa activada por AMP (AMPK), lo que sugiere un papel de BRAFV600E en la mediación de la resistencia al estrés energético [8],[9]. BRAF afecta al metabolismo oxidativo a través del control dependiente del factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF) del regulador maestro mitocondrial PGC1α [7]. Estudios previos han demostrado que los melanomas que expresan PGC1α tienen un fenotipo más oxidativo que los melanomas PGC1α-negativos [4],[7]. Además, se demostró que BRAFV600E media en la senescencia inducida por oncogenes a través de la regulación metabólica. Este mecanismo implica un aumento de la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH) a través de la supresión de la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK) [10]. La PDH controla el acoplamiento entre la glucólisis y la respiración mitocondrial facilitando la entrada de piruvato en las mitocondrias, promoviendo la utilización completa de la glucosa. El eje PDK-PDH suele estar desregulado en el cáncer, donde la sobreexpresión de PDK reduce el acoplamiento entre los dos sistemas energéticos y contribuye así al efecto Warburg [11],[12]. Sobre la base de estos hallazgos, se propuso la inhibición dirigida de la PDK como opción terapéutica para el melanoma, con un posible efecto sinérgico de los inhibidores químicos de BRAFV600E, como el vemurafenib [10],[13].

El dicloroacetato (DCA) es un inhibidor de las cuatro isoformas de PDK y se utilizó anteriormente para el tratamiento de la acidosis láctica [14],[15], con baja toxicidad a niveles de dosis eficaces [16],[17]. Varios estudios han demostrado que el DCA revierte el efecto Warburg en células cancerosas y afecta negativamente a su crecimiento y supervivencia [13],[18]-[21]. Este efecto se atribuyó a una normalización del potencial de membrana mitocondrial desde el estado hiperpolarizado que caracteriza a las células cancerosas. Los cambios en el potencial de membrana dan lugar a la reapertura de los canales aniónicos dependientes de voltaje y se demostró que introducen una resensibilización a la apoptosis, debido a la recuperación de la capacidad de liberar mediadores proapoptóticos [18]. Aquí hemos investigado el efecto del DCA en células de melanoma. En concreto, hemos analizado las respuestas celulares en relación con el metabolismo, la bioenergética, el crecimiento, la proliferación y la muerte celular en líneas celulares de melanoma, melanocitos humanos primarios y células de melanoma con mutación BRAFV600E con resistencia adquirida al vemurafenib.

Métodos

Loscompuestos químicos
DCA
(dicloroacetato sódico) y 2-Deoxi-D-glucosa (2-DG) se adquirieron a Sigma-Aldrich y se disolvieron en dH2Ohasta concentraciones de trabajo de 1 M. Vemurafenib (PLX4032) se adquirió a Selleck Chemicals y se disolvió en DMSO hasta una concentración de trabajo de 0,05 M.

Cultivo celular
Las líneas celulares de melanoma ED-007, ED-013, ED-024, ED-027, ED-029, ED-034, ED-050, ED-070, ED-071, ED-117, ED-140, ED-179 y ED-196 se obtuvieron de la European Searchable Tumour line Database (ESTDAB, ED) [22]. La línea celular de melanoma SK-MEL-28 se adquirió a ATCC. Los melanocitos epidérmicos humanos primarios (neonatales) procedentes de tejido ligeramente pigmentado (HEMn-LP) se adquirieron a Invitrogen. Las líneas celulares de melanoma se cultivaron a 37 °C bajo un 5% deCO2 en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina/estreptomicina. Las células HEMn-LP se cultivaron en las mismas condiciones en medio 254CF suplementado con un 1% de suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS-2) y 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato(TPA; 10 ng/ml). Todos los medios y suplementos se adquirieron a Invitrogen.

Análisis metabólico
La caracterización metabólica se realizó en líneas celulares de melanoma y melanocitos humanos primarios utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XF96 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA), que realiza mediciones en tiempo real de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Se diseñó un ensayo para estudiar la capacidad de los sistemas energéticos mitocondrial y glucolítico. La ECAR y la OCR se midieron en condiciones basales y durante la adición sucesiva de cinco moduladores metabólicos: El inhibidor de la ATP sintasa, oligomicina (1 μM); el permeabilizador de la membrana mitocondrial, cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) (1 μM); los inhibidores de la respiración mitocondrial, rotenona (1 μM) y antimicina A (1 μM); y el inhibidor glucolítico, 2-DG (100 mM). El XF Cell Mito Stress Kit, que contiene oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A, se adquirió a Seahorse Bioscience.

Mediciones de ATP
Los niveles intracelulares de ATP se midieron utilizando el ATPlite, 1 step Luminescence Assay System (Perkin Elmer), un método basado en la reacción del ATP con la luciferasa y la D-luciferina. Las células se sembraron por triplicado con 10.000 células por pocillo y se trataron con los compuestos indicados y el control del vehículo durante 2 o 24 horas. La luminiscencia se midió con el lector de microplacas de luminiscencia Spectra Max Gemini EM (Molecular Devices) y se normalizó a niveles de fondo.

Ensayo con violeta de cristal
Se aplicóunensayo con violeta de cristal para evaluar el efecto de los compuestos estudiados sobre el crecimiento celular. Las células se sembraron por duplicado a una densidad adecuada y se trataron con DCA, vemurafenib, los dos compuestos combinados y el vehículo de control. El medio y los compuestos de tratamiento se sustituyeron cada 48 horas. El experimento se repitió tres veces de forma independiente. Para finalizar el experimento, se eliminaron el medio y las células no adheridas, y las células restantes se lavaron con PBS y se fijaron con glutaraldehído durante 15 minutos. Las células fijadas se incubaron con solución de violeta cristal (0,1% de violeta cristal, 20% de CH3OH) durante 1 hora. La cantidad de colorante absorbido por la monocapa, proporcional al número de células viables adheridas al fondo del pocillo, se cuantificó extrayendo el color con ácido acético al 10% y midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. La correlación lineal entre la absorbancia y el número de células se verificó mediante la realización de una curva estándar. El crecimiento celular relativo se determinó normalizando con respecto a los controles no tratados tras la sustracción del fondo (sin células).

Ensayo de proliferación celular
Se sembraron células de melanoma por triplicado con 500-1.000 células por pocillo y se trataron con DCA a las concentraciones dadas y con el control del vehículo durante 96 horas. A continuación se midió la proliferación mediante la detección de BrdU tras 12 horas de incorporación al ADN celular. El procedimiento se llevó a cabo según el protocolo proporcionado con el BrdU Cell Proliferation Assay Kit (Cell Signaling Technology®).

Detección de apoptosis con Annexin V-FITC


La detección de apoptosis se realizó utilizando un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC (BD Bioscience), según el protocolo proporcionado. Se cosecharon las células y se lavaron dos veces en PBS frío. A continuación, las células se transfirieron a otro tubo, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de unión. A partir de la resuspensión, se transfirieron 5 ×
105 células a tubos FACS y se tiñeron con Annexin V-FITC y yoduro de propidio (PI). Tras 30 minutos de incubación, se realizó una citometría de flujo en un instrumento Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter). Como control se incluyeron células sin teñir.

Inducción de la resistencia adquirida in vitro al vemurafenib


La resistencia adquirida al vemurafenib se indujo en siete cultivos derivados de cuatro líneas celulares de melanoma con mutación
BRAFV600E y sensibles al vemurafenib (ED-013, ED-071, ED-196 y SK-MEL-28). Las células se cultivaron en concentraciones crecientes de vemurafenib hasta que crecieron de forma constante en una concentración superior a la IC50, y después se mantuvieron en medio que contenía vemurafenib.

Pirosecuenciación
La pirosecuenciación
de los puntos calientes de mutación en BRAF y NRAS se realizó en una plataforma PyroMark Q24 (Qiagen), utilizando reactivos PyroMark Gold Q24 (Qiagen). Las secuencias de los cebadores se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1.

Sitio dianaNombre del cebadorSecuencia del cebador (5′-3′)
BRAF V600EBRAF-F1[Btn]-TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA
BRAF-R1GGCCAAAAATTTAATCAGTGGAA
BRAF-S1CCACTCCATCGAGATTT
NRAS Q61K,L,RNRAS-F1[Btn]-ACCCCCAGGATTCTTACAGAAA
NRAS-R1CGCAAATGACTTGCTATTATTGA
NRAS-S1TCATGGCACTGTACTCTT
Tabla suplementaria S1

Análisis de expresión de PGC1α
El ARN total se aisló con el kit RNeasy mini (Qiagen) y el ADNc se sintetizó con el kit de transcriptasa inversa SuperScript™ III (Invitrogen). Se utilizaron oligo dT24 y hexámeros aleatorios como cebadores para la síntesis de ADNc. La expresión génica de PGC1α se determinó con PCR cuantitativa en tiempo real en el LightCycler 2.0 de Roche utilizando el kit LigthCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche). Las secuencias de cebadores fueron PPARGC1A_2241F: 5′-GCTGTACTTTTGTGGACGCA-3′ y PPARGC1A_2306R: 5′-GGAAGCAGGGTCAAAGTCAT-3′. La expresión se normalizó con respecto a la expresión del gen de mantenimiento RPLP0. Las secuencias del cebador fueron: RPLP0_433F: 5′-ACTAAAATCTCCAGGGGCACC-3′ y RPLP0_547R: 5′-ATGACCAGCCCAAAGGAGAA-3′. Las dos líneas celulares de melanoma ED-050 y SK-MEL-28 se incluyeron como controles positivo y negativo, respectivamente [4].

Análisis estadístico
Las diferencias entre conjuntos de datos independientes se determinaron con la prueba t de Student. Para el análisis estadístico de la varianza entre los distintos tratamientos (control con vehículo, DCA, vemurafenib y la combinación de DCA y vemurafenib) se utilizó ANOVA de muestras emparejadas de una vía. Para determinar la significación estadística se utilizó la prueba multicomparativa de diferencia significativa honesta (HSD) de Tukey. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para determinar la correlación entre la sensibilidad al DCA y los parámetros metabólicos. Un valor de 1 indicaba una correlación positiva, 0 ninguna correlación y -1 una correlación negativa.

En los experimentos realizados en este estudio sólo se utilizaron líneas celulares disponibles en el mercado, por lo que no requirieron la aprobación de un comité ético.

Resultados

Caracterización metabólica de líneas celulares de melanoma y melanocitos primarios
El perfil metabólico de 12 líneas celulares de melanoma y melanocitos humanos primarios (HEMn-LP) se realizó utilizando el analizador Seahorse FX96. Este instrumento realiza mediciones en tiempo real de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), que son medidas indirectas de la actividad glucolítica y la respiración mitocondrial, respectivamente [23]. Las mediciones se realizaron en condiciones basales y durante la adición sucesiva de cinco moduladores metabólicos (Figura 1A). En comparación con los melanocitos normales, 11 de las 12 líneas celulares presentaron tasas glucolíticas más elevadas, como indican los ECAR glucolíticos basales más altos, lo que demuestra que el efecto Warburg es una característica general de las células de melanoma. Además, nueve de las líneas celulares presentaron capacidades glucolíticas máximas superiores en comparación con los melanocitos (Figura 1B). Con pocas excepciones, no hubo diferencias significativas en la respiración mitocondrial basal y máxima entre los melanocitos y las células de melanoma (archivo adicional 2: Figura S2). Según las relaciones OCR-ECAR (OCR/ECAR; Figura 1C), la contribución relativa de la respiración mitocondrial a la producción de ATP fue menor en 10 de las líneas celulares de melanoma en comparación con los melanocitos.

Figura S2

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Figura 1. Caracterización metabólica de líneas celulares de melanoma y melanocitos primarios. A, Perfiles metabólicos de dos líneas celulares de melanoma (ED-013 y ED-179) y melanocitos epidérmicos humanos (HEMn-LP), basados en mediciones Seahorse XF96. Se representan las mediciones de ECAR (panel izquierdo) y OCR (panel derecho) durante la adición sucesiva de oligomicina (1 μM), FCCP (1 μM), rotenona/antimicina (1 μM/1 μM) y 2-DG (100 mM). Los datos constituyen 6 mediciones paralelas y son representativos de tres experimentos independientes. B, Valores ECAR glucolíticos basales y máximos para líneas celulares de melanoma y melanocitos primarios humanos (HEMn-LP). El ECAR medido tras la adición de 2-DG (ECAR no glucolítico) se restó de todos los valores. La línea discontinua indica el ECAR basal de HEMn-LP. C, Relaciones entre el OCR mitocondrial basal y el ECAR glucolítico basal. D, Acoplamiento ATP que representa la fracción del OCR basal utilizada para la producción de ATP (fracción inhibida por oligomicina). E, El ratio de control respiratorio, que denota el ratio entre el OCR mitocondrial máximo y la fuga de protones (OCR tras la adición de oligomicina).(BE), Los valores son las medias de tres mediciones independientes ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Students para determinar las diferencias entre HEMn-LP y las líneas celulares de melanoma (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

La eficiencia mitocondrial (acoplamiento ATP) y el rendimiento (ratio de control respiratorio) se estimaron a partir de mediciones de dos parámetros de la función mitocondrial; la fuga de protones y el OCR mitocondrial máximo [24]. La fuga de protones se determinó tras la adición del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina, y el OCR mitocondrial máximo se determinó tras la adición del desacoplador mitocondrial FCCP. Este análisis mostró un acoplamiento ATP significativamente menor en las células de melanoma en comparación con los melanocitos (p < 0,05; ED-007: p = 0,07), lo que sugiere una mayor fuga de protones y una producción menos eficiente de ATP en relación con el nivel de consumo de oxígeno (Figura 1D). Además, seis de las líneas celulares de melanoma también presentaban ratios de control respiratorio significativamente más bajos que los melanocitos (p?<?0,01, Figura 1E), lo que indica un rendimiento mitocondrial deficiente.

ElDCA desplaza el metabolismo hacia la respiración mitocondrial y reduce los niveles de ATP
Para determinar el efecto del DCA sobre el metabolismo de las células de melanoma, analizamos el panel de 12 líneas celulares utilizando el analizador Seahorse XF96. Tras el tratamiento con 10 mM de DCA durante 2 horas, todas las líneas celulares respondieron con una reducción del ECAR y un aumento del OCR (Figura 2A), lo que indica un desplazamiento hacia la respiración mitocondrial. La respuesta ECAR fue similar entre las líneas celulares, mientras que hubo una gran variación en la respuesta OCR (Figura 2A). Los cambios relativos en ECAR, OCR y OCR/ECAR en respuesta al DCA dependieron de la concentración (archivo adicional 3: Figura S3).

Figura 2. Efectos del Efectos del DCA sobre el metabolismo y los niveles de ATP. A, Cambios relativos en el OCR mitocondrial basal y el ECAR glucolítico inducidos por el tratamiento con 10 mM de DCA durante 2 horas. B, Niveles relativos de ATP tras el tratamiento con DCA (10 o 20 mM) durante 24 horas. Para el análisis estadístico se utilizó el ANOVA de muestras emparejadas de una vía y la prueba HSD de Tukey para determinar la significación estadística (*p < 0,05; **p < 0,01).

Para determinar si el cambio en el metabolismo interfería con la homeostasis energética, medimos los niveles de ATP en células de melanoma tras el tratamiento con 0,1, 1 o 10 mM de DCA durante 2 horas. Las tres líneas celulares analizadas fueron capaces de mantener los niveles de ATP tras el tratamiento con concentraciones bajas de DCA (0,1-1 mM), mientras que se observó una tendencia a la reducción del ATP en los cultivos tratados con 10 mM de DCA (archivo adicional 3: Figura S3). Cuando las células se trataron con DCA (10 o 20 mM) durante 24 horas, se observó una disminución significativa del ATP dependiente de la concentración (Figura 2B), lo que indica un agotamiento gradual del sistema metabólico.

Figura S3

El DCAreduce el crecimiento de las células de melanoma independientemente del controlador genético y del estado de expresión de PGC1α
Para evaluar una posible aplicación clínica del DCA para el tratamiento del melanoma, estudiamos sus efectos sobre diferentes parámetros de crecimiento celular. El panel completo de líneas celulares y melanocitos primarios se trató con un rango de concentraciones de DCA (0,5-100 mM) durante 96 horas (véase la Figura 3A para los resultados representativos). Todas las líneas celulares mostraron una reducción del crecimiento dependiente de la concentración, con valores de IC50 en el intervalo de 9-38 mM (Tabla 1), en comparación con un valor de IC50 de 70 mM para los melanocitos primarios (p < 0,001). No hubo correlación entre la respuesta al DCA y el estado de mutación BRAF/NRAS o los niveles de expresión de PGC1α (Tabla 1).

Línea celularDCA IC50(mM)4Estado BRAF/NRASS1Expresión de PGC1α2,4
ED-0708.9 ± 0.6***NRASQ61L1.0 ± 0.2
ED-00712.2 ± 2.2***WT30.6 ± 0.0
ED-07112.3 ± 3.6***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-03412.7 ± 1.7***BRAFL597S1.0 ± 0.2
ED-01314.4 ± 2.0***BRAFV600E1.9 ± 0.3
ED-02717.7 ± 2.1***BRAFV600E0.5 ± 0.1
SK-MEL-2820.0 ± 4.5***BRAFV600E0.0 ± 0.0
ED-17920.6 ± 1.8***NRASQ61R0.3 ± 0.0
ED-02421.9 ± 1.6***NRASQ61L0.0 ± 0.0
ED-14023.9 ± 2.0***WT0.4 ± 0.1
ED-05024.1 ± 3.1***WT2.7 ± 0.5
ED-02929.7 ± 5.1***BRAFV600K1.3 ± 0.2
ED-19635.8 ± 3.2***BRAFV600E1.5 ± 0.5
ED-11737.6 ± 2.2***BRAFV600E1.2 ± 0.1
HEMn-LP69.1 ± 6.4WT1
ED-013-R112.6 ± 3.0***BRAFV600E
ED-013-R213.6 ± 2.4***BRAFV600E
ED-071-R112.2 ± 0.9***BRAFV600E
ED-071-R213.8 ± 3.7***BRAFV600E
SK-MEL-28-R123.1 ± 4.6***BRAFV600E
SK-MEL-28-R226.2 ± 8.0**BRAFV600E
Tabla 1 Valores IC 50 delDCA, estado de BRAF/NRAS y expresión de PGC1α
**p < 0,01; ***p < 0,001 en comparación con HEMn-LP.
1Elestado deBRAF/NRAScoincide con los resultados publicados[25].
2Respectoa la expresión de PGC1α en melanocitos normales.
3Detiposilvestre.
4Losvalores IC50del DCAy la expresión de PGC1α representan las medias de tres mediciones independientes ± desviación estándar.
Figura 3. Efectos del DCA sobre el crecimiento, la proliferación y la apoptosis. A, Selección representativa de tinciones con violeta cristal de cuatro líneas celulares de melanoma (ED-007, ED-070, ED-179 y ED-196) tratadas con concentraciones crecientes de DCA (1-50 mM) durante 96 horas. B, Proliferación determinada por la incorporación de BrdU tras el tratamiento con DCA (1 y 10 mM) durante 96 horas. Para el análisis estadístico se utilizó el ANOVA de una vía con muestras emparejadas y la prueba HSD de Tukey para determinar la significación estadística (*p < 0,05; **p < 0,01). C, Detección de apoptosis mediante citometría de flujo basada en Annexin V y PI en células ED-179 y ED-196 tras el tratamiento con DCA a concentraciones inferiores (10 mM) y superiores (100 mM) al IC50 durante 96 horas.

Para caracterizar mejor los efectos del DCA sobre el crecimiento celular, medimos la incorporación de BrdU en células tratadas con 1 o 10 mM de DCA durante 96 horas. Como se muestra en la Figura 3B, las cuatro líneas celulares analizadas respondieron con una proliferación reducida, del orden del 11-30% a 1 mM y del 42-88% a 10 mM. También medimos la respuesta apoptótica al DCA mediante un análisis de flujo-citométrico de los niveles de anexina V. A concentraciones de DCA por debajo de IC50, el número de células anexina V-positivas no aumentó después de 96 horas y hasta 3 semanas. En cambio, el tratamiento con concentraciones superiores a la IC50 aumentó el número de células positivas tanto para anexina V como para PI, lo que indica la inducción de la muerte celular ya después de 96 horas (Figura 3C).

El DCApotencia el efecto del vemurafenib en células de melanoma con mutación BRAFV600E
Para investigar si el DCA puede utilizarse para mejorar la eficacia de los inhibidores químicos de BRAF para el tratamiento del melanoma, probamos varias combinaciones de DCA y vemurafenib sobre el crecimiento celular. El tratamiento de cuatro líneas celulares mutantes de BRAFV600E con vemurafenib (0,05-5 μM) durante 96 horas reveló valores de IC50 de 0,5 a 4,5 μM, en consonancia con los datos de estudios anteriores [26]. Al exponer melanocitos primarios al mismo tratamiento, no alcanzamos el valor IC50 para estas células, ni siquiera con la concentración más alta ensayada (5 μM), lo que confirma la especificidad del compuesto.

Cuando las células se trataron con DCA 1 mM en combinación con concentraciones bajas de vemurafenib (<IC50), la reducción del crecimiento celular fue más pronunciada que con DCA o vemurafenib solos (p < 0,05; Figura 4A, B). El DCA no potenció el efecto del vemurafenib en las células ED-117, lo que puede atribuirse a la resistencia inherente de estas células al DCA (IC50 38 mM; Tabla 1). A las concentraciones IC50, tanto el DCA como el vemurafenib causaron una reducción de los niveles intracelulares de ATP cuando se utilizaron como agentes únicos y una reducción adicional cuando se utilizaron en combinación, aunque no estadísticamente significativa para todas las líneas celulares (Figura 4C).

Figura 4. Efectos del tratamiento combinado con DCA y vemurafenib. A, B, Cuatro líneas celulares de melanoma (ED-013, ED-071, ED-117 y ED-196) se trataron con DCA (1 mM), vemurafenib (50 nM para ED-071 y ED-117; 100 nM para ED-013 y ED-196) o la combinación durante 2 semanas. A, Resultados de la tinción con violeta de cristal representativos de tres experimentos independientes. B, Cuantificación de los datos ejemplificados en A. C, Niveles relativos de ATP en células tratadas con DCA (IC50), vemurafenib (IC50) o la combinación durante 24 horas. B, C, Los datos representan la media ± desviación estándar de tres mediciones independientes. Para el análisis estadístico se utilizó el ANOVA de una vía con muestras emparejadas y la prueba HSD de Tukey para determinar la significación estadística (*p < 0,05; **p < 0,01).

Laslíneas celulares resistentes al vemurafenib tienen una capacidad oxidativa mejorada y conservan la sensibilidad al DCA
Se generaron siete cultivos de células resistentes al vemurafenib a partir de cuatro líneas celulares mutantes BRAFV600E exponiendo las células a concentraciones crecientes de vemurafenib. Se consideró que las células eran resistentes cuando podían propagarse continuamente a una concentración de vemurafenib superior a la IC50. Se aisló ADN de los siete cultivos y se analizó en busca de aumento del número de copias de BRAF y mutaciones secundarias de NRAS, que son dos mecanismos bien descritos de resistencia adquirida a vemurafenib [27],[28]. La pirosecuenciación reveló un aumento de la proporción de BRAF V600E respecto a BRAF WT en una de las líneas celulares resistentes (ED-013-R2) en comparación con la línea celular parental (archivo adicional 4: figura S4). No se encontraron alteraciones de BRAF o NRAS en las restantes líneas celulares resistentes.

Figura S4

La caracterización metabólica de dos de las líneas celulares resistentes (ED-013-R1 y ED-196-R) mediante el analizador Seahorse XF96 mostró que ambas líneas celulares resistentes presentaban un perfil metabólico transformado con un aumento significativo de la capacidad respiratoria máxima (Figura 5A), pero sin cambios en el OCR respiratorio basal, el acoplamiento ATP o el OCR no mitocondrial. Curiosamente, cuando se comprobó la sensibilidad al DCA, todas las líneas celulares resistentes al vemurafenib presentaron valores de IC50 similares a los de las líneas celulares parentales (Tabla 1).

Figura 5. Respuesta del vemurafenib al DCA Respuesta de las líneas celulares demelanoma resistentes al vemurafenib al DCA. A, Perfiles metabólicos de dos líneas celulares de melanoma resistentes a vemurafenib (ED-013-R1 y ED-196-R) en comparación con sus líneas celulares parentales (ED-013 y ED-196). Los paneles indican el OCR basal y los cambios durante la adición sucesiva de oligomicina (1 μM), FCCP (1 μM), rotenona/antimicina (1 μM/1 μM) y 2-DG (100 mM). Los datos constituyen 6 mediciones paralelas y son representativos de tres experimentos independientes. B. Crecimiento celular relativo de las líneas celulares sensibles al vemurafenib (ED-013, ED-071 y SK-MEL-28) y sus subcultivos resistentes al vemurafenib (denominados R1 y R2) tras el tratamiento con DCA (10 mM), vemurafenib (1 μM) o la combinación durante 96 horas. C, Niveles relativos de ATP tras el tratamiento con DCA (IC50), vemurafenib (IC50) o la combinación durante 24 horas.

La Figura 5Bilustra la sensibilidad de las líneas celulares resistentes al vemurafenib al DCA y al vemurafenib, como agentes únicos o en combinación, en comparación con las líneas celulares parentales. El crecimiento de las líneas celulares resistentes disminuyó ligeramente, no se vio afectado o incluso aumentó en presencia de vemurafenib después de 96 horas, mientras que la sensibilidad al DCA fue similar a la de las células parentales, tanto en presencia como en ausencia de vemurafenib (Figura 5B). Se obtuvieron resultados similares al medir los cambios en los niveles de ATP tras el tratamiento con los mismos fármacos durante 24 horas (Figura 5C). En conjunto, estos datos demuestran que las células de melanoma resistentes al vemurafenib conservaron la sensibilidad al DCA, a pesar del cambio en su perfil metabólico.

Discusión

La terapia metabólica dirigida contra el cáncer se ha centrado principalmente en el suministro de energía mediante la inhibición de la glucólisis. Sin embargo, el reconocimiento de que las mitocondrias pueden contribuir activamente a la progresión del melanoma ha incrementado la atención sobre el metabolismo oxidativo como potencial diana terapéutica [10],[13],[29]. El DCA promueve la activación de la PDH dependiente de la PDK, invirtiendo la producción de lactato a favor de la entrada de piruvato en la mitocondria [15],[18]. A través de este mecanismo, el DCA mejora el acoplamiento entre la glucólisis y la respiración mitocondrial, lo que tendrá un mayor impacto en las células con un acoplamiento deficiente, como las células cancerosas [18]. Todas las líneas celulares de melanoma examinadas en nuestro estudio respondieron al DCA con una reducción de la producción de lactato y un aumento de la OCR. Se esperaba que este cambio hacia la respiración mitocondrial optimizara la utilización de sustratos y condujera a un rendimiento energético más eficiente, pero en su lugar condujo a una caída significativa de los niveles de ATP a pesar de un acoplamiento ATP mitocondrial no afectado o incluso aumentado. La reducción observada en el ECAR en respuesta al DCA sugiere que la inhibición de la glucólisis podría ser uno de los principales factores que contribuyen a la privación de energía. No se ha descrito previamente un mecanismo de inhibición de la glucólisis por el DCA. Sin embargo, se ha demostrado que la piruvato quinasa, el último sitio productor de ATP en la vía glucolítica, está regulada negativamente por la acetil coenzima A (acetil-CoA) [30]. Dado que la activación de la PDH aumenta directamente la formación de acetil-CoA [31], esto podría explicar la inhibición de la glucólisis mediada por el DCA. La similitud estructural entre el DCA y el piruvato [32] también podría implicar una inhibición directa de la glucólisis por el DCA, posiblemente a través de un mecanismo de retroalimentación alostérica.

La respuesta metabólica al DCA vino acompañada de una reducción de la proliferación de las células de melanoma, independientemente del estado del controlador genético y de los perfiles metabólicos de estas células. Varios estudios previos han demostrado un efecto apoptótico del DCA sobre las células cancerosas [13],[18],[19],[32]-[34]. Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, la respuesta apoptótica sólo se desencadenó a concentraciones demasiado altas para ser clínicamente relevantes [32]. Para explorar más a fondo la relevancia clínica del DCA en el tratamiento del melanoma, examinamos la eficacia de este agente en combinación con el inhibidor de BRAF vemurafenib. Estos experimentos demostraron un efecto potenciador del DCA en la inhibición del crecimiento de células de melanoma mutantes para BRAFV600E. A concentraciones bajas de DCA que por sí solas no tenían ningún efecto sobre el crecimiento celular, la combinación con concentraciones bajas de vemurafenib tenía un efecto reductor del crecimiento significativamente mayor que el vemurafenib por sí solo. Este efecto potenciador del DCA también se reflejó en la reducción de los niveles de ATP. Los análisis bioquímicos han demostrado la capacidad de BRAFV600E para desacoplar la vía de detección de energía LKB1-AMPK, promoviendo la resistencia a la privación de energía e impidiendo una respuesta apoptótica [8],[9]. El tratamiento con inhibidores de BRAF restaura esta vía [35] y puede, por tanto, potenciar la respuesta a compuestos que reducen la generación de ATP. Tanto el DCA como el vemurafenib suprimen la actividad glucolítica en las células de melanoma y, por tanto, las hacen más dependientes de la respiración mitocondrial [6]. Dado que la glucólisis representa una gran fracción de la producción total de energía en estas células, la inhibición de este proceso supondrá una gran demanda del sistema oxidativo para la producción de ATP. El menor rendimiento de las mitocondrias en las células de melanoma podría explicar la incapacidad de estas células para mantener los niveles de ATP en presencia de DCA y vemurafenib. El efecto cooperativo de estos compuestos en la disminución de los niveles de ATP sugiere que el umbral energético que promueve la detención del crecimiento o la muerte celular en las células de melanoma puede alcanzarse con concentraciones más bajas de vemurafenib en presencia de DCA.

Estudios anteriores han investigado la capacidad de los moduladores metabólicos para mejorar el efecto terapéutico de los inhibidores de BRAF en el tratamiento del melanoma. La combinación de PLX4720 (un análogo de vemurafenib) con cualquiera de las dos biguanidas antidiabéticas, metformina y fenformina, mostró una inhibición sinérgica de la viabilidad de las células de melanoma [35],[36]. Ambos agentes deterioran la síntesis de ATP a través de la inhibición de la actividad del complejo mitocondrial I, lo que conduce a una reducción en la relación ATP a ADP y la activación de la vía LKB1-AMPK para suprimir el crecimiento [35],[36]. A diferencia del DCA, tanto la metformina como la fenformina estimulan la glucólisis y la producción de ácido láctico [37],[38], lo que podría explicar los efectos estimulantes del crecimiento de la metformina en algunas líneas celulares de melanoma cuando se utiliza como agente único. Además, las concentraciones a las que la metformina era eficaz estaban por encima de un nivel terapéuticamente relevante [35]. La fenformina era significativamente más potente que la metformina [36], pero se ha asociado a un alto riesgo de acidosis láctica [39], por lo que se retiró del mercado para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 en muchos países. Por otra parte, se ha demostrado que el DCA potencia el efecto del vemurafenib en concentraciones de hasta 1 mM, y que tiene pocos efectos adversos cuando se administra a pacientes [17],[19],[40]. Estos hallazgos aluden a un potencial terapéutico del DCA como cofármaco para el tratamiento con vemurafenib del melanoma mutante para BRAFV600E. Esto se vio reforzado por la demostración de que la sensibilidad al DCA se mantenía en líneas celulares de melanoma con resistencia adquirida al vemurafenib. Aunque las células resistentes mostraban un perfil metabólico alterado con un aumento significativo de la respiración mitocondrial máxima, como también demostraron Corazao-Rozas et al. [41], eran tan sensibles al DCA como las células parentales sensibles al vemurafenib. Por lo tanto, el DCA podría posiblemente proporcionar una estrategia para prevenir la aparición de subpoblaciones tolerantes a vemurafenib durante el tratamiento inicial y así posponer o prevenir el desarrollo de resistencia.

Conclusiones

Aquí proporcionamos una comprensión más elaborada de los efectos del DCA sobre el metabolismo y el crecimiento de las células de melanoma. La capacidad del DCA para reducir los niveles de ATP y el crecimiento del melanoma parece potenciar el efecto del vemurafenib, un fármaco ya utilizado en la clínica para el tratamiento de melanomas metastásicos con mutación BRAFV600E. Es importante destacar que las células de melanoma con resistencia adquirida al vemurafenib conservaron su sensibilidad al DCA. Estos hallazgos deberían animar a seguir investigando esta combinación de fármacos y la aplicación in vivo del DCA.

Archivos adicionales

Archivo adicional 1: Tabla S1.(33K, doc)
Cebadores de pirosecuenciación para la amplificación y secuenciación de puntos calientes de mutación BRAF y NRAS. Los cebadores directos, inversos y de secuenciación se denotan F, R y S, respectivamente.

Archivo adicional 2:Figura S2.(8.5M, tiff)
Valores OCR mitocondrial basal y máximo para líneas celulares de melanoma y melanocitos epidérmicos humanos (HEMn-LP). El OCR medido tras la adición de rotenona/antimicina A (OCR no mitocondrial) se restó de todos los valores. La línea discontinua indica el OCR basal de HEMn-LP. Los valores indicados son medias de tres mediciones independientes ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para determinar las diferencias entre HEMn-LP y las líneas celulares de melanoma (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). No se indicó el OCR mitocondrial máximo para ED-034 debido a una variación muy grande entre cuatro experimentos independientes, que osciló entre 6,19 y 58,36 pmoles/min/1.000 células.

Archivo adicional 3: Figura S3.(12M, tiff)
Respuesta metabólica de las células de melanoma al DCA Respuesta relativa en los niveles de ECAR, OCR, OCR/ECAR y ATP tras el tratamiento con DCA (0,1, 1 y 10 mM) durante 2 h. Las barras de error de los tres primeros paneles representan las desviaciones estándar de tres mediciones repetidas de seis muestras paralelas. Las barras de error del panel inferior representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. Para el análisis estadístico se utilizó el ANOVA de muestras emparejadas de una vía y la prueba HSD de Tukey para determinar la significación estadística (*p < 0,05; **p < 0,01).

Archivo adicional 4: Figura S4.(5.6M, tiff)
Estado alélico de BRAF. Pirosecuenciación del sitio de mutación de BRAF c.1799 T > A en ED-013 y el derivado resistente a vemurafenib ED-013-R2. El aumento de la proporción entre BRAFV600E y BRAF WT en ED-013-R2 indica una ganancia en el número de copias, lo que podría explicar la resistencia al vemurafenib.

Intereses contrapuestos

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Contribuciones de los autores

PG y CA planificaron y organizaron el estudio. CA realizó la mayoría de los experimentos y el procesamiento de los datos. CD planificó y realizó el ensayo de proliferación celular y ayudó a interpretar los resultados. AB y TM ayudaron a preparar y optimizar el diseño para el análisis metabólico en el instrumento Seahorse XF. CA, AB y TM discutido e interpretado los resultados del análisis metabólico. CA y PG escribió el manuscrito con las contribuciones y ediciones de CD, AB y TM. El manuscrito final fue leído y aprobado por todos los autores.

Agradecimientos

Damos las gracias al profesor Karsten Kristiansen (Departamento de Biología, Universidad de Copenhague) y al profesor asociado Jacob B. Hansen (Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Copenhague) por proporcionar el equipo y la experiencia técnica en relación con el análisis Seahorse XF. Este estudio ha sido financiado con subvenciones de la Sociedad Danesa del Cáncer y la Fundación Danesa para la Investigación del Cáncer.

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