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Géraldine De Preter1, Marie-Aline Neveu1, Pierre Danhier1, Lucie Brisson2, Valéry L. Payen2, Paolo E. Porporato2, Bénédicte F. Jordan1, Pierre Sonveaux2 y Bernard Gallez1

1 Louvain Drug Research Institute (LDRI), Biomedical Magnetic Resonance Research Group, Université Catholique de Louvain (UCL), Bruselas, Bélgica
2 Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Polo de Farmacología, Université Catholique de Louvain (UCL), Bruselas, Bélgica


Correspondencia: Bernard Gallez, correo electrónico: [email protected]

Recibido: 1 de junio de 2015
Aceptado: 26 de diciembre de 2020
Publicado: 9 de diciembre de 2020

Resumen

La fermentación de la glucosa a través de la glucólisis incluso en presencia de oxígeno (efecto Warburg) es una característica común de las células cancerosas considerada cada vez más como un objetivo tentador en el desarrollo clínico. El objetivo de este estudio era analizar la relación entre el metabolismo, las reservas energéticas y las tasas de proliferación de las células cancerosas. Descubrimos que la proliferación celular, evaluada mediante la cuantificación de la síntesis de ADN, está correlacionada con la eficiencia glucolítica en seis líneas celulares cancerosas, así como en líneas celulares cancerosas isogénicas. Para investigar más a fondo el vínculo entre la glucólisis y la proliferación, se utilizó un inhibidor farmacológico de la vía de la pentosa fosfato (PPP). Demostramos que la reducción de la actividad de la PPP disminuye la proliferación de las células cancerosas, con un efecto profundo en las células cancerosas de fenotipo Warburg. El papel crucial de la PPP en el mantenimiento de la proliferación de las células cancerosas se confirmó utilizando siRNAs contra la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la primera enzima y la que limita la velocidad de la PPP. Además, descubrimos que el dicloroacetato (DCA), un nuevo compuesto clínicamente probado, inducía un cambio de las células cancerosas glicolíticas a un fenotipo más oxidativo y disminuía la proliferación. Al demostrar que el DCA disminuía la actividad de la APP, proporcionamos un nuevo mecanismo por el que el DCA controla la proliferación de las células cancerosas.


Palabras clave: bioenergética, glucólisis, dicloroacetato, vía de las pentosas fosfato, proliferación

2020 por los autores. Licencia MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).


INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el metabolismo ha suscitado un enorme interés en el campo de la investigación del cáncer. Muchos estudios se han centrado en los distintos perfiles metabólicos de diferentes tumores [1-3] porque la plasticidad metabólica está implicada en la progresión del cáncer, la resistencia a los fármacos y la metástasis [4-6]. En las células normales, la glucólisis está acoplada a la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para sintetizar de forma óptima ATP intracelular a partir de la glucosa [7]. Sin embargo, muchas células cancerosas sufren una transformación metabólica fundamental, el «cambio glucolítico», por el que la glucólisis se desacopla de la respiración y se reconduce a la fermentación láctica, convirtiéndose así en la principal fuente de producción de ATP celular. El cambio a un metabolismo glucolítico se produce principalmente en condiciones de hipoxia como mecanismo de rescate para la producción de energía. Sin embargo, algunas células cancerosas adoptan además un fenotipo glucolítico particular, descrito por primera vez por Warburg [8] y acuñado como «glucólisis aeróbica» [9]. El fundamento biológico del fenotipo de Warburg sigue siendo controvertido, pero recientemente se ha propuesto que las células cancerosas en proliferación potencian la glucólisis porque beneficia tanto a la bioenergética como a la biosíntesis [4,10]. De hecho, un metabolismo glucolítico permite potencialmente una producción rápida de ATP y proporciona intermediarios de carbono que pueden dirigirse a vías biosintéticas ramificadas, permitiendo una expansión más rápida de la biomasa celular. De forma convincente, las mutaciones que se producen en las vías de señalización que regulan tanto la biosíntesis celular como la glucólisis aeróbica, como la vía PI3K/Akt/mTOR, son la clase de mutaciones más prevalente en los tumores humanos [11]. Sin embargo, faltan pruebas experimentales que relacionen la glucólisis aeróbica con la proliferación de células cancerosas, y la ventaja selectiva que proporciona este fenotipo no está del todo clara. El objetivo del presente estudio era dilucidar el acoplamiento entre el metabolismo, el suministro de energía y la proliferación celular en diversas células cancerosas humanas y murinas. Se indujeron interruptores metabólicos para aportar pruebas de que la bioenergética, y más concretamente la glucólisis, impulsa directamente la proliferación de las células cancerosas. En esta línea, encontramos un nuevo mecanismo terapéutico del dicloroacetato (DCA), un activador de la oxidación mitocondrial de la glucosa actualmente investigado en estudios clínicos [12]. El DCA inhibía la vía de las pentosas fosfato (PPP), una vía biosintética pivotal ramificada a la glucólisis. Informamos de que la PPP tiende un puente entre un metabolismo glucolítico y la proliferación de células cancerosas.

RESULTADOS

Laeficiencia glucolítica está vinculada positivamente a la proliferación pero no a los niveles de ATP en células cancerosas
En primer lugar, se realizóuncribado de las actividades metabólicas de seis líneas celulares cancerosas para investigar el vínculo entre el metabolismo de la glucosa, las reservas de ATP y la capacidad de proliferación. La OXPHOS, evaluada por la tasa de consumo de oxígeno sensible a la oligomicina (mitoOCR), y la eficiencia glucolítica, medida por la relación lactato producido/glucosa consumida (mol/mol) [13], se evaluaron por separado en células incubadas 24 horas en un medio de cultivo que sólo contenía glucosa como combustible energético. Para investigar la influencia del estado metabólico en las reservas energéticas celulares, también se midió el pool total de ATP intracelular. No se encontró ninguna correlación significativa entre el contenido de ATP intracelular y los parámetros metabólicos. Sin embargo, observamos que la proliferación celular evaluada mediante la síntesis de ADN se correlacionaba significativamente con la eficiencia glucolítica (Figura 1A), donde un aumento de la glucólisis se asociaba a un aumento de la capacidad de proliferación, y a la inversa. No se observó ninguna correlación significativa entre la capacidad de proliferación y la respiración mitocondrial. Estos datos sugieren que la glucólisis es potencialmente la vía energética clave que favorece la proliferación de las células cancerosas. La hipótesis actual es que esta vía apoya la proliferación celular predominantemente mediante el suministro de precursores para las vías biosintéticas, más que mediante la producción de ATP [10,11]. Como prueba de que el suministro de ATP no es el principal factor limitante de la proliferación celular, no se encontró correlación entre el contenido de ATP y la síntesis de ADN en las líneas celulares (Figura suplementaria S1). Para confirmar que la glucólisis promueve la proliferación de las células cancerosas y excluir las influencias independientes del metabolismo inherentes a los distintos genotipos, se comparó la capacidad de proliferación de las células cancerosas de cuello de útero SiHa oxidativas humanas de tipo salvaje (WT) con la de las SiHa con depleción mitocondrial parcial (SiHa ρ0) [14,15]. Las células cancerosas SiHa ρ0 mostraron un fenotipo glucolítico con una disminución de ~40% en mitoOCR (Figura 1B), un aumento de ~2,5 veces en la eficiencia glucolítica (Figura 1C) y un aumento de ~50% en el consumo de glucosa (Figura 1D). La disminución neta del ~20% en la reserva total de ATP en las células SiHa ρ0 confirmó que el aumento de la glucólisis no era suficiente para mantener las reservas de ATP (Figura 1E). Mediante la cuantificación de la síntesis de ADN, descubrimos que el aumento de la glucólisis aeróbica promueve la proliferación celular, ya que el cambio glucolítico en las células SiHa ρ0 se asoció con un aumento del ~45% en la proliferación celular (Figura 1F). Los ensayos de viabilidad no revelaron diferencias en el número de células viables 24 h después de incubar las células en el medio de cultivo experimental (Figura suplementaria S2), probablemente porque la cuantificación de la síntesis de ADN detecta cambios tempranos en la tasa de proliferación de las células.

Lainhibición de la glucólisis mediante DCA afecta a la proliferación de las células cancerosas
Basándonos en nuestras observaciones, investigamos si la inhibición de la glucólisis podría afectar directamente a la proliferación de las células cancerosas. Para ello, las células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231 (fenotipo Warburg, Figura 1A) y las células humanas de cáncer de cuello de útero SiHa (fenotipo oxidativo, Figura 1A) se trataron con dicloroacetato (DCA), un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK) que aumenta la actividad oxidativa de las células mediante la activación de la piruvato deshidrogenasa (PDH), la enzima encargada de la oxidación de la glucosa en las mitocondrias [16]. Hasta la fecha, el prometedor efecto terapéutico del DCA sobre las células cancerosas se atribuye globalmente a una normalización del potencial de membrana mitocondrial hiperpolarizado que caracteriza a las células cancerosas y a una resensibilización a la apoptosis [17]. Aquí, postulamos que el DCA también controla la proliferación tumoral mediante la inhibición de la glucólisis. Para probar esta hipótesis, se trataron células cancerosas glicolíticas MDA-MB-231 y oxidativas SiHa con 5 mM de DCA durante 48 h, y se evaluaron los efectos del tratamiento sobre el metabolismo y la proliferación. En comparación con las células tratadas con vehículo, el DCA indujo un cambio de las células cancerosas MDA-MB-231 glicolíticas a un fenotipo más oxidativo, como evidenció un aumento de la mitoOCR (Figura 2A) y una disminución del consumo de glucosa (Figura 2B). La disminución de la actividad glucolítica observada en este experimento concuerda con otro estudio reciente [18] y probablemente esté inducida por el Efecto Pasteur [4,19] para mantener la homeostasis del ATP en las células (Figura 2C). También observamos que la inhibición de la glucólisis mediante DCA se asociaba a una disminución de la tasa de proliferación de las células cancerosas MDA-MB-231 (Figura 2D). Como prueba de que la inhibición de la glucólisis afecta a la proliferación en esta línea celular, las células cancerosas MDA-MB-231 tratadas con 2-Deoxi-D-glucosa también mostraron una menor tasa de proliferación (Figura suplementaria S3).

Por otro lado, el DCA no alteró significativamente las actividades metabólicas de las células cancerosas SiHa oxidativas (Figura 2A-2C) y no tuvo efectos significativos sobre la proliferación de SiHa (Figura 2D). Las mediciones de la producción de lactato a corto plazo (1 hora) mostraron que el DCA era efectivamente más eficaz en la línea celular cancerosa glucolítica que en la oxidativa (Figura suplementaria S4). Para investigar si el perfil metabólico determina la respuesta al DCA, también se analizó la capacidad de proliferación de las células cancerosas glicolíticas SiHa ρ0 tras el tratamiento con DCA. Encontramos una disminución significativa de la síntesis de ADN en esta línea celular (Figura 2E), efecto que no se observó en SiHa WT. Además, se midió el mismo número de células cancerosas MDA-MB-231 y SiHa ρ0 viables 48 h después del tratamiento con vehículo o DCA (Figura suplementaria S5 A-B), lo que demuestra que los efectos del DCA sobre las funciones metabólicas y las tasas de proliferación no se deben a la mortalidad celular.

Figura 1: La eficienciaglucolítica está positivamente relacionada con la proliferación pero no con los niveles de ATP en células cancerosas. A. Diagramas de correlación entre parámetros metabólicos (eficiencia glucolítica y tasa de consumo de oxígeno mitocondrial [mitoOCR]), contenido de ATP intracelular y proliferación de seis líneas celulares de cáncer humano y murino. Las mediciones se realizaron tras 24 h de incubación en presencia de un medio de cultivo que sólo contenía glucosa como combustible energético. La mitoOCR se determinó mediante la OCR sensible a la oligomicina de células enteras viables y la eficiencia glucolítica (relación consumo de glucosa/producción de lactato) se midió a partir del sobrenadante celular. El ATP total se cuantificó a partir de células lisadas y se normalizó con respecto al contenido proteico. Las tasas de proliferación se analizaron mediante la incorporación de un nucleótido análogo (5-bromo-2′-desoxiuridina [BrdU]). Se encontró una correlación significativa entre la eficiencia glucolítica y la proliferación(valor p= 0,04, Pearson r = 0,82). Se encontraron correlaciones no significativas entre la mitoOCR y el contenido de ATP(p-valor = 0,06, Pearson r = 0,78), la mitoOCR y la proliferación(p-valor= 0,053, Pearson r = -0,80) y entre la eficiencia glucolítica y el contenido de ATP(p-valor= 0,11, Pearson r = 0,72). B.-F. Comparación del perfil metabólico (B-C-D), el contenido de ATP intracelular E. y la proliferación F. entre las células cancerosas isogénicas SiHa de tipo salvaje (WT) y sin mitocondrias (ρ0). Prueba t de dos caras. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Los resultados se expresan como media ± SEM.
Figura 2: El DCA influye significativamente en el metabolismo y la proliferación de las células cancerosas glucolíticas pero no oxidativas. A. Tasa de consumo mitocondrial de oxígeno, B. consumo de glucosa, C. contenido de ATP intracelular y D. proliferación de células cancerosas humanas MDA-MB-231 (glucolíticas) y SiHa (oxidativas) tras 48 h de tratamiento con dicloroacetato (DCA) 5 mM. E. Proliferación de células cancerosas SiHa sin mitocondrias (ρ0) tras 48 horas de tratamiento con DCA 5 mM. El medio sin FBS se utilizó como control positivo en los experimentos de proliferación. Prueba t de dos caras A.-C. o ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni D.-E. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, no significativo. Los resultados se expresan como cambio relativo respecto a las células control y como media ± SEM.

La glucólisiscontrola la proliferación de las células cancerosas a través de la vía de las pentosas fosfato
En conjunto, nuestros datos aportan pruebas experimentales concluyentes de que la glucólisis per se interviene en el control de la proliferación celular. Aún quedaba por establecer el mecanismo que vinculaba la glucólisis y la proliferación. Postulamos que la vía de la pentosa fosfato (PPP) podría vincular la glucólisis con la proliferación, ya que la PPP utiliza intermediarios glucolíticos para suministrar a las células nucleótidos y NADPH, un reductor crucial en los procesos anabólicos [20]. Para determinar específicamente el NADPH producido a partir de la APP (NADPHppp), las células se trataron con 6-aminonicotinamida (6-AN), un inhibidor específico de la APP [21,22]. Descubrimos que la contribución de la NADPHppp a la reserva total de NADPH (NADPHtot) era más predominante en las células cancerosas MDA-MB-231 que en las células cancerosas SiHa, como lo demuestra la importante disminución del nivel de NADPHtot tras el tratamiento con 6-AN en las células glicolíticas MDA-MB-231 (Figura 3A). Se observaron efectos más limitados en las células oxidativas SiHa (Figura 3B). Las mediciones también revelaron una mayor relación NADPHppp/NADP+ en las células cancerosas MDA-MB-231, lo que pone de manifiesto un mayor flujo de PPP en esta línea celular glucolítica en comparación con SiHa (Figura 3C). Para verificar que la APP está implicada en el control de la proliferación de las células cancerosas, se evaluó la síntesis de ADN en células tratadas y no tratadas con 6-AN. Observamos que la capacidad de proliferación de las células cancerosas se veía mermada cuando se inhibía la APP (Figura 3D). Curiosamente, se evidenció un efecto mayor en las células cancerosas glicolíticas MDA-MB-231 (~70 % de disminución de la tasa de síntesis de ADN) en comparación con las oxidativas SiHa (~25 % de disminución de la tasa de síntesis de ADN) (Figura 3D). Es importante destacar que las SiHa ρ0 fueron más sensibles que las SiHa WT al 6-AN, ya que se observó una disminución del ~40 % en la síntesis de ADN (Figura suplementaria S6). Debido a los posibles efectos no deseados de los inhibidores farmacológicos, complementamos nuestros estudios con 6-AN utilizando pequeños ARN de interferencia (siARN) dirigidos a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), la primera enzima limitante de la PPP [23]. En las células MDA-MB-231 transfectadas, confirmamos el silenciamiento de la G6PD mediante inmunotransferencia (Figura 4A) y demostramos que, al igual que el 6-AN, la inhibición de la G6PD disminuía la actividad de la PPP (Figura 4B) y la síntesis de ADN (Figura 4C). Estos resultados señalan la contribución predominante de la PPP en el mantenimiento de la proliferación de las células cancerosas con fenotipo de Warburg.

Figura 3: La APP favorece de forma diferencial la proliferación en células cancerosas glucolíticas y oxidativas. Niveles intracelulares de NADP+ y NADPH medidos individualmente en células cancerosas glicolíticas viables MDA-MB-231 A. y oxidativas SiHa B. se utilizó 6-aminonicotinamida (6-AN), un inhibidor específico de la PPP (100 µM, 48 h de tratamiento) para resaltar la producción de NADPH a partir de la PPP (NADPHppp). C . Relaciones NADPHPPP/NADP+ en células cancerosas MDA-MB-231 y SiHa. D . Proliferación medida por la incorporación de BrdU en células cancerosas MDA-MB-231 y SiHa tras la exposición a 6-AN (100 µM, 48 h de tratamiento). El medio sin FBS se utilizó como control positivo en los experimentos de proliferación. Prueba t de dos caras A.-C. o ANOVA de una vía con prueba post-hoc de Bonferroni D.. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, no significativo. Los resultados se expresan como media ± SEM.

Figura 4: La inhibición de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con ARNsi reduce la proliferación de células cancerosas glucolíticas. Se transfectaron células cancerosas MDA-MB-231 con ARNsi dirigidos a la G6PD (siG6PD) o con ARNsi no dirigidos (siCTL). 48 horas después de la transfección, las células se sometieron a A. análisis de inmunotransferencia utilizando Hsp90 como control de carga, B. cuantificación de los niveles de NADP+ y NADPH y C. medición de la síntesis de ADN. Prueba t de dos caras. *p < 0,05, ***p < 0,001. Los resultados se expresan como media ± SEM.

El DCAinhibe la vía de las pentosas fosfato
Por último, investigamos si el DCA podía inhibir la PPP, lo que explicaría la relación entre la inhibición de la glucólisis y la disminución de la tasa de proliferación de las células cancerosas tratadas con DCA. Como se muestra en la Figura 5, observamos que el DCA (5 mM, 48 h) disminuyó significativamente el nivel de NADPHtot en las células cancerosas MDA-MB-231 (Figura 5A). Además, aunque no se obtuvo una disminución adicional de NADPHtot cuando las células se expusieron a DCA y 6-AN conjuntamente (Figura 5A), demostramos que el DCA disminuyó específicamente NADPHPPP. Se obtuvieron resultados similares utilizando la inhibición molecular de la G6PD (Figura 5B). Estos resultados demuestran la implicación de la PPP en los efectos del DCA sobre las células cancerosas glucolíticas.

Figura 5: El DCA disminuye la actividad de la PPP. A. Niveles intracelulares de NADP+ y NADPH medidos en células cancerosas MDA-MB-231 tratadas con ± DCA (5 mM, 48 h) y ± 6-AN (100 µM, 48 h). B. Niveles intracelulares de NADP+ y NADPH medidos en células cancerosas MDA-MB-231 transfectadas con siRNAs contra G6PD (siG6PD) o siRNAs no dirigidos (siCTL) y tratadas con ± DCA. ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05, ns, no significativo. Los resultados se expresan como media ± SEM.

DISCUSIÓN

Este estudio subraya el papel predominante de la vía de las pentosas fosfato en la biología del cáncer. El efecto Warburg (la fermentación de glucosa a lactato en presencia de una concentración fisiológica de O2 ) observado en numerosas células cancerosas se ha propuesto para satisfacer tanto las demandas energéticas (ATP) como biosintéticas [4,10]. En este estudio, demostramos que el aumento de la glucólisis aeróbica no era suficiente para mantener los niveles de ATP en las células cancerosas. Por lo tanto, un nivel bajo de ATP intracelular se asociaba a un aumento de la glucólisis. Además, el cambio glucolítico inducido en las células cancerosas deficientes en mitocondrias no fue capaz de proporcionar un suministro adecuado de ATP en comparación con las células de tipo salvaje. De hecho, se sugiere que, desde el punto de vista bioenergético, un metabolismo glucolítico es menos eficiente que uno oxidativo, pero que la glucólisis puede ser ventajosa para producir rápidamente ATP con el fin de satisfacer demandas energéticas a corto plazo [24]. Nuestros hallazgos también corroboran que las células cancerosas con fenotipo Warburg desarrollan varias adaptaciones para mantener niveles bajos de ATP con el fin de evitar la inhibición alostérica de las enzimas glucolíticas limitadoras de la tasa (el Efecto Pasteur) y mantener tasas elevadas de flujo glucolítico [10]. Por otro lado, demostramos que la glucólisis promueve la proliferación de las células cancerosas, lo que respalda las estrategias clínicamente probadas que inhiben el Efecto Warburg [12,25]. La relación positiva entre la eficiencia glucolítica (moles de lactato producidos por mol de glucosa consumida) y la tasa de proliferación de las células cancerosas puso de relieve que las células que se dividen rápidamente fermentan grandes cantidades de glucosa en lactato. Estudios recientes han propuesto que la producción de lactato permite a las células cancerosas regenerar eficazmente NAD+ mediante la enzima lactato deshidrogenasa [26]. Al mantener el equilibrio redox NAD+/NADH, las células cancerosas permiten un flujo más rápido de glucosa a través de la glucólisis, junto con una incorporación más rápida de metabolitos de glucosa a las vías biosintéticas, lo que les confiere ventajas para la proliferación [10].

Para comprobar si el aumento de la glucólisis aeróbica favorece la proliferación de las células cancerosas alimentando los procesos anabólicos, se evaluó la implicación de la vía de la pentosa fosfato (PPP). De hecho, se sabe que la PPP utiliza glucosa-6-fosfato (el producto de la enzima glucolítica hexocinasa) para suministrar a las células nucleótidos y NADPH, un reductor crucial en las reacciones anabólicas [20]. En nuestro estudio, demostramos que el flujo de PPP, evaluado por la relación NADPHppp/NADP+, aumentaba en las células con fenotipo de Warburg en comparación con las células cancerosas oxidativas. La comparación de la actividad de las enzimas PPP también podría haberse ensayado para confirmar esta diferencia en el flujo de PPP. No obstante, nuestros resultados apoyan que la activación de la glucólisis va acompañada de un aumento de la actividad de la APP para la biosíntesis en las células que se dividen rápidamente [20]. De forma convincente, observamos que la inhibición de la APP disminuía la proliferación de las células cancerosas, con un efecto mayor en las células cancerosas con fenotipo Warburg. La diferente sensibilidad de las células cancerosas glucolíticas y oxidativas a la inhibición de la APP se debe probablemente a la dependencia variable de esta vía para la síntesis de macromoléculas, como lípidos y nucleótidos. Además, las células cancerosas con una actividad mitocondrial elevada pueden compensar los niveles de NADPH utilizando enzimas asociadas al ciclo TCA (enzimas málico e isocitrato deshidrogenasas) para reponer la reserva de NADPH [20]. En conjunto, estos resultados demuestran que las células cancerosas, especialmente las de fenotipo Warburg agresivo, dependen de la vía de la pentosa fosfato para una proliferación óptima.

Para evaluar la relevancia terapéutica de estos hallazgos, se investigaron los efectos del DCA. El DCA ya ha demostrado interesantes propiedades anticancerígenas in vitro e in vivo

[17], y actualmente se está probando en ensayos clínicos de fase I-II [12]. Hasta la fecha, el DCA debe sus propiedades terapéuticas a la resensibilización de las células cancerosas a la apoptosis [17]. Sin embargo, como han señalado recientemente Stockwin et al. [27], el DCA es relativamente inactivo sobre la viabilidad celular e induce la apoptosis sólo a altas concentraciones. Stockwin et al. informaron además de que el DCA era preferentemente activo en células con defectos mitocondriales. Por lo tanto, postulamos que, a dosis más bajas, el DCA también disminuye la proliferación de las células cancerosas reduciendo la glucólisis. Encontramos que 5 mM de DCA era más efectivo en las células cancerosas con fenotipo Warburg, reduciendo la proliferación celular al disminuir la glucólisis. Las diferentes sensibilidades entre líneas celulares con diferente fenotipo metabólico pueden ser el resultado de la capacidad del DCA para alcanzar la PDK en la matriz de las mitocondrias. En efecto, al igual que el piruvato, el DCA está ionizado y no puede atravesar las membranas. Curiosamente, sólo se han publicado unos pocos informes sobre el transporte de DCA en el citosol de células de mamíferos [28,29]. Aunque todavía no se ha investigado, el nivel de expresión de los transportadores mitocondriales de piruvato (MPC) también puede definir la eficacia del DCA. Además, como el DCA tiene un Kidiferente para cada una de las cuatro isoenzimas PDK [30], la sensibilidad variable de las células cancerosas puede deberse a la expresión diferencial de las PDK.

Aunque algunos informes mostraron que el DCA en concentraciones comparables promueve la citotoxicidad en otras líneas celulares [31,32], nosotros mostramos que el DCA no tenía incidencia en la viabilidad de las células cancerosas MDA-MB-231 y SiHa. Basándonos en nuestros datos, proponemos que la reactivación de la producción de ATP en las mitocondrias inducida por el DCA disminuye el flujo glucolítico de las células cancerosas, reduciendo así la incorporación de glucosa. En consecuencia, la disminución de la síntesis de intermediarios glucolíticos reduce la actividad de vías biosintéticas como la APP, comprometiendo la proliferación de las células cancerosas con fenotipo de Warburg (Figura 6). No obstante, es concebible que otros mecanismos puedan participar en los efectos antiproliferativos del DCA, ya que otros estudios han demostrado la detención del ciclo celular a concentraciones comparables de DCA [33, 34].

En general, nuestro estudio demostró que la APP tiende un puente entre la glucólisis y la proliferación en células cancerosas agresivas, y aboga por tener en cuenta el metabolismo del cáncer para la elección de estrategias terapéuticas anticancerosas adecuadas. En particular, uniéndonos a las conclusiones de otros [27], sugerimos que el desarrollo clínico del DCA puede beneficiarse de la selección de pacientes con tumores altamente glucolíticos.

Figura 6: Mecanismo por el que el DCA controla la proliferación de células cancerosas glucolíticas. Las células cancerosas altamente glucolíticas que presentan un fenotipo Warburg fermentan grandes cantidades de glucosa en lactato incluso en presencia de oxígeno. Este fenómeno permite una rápida producción de ATP y proporciona precursores para los procesos biosintéticos que promueven la proliferación celular. Al aliviar la inhibición de la PDH por la PDK, el DCA favorece la conversión de piruvato en acetil-CoA y activa la respiración mitocondrial. La consiguiente inhibición alostérica de la glucólisis por ATP reduce el consumo de glucosa y los niveles de intermediarios glucolíticos, disminuyendo así el flujo de la vía de las pentosas fosfato junto con la proliferación celular. PDH, piruvato deshidrogenasa. PDK, Piruvato deshidrogenasa cinasa. G6P, glucosa-6-fosfato. NAD, dinucleótido de nicotinamida y adenina. NADP, Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato. Glut, transportador de glucosa. MCT4, Transportador de monocarboxilato 4.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular y reactivos
El carcinoma de células escamosas de cuello uterino humano SiHa (ATCC), el cáncer de mama humano MDA-MB-231 (ATCC), el hepatocarcinoma de ratón TLT (tumor hepático transplantable) [35], el fibrosarcoma de ratón FSaII [36], el sarcoma de ratón KHT [37], el tumor mamario de ratón NT2 [38] se cultivaron siguiendo las recomendaciones del proveedor o como se describe. Los SiHa con depleción mitocondrial parcial (ρ0) se obtuvieron mediante exposición crónica a bajas concentraciones de bromuro de etidio como se ha detallado previamente [14,39]. Todos los cultivos se mantuvieron a 37°C en una atmósferacon un 5% deCO2. Las células se incubaron en un medio experimental único 24 horas antes de los experimentos (DMEM sin glutamina [Invitrogen], conteniendo 4,5 g/L de glucosa suplementado con 10% de FBS inactivado por calor y 1% de penicilina-estreptomicina). Cuando se compararon SiHa ρ0 con SiHa de tipo salvaje, se utilizó DMEM sin glutamina (Invitrogen), que contenía 4,5 g/L de glucosa suplementada con 1% de piruvato, 10% de FBS inactivado por calor, 1% de penicilina-estreptomicina y 50 ng/ml de uridina. A menos que se indique lo contrario, los experimentos se realizaron en células confluentes. Oligomicina en un inhibidor de la ATP sintasa. El dicloroacetato (DCA) es un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK). la 6-aminonicotinamida (6-AN) es un inhibidor de las enzimas dependientes de NADP+ de la vía de las pentosas fosfato, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGD). Todos los productos químicos se adquirieron a Sigma. La oligomicina se disolvió en DMSO. El DCA y el 6-AN se disolvieron directamente en los medios de cultivo.

transfección de siRNA
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA against human G6PD y ON-TARGETplus Non-targeting siRNA eran de Dharmacon. La concentración final de siARN fue de 25 nM. Todos los siRNA se transfectaron utilizando RNAi/MAX según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).

Western blotting
Se recogieron lisados de células enteras y se sometieron a análisis de inmunoblot como se ha descrito previamente [40]. Los anticuerpos primarios fueron monoclonales humanos contra G6PD o Hsp90 (Sigma).

Consumo mitocondrial de oxígeno
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) de células enteras intactas se midió utilizando un espectrómetro Bruker EMX EPR que operaba a 9,5 GHz como se ha de

scrito previamente

[41]. Las células adherentes se cosecharon en medio experimental fresco (107 células/ml). se mezclaron 100 µl de la suspensión celular con 100 µl de dextrano al 20% para evitar la aglomeración y se sellaron las células en un tubo capilar de vidrio en presencia de 0,2 mM de una sonda de nitróxido que actuaba como sensor de oxígeno (15N4-oxo-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-d16-15N-1-oxilo, isótopos CDN, Pointe-Claire, Quebec, Canadá). Las células se mantuvieron a 37°C durante la adquisición de los espectros. El ancho de línea EPR se midió cada minuto y se reportó en una curva de calibración para obtener la concentración de oxígeno. El OCR se determinó mediante el valor absoluto de la pendiente de la disminución de la concentración de oxígeno en el tubo capilar cerrado a lo largo del tiempo [42]. Para obtener la OCR de la fosforilación oxidativa, la OCR en presencia de un tratamiento con 1 µM de oligomicina se restó de la OCR total de las células.

Consumode glucosa yproducción de lactato


El consumo de glucosa y la producción de lactato se midieron a partir de los sobrenadantes de las células cultivadas. Las concentraciones de metabolitos se cuantificaron en muestras desproteinizadas utilizando ensayos enzimáticos específicos en un analizador CMA600 (CMA Microdialysis AB, Solna, Suecia). El consumo de glucosa y la producción de lactato se normalizaron con respecto al contenido de proteínas mediante el ensayo Pierce BCA Protein (Thermo Scientific). Para detectar eficazmente las diferencias en las concentraciones de metabolitos entre los sobrenadantes de SiHa WT y SiHa ρ0, se utilizó un medio bajo en glucosa (1 g/L).

Cuantificación del ATP intracelular
El ATP intracelular total se midió con el ATP Determination Kit (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron en el tampón recomendado por el fabricante (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,01% Triton X-100). Los lisados celulares se añadieron a una mezcla de reacción que contenía luciferasa y luciferina para medir la bioluminiscencia utilizando un lector de placas (SpectraMax M2e, Molecular Devices). Se generó una curva estándar con concentraciones conocidas de ATP en las mismas condiciones. Se utilizó sistemáticamente una fracción de los lisados celulares para la cuantificación de proteínas (Pierce BCA Protein assay, Thermo Scientific) a fin de normalizar el nivel de ATP con el contenido proteico.

Proliferación
La proliferación celular se analizó con un kit basado en 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU)-ELISA (Roche) siguiendo las instrucciones del proveedor. Las células subconfluentes se incubaron en presencia de BrdU (un análogo de nucleótido) durante 4 horas. Cuando se comparó la proliferación de SiHa WT y SiHa ρ0, las células se incubaron durante 6 horas en presencia de BrdU. La cantidad de BrdU incorporada a las células se evaluó mediante mediciones colorimétricas utilizando un lector de placas (SpectraMax M2e, Molecular Devices), que permitió cuantificar la síntesis de ADN en las células en replicación.

Mediciones de NADPH y NADP+
Los niveles de NADP+ y NADPH se detectaron individualmente a partir de 6.000 células cosechadas utilizando un kit de detección (NADP/NADPH-Glo Assay, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Estadísticas
Todos los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa GraphPad Prism 5. P<0,05 se consideró estadísticamente significativo. P<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido financiado por el Fonds National de la Recherche Scientifique (F.R.S.-FNRS, PDR T.0107.13), el Fonds Joseph Maisin, la Action de Recherches Concertées ARC 14/19-058, y una Starting Grant del Consejo Europeo de Investigación (ERC No. 243188 TUMETABO a P. Sonveaux). BFJ y PS son Investigadores Asociados, LB y PEP son Investigadores Postdoctorales, PD es Becario Postdoctoral Télévie. VLP es becaria de doctorado de la F.R.S.-FNRS. GDP es becario de doctorado Télévie.

CONFLICTOS DE INTERESES

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

REFERENCIAS

1 Moreno-Sánchez R, Marín-Hernández A, Saavedra E, Pardo JP, Ralph SJ y Rodríguez-Enríquez S. ¿Quién controla el suministro de ATP en las células cancerosas? Lecciones de bioquímica para entender el metabolismo energético del cáncer. Int J Biochem Cell Biol. 2014; 50:10-23.
2 Scott DA, Richardson AD, Filipp FV, Knutzen CA, Chiang GG, Ronai ZA, Osterman AL y Smith JW. Comparative metabolic flux profiling of melanoma cell lines: beyond the Warburg effect. J Biol Chem. 2011; 286:42626-42634.
3 Jose C, Bellance N and Rossignol R. Choosing between glycolysis and oxidative phosphorylation: a tumor’s dilemma? Biochim Biophys Acta. 2011; 1807:552-561.
4 Gatenby RA y Gillies RJ. Por qué los cánceres tienen una glucólisis aeróbica elevada? Nat Rev Cancer. 2004; 4:891-899.
5 Sonveaux P, Végran F, Schroeder T, Wergin MC, Verrax J, Rabbani ZN, De Saedeleer CJ, Kennedy KM, Diepart C, Jordan BF, Kelley MJ, Gallez B, Wahl ML, Feron O y Dewhirst MW. Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice. J Clin Invest. 2008; 118:3930-3942.
6 Porporato PE, Payen VL, Perez-Escuredo J, De Saedeleer CJ, Danhier P, Copetti T, Dhup S, Tardy M, Vazeille T, Bouzin C, Feron O, Michiels C, Gallez B y Sonveaux P. A Mitochondrial Switch Promotes Tumor Metastasis. Cell Rep. 2014; 8:754-766.
7 Rolfe DF y Brown GC. Utilización de la energía celular y origen molecular de la tasa metabólica estándar en mamíferos. Physiol Rev. 1997; 77:731-758.
8 Warburg O. Uber den Stoffwechsel der Carcinomzelle. Klin Wochenschr. 1925;4:534-536..
9 Semenza GL, Artemov D, Bedi A, Bhujwalla Z, Chiles K, Feldser D, Laughner E, Ravi R, Simons J, Taghavi P y Zhong H. ‘The metabolism of tumours’: 70 years later. Novartis Found Symp. 2001; 240:251-260; discusión 260-254.
10 Lunt SY y Vander Heiden MG. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011; 27:441-464.
11 DeBerardinis RJ, Lum JJ, Hatzivassiliou G y Thompson CB. La biología del cáncer: la reprogramación metabólica alimenta el crecimiento y la proliferación celular. Cell Metab. 2008; 7:11-20.
12 Tennant DA, Duran RV y Gottlieb E. Targeting metabolic transformation for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2010; 10:267-277.
13 Zancan P, Sola-Penna M, Furtado CM and Da Silva D. Differential expression of phosphofructokinase-1 isoforms correlates with the glycolytic efficiency of breast cancer cells. Molecular Genetics and Metabolism. 2010; 100:372-378.
14 De Saedeleer CJ, Copetti T, Porporato PE, Verrax J, Feron O y Sonveaux P. Lactate activates HIF-1 in oxidative but not in Warburg-phenotype human tumor cells. PLoS One. 2012; 7:e46571.
15 Bol V, Bol A, Bouzin C, Labar D, Lee JA, Janssens G, Porporato PE, Sonveaux P, Feron O y Gregoire V. Reprogramming of tumor metabolism by targeting mitochondria improves tumor response to irradiation. Acta Oncol. 2014:1-9.
16 Stacpoole PW y Felts JM. Efectos del dicloroacetato de diisopropilamonio en el metabolismo de la glucosa. Proc West Pharmacol Soc. 1969; 12:111-113.
17 Kankotia S y Stacpoole PW. Dicloroacetato y cáncer: ¿Nuevo hogar para un medicamento huérfano? Biochim Biophys Acta. 2014; 1846:617-629.
18 Abildgaard C, Dahl C, Basse AL, Ma T and Guldberg P. Bioenergetic modulation with dichloroacetate reduces the growth of melanoma cells and potentiates their response to BRAFV600E inhibition. J Transl Med. 2014; 12:247.
19 Neveu MA, Bol V, Bol A, Bouzin C, Gregoire V, Feron O, Jordan BF and Gallez B. The increase in tumor oxygenation under carbogen breathing induces a decrease in the uptake of [F]-fluoro-deoxy-glucose. Radiother Oncol. 2015; 116:400-3.
20 Jiang P, Du W y Wu M. Regulación de la vía de las pentosas fosfato en el cáncer. Protein Cell. 2014; 5:592-602.
21 Koutcher JA, Alfieri AA, Matei C, Meyer KL, Street JC y Martin DS. Effect of 6-aminonicotinamide on the pentose phosphate pathway: 31P NMR and tumor growth delay studies. Magn Reson Med. 1996; 36:887-892.
22 Tsouko E, Khan AS, White MA, Han JJ, Shi Y, Merchant FA, Sharpe MA, Xin L y Frigo DE. Regulation of the pentose phosphate pathway by an androgen receptor-mTOR-mediated mechanism and its role in prostate cancer cell growth. Oncogenesis. 2014; 3:e103.
23 Krebs HA y Eggleston LV. La regulación del ciclo de la pentosa fosfato en el hígado de rata. Adv Enzyme Regul. 1974; 12:421-434.
24 Epstein T, Xu L, Gillies RJ y Gatenby RA. Separation of metabolic supply and demand: aerobic glycolysis as a normal physiological response to fluctuating energetic demands in the membrane. Cancer Metab. 2014; 2:7.
25 Chen X, Qian Y y Wu S. El efecto Warburg: Interpretaciones en evolución de un concepto establecido. Free Radic Biol Med. 2015; 79:253-263.
26 Porporato PE, Dhup S, Dadhich RK, Copetti T y Sonveaux P. Anticancer targets in the glycolytic metabolism of tumors: a comprehensive review. Front Pharmacol. 2011; 2:49.
27 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG y Newton DL. Sodium dichloroacetate selectively targets cells with defects in the mitochondrial ETC. Int J Cancer. 2010; 127:2510-2519.
28 Babu E, Ramachandran S, CoothanKandaswamy V, Elangovan S, Prasad PD, Ganapathy V and Thangaraju M. Role of SLC5A8, a plasma membrane transporter and a tumor suppressor, in the antitumor activity of dichloroacetate. Oncogene. 2011; 30:4026-4037.
29 Jackson VN y Halestrap AP. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2′,7′-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J Biol Chem. 1996; 271:861-868.
30 Bowker-Kinley MM, Davis WI, Wu P, Harris RA y Popov KM. Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex. Biochem J. 1998; 329:191-196.
31 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B y Michelakis ED. A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell. 2007; 11:37-51.
32 Pajuelo-Reguera D, Alan L, Olejar T y Jezek P. Dichloroacetate stimulates changes in the mitochondrial network morphology via partial mitophagy in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Int J Oncol. 2015; 46:2409-2418.
33 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A, Stenson TH, Haromy A, Parker JM, McMurtry MS y Michelakis ED. Mitochondrial activation by inhibition of PDKII suppresses HIF1a signaling and angiogenesis in cancer. Oncogene. 2013; 32:1638-1650.
34 Hong SE, Shin KS, Lee YH, Seo SK, Yun SM, Choe TB, Kim HA, Kim EK, Noh WC, Kim JI, Hwang CS, Lee JK, Hwang SG, Jin HO y Park IC. Inhibition of S6K1 enhances dichloroacetate-induced cell death. J Cancer Res Clin Oncol. 2015; 141:1171-1179.
35 Taper HS, Woolley GW, Teller MN y Lardis MP. Un nuevo tumor hepático de ratón trasplantable de origen espontáneo. Cancer Res. 1966; 26:143-148.
36 Volpe JP, Hunter N, Basic I y Milas L. Metastatic properties of murine sarcomas and carcinomas. I. Positive correlation with lung colonization and lack of correlation with s.c. tumor take. Clin Exp Metastasis. 1985; 3:281-294.
37 Rockwell S y Kallman RF. Growth and cell population kinetics of single and multiple KHT sarcomas. Cell Tissue Kinet. 1972; 5:449-457.
38 Reilly RT, Gottlieb MB, Ercolini AM, Machiels JP, Kane CE, Okoye FI, Muller WJ, Dixon KH y Jaffee EM. HER-2/neu es una diana de rechazo tumoral en ratones transgénicos HER-2/neu tolerados. Cancer Res. 2000; 60:3569-3576.
39 King MP y Attardi G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 1989; 246:500-503.
40 Feron O, Belhassen L, Kobzik L, Smith TW, Kelly RA y Michel T. Endothelial nitric oxide synthase targeting to caveolae. Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac myocytes and endothelial cells. J Biol Chem. 1996; 271:22810-22814.
41 Diepart C, Verrax J, Calderon PB, Feron O, Jordan BF y Gallez B. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 2010; 396:250-256.
42 Jordan BF, Gregoire V, Demeure RJ, Sonveaux P, Feron O, O’Hara J, Vanhulle VP, Delzenne N and Gallez B. Insulin increases the sensitivity of tumors to irradiation: involvement of an increase in tumor oxygenation mediated by a nitric oxide-dependent decrease of the tumor cells oxygen consumption. Cancer Res. 2002; 62:3555-3561.

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