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Jong-Lyel Roh a, *, Jin Young Park a, Eun Hye Kim a, Hye Jin Jang a, Minsu Kwon b

a Departamento de Otorrinolaringología, Centro Médico Asan, Facultad de Medicina de la Universidad de Ulsan, Seúl, República de Corea
b Departamento de Otorrinolaringología, Facultad de Medicina del Hospital de la Universidad Nacional de Gyeongsang, Jinju, República de Corea

Correspondencia autor: Tel: +82 2 3010 3965; fax: +82 2 489 2773. Dirección de correo electrónico: [email protected] (J.-L. Roh).



Recibido: 9 de septiembre de 2015
Revisado: forma revisada 13 de noviembre de 2015
Aceptado: 14 de noviembre de 2015

Resumen

Dicloroacetato (DCA), un medicamento huérfano que promueve un cambio de la glucólisis a la fosforilación oxidativa, ha sido reutilizado para la terapia del cáncer. En el presente estudio se investigó si el DCA puede superar la resistencia al cisplatino en el cáncer de cabeza y cuello (CCC). Se utilizaron dos líneas celulares HNC resistentes al cisplatino (AMC-HN4R y -HN9R), sus líneas parentales y otras líneas HNC humanas. El efecto del DCA, solo y en combinación con cisplatino, se evaluó midiendo el ciclo celular, la viabilidad, la muerte, la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y la expresión proteica en modelos preclínicos de xenoinjerto tumoral en ratón. El aumento de la glucólisis se correlacionó con una menor sensibilidad al cisplatino y se redujo con DCA. Las células resistentes al cisplatino sobreexpresaban la piruvato deshidrogenasa quinasa 2 (PDK2). El DCA indujo la muerte de las células HNC al disminuir la ΔΨm y promover la producción mitocondrial de ROS. Este efecto se vio reducido por el antioxidante N-acetil-l-cisteína o por la inhibición de la apoptosis mediada por caspasas. La activación de la oxidación mitocondrial de la glucosa por el DCA activó finalmente la señalización apoptótica mitocondrial descendente, provocando la muerte de las células cancerosas quimiorresistentes. Por lo tanto, el DCA sensibilizó significativamente a las células HNC resistentes al cisplatino in vitro e in vivo. La glucólisis elevada y la sobreexpresión de PDK2 están estrechamente relacionadas con la resistencia al cisplatino en células HNC; esta última puede ser superada por el DCA.

Palabras clave: Cáncer de cabeza y cuello, Resistencia al cisplatino, PDK2, Dicloroacetato, Remodelación mitocondrial
Abreviaturas: HNC, cáncer de cabeza y cuello; DCA, dicloroacetato; CDDP, cisplatino; OXPHOS, fosforilación oxidativa; PDK2, piruvato deshidrogenasa cinasa 2; PDHE1α, piruvato deshidrogenasa isoforma E1α; ROS, especies reactivas del oxígeno; ΔΨm, potencial de membrana mitocondrial; NAC, N-acetil-l-cisteína; DCF-DA: diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína; PARP: poli(ADP-ribosa) polimerasa; siRNA: ARN de interferencia corta; 18F-FDG: 18F-fluorodesoxiglucosa; PET: tomografía por emisión de positrones; SUV: valor de captación normalizado; MTV: volumen tumoral metabólico; TUNEL: marcaje de extremo de níquel dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal.

2015 Elsevier Ireland Ltd. Todos los derechos reservados.


INTRODUCCIÓN

El cáncer de cabeza y cuello (CCN) es el octavo cáncer más frecuente en todo el mundo, con más de medio millón de nuevos casos diagnosticados cada año [1]. Los tumores surgen en el tracto aerodigestivo superior, incluyendo la cavidad oral o nasal, la faringe y la laringe, y metastatizan a los ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes. En la actualidad, el tratamiento estándar del CNH consiste en un abordaje multimodal que incluye cirugía, quimioterapia y radioterapia, especialmente en los casos avanzados. Junto con el reciente interés en las estrategias de preservación de órganos, las modalidades no quirúrgicas, como la radioterapia combinada con quimioterapia, se han utilizado cada vez más como tratamiento de primera línea en el CNH [2]. En el tratamiento de pacientes con CNH avanzado, la quimioterapia sistémica es ahora un componente central de varios enfoques curativos, incluida la combinación con radioterapia definitiva o tratamiento de inducción, superando la reserva sólo para paliación [3]. El cisplatino, el derivado del platino cis-diamminedicloroplatino (II) (CDDP), sigue siendo un agente quimioterapéutico de primera línea en las modalidades no quirúrgicas contra el CNH, a pesar de los recientes avances en la terapia dirigida [4]. Sin embargo, en las últimas tres décadas, a pesar de los avances diagnósticos y terapéuticos, la tasa de supervivencia global en el HNC no ha cambiado sustancialmente, como resultado de la tenaz resistencia de las células cancerosas a la terapia, incluyendo el cisplatino y la radiación [2].

Los cambios metabólicos son una característica común de las células cancerosas: un cambio en la generación de energía celular de la fosforilación oxidativa mitocondrial a la glucólisis aeróbica proporciona una ventaja biosintética a las células cancerosas [5]. El aumento de la glucólisis en las células cancerosas, denominado efecto Warburg, suele estar relacionado con cambios fenotípicos, como la adaptación a la hipoxia y la escasez de nutrientes, la resistencia al estrés oxidativo y a los estímulos apoptóticos, y una mayor síntesis de biomasa [6]. La desregulación del metabolismo está relacionada con la resistencia al tratamiento del cáncer [7]. En la vía glucolítica, la regulación al alza del transportador de glucosa (GLUT), la hexoquinasa (HK), la piruvato quinasa M2 (PKM2), la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK), la lactato deshidrogenasa A (LDHA), la síntesis de ácidos grasos (FASN) y la glutaminasa, entre otros, se asocia con la resistencia a los fármacos contra el cáncer [7]. Está demostrado que la regulación del metabolismo de las células cancerosas puede mejorar la terapia y superar la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia [8,9].

El dicloroacetato (DCA), un fármaco huérfano para la acidosis láctica, desplaza el metabolismo del cáncer de la glucólisis a la fosforilación oxidativa [10]. El DCA inhibe selectivamente la PDK, que se activa en muchos cánceres, lo que provoca la activación de la piruvato deshidrogenasa (PDH), un complejo de enzimas que convierten el piruvato citosólico en acetil-CoA mitocondrial. La inhibición de la PDK con ARN de interferencia pequeño (ARNsi) o el tratamiento con DCA cambia la bioenergética del cáncer y restaura la apoptosis dependiente de mitocondrias en las células cancerosas [11]. El DCA es eficaz en el tratamiento de cánceres con fenotipos agresivos in vitro e in vivo[12,13], y supera la resistencia al sorafenib en el carcinoma hepatocelular mediante la activación de la fosforilación oxidativa mitocondrial [14]. Por lo tanto, el DCA puede ser un fármaco anticancerígeno adecuado para aumentar la eficacia de la quimioterapia y superar la resistencia a los agentes quimioterapéuticos en el cáncer humano; sin embargo, aunque el DCA se ha estudiado ampliamente en el cáncer, rara vez se ha probado en células de HNC [15], en particular en el contexto de la resistencia a los agentes quimioterapéuticos. Es necesario seguir investigando los mecanismos del DCA y su sinergia con agentes quimioterapéuticos convencionales. Aquí, mostramos que el DCA desplaza la bioenergética del HNC hacia la oxidación mitocondrial de la glucosa y conduce a la acumulación celular de especies reactivas de oxígeno mitocondriales (mROS), sensibilizando así las células HNC quimiorresistentes al cisplatino in vitro e in vivo.

Materiales y métodos

Cultivo celular y establecimiento de células HNC resistentes al cisplatino
Las células humanas de cáncer de cabeza y cuello (HNC) AMC-HN2, -HN3, -HN4, -HN5, -HN9 y -HN10 se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, EE.UU.); Las células SNU-1041, -1066 y -1076 se cultivaron en medio del Roswell Park Memorial Institute (Life TechnologiesTM ); y las células UMSCC1 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (Life TechnologiesTM ). Los medios se suplementaron con un 10% de suero bovino fetal. Todas las líneas celulares cancerosas se autentificaron mediante perfiles de ADN (repeticiones cortas en tándem, STR) proporcionados por el Banco Coreano de Líneas Celulares. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

Las células AMC-HN4 y HN9 resistentes al cisplatino (HN4R y HN9R) se desarrollaron a partir de las células parentales AMC-HN4 y HN9 sensibles al cisplatino, respectivamente, mediante la exposición a concentraciones crecientes de cisplatino (dicloruro de cis-platino (II) diamina [CDDP]; Sigma-Aldrich, Louis, MO, EE.UU.) [16]. La resistencia al cisplatino en las líneas celulares establecidas se evaluó mediante ensayos de viabilidad celular y se comparó con la de las células parentales.

Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó mediante exclusión con azul tripán, MTT y ensayos clonogénicos. La exclusión del azul tripán se realizó en células HNC sembradas a 1 x105 en placas de 6 pocillos. Se dejó que las células alcanzaran una confluencia del 60-70% y se expusieron a dicloroacetato (DCA; Sigma-Aldrich) durante 72 h. A continuación se tripsinizaron las células, se tiñeron con azul tripán al 0,4% (Life TechnologiesTM ) y se contaron utilizando un hemocitómetro. El ensayo MTT se realizó en células HNC sembradas a 3-5 x103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante la noche y luego se expusieron a DCA y cisplatino, solos o en combinación, durante 72 h. A continuación, las células se expusieron al compuesto de tetrazolio 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil-2H-bromuro de tetrazolio (MTT; Sigma-Aldrich) durante 4 h, tras lo cual se añadió tampón de solubilización durante 2 h. La absorbancia en cada pocillo se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Para los ensayos clonogénicos, las células se expusieron a DCA o vehículo durante 72 h y luego se incubaron en medio libre de fármacos durante 7-10 días. Los pocillos se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,5% y se contó el número de colonias. Todos los ensayos se realizaron con muestras triplicadas y se repitieron tres veces.

La citotoxicidad del cisplatino se evaluó mediante MTT después de 72 h, y se calculó la concentración inhibitoria semimáxima (IC50) de cada célula HNC. La interacción de dos fármacos se consideró sinérgica cuando la inhibición del crecimiento inducida por la combinación de fármacos era mayor que la suma de las inhibiciones inducidas por cualquiera de los fármacos por separado: índice de combinación (IC) = 1, interacción aditiva; IC < 1, interacción sinérgica; e IC > 1, interacción antagónica [17].

Medición de la bioenergética y la producción de ROS
Las células HNC (1 x104 células por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y, al día siguiente, se lavaron y se incubaron en DMEM sin suero suplementado con o sin 100 ng/mL de oligomicina (un inhibidor de la ATP sintasa; Sigma-Aldrich) durante 6 h. Se recogió el medio de cultivo (50 µl) de cada placa y se midió la concentración de lactato del medio de cultivo con un kit de ensayo de lactato (Biovision, Mountain View, CA, EE.UU.). Lac (o) y Lac (c) denotan la concentración de lactato en el medio tras 6 h de incubación en presencia y ausencia de oligomicina, respectivamente. La contribución de la glucólisis y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) a la bioenergética celular se calculó con la siguiente fórmula: glucólisis (%) = Lac (c)/Lac (o) x 100; OXPHOS (%) = 100 – glucólisis (%) [14].

Las células se expusieron a 15 o 30 mM de DCA durante 24 h, y se detectó la generación de ROS en células incubadas con 10 µM de diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF-DA) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EE.UU.). Las células se incubaron con 10 µM de DCF-DA durante 30 minutos a 37 °C, se lavaron dos veces con PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACScalibur. Las células también se pretrataron con 3 mM de N-acetil-l-cisteína (NAC; Sigma-Aldrich) durante 1 h o con 10 µM del inhibidor de la superóxido dismutasa (SOD) dietil-ditiocarbamato (Sigma-Aldrich) antes de la exposición a 30 mM de DCA. Los niveles de ROS se midieron mediante citometría de flujo utilizando DCF-DA y se muestran como el cambio de pliegues sobre los niveles de control (basales).

Ensayos de ciclo celular y muerte celular
Para los ensayos de ciclo celular, las células se expusieron a DCA durante 72 h. A continuación, se tripsinizaron, se fijaron durante toda la noche en etanol frío y se tiñeron durante 30 min con yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) a 37 °C. El contenido de ADN celular se midió mediante citometría de flujo utilizando DCF-DA. El contenido de ADN celular se midió con un citómetro de flujo FACScalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, EE.UU.). Para los ensayos de muerte celular, las células se cultivaron con cisplatino y DCA, solos o en combinación, o con una cantidad equivalente de DMSO (control vehicular). Después de 72 h, se cosecharon las células, se lavaron con PBS frío y se resuspendieron en tampón de unión. Las células se tiñeron con anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) y yoduro de propidio utilizando un kit de detección de apoptosis anexina V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), y luego se analizaron por citometría de flujo. Todos los datos se analizaron utilizando el software Cell Quest (BD Biosciences). La significación estadística entre los distintos grupos de tratamiento se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos colas o la prueba t de Student.

Para los ensayos de actividad de caspasas, las células HN4R y HN9R sembradas en una placa de 96 pocillos se expusieron a 100 µl de medio que contenía cisplatino y DCA solo o en combinación, durante 72 h, con o sin 3 mM de NAC o 50 µM de Z-VAD-fmk (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) antes de la exposición a 30 mM de DCA. Los ensayos se realizaron en pocillos por triplicado utilizando el ensayo fluorimétrico Homogeneous Caspase Assay (Roche Life Science, Basilea, Suiza). Se añadió la solución de sustrato de trabajo y la placa se incubó en la oscuridad a 37 °C durante 2-8 h o a temperatura ambiente durante toda la noche. La absorbancia en cada pocillo se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax M2.

Para medir el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), las células HN4R y HN9R sembradas en una placa de 96 pocillos se expusieron a 100 µl de medio que contenía cisplatino y DCA solos o en combinación durante 36 h. Las células se tiñeron con éster etílico de tetrametilrhodamina 200 nM (TMRE, Life Technologies TM ) durante 20 min y luego se analizaron por citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia (IMF) de cada grupo de tratamiento se normalizó con respecto al grupo de control.

Transcripción inversa-PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN celular total se extrajo utilizando el reactivo de lisis QIAzol y el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). El ADNc se generó a partir del ARN purificado utilizando un kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de la piruvato deshidrogenasa quinasa 2 (PDK2) se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: 5′-ATGGCAGTCCTCCTCTCTGA-3′ (avance) y 5′-CACCCACCCTTCCTAACA-3′ (retroceso). Para la β-actina (un control endógeno), se utilizaron los siguientes cebadores: 5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ (directo) y 5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′ (inverso). La transcripción-PCR inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó con SYBR Green (Qiagen) en un sistema 7900HT Fast Real-time PCR (Applied Bioscience, Foster, CA, EE.UU.). Los niveles relativos de ARNm diana se normalizaron con respecto a la expresión de β-actina.

siRNA
Para la reducción de PDK2 y PDHE1α, se sembraron AMC-HN4-cisR y HN9-cisR en placas de 60 mm en medio sin antibióticos y, 18 h después, se transfectaron con 100 nmol/L de pequeño ARN de interferencia (siRNA) dirigido al gen humano PDK2 o PDHE1α o con un siRNA de control codificado (Life Technologies TM ). Tras 72 h, las células se expusieron a DCA durante un periodo adicional de 72 h y se analizó la expresión proteica. El knockdown se confirmó mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-PDK2 o PDHE1.

Inmunotransferencia
Las células se lisaron a 4 °C en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Life TechnologiesTM ). La inmunotransferencia se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar. Brevemente, se resolvió un total de 50 µg de proteína mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) en geles al 10-12%, se transfirió a membranas de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno y se probó con anticuerpos primarios y secundarios. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios p53 (DO1) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); hexocinasa 2 (HK2), p21 WAF1/CIP1, PUMA, poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) escindida, fosfo-p53-Ser15 y caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.); PDK2 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.); y PDHE1α y fosfo-PDHE1α (ser293) (Calbiochem, Billerica, MA, EE.UU.). la β-actina (Sigma-Aldrich) se utilizó como control de carga. Todos los anticuerpos se diluyeron entre 1:250 y 1:5000.

Microscopía confocal
Se obtuvieron imágenes de ΔΨm en células cancerosas vivas utilizando TMRM (Life TechnologiesTM ), un colorante a base de rodamina sensible a las mitocondrias y al voltaje (fluorescencia roja). El superóxido mitocondrial (mROS, Life TechnologiesTM ) producido durante la respiración celular se midió con MitoSOX (fluorescencia roja). Las imágenes de fluorescencia de TMRM o mitoSOX se capturaron con un microscopio confocal de dos fotones Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss AG, Heidenheim, Alemania), y la fluorescencia media se cuantificó (unidades arbitrarias de fluorescencia, AFU) en células cancerosas en cultivo utilizando el software de imágenes Zen (Carl Zeiss AG). La adquisición de imágenes y los análisis fueron realizados por dos científicos que no conocían el origen de las muestras celulares.

Imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET)
La captación de glucosa se visualizó in vivo en ratones desnudos con trasplante de células HN4R o HN9R utilizando anestesia con gas isoflurano (20% de oxígeno) y 18 F-fluorodeoxiglucosa (18 F-FDG) como radiotrazador. Las imágenes PET se realizaron con microPET FOCUS 120 (Concorde Microsystem Inc., Knoxville, TN, EE.UU.). Los ratones ayunaron durante la noche y a continuación se les inyectó 0,15 mCi por vía intravenosa. Después de 1 h, se realizó una exploración PET con 18 F-FDG en todo el cuerpo. Las imágenes de adquisición de datos PET se muestran mediante un mapa de pseudocolores en el que el color rojo indica una elevada captación de 18 F-FDG.

Para determinar la actividad de 18 F-FDG-PET se utilizó el valor de captación estandarizado máximo y medio (SUVmax y SUVmean). El SUV se analizó mediante la ecuación SUV = A/(ID/BW), donde A es la actividad corregida por decaimiento en el tejido (en mCi/mL), ID es la dosis inyectada de FDG (en mCi) y BW es el peso corporal del ratón (en gramos). Se colocaron regiones de interés (ROI) esféricas o elípticas sobre las lesiones visibles en las imágenes PET. El SUVmax y el SUVmean se calcularon dibujando automáticamente una ROI sobre el corte más intenso de los tumores visibles en las imágenes PET. Los MTV se calcularon a partir de datos de PET con atenuación corregida utilizando un paquete de software comercial (INFINITT PACS; INFINITT Healthcare Co., Ltd). los datos de PET con 18 F-FDG se introdujeron en la estación de trabajo en formato DICOM, y los valores de intensidad se convirtieron automáticamente en SUV. Para los cálculos de MTV, los márgenes de contorno del tumor se definieron utilizando un SUV fijo de 2,0, y el volumen tumoral se delineó a continuación con el isocontorno SUV 2,0. Las imágenes PET se obtuvieron en ratones con tumor implantado el día 21 tras el inicio del tratamiento. Se compararon los valores medios de los valores SUVmax y MTV tumorales entre los distintos grupos de tratamiento.

Estudios preclínicos
Todos los procedimientos de los estudios con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de nuestra institución. Se adquirieron ratones BALB/c macho nude atímicos (nu/nu) de seis semanas de edad a Central Lab Animal Inc. (Seúl, República de Corea). Se inyectaron células AMC-HN4R o HN9R (5 x 10 6 ) por vía subcutánea en el flanco. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron cada 3 días. Los tumores se midieron con un calibre y el volumen se calculó como (longitud x anchura2 )/2. El tratamiento comenzó cuando los implantes celulares se convirtieron en nódulos palpables (=día 0). Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento: vehículo, DCA, cisplatino y DCA más cisplatino.

Los ratones fueron tratados con agua potable suplementada con 0,5 g/L de DCA, o mediante inyección i.p. de 5 mg/kg de cisplatino una vez por semana, o con una combinación de DCA y cisplatino según los mismos esquemas. Se sacrificó a los ratones el día 24 y se aislaron los tumores, que se analizaron mediante inmunotransferencia y el ensayo in situ de etiquetado con dUTP nick-end mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) (EMD Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). El número de cuerpos apoptóticos se contó a ciegas en diez campos de alta potencia seleccionados aleatoriamente. La significación estadística entre los distintos grupos de tratamiento se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos colas o la prueba t de Student.

Resultados

Elaumento de la glucólisis en las células HNC se asocia con la resistencia al cisplatino y se revierte mediante DCA
Todas las líneas celulares utilizadas en nuestro estudio eran HNC humanas. El efecto citotóxico del DCA se evaluó en células HNC mediante exclusión con azul tripán, tinción con violeta cristal y ensayo MTT. El DCA, probado hasta 30 mM durante 72 h, inhibió marcadamente el crecimiento de las células HNC (ensayo MTT, Fig. 1A ). El DCA modificó la bioenergética de las células HNC: la glucólisis celular disminuyó significativamente, mientras que la fosforilación oxidativa aumentó (Fig. 1B ). El cambio en la bioenergética varió entre las líneas celulares HNC y se asoció significativamente con la sensibilidad al cisplatino: las células HNC con alta glucólisis mostraron resistencia al cisplatino (R2 = 0,859, P < 0,001; Fig. 1C ). Además, tras la exposición al DCA, las células cancerosas con el mayor cambio en la bioenergética eran propensas a ser más apoptóticas (R2 = 0,769, P = 0,002; Fig. 1D ). Esto sugiere que el DCA induce la apoptosis específica de las células cancerosas mediante la disminución de la glucólisis en las células HNC.

Fig. 1. El aumento de la glucólisis en las células HNC se correlaciona con la disminución de la sensibilidad al cisplatino y se reduce por dicloroacetato (DCA). (A) El DCA indujo la muerte celular en células HNC. La citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo MTT tras la exposición a diferentes concentraciones de DCA durante 72 h. (B) Cambio en la bioenergética por DCA en células HNC. Las mediciones de glucólisis y OXPHOS (%) se describieron en la sección Materiales y métodos. (C) Correlación entre glucólisis e IC50 de cisplatino en un panel de líneas celulares HNC. La IC50 se calculó mediante el ensayo MTT en tres experimentos independientes, cada uno realizado con muestras triplicadas. La correlación se evaluó mediante regresión lineal. (D) Correlación entre cambios bioenergéticos y apoptosis en células HNC. Los ensayos de apoptosis midieron las fracciones apoptóticas anexina V-positivas tras la exposición a 20 mM de DCA durante 72 horas.

Laexpresión de PDK2 está asociada con la resistencia al cisplatino en HNC
Los efectos citotóxicos del cisplatino se probaron en cultivos de HN4-cisR y HN9-cisR y líneas celulares de cáncer parentales (Fig. 2A). Las células HN4-cisR y HN9-cisR resistentes al cisplatino mostraron un aumento del IC50 de 12 y 18 veces, respectivamente, en comparación con sus respectivas líneas parentales. El análisis por Western blot mostró que HK2 y PDK2 se expresaban altamente tanto en las células HN4-cisR como en las HN9-cisR en comparación con las respectivas células parentales, mientras que la expresión de PDHE1α era baja en las células resistentes al cisplatino ( Fig. 2B ). El nivel de expresión del ARNm de PDK2 también fue mayor en las células resistentes que en las sensibles (P < 0,01) (Fig. 2C). El DCA inhibió el crecimiento de las células HNC resistentes al cisplatino tanto como el de las células HNC sensibles al cisplatino (Fig. 2D). El análisis de Western blot mostró que el DCA disminuyó significativamente los niveles de PDK2 y fosfo-PDHE1α (pPDHE1α), pero aumentó el nivel de proteínas proapoptóticas, incluyendo PARP escindido (cPARP) y PUMA, y el de p21 en HN4-cisR y HN9-cisR (Fig. 2E). Esto sugiere que el DCA puede inhibir eficazmente el crecimiento de las células HNC resistentes al cisplatino, así como el de las células HNC sensibles al cisplatino.

Fig. 2. La expresión de PDK2 está asociada con la resistencia al cisplatino en el HNC. (A) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT tras la exposición a cisplatino durante 72 h. (B) El análisis Western blot muestra diferentes niveles de proteínas hexocinasa 2 (HK2), piruvato deshidrogenasa cinasa 2 (PDK2), piruvato deshidrogenasa (PDH) E1α (PDHE1α) y lactato deshidrogenasa A (LDHA) en células HN4 (HN4R) y HN9 (HN9R) resistentes al cisplatino no tratadas y en sus células parentales. (C) Cambio en el nivel de expresión génica de PDK2 entre las células resistentes al cisplatino (cis-R) y sus células parentales. * denota P <0,01 en relación con las células HNC parentales. (D) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT tras la exposición a 15 y 30 mM de DCA durante 72 h. Las barras de error representan la E.S. de tres experimentos independientes, cada uno realizado con muestras triplicadas. (E) Análisis de Western blot que revela cambios en los niveles de PARP escindida, PUMA, p21, PDK2, fosho-PDHE1α (pPDHE1α) y PDHE1α en células HN4R y HN9R resistentes al cisplatino expuestas a DCA durante 24 h. Se evaluó el nivel de β-actina como control de carga.

El DCAinduce la acumulación de ROS en células HNC
El cambio en las ROS celulares por el DCA se evaluó mediante citometría de flujo utilizando la sonda fluorescente DCF-DA sensible al redox. La exposición al DCA causó un aumento significativo de los niveles de ROS en las células HNC (P < 0,01), que fue bloqueado por la co-exposición con NAC o el inhibidor de la SOD dietil-ditiocarbamato (Fig. 3A). La glucólisis aumentó significativamente en las células HNC resistentes al cisplatino en comparación con sus células parentales (P < 0,01), pero el DCA indujo una disminución significativa de la glucólisis y un aumento de la fosforilación oxidativa tanto en las células HNC sensibles al cisplatino como en las resistentes al cisplatino (P < 0,01) ( Fig. 3B ). El potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se midió utilizando TMRM, un colorante a base de rodamina sensible al voltaje y sensible a las mitocondrias, y la ROS mitocondrial (mROS, superóxido mitocondrial) se midió utilizando MitoSOX red. Las células HNC tratadas con DCA mostraron una disminución de ΔΨm y un aumento de mROS (P < 0,01) (Fig. 3C). El cambio en ΔΨm en células HNC resistentes a cisplatino tras la exposición a DCA fue bloqueado por el pretratamiento con NAC (Fig. 3D). Esto sugiere que el DCA puede inducir la acumulación de ROS en las células HNC mediante la activación de la fosforilación oxidativa.

Fig. 3. El DCA induce la acumulación intracelular de ROS en células HNC. (A) Elevación de ROS por DCA. Células HN4R y HN9R resistentes al cisplatino fueron expuestas a 15 o 30 mM de DCA durante 24 h. Las células también fueron pretratadas con el inhibidor de ROS N-acetil-l-cisteína(NAC, 3 mM) o el inhibidor de superóxido dismutasa (iSOD) dietil-ditiocarbamato (10 µM). Los niveles de ROS se midieron mediante citometría de flujo utilizando DCF-DA y se muestran como cambios de pliegues sobre los niveles de control (basales). Todos los valores son la media ± E.S. de tres experimentos independientes. * denota P <0,01 en relación con el control, y ** denota P <0,01 en relación con 30 mM DCA. (B) Cambio en la bioenergética por DCA en células HNC. * denota P <0,05 en relación con el control, y ** denota P <0,01 en relación con sus células parentales sensibles al cisplatino. (C) Cambio en las especies reactivas de oxígeno (ROS, es decir, superóxido) medido por mitoSOX y el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm, tinción roja) tras la exposición a 20 mM de DCA en comparación con el control no tratado (ctr). Unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU) en células control y tratadas con DCA. (D) Cambios en ΔΨm en células HN4R y HN9R tras una exposición de 36 h a DCA. El ΔΨm se midió utilizando éster etílico de tetrametilrodamina y se analizó por citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia de cada grupo de tratamiento se normalizó con respecto al grupo de control. Las barras de error representan la E.S. de tres experimentos independientes, cada uno realizado con muestras triplicadas. * denota P <0,01 en comparación con el control. ** Denota P <0,01 en comparación con DCA solo o DCA más NAC.

ElDCA promueve la detención del ciclo celular y la apoptosis en células HNC
Los ensayos clonogénicos dieron como resultado una marcada disminución del número de colonias HN4-cisR y HN9-cisR tras la exposición al DCA (P < 0,01) (Fig. 4A ). La citometría de flujo utilizando tinción con yoduro de propidio mostró un cambio significativo del ciclo celular en las células HNC: la wogonina aumentó la población apoptótica sub-G1 (P < 0,05), y este efecto fue bloqueado por la co-exposición con NAC (Fig. 4B ). El análisis de Western blot mostró que el DCA disminuía la pPDHE1α pero aumentaba la cPARP, la p21, la fosfo-p53 y la caspasa-3 escindida (cCasp3) de forma dependiente del tiempo (Fig. 4C ). La activación de PDHE1α mediante el knockdown de PDK2 en células AMC-HN4-cisR no aumentó significativamente las proteínas proapoptóticas cPARP y cCasp3 (Fig. 4D ); sin embargo, el knockdown de PDHE1α disminuyó la expresión de p21 y la fosforilación de p53. La citometría de flujo mediante tinción con yoduro de propidio y anexina-V mostró una inducción eficaz de la apoptosis y la muerte celular en células HNC resistentes al cisplatino por DCA; el efecto se redujo con la co-exposición a DCA y el antioxidante NAC o el inhibidor pan-caspasa Z-VAD-fmk ( Fig. 4E ). Esto se confirmó mediante la medición de la actividad de la caspasa, que aumentó significativamente con el DCA de forma dependiente de la concentración (Fig. 4F ).

Fig. 4. El DCA induce la muerte celular y cambios en el ciclo celular de las células HNC. (A) Ensayo clonogénico de líneas celulares de cáncer resistentes a cisplatino expuestas a DCA. Las células cancerosas AMC-HN4R y HN9R se expusieron a DCA durante 72 h. Las barras de error representan la E.S. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. * denota P <0,01. (B) Análisis del ciclo celular tras la exposición a DCA. Las células AMC-HN4R expuestas a DCA durante 72 h se tiñeron con yoduro de propidio y se sometieron a análisis de citometría de flujo. * p <0,05. (C) Análisis de Western blot que revela cambios en los niveles de PARP escindida (cPARP), p21WAF1, fosfo-p53-ser 15 (pp53), caspasa 3 escindida (cCasp3), pPDHE1α y PDHE1α. Los extractos celulares se obtuvieron tras exponer las células AMC-HN4R a 30 mM de DCA. (D) Efectos del DCA y de la inhibición genética de PDK2 y PDHE1α sobre las proteínas proapoptóticas, PARP escindida y caspasa 3 escindida, y sobre p21WAF1. Las proteínas se midieron mediante análisis Western blot en células AMC-HN4R expuestas a 30 mM de DCA. Las células cancerosas se transfectaron con ARNsi revuelto (scr), ARNsi PDK2 o ARNsi PDHE1α durante 48 h, antes de la exposición a 30 mM de DCA. (E) Ensayos de apoptosis en células AMC-HN4R y HN9R expuestas a DCA. Las células se expusieron a DCA durante 72 h y se midieron las fracciones apoptóticas con anexina V positiva. (F) Elevación de la actividad de las caspasas tras el tratamiento con DCA. Las barras de error representan la E.S. de tres réplicas. * y ** indican P <0,01 en relación con el control y 30 mM DCA, respectivamente. Las células también fueron pretratadas con 3 mM de NAC o 50 µM del inhibidor pan-caspasa Z-VAD-fmk antes de ser expuestas a 30 mM de DCA.

ElDCA sensibiliza las células HNC resistentes alcisplatino al cisplatino in vitro e in vivo
El cisplatino (10 µM) no indujo ninguna citotoxicidad significativa ni expresión de proteínas apoptóticas en las líneas HNC HN4-cisR y HN9-cisR resistentes al cisplatino en comparación con las líneas parentales HN4 y HN9 sensibles al cisplatino (Fig.

5A).

5A); sin embargo, el DCA indujo una marcada disminución de la supervivencia en las células HNC resistentes al cisplatino (P < 0,05), que fue bloqueada por el pretratamiento con NAC. El DCA indujo la expresión de proteínas apoptóticas y aumentó la citotoxicidad inducida por el cisplatino y la expresión de proteínas apoptóticas en las células HN4-cisR (Fig. B). En combinación, el DCA aumentó la citotoxicidad del cisplatino en las células HN4-cisR al aumentar la actividad de las caspasas en mayor medida que la suma de los efectos de cualquiera de los agentes por separado (CI < 1, P < 0,01), que se vieron debilitados por el silenciamiento del gen PDHE1α (Fig. 5C). El ΔΨm fue mayor en las células HN4-cisR resistentes al cisplatino que en las células HN4 parentales sensibles al cisplatino (ΔΨm, intensidad media de fluorescencia [IMF]: 1 ± 0 frente a 0,54 ± 0,09, P < 0,001) y se redujo mediante DCA o la combinación de cisplatino y DCA, lo que se vio anulado por el silenciamiento del gen PDHE1α (Fig. 5D).

Fig. 5. El DCA sensibilizó al cisplatino las células HNC resistentes al cisplatino. (A) La viabilidad celular se evaluó por exclusión de azul tripán después de la exposición a cisplatino (CDDP), DCA, o su combinación. El efecto citotóxico del DCA fue bloqueado por el antioxidante N-acetil-l-cisteína(NAC, 3 mM). Las barras de error representan la E.S. de tres experimentos independientes, cada uno realizado con muestras triplicadas. * denota P <0,01 frente a control, y ** denota P <0,01 frente a pretratamiento con NAC. (B) Western blotting que muestra un aumento de la sensibilidad al cisplatino (CDDP) por DCA. Las células AMC-HN4R resistentes al cisplatino fueron tratadas con DCA, cisplatino o ambos durante 72 h. (C) Elevación de la caspasa tras una exposición de 72 h a DCA, cisplatino y PDHE1α siRNA. Las células HN4R se expusieron a DCA, cisplatino o la combinación de ambos fármacos, y se midió la actividad de la caspasa.(D) Cambios en ΔΨm en células HN4R tras una exposición de 36 h a DCA, cisplatino o la combinación de ambos fármacos. El ΔΨm se midió utilizando éster etílico de tetrametilrhodamina y se analizó mediante citometría de flujo. La mediana de la intensidad de fluorescencia de cada grupo de tratamiento se normalizó con respecto al grupo de control. Las barras de error representan la E.S. de tres experimentos independientes, cada uno realizado con muestras triplicadas. * y ** indican P <0,01 en comparación con el ARNsi de control y el ARNsi mezclado (scr), respectivamente. *** denota P <0,01 en comparación con DCA o cisplatino solos.

Estos resultados se examinaron más a fondo en modelos de xenoinjerto tumoral in vivo. Los ratones BALB/c atímicos desnudos portadores de tumores AMC-HN4-cisR o HN9-cisR fueron tratados con DCA, cisplatino, DCA más cisplatino o vehículo. La combinación de cisplatino y DCA suprimió sinérgicamente el crecimiento tumoral (Fig. 6A). Se realizaron imágenes in vivo del crecimiento tumoral mediante PET con 18 F-FDG el día 21 del tratamiento. Se observaron captaciones focales de 18 F-FDG en los lugares de implantación del tumor, donde se midieron la captación estandarizada máxima (SUVmax) y el volumen tumoral metabólico a SUV 2,0 (MTV2,0). El SUVmax no fue diferente entre los grupos de tratamiento (P > 0,1), pero el MTV2.0 fue significativamente menor en los grupos tratados con DCA y combinación que en los otros grupos (P < 0,05) (Fig. 6B). Los ensayos de apoptosis in situ mostraron que los cuerpos apoptóticos TUNEL-positivos se observaron con mayor frecuencia en los tumores tratados con DCA y cisplatino más DCA que en los tratados con vehículo (P < 0,01) (Fig. 6C). Los análisis de Western blot de los tejidos tumorales mostraron que los niveles de proteínas apoptóticas aumentaron en mayor medida en las células HN4-cisR tratadas con la combinación de cisplatino y DCA que en los tumores tratados con agentes únicos (Fig. 6D).

Fig. 6. El DCA sensibiliza a las células HNC resistentes al cisplatino in vivo. (A) Efecto antitumoral del DCA y el cisplatino en un modelo de ratón de xenoinjerto tumoral. Se inyectaron ratones desnudos con 5 ×106 células AMC-HN4R y HN9R en el flanco. Los tratamientos con vehículo, cisplatino (CDDP), DCA o la combinación de cisplatino y wogonin comenzaron una vez que las células tumorales implantadas formaron nódulos palpables. Cada grupo incluía diez ratones. Las barras de error representan la E.S. * y ** denotan P <0,05 y P <0,01 frente a control (ctr), respectivamente. (B) Imágenes tumorales in vivo mediante tomografía por emisión de positrones (PET) con 18F-fluorodesoxiglucosa. La PET se realizó 3 semanas después del inicio del tratamiento. Se obtuvieron el volumen máximo de captación normalizado (SUVmáx) y el volumen tumoral metabólico (MTV2,0) en los tumores (flechas), y se compararon los valores medios entre los distintos grupos de tratamiento. * y ** indican P <0,05 y P <0,01 frente a control, respectivamente. (C) Cuantificación a partir de ensayos TUNEL in situ en secciones tumorales de cada grupo. Los cuerpos apoptóticos TUNEL-positivos se contaron a ciegas en diez campos de alta potencia seleccionados aleatoriamente. Las barras de error representan la E.S. Prueba t de Student de dos colas, * denota P <0,01. (D) Análisis Western blot de las proteínas PARP escindida, fosfo-p53-ser15, caspasa 3 escindida y PDHE1α obtenidas de tumores tratados con vehículo control, DCA, cisplatino o la combinación de ambos fármacos. la β-actina sirvió como control de carga interno.

Discusión

El aumento de la glucólisis, frecuente en el cáncer, está estrechamente relacionado con la alteración mitocondrial o la fosforilación oxidativa defectuosa y contribuye a la resistencia terapéutica [18,19]. La glucólisis aeróbica se ha implicado en la resistencia a la quimioterapia [20] o a la radioterapia [21]. En el presente estudio, las líneas celulares resistentes al cisplatino muestran una glucólisis elevada, lo que indica un vínculo bioquímico entre la glucólisis y la quimiorresistencia. Las células resistentes a fármacos muestran una mayor necesidad de ATP que las células normales para mantener la homeostasis celular y activar las vías de supervivencia que permiten escapar de la muerte celular bajo estrés genotóxico [20]. Las células cancerosas resistentes aumentan la glucólisis para generar ATP rápidamente y satisfacer la demanda intracelular. Esto se observó claramente en nuestras células resistentes al cisplatino en comparación con las células sensibles parentales, lo que indica que la resistencia a fármacos en el HNC está directamente asociada a un aumento de la glucólisis. Esto implica que el cambio bioenergético de las células cancerosas hacia un aumento de la glucólisis está relacionado con la quimiorresistencia [14,22]. Por lo tanto, el nivel de glucólisis en cánceres humanos puede ser un biomarcador de quimiorresistencia y requiere validación clínica en tejidos de cáncer humano.

El presente estudio muestra que el DCA desplaza la generación de energía de la glucólisis a la oxidación mitocondrial de la glucosa en el HNC. Esta inversión inducida por el DCA del cambio metabólico hacia la glucólisis elimina la ventaja proliferativa de las células cancerosas y finalmente conduce a la muerte celular [23]. El DCA, como análogo estructural del piruvato, inhibe la PDK y reactiva la PDH, una enzima que forma parte del complejo que convierte el piruvato en acetil-CoA, el sustrato primario del ciclo de Krebs [10,23]. Dado que la mayoría de los tipos de cáncer producen un ambiente hipóxico, las células cancerosas dependen de la glucólisis anaeróbica como fuente de energía primaria. La activación del factor inducible por hipoxia (HIF) induce la PDK mitocondrial [24]. La actividad de la PDH mitocondrial en el cáncer está bloqueada por la PDK, lo que resulta en una menor disponibilidad de acetil-CoA para la oxidación mitocondrial de la glucosa [24]. El aumento de la expresión de PDK se asocia con la resistencia a fármacos en el cáncer [25,26]. También se ha observado un aumento de PDK2 por mutaciones mitocondriales y estabilización de HIF1α en células HNC [27]. En el presente estudio, también se confirmó la asociación entre la sobreexpresión de PDK2 y la resistencia al cisplatino en células HNC. Estos hallazgos indican la importancia de la PDK como nueva diana molecular en la terapia del cáncer [10]. Datos anteriores mostraron que la inhibición genética o farmacológica de PDK cambia la bioenergética del cáncer y restaura la apoptosis dependiente de mitocondrias en células cancerosas [11,13]. Por lo tanto, la PDK es eficaz para superar la resistencia al tratamiento en cánceres con fenotipos agresivos in vitro e in vivo[12-14].

La activación de la PDH por el DCA induce la acumulación de mROS en las células cancerosas. Las células cancerosas tienen un metabolismo mitocondrial de la glucosa disminuido, lo que resulta en una disminución de la actividad de la cadena de transporte de electrones (ETC) y una disminución de mROS [10], [28]. La remodelación mitocondrial de ΔΨm hiperpolarización y la disminución de la producción de mROS en el cáncer conduce a la resistencia a la apoptosis bajo estrés genotóxico. En células cancerosas resistentes con un fenotipo más glucolítico, HK2 provoca su translocación a la membrana mitocondrial externa y el aumento de ΔΨm [29]. La inhibición de la glucólisis y de la translocación de HK2 disminuye la ΔΨm del cáncer e invierte la resistencia a la apoptosis [29]. En el presente estudio, el aumento de la expresión de HK2 y PDK2 y el potencial de membrana mitocondrial también se encontraron en las células cancerosas resistentes al cisplatino. El DCA fuerza la entrada de piruvato en la mitocondria a través de la activación de la PDH, el regulador de la oxidación mitocondrial de la glucosa, y disminuye la ΔΨm y aumenta la mROS [13]. En el presente estudio, el DCA simplemente revirtió la elevada remodelación mitocondrial en las células HNC resistentes al cisplatino, lo que contribuyó a la muerte de las células cancerosas. La activación de la oxidación mitocondrial de la glucosa por el DCA indujo la mROS y la activación de la señalización mitocondrial descendente, lo que resultó en la activación de p53 y sus vías proapoptóticas relacionadas y condujo a la muerte de las células cancerosas quimiorresistentes. En nuestro estudio, la inhibición farmacológica de la producción de mROS o de la apoptosis mediada por caspasas atenuó el efecto citotóxico del DCA en células HNC, lo que confirma los mecanismos conocidos del fármaco.

Estudios preclínicos y clínicos apoyan el uso del DCA en pacientes con cáncer y en pacientes con acidosis láctica asociada a enfermedades mitocondriales [10,23]. Varios estudios demuestran los efectos citotóxicos del DCA, solo o en combinación con otros tratamientos, en una variedad de tumores derivados de las tres capas germinales [23]. Un estudio previo demostró que el glioblastoma, uno de los cánceres humanos más agresivos, sobreexpresa PDK2 en tejidos cancerosos extirpados de 49 pacientes y remitió en cinco pacientes tras el tratamiento con DCA, lo que demuestra el beneficio clínico del DCA en cánceres resistentes [13]. En HNC, un estudio reciente comparó el efecto del DCA en tres líneas celulares de carcinoma oral de células escamosas (OSCC) [15]. Las células de OSCC que presentaban una fosforilación oxidativa mitocondrial deficiente (es decir, una glucólisis elevada) eran más sensibles al DCA que las demás [15,30]. El presente estudio confirmó que las células HNC con altos cambios bioenergéticos eran más sensibles al DCA. De hecho, dado que las células cancerosas quimiorresistentes tienden a presentar una glucólisis elevada, estas células podrían ser diana de inhibidores metabólicos [31]. Por lo tanto, el DCA es un buen candidato para tratar células cancerosas con fenotipos agresivos, incluidas las células HNC quimiorresistentes. Sin embargo, debido a que los potenciales efectos anticancerígenos del DCA son todavía controvertidos, particularmente en tumores bajo hipoxia, se requieren más estudios preclínicos y clínicos sobre el DCA y el cáncer [32]. Una revisión sistemática reciente muestra que el DCA sinergiza con muchos agentes anticancerígenos estándar, y los ensayos clínicos de fase temprana sugieren que el DCA crónico es seguro y bien tolerado cuando se administra por vía oral 12,5 mg/kg dos veces al día [23].

Nuestro estudio reveló que el DCA sinergiza con el cisplatino y, por lo tanto, elude la resistencia al cisplatino en las células HNC. Dado que el cisplatino es un agente quimioterapéutico de primera línea en el HNC, la combinación de cisplatino y DCA puede ser eficaz en el ámbito clínico para reducir la toxicidad y superar la resistencia a los fármacos contra el cáncer. Informes anteriores demostraron que el DCA potencia el efecto citotóxico del cisplatino induciendo la apoptosis dependiente de mitocondrias [33,34]. La unión de dos moléculas de DCA al cisplatino, denominada mitaplatino, induce la muerte selectiva de células cancerosas [35,36]. Estos resultados proporcionan pruebas de que el DCA puede tener beneficios adicionales en combinación con las terapias anticancerígenas actuales. En nuestro estudio, el DCA y su combinación con cisplatino no afectaron al SUVmax pero disminuyeron significativamente el MTV2.0. Esto significa que el DCA suprime eficazmente el crecimiento tumoral in vivo a pesar de que no se produzcan cambios significativos en la captación máxima de glucosa en las regiones de interés localizadas en el tumor. El presente estudio es el primero en demostrar que el DCA restaura el efecto citotóxico del cisplatino en células HNC resistentes a fármacos in vitro e in vivo. El DCA indujo un fuerte aumento de la apoptosis mediada por cisplatino a través de la activación de p53, PARP y caspasas en células HNC resistentes al cisplatino. El DCA sensibilizó al cisplatino a las células del CNH resistentes a los fármacos, lo que condujo a un aumento de la citotoxicidad y a una terapia más eficaz para el CNH agresivo. En conjunto, estos hallazgos pueden tener una importancia clínica fundamental: inducir la muerte de las células resistentes con DCA podría reducir la dosis de cisplatino necesaria en el ámbito clínico y, por tanto, minimizar los posibles efectos adversos de la quimioterapia con cisplatino.

En conclusión, nuestros datos sugieren que la glucólisis elevada y la sobreexpresión de PDK están estrechamente relacionadas con la resistencia al cisplatino en células HNC. El DCA cambia la bioenergética de las células HNC hacia la fosforilación oxidativa mitocondrial. Esto conduce a una disminución de ΔΨm y un aumento de mROS, sensibilizando así las células HNC quimiorresistentes al cisplatino in vitro e in vivo. Estos datos justifican nuevas investigaciones preclínicas y clínicas del DCA, un prometedor candidato a fármaco anticanceroso, en el HNC con fenotipos agresivos. Sin embargo, nuestra conclusión debe tomarse en consideración con cautela, en un escenario opuesto. La fosforilación oxidativa mitocondrial defectuosa se relacionó con la sensibilidad de las células cancerosas a la condición de glucosa baja, lo que podría utilizarse en un biomarcador para la terapia del cáncer [37]. La célula cancerosa también está adaptada para facilitar la proliferación mediante la captación e incorporación de nutrientes a la biomasa en lugar de para la producción eficiente de ATP [38]. Por lo tanto, los efectos preclínicos y clínicos de DCA en HNC y otros tipos de cáncer deben ser examinados más a fondo.

Agradecimientos

Este estudio ha contado con el apoyo de una subvención (2015R1A2A1A15054540) del Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro, y una subvención (HI14C23050000) del Proyecto Coreano de I+D en Tecnología Sanitaria, Ministerio de Salud y Bienestar, Seúl, República de Corea (J.-L. Roh).

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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