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Allison B. Haugrud, Yongxian Zhuang, Joseph D. Coppock, W. Keith Miskimins

Cancer Biology Research Center, Sanford Research, 2301 E. 60th St North, Sioux Falls, SD 57104, EE.UU.
e-mail: [email protected]



Recibido: 24 de abril de 2014
Aceptado: 5 de septiembre de 2014
Publicado: 12 de septiembre de 2014

Resumen

El metabolismo único de las células de cáncer de mama ofrece interés para explotar este fenómeno terapéuticamente. La metformina, una prometedora terapia contra el cáncer de mama, actúa sobre el complejo I de la cadena de transporte de electrones, lo que conduce a una acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que finalmente conducen a la muerte celular. La inhibición del complejo I conduce a la producción de lactato, un subproducto metabólico ya muy producido por las células cancerosas reprogramadas y asociado a un mal pronóstico. Aunque la metformina sigue siendo una prometedora terapia contra el cáncer, buscamos un agente complementario que aumentara los efectos apoptóticos de la metformina y atenuara la producción de lactato, lo que podría mejorar considerablemente su eficacia. El dicloroacetato (DCA) es un fármaco bien establecido utilizado en el tratamiento de la acidosis láctica que funciona a través de la inhibición de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK) promoviendo el metabolismo mitocondrial. Nuestro propósito era examinar la sinergia y los mecanismos por los que estos dos fármacos eliminan las células de cáncer de mama. Se sometieron líneas celulares a los tratamientos indicados y se analizaron la muerte celular y diversos aspectos del metabolismo. La muerte celular y la producción de ROS se analizaron mediante citometría de flujo, análisis Western blot y métodos de recuento celular. Se tomaron imágenes de las células con microscopía de contraste de fase o microscopía confocal. El metabolismo de las células se analizó utilizando el analizador Seahorse XF24, ensayos de lactato y análisis de pH. Demostramos que cuando el DCA y la metformina se utilizan en combinación, se produce una inducción sinérgica de la apoptosis de las células de cáncer de mama. El daño oxidativo inducido por la metformina es potenciado por el DCA a través de la inhibición de la PDK1, que también disminuye la producción de lactato promovida por la metformina. Demostramos que el DCA y la metformina se combinan para inducir sinérgicamente la apoptosis dependiente de la caspasa que implica daño oxidativo con atenuación simultánea de la producción de lactato promovida por la metformina. Las combinaciones innovadoras como la metformina y el DCA resultan prometedoras para ampliar las terapias contra el cáncer de mama.


Palabras clave: Metformina; Dicloroacetato; Cáncer de mama; Lactato; Apoptosis

springer Science+Business Media Nueva York 2014


INTRODUCCIÓN

El metabolismo del cáncer se está convirtiendo en un área prometedora para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. En comparación con las células normales de las que derivan, las células cancerosas están metabólicamente reprogramadas, utilizando preferentemente la glucólisis incluso en condiciones de oxígeno suficiente, un fenómeno conocido como efecto Warburg [1]. Para compensar la pérdida de ATP como resultado de la glucólisis preferente (frente a la progresión a través de la fosforilación oxidativa), las células cancerosas regulan al alza los genes que codifican los transportadores de glucosa y las enzimas glucolíticas como la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK) y la lactato deshidrogenasa (LDH). Esta elevada tasa de captación de glucosa y el metabolismo alterado no sólo proporcionan ATP y permiten a las células sobrevivir en condiciones de hipoxia, sino que también proporcionan bloques de construcción biosintéticos como intermediarios y sustratos para la producción de aminoácidos, NADPH y ribosa-5-fosfato, que son esenciales para la síntesis de nucleótidos, proteínas y membranas necesarias en las células que se dividen rápidamente. Esto también significa que el ciclo TCA mitocondrial genera un porcentaje menor de ATP, permitiendo que el citrato se utilice en la biosíntesis de ácidos grasos y lípidos para la producción de nuevas membranas [2]. Gran parte del lactato derivado de la glucólisis es absorbido por las células circundantes con reciclaje recíproco para favorecer el crecimiento del tumor y la resistencia a los mecanismos de muerte celular apoptótica [2, 3]. El lactato producido por los tumores puede alterar el metabolismo de las células T y la presentación de antígenos de las células dendríticas, lo que conduce a la evasión inmunitaria del tumor [4, 5]. Así pues, los altos niveles de uso de glucosa y glucólisis proporcionan a las células cancerosas numerosas ventajas. Sin embargo, también puede ser posible explotar terapéuticamente el perfil metabólico único del cáncer. En este estudio, examinamos la actividad y la interacción de dos fármacos dirigidos al metabolismo, la metformina y el dicloroacetato (DCA), para determinar sus efectos sobre el crecimiento y la supervivencia de las células de cáncer de mama.

El clorhidrato de metformina (clorhidrato de 1,1-dimetilbiguanida) es un fármaco oral ampliamente utilizado en el tratamiento de la diabetes de tipo dos. Los estudios han demostrado que los pacientes diabéticos que toman metformina tienen una menor incidencia de cáncer y muertes relacionadas que los pacientes que no toman metformina. En uno de estos estudios, las pacientes diabéticas con cáncer de mama que tomaban metformina tuvieron una respuesta significativamente mejor a la quimioterapia neoadyuvante en comparación con las pacientes que no tomaban metformina [6-8]. Los estudios in vitro han concluido que la metformina inhibe el crecimiento de muchos tipos de células cancerosas, incluidas las del cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer de próstata, el cáncer de ovario y los gliomas [9-12]. Se sabe que la metformina activa la proteína cinasa activada por AMP (AMPK), lo que conduce a la inhibición de la síntesis proteica y el crecimiento celular [13]. Sin embargo, la activación de la AMPK por sí sola no es suficiente para provocar la muerte celular apoptótica [14]. Los estudios han demostrado que la metformina se acumula en la mitocondria e inhibe ligeramente el complejo I de la cadena de transporte de electrones, un acontecimiento que tiene lugar antes de la activación de la AMPK [15-18]. Al inhibirse el complejo I, el paso impedido de electrones conduce a la producción de superóxido dentro de la matriz mitocondrial, dañando las proteínas mitocondriales, los lípidos y los ácidos nucleicos. En los estudios en los que se ha demostrado que la metformina promueve la muerte celular, la apoptosis es la vía principal [10, 12, 19]. Anteriormente hemos demostrado que la metformina induce tanto la muerte celular dependiente de la caspasa como la dependiente de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama, mientras que no es citotóxica para las células epiteliales de mama no transformadas [20]. La muerte celular dependiente de la poli(ADP-ribosa) polimerasa se asoció con alteraciones importantes en la forma y función mitocondrial, lo que llevó a la conclusión de que el daño mitocondrial en las células cancerosas es un mediador clave de la muerte celular inducida por metformina. Basándonos en estas observaciones, planteamos la hipótesis de que los compuestos que promueven el metabolismo oxidativo mitocondrial potenciarían el daño mitocondrial inducido por la metformina y actuarían en sinergia con ésta para destruir las células cancerosas. Como el tratamiento con metformina también promueve la producción de lactato [21], lo ideal sería que un compuesto de este tipo también combatiera este efecto.

El dicloroacetato también es un fármaco disponible por vía oral con una farmacocinética bien estudiada y se ha probado para el tratamiento de la acidosis láctica (un posible efecto secundario de la metformina) y las deficiencias mitocondriales [27]. El dicloroacetato es un inhibidor de la PDK que fosforila la piruvato deshidrogenasa (PDH), dejándola inactiva [23]. La piruvato deshidrogenasa es la enzima responsable de catalizar la transformación del piruvato en acetil-CoA para su entrada en el ciclo mitocondrial del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa. En las células cancerosas, la actividad de la PDK suele ser elevada, actuando como guardián para reducir el flujo de piruvato del citoplasma al metabolismo mitocondrial. Se cree que este es un componente importante de la reprogramación metabólica en las células cancerosas, que conduce a una reducción de la oxidación de la glucosa y la producción de lactato [24-26]. Al inhibir la PDK, el DCA aumenta la actividad de la PDH, permitiendo que el piruvato entre en el ciclo TCA en lugar de convertirse en lactato y ser secretado [27].

En este estudio, examinamos la actividad antitumoral y la interacción de dos fármacos dirigidos al metabolismo, la metformina y el DCA. Demostramos que el DCA aumenta la citotoxicidad de la metformina en las células de cáncer de mama a través de un mecanismo que implica el daño oxidativo, al tiempo que reduce la producción de lactato por la metformina, lo que podría proporcionar una doble ventaja terapéutica.

Métodos

Productos químicos y reactivos
Los siguientes productos químicos, reactivos y kits se adquirieron a través de Sigma-Aldrich, a menos que se indique lo contrario: metformina (1,1-dimetilbiguanida), dicloroacetato sódico, solución de azul tripán al 04 % de solución de azul tripán, medio de montaje Vectashield para fluorescencia que contiene 4,6 diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories), kit de ensayo de lactato (Eton Biosciences), inhibidor de caspasas OPH-109 (MP Biomedicals), Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad Laboratories), paraformaldehído, SYTOX® Green (Life Technologies), Triton X-100 (Eastman) e inhibidor de PARP II INH2BP (Epigentek).

Cultivo celular
Las líneas celulares de cáncer de mama humano MCF7 y T47D y las células epiteliales mamarias humanas MCF10A se adquirieron a ATCC. La línea celular de carcinoma mamario de ratón 66CL4 fue proporcionada por el Dr. Fred Miller (Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI). Tras recibir las líneas celulares, las células se cultivaron y expandieron inmediatamente para preparar reservas de ampolla congeladas. Las células se pasaron durante un máximo de 2-3 meses antes de establecer nuevos cultivos a partir de las primeras ampollas congeladas. Las líneas celulares se sometieron a controles rutinarios de contaminación por micoplasma y los laboratorios IDEXX RADIL verificaron que estaban libres de micoplasma. Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10 % de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se incubaron en un incubador deCO2 humidificado a 37 °C.

Ensayo de exclusión con azul tripán
Las líneas celulares MCF7 y T47D se sembraron en placas de 35 mm. Las células se trataron con metformina y DCA a las concentraciones indicadas o con vehículo. Tras el periodo de tiempo indicado, se recogió el medio para conservar las células muertas flotantes. Las células adheridas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), que se mezcló con el medio recogido. A continuación, se cosecharon las células por tripsinización y se añadieron al pool. A continuación, se utilizó una solución de azul tripán para teñir las células muertas 1:1 y se contaron las células mediante un hemocitómetro.

Western blotting
Las
células se colocaron en placas de 35 mm. Tras el tratamiento durante el periodo de tiempo indicado, se cosecharon las células en el medio para recoger las células vivas y muertas. Las células se pelletearon, se lavaron con PBS y se volvieron a pelletear. A continuación, el sedimento celular se lisó añadiendo tampón de muestra de dodecilsulfato sódico (SDS) 1× [Tris-HCl 2,5 mM (pH 6,8), SDS 2,5%, ditiotreitol 100 mM, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,025%]. Se separaron cantidades iguales de proteínas en un gel de SDS-poliacrilamida al 8,5 %. Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon P (Millipore) con un aparato Bio-Rad Trans-blot utilizando un tampón de transferencia [48 mM Tris-HCl, 39 mM glicina]. Las membranas se sumergieron en leche en polvo desgrasada al 5 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (TBS-T) [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-20] con el anticuerpo indicado durante 3 h a temperatura ambiente o 4 °C durante la noche. Tras lavar a fondo con TBS-T, se aplicó un anticuerpo secundario adecuado conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). La membrana se lavó de nuevo y las proteínas se detectaron utilizando el sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (Pierce Biochemical). Para el aislamiento de mitocondrias, (Fig. 3d) se cultivaron células MCF7 hasta una confluencia del 95 % en placas de 150 mm. Se utilizó un kit de aislamiento mitocondrial para células cultivadas (Pierce) para aislar las mitocondrias de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los blots se visualizaron con un sistema de imagen UVP. Se utilizaron los siguientes anticuerpos Piruvato deshidrogenasa quinasa1 (Abcam), PARP (Cell Signaling), anti-4-hidroxinonenal (Millipore), subunidad del complejo I NDUFB8 (Mitosciences), GAPDH (Ambion), PDH (Abcam) y fosfo-PDHE1 alfa (Calbiochem).

Microscopía confocal
Las
células se colocaron en cubreobjetos de vidrio en placas de 35 mm y se trataron como se indica. Las células se lavaron en PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, se montaron en medio Vectashield con DAPI en portaobjetos de microscopio estándar y se observaron en un microscopio confocal Olympus FV1000 a 100×. El establecimiento de líneas celulares MCF7 con expresión estable de pAcGFP1-Mito (Clontech; un plásmido que codifica proteínas fluorescentes mitocondriales dirigidas) se describió previamente [20].

Ensayo de lactato y análisis del pH
Las células MCF7 y 66CL4 en placas de 35 mm se cultivaron hasta una confluencia del 80 % y se trataron como se indica en medios libres de rojo de fenol y carbonato. Las células se trataron durante 4-6 h. Se recogió el medio de las placas y se midió la concentración de lactato utilizando un kit comercial de ensayo de L-lactato (Eton Bioscience). Para la línea celular 66Cl4, se contaron las células con un hemocitómetro para normalizar los niveles de lactato. Se utilizó un pH-metro para medir el pH del medio.

Ensayo de formación de colonias
Se sembraron 500 células MCF7 por placa de 60 mm. Al día siguiente, las células se trataron como se indica. Tras 12 días de incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con etanol al 70% durante 5 minutos. A continuación, se tiñeron las colonias con azul de Coomassie [metanol al 40 %, ácido acético glacial al 12 %, azul de Coomassie al 0,24 %], se lavaron, se tomaron imágenes y se cuantificaron utilizando un sistema AlphaImager y el software de análisis de imágenes correspondiente (AlphaInnotech, Santa Clara, CA).

Citometría de flujo
Las células MCF7 se trataron como se indica. A continuación, se incubaron las células con MitoSOX (5 µM) durante 15 minutos, se lavaron, se tripsinizaron y se añadió a las células 1 ml de DMEM al 10 % de FBS. La detección de los niveles de MitoSOX en un número igual de células por condición de tratamiento se determinó mediante citometría de flujo utilizando un citómetro Accuri C6.

Inhibición de PDK1 utilizando un siRNA
On-TARGET Plus Smartpool El siRNA dirigido a PDK1 y el siRNA no dirigido se adquirieron en Thermo Scientific. se sembraron células 66CL4 (250.000 por plato) en placas de 35 mm. Al día siguiente, las células se transfectaron con los siARN utilizando Dharmafect (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. La transfección se repitió al día siguiente. Al día siguiente, las células se lavaron y se trataron como se indica en DMEM sin carbonatos con un 10 % de FBS. Después de 4 h, se contaron las células utilizando el hemocitómetro y se recogió el medio para medir los niveles de pH y lactato. Se recogieron células para analizar los niveles de PDK1 mediante western blotting.

Ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Las células MCF7 se cultivaron hasta una confluencia del 100 % en placas de 150 mm. Las células se trataron como se indica durante 24 h con metformina (8 mM) o DCA (5 mM). Las células se cosecharon en PBS, se sonicaron y se determinaron los valores relativos de proteínas mediante el ensayo de Bradford. Los lisados se procesaron utilizando el Quantichrom™ TBARS Assay Kit y se leyeron en un lector de placas SpectraMax M5 (λ ex/em = 560 nm/585 nm).

Ensayo SYTOX® green
Las células MCF7 y T47D se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia del 90 %. Las células se trataron como se indica y, a continuación, se añadió la tinción de ácido nucleico SYTOX® Green (10 µM) y se incubaron durante 20 minutos antes de la lectura en un lector de placas de fluorescencia a λ ex/em = 485/535 nm con un corte de 515 nm. A continuación, las células se permeabilizaron con Tritón X-100 (0,4 %) durante 30 minutos y se realizó una segunda lectura para determinar el nivel total de tinción de ADN, un sustituto del número total de células. Los valores del índice de combinación se determinaron utilizando el software CalcuSyn.

Tasa de consumo deoxígeno
La tasa de consumo de oxígeno (TCO) se midió con un analizador Seahorse XF24 siguiendo las instrucciones del fabricante (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, EE.UU.). Las células T47D se sembraron a 40.000 células/pocillo en placas de pocillos XF24. Al día siguiente, se lavaron las células y se equilibraron con un medio sin tampón durante 30 minutos a 37 °C en una incubadorasin CO2 antes de transferirlas al analizador XF24. Se obtuvo una medición inicial de OCR seguida de la adición de DCA a través de puertos de inyección en los pocillos hasta una concentración final de 5 mM. El OCR se midió cada 30 minutos.

Análisis estadístico
La comparación de dos grupos se realizó mediante la prueba t no apareada con corrección de Welch generada en el software Graph Pad Prism (La Jolla, CA). Se consideró que los valores de p inferiores o iguales a 0,05 eran significativos.

Resultados

ElDCA y la metformina inducen sinérgicamente la apoptosis en células de cáncer de mama
Anteriormente hemos demostrado que la metformina induce dos tipos distintos de muerte celular después de 3 días de tratamiento en la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama, mientras que no es citotóxica para las células epiteliales mamarias normales [20]. La inducción de la muerte celular en células de cáncer de mama estaba estrechamente asociada con la alteración de la estructura mitocondrial, lo que sugiere que la metformina, un conocido inhibidor del Complejo I de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, mata las células cancerosas alterando la función mitocondrial. Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que el aumento del transporte mitocondrial de electrones potenciaría la muerte de las células cancerosas inducida por la metformina. Dado que el DCA promueve la oxidación mitocondrial del piruvato, examinamos en primer lugar si el DCA podría potenciar la citotoxicidad inducida por la metformina en líneas celulares de cáncer de mama.

Las células de cáncer de mama MCF7 y T47D se trataron con metformina, DCA o su combinación. La concentración de metformina utilizada fue de 8 mM, lo que representa una dosis fisiológicamente relevante de metformina, como muestra el trabajo de Owen et al. [17]. En cuanto al DCA, pueden alcanzarse concentraciones milimolares bajas en el suero de los pacientes, por lo que el intervalo de 0,5-5 mM es clínicamente relevante [27-29] y se utilizó en estos experimentos. El número de células vivas y muertas se determinó mediante el ensayo de exclusión con azul tripán (Fig. 1a). La muerte celular se midió en células MCF7 (Fig. 1a izquierda) tratadas durante 2 días, y en células T47D (Fig. 1aderecha) tratadas durante 4 días. En ambas líneas celulares, la metformina indujo la muerte celular tal y como se había observado en experimentos anteriores [20]. Sin embargo, la muerte celular se incrementó significativamente por el tratamiento concurrente con DCA y metformina, mientras que el DCA solo tuvo efectos citotóxicos mínimos (Fig. 1a). Cuando las células epiteliales de mama MCF10A no transformadas fueron sometidas a los mismos tratamientos, no se observó muerte celular, como se muestra en la Fig. 1b. Para explorar más a fondo esta observación de muerte celular en células cancerosas, se realizaron titulaciones de dosis y ensayos de citotoxicidad con SYTOX Green (Fig. 1c). Se comprobó la sinergia de la combinación de fármacos mediante el método de Chou [30] utilizando el software CalcuSYN que genera un índice de combinación (IC) de los fármacos; a partir del cual se indica sinergia si el IC es inferior a 1. Las células MCF7 (Fig. 1c izquierda) tuvieron un IC de 0,00047 cuando se trataron durante dos días con la combinación de DCA y metformina. Las células T47D tuvieron un IC de 9,762e-006 tras 4 días de tratamiento (Fig. 1c derecha). Estos valores indican una fuerte citotoxicidad sinérgica con la combinación de DCA y metformina en estas líneas celulares de cáncer de mama.

Figura 1. Se utilizó un ensayo de exclusión celular con azul tripán para determinar el porcentaje de células de cáncer de mama MCF7 y T47D muertas tratadas con (+) o sin (-) 5 mM de DCA y/o 8 mM de metformina. Las células MCF7 se trataron durante 2 días(p < 0,004) mientras que las células T47D se trataron durante 4 días (*p < 0,0035 Met a DCA + Met). b Las células MCF10A se trataron con (+) o sin (-) 5 mM DCA y/o 8 mM metformina. Se tomaron imágenes de contraste de fases tras 8 días de tratamiento. La barra blanca representa 200 μm. c Se utilizó el ensayo de citotoxicidad verde SYTOX® para examinar los efectos de dosis crecientes de DCA y/o metformina, según se indica, en células MCF7 y T47D. d Ensayos de formación de colonias. Imágenes representativas de colonias MCF7 formadas durante el tratamiento con DCA (2,5 mM), metformina (1 mM), o su combinación. e El número medio de colonias en cada grupo de tratamiento se generó a partir del experimento de C (*p = 0,0027 Met a DCA + Met)

A continuación se validaron los efectos citotóxicos observados del DCA (2,5 mM) y la metformina (1 mM) mediante ensayos de formación de colonias. A estas concentraciones, ambos fármacos por sí solos redujeron el tamaño de las colonias pero no redujeron significativamente el número de colonias (Fig. 1d, e). Sin embargo, se observó una disminución significativa en el número de colonias cuando se combinaron los dos fármacos (Fig. 1e). Estas observaciones demuestran que el DCA potencia la citotoxicidad inducida por la metformina en células de cáncer de mama en comparación con cualquiera de los dos fármacos por separado.

El DCApromueve la fosforilación oxidativa a través de la inhibición de PDK1 y atenúa la producción de lactato inducida por metformina
Para confirmar que los efectos observados del DCA se deben a la inhibición de la diana esperada, PDK1, mostramos que el DCA efectivamente disminuye los niveles de PDH fosforilada en comparación con el control en células MCF7 y MCF10A mediante western blot (Fig. 2a). Se espera que la estimulación de la piruvato deshidrogenasa tras el tratamiento con DCA mejore el metabolismo oxidativo del piruvato. Este efecto se estudió utilizando un analizador Seahorse XF24. Se midieron los OCR de las células MCF7 de control frente a las tratadas con DCA (Fig. 2b). Las células tratadas con dicloroacetato presentaron un OCR significativamente mayor en comparación con las células control.

Figura 2. DCA promueve la fosforilación oxidativa a través de la inhibición de PDK1 y atenúa la producción de lactato inducida por metformina. a Niveles de fosfo-PDH y PDH total en el control o en células epiteliales mamarias humanas normales MCF10A o de cáncer de mama MCF7 tratadas con 5 mM de DCA determinados por western blot de lisados de células enteras a las 24 horas. GAPDH se utilizó como control de carga. b Tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células MCF7 tras la administración de DCA medida con el analizador Seahorse XF24 (*p = 0,004). c Las células MCF7 se trataron como se indica antes de medir los niveles de lactato en el medio 6 h después del tratamiento(izquierda, *p = 0,0038, ◊p = 0.0058) o el pH del medio de cultivo de las células MCF7 tras 6 h de tratamiento medido mediante sonda de pH(derecha, *p = 0,0097, ◊p = 0,0038). d Niveles de PDK1 en células de carcinoma mamario de ratón 66CL4 tras transfección estable con siARN de PDK1 o siARN de control sin objetivo detectados mediante western blot. Se utilizó β-actina como control de carga. e Concentraciones de lactato en el medio en cultivos 66CL4 tras la transfección con ARNsi de control o ARNsi de PDK1 y el tratamiento con metformina (Met) o DCA según se indica (*p = 0,03, ◊p = 0,002). f pH del medio de cultivo tras el tratamiento de las células como en F durante 6 h (*p = 0,009, ◊p = 0,0008)

Se espera que la metformina, como inhibidor leve del complejo I y potenciador de la actividad AMPK, estimule las tasas glucolíticas y aumente la producción de lactato [11,14,15,17]. Por el contrario, se espera que el DCA redirija el piruvato al metabolismo mitocondrial a expensas de la producción de lactato. Para examinar esto, se midieron los niveles de pH y lactato en los medios de cultivo de células MCF7 tras el tratamiento con metformina, DCA o ambos. Las células tratadas con metformina produjeron niveles significativamente más altos de lactato en comparación con los controles no tratados. El dicloroacetato solo tuvo efectos pequeños pero disminuyó significativamente la producción de lactato inducida por la metformina. El pH del medio se correspondió con los cambios observados en los niveles de lactato (Fig. 2c). Es decir, la metformina redujo significativamente el pH del medio y este efecto fue eliminado en gran medida por el DCA.

Para corroborar aún más el papel de la PDK en la producción de lactato y la inhibición de la entrada de piruvato en el ciclo TCA, se eliminó la PDK utilizando siRNA en células 66CL4. Esta línea celular procede de un carcinoma mamario de ratón y puede ser útil para trasladar estos experimentos a un entorno preclínico en futuros estudios. Las células se transfectaron con siRNA dirigido a PDK1 (PDK1siRNA) o con un siRNA de control no dirigido (C. siRNA). Los niveles de PDK1 se detectaron mediante western blot, y las células transfectadas con ARNsi PDK1 tenían niveles notablemente inferiores de PDK1 en comparación con las células transfectadas con ARNsi C. (Fig. 2d). La represión de PDK1 mediada por siRNA redujo la producción de lactato y aumentó el pH del medio, en consonancia con las funciones conocidas de PDK1 (Fig. 2e, f). El knockdown de PDK1 redujo eficazmente los cambios inducidos por metformina en el lactato y el pH del medio. El dicloroacetato redujo aún más el lactato y aumentó el pH en las células transfectadas con PDK1 siRNA. La capacidad del DCA para revertir los efectos de la metformina sobre el lactato y el pH se redujo en cierta medida cuando se eliminó la PDK1, lo que sugiere de nuevo que el DCA está mediando sus efectos a través de la PDK1. En resumen, puede concluirse que la pérdida de PDK1 mediante transfección con ARNsi o inhibición con DCA previene la producción de lactato inducida por metformina.

El DCAen combinación con la metformina potencia el daño oxidativo y la subsiguiente muerte celular dependiente de caspasas
La metformina inhibe el complejo I de la cadena de transporte de electrones, impidiendo el flujo de electrones y conduciendo a la producción de superóxido dentro de la matriz mitocondrial. Dado que el DCA promueve la entrada de piruvato en el ciclo TCA, planteamos la hipótesis de que el DCA podría aumentar la producción de ROS como mecanismo potencial de su sinergia citotóxica con la metformina. MitoSOX, un indicador específico de la producción de superóxido mitocondrial, tiñó las células que fueron analizadas por citometría de flujo. Tras 1 h de tratamiento, ni la metformina (línea roja Fig. 3a panel izquierdo) ni el DCA (no mostrado) aumentaron la producción de superóxido mitocondrial. Sin embargo, el tratamiento combinado con DCA y metformina produjo un desplazamiento a la derecha de la intensidad de fluorescencia, lo que indica un aumento de la producción de superóxido. Tras 3 h de tratamiento, las células tratadas con metformina empezaron a producir mayores niveles de superóxido mitocondrial metformina (línea roja Fig. 3a panel derecho) en comparación con las células no tratadas (línea negra). La combinación de DCA y metformina mostró niveles aún mayores de tinción de superóxido. Estos resultados indican que la metformina interfiere con el transporte de electrones en el complejo I, provocando un aumento de la producción de superóxido, y que el DCA potencia el efecto de la metformina.

Figura 3. A Las células MCF7 se trataron como se indica y se tiñeron con MitoSOX, un indicador de la producción de superóxido mitocondrial. Las células se analizaron por citometría de flujo tras 1(izquierda) o 3(derecha) horas de tratamiento. b Análisis Western blot de H2AX fosforilado (p-H2AX), un indicador de daño en el ADN, en lisados de células enteras de las líneas celulares MCF10A, MCF7 y 66CL4 tratadas durante un día según se indica. c Ensayo TBARS que muestra oxidación lipídica en células MCF7 tras un día de tratamiento (*p = .0618). d Las mitocondrias de células MCF7 se analizaron mediante Western blot de proteínas modificadas con 4-hidroxinonenal (4-HNE), un indicador de peroxidación de membrana, tras un día de los tratamientos indicados. La subunidad 8 de la NADH ubiquinona oxidorreductasa del complejo I se detectó como control de carga. Debajo del blot, cuantificación por densitometría de la señal de 4-HNE. Los valores se normalizaron con respecto a la subunidad 8 de la NADH ubiquinona oxidorreductasa del complejo I

La acumulación de superóxido y otras ERO puede dañar componentes celulares como las proteínas, las membranas y el ADN. El daño oxidativo en el ADN puede provocar roturas de la doble cadena y la fosforilación de la histona H2AX (p-H2AX), que es un marcador sustitutivo útil de dicho daño en el ADN [31]. Por lo tanto, para estimar el daño en el ADN asociado a la producción de ROS en respuesta al tratamiento con metformina y DCA, se pueden analizar los niveles de H2AX fosforilado. Las células epiteliales mamarias humanas MCF10A y las líneas celulares de cáncer de mama MCF7 y 66CL4 se analizaron mediante western blotting tras el tratamiento con DCA, metformina o su combinación durante 24 h (Fig. 3b). En las células MCF10A, no se observaron cantidades detectables de p-H2AX con ningún tratamiento. En las células MCF7, p-H2AX estaba presente en las células no tratadas y aumentó considerablemente con la combinación de metformina y DCA, pero no con ninguno de los dos fármacos por separado. En las células 66CL4, sólo se observó p-H2AX en las células co-tratadas con DCA más metformina. Estos datos sugieren que el DCA y la metformina se combinaron para potenciar el daño oxidativo del ADN.

Como segundo nivel de evidencia, medimos la peroxidación lipídica que se produce cuando los radicales libres dañan los lípidos de las membranas celulares. Se utilizaron dos métodos distintos para estimar el grado de oxidación lipídica tras el tratamiento con DCA y metformina. En primer lugar, el ensayo TBARS, que mide los subproductos de la peroxidación lipídica y se utiliza para evaluar el grado de daño oxidativo de las membranas celulares causado por ROS. El TBARS aumentó en las células MCF7 tratadas con metformina o DCA solos, y el mayor aumento se observó cuando se combinaron ambos fármacos (Fig. 3c). El segundo método utilizado para estimar la oxidación lipídica fue un western blot de aductos proteicos de 4-hidroxinonenol (4-HNE) que se derivan de la oxidación de ácidos grasos insaturados en las membranas celulares y forma aductos covalentes con proteínas, proporcionando una indicación de daño oxidativo a las membranas celulares. Los extractos mitocondriales MCF7 de células tratadas con DCA, metformina o ambos durante 24 h se analizaron para determinar los niveles de aducto proteico 4-HNE (Fig. 3d). Sólo se observó un aumento de los niveles de aductos 4-HNE mitocondriales en las células tratadas con la combinación de metformina y DCA. Esto apoya los resultados anteriores de que la combinación de estos fármacos provoca un aumento de la producción de ROS.

Nuestros datos anteriores muestran que las células sensibles a la metformina desarrollan grandes vacuolas que se determinó mediante imágenes de mitocondrias ligadas a GFP y mediante microscopía electrónica que eran mitocondrias estructuralmente alteradas. Estas mitocondrias alteradas parecen estar específicamente relacionadas con una vía de muerte celular dependiente de PARP que se retrasa en el tiempo con respecto a la muerte celular apoptótica [20]. Dado que el DCA sinergiza con la metformina en la muerte celular, se investigaron los efectos del DCA sobre la estructura mitocondrial. Se desarrolló una línea celular MCF7 estable que expresaba una proteína verde fluorescente dirigida a las mitocondrias (pAcGFP1-Mito). Las células se trataron durante un día antes de obtener imágenes por contraste de fase y microscopía confocal (Fig. 4). En las células tratadas sólo con metformina se observaron mitocondrias de gran tamaño, como ya se había visto anteriormente [20]. En marcado contraste, las células tratadas con DCA parecían tener mitocondrias más pequeñas y numerosas. El dicloroacetato también impidió el agrandamiento mitocondrial causado por la metformina. Por contraste de fase, las mitocondrias agrandadas eran evidentes en las células tratadas con metformina, mientras que estaban ausentes en el tratamiento combinado. También se examinó una segunda línea celular sensible a la metformina, la T47D. De nuevo, se observaron mitocondrias agrandadas con el tratamiento con metformina, mientras que éstas estaban ausentes en el tratamiento combinado.

Figura 4. El DCA previene el agrandamiento mitocondrial inducido por la metformina. Las células se trataron como se indica (5 mM de DCA u 8 mM de metformina) durante un día. (Filasuperior) Se fijaron células MCF7 con expresión de pAcGFP1-mito, una proteína verde fluorescente dirigida a mitocondrias, y se observaron mediante microscopía confocal (100×).(Fila central) Imágenes de contraste de fases de células MCF7 vivas tomadas con un aumento de 400× tras 1 día de tratamiento.(Fila inferior) Imágenes de contraste de fases de células T47D vivas tomadas con un aumento de 400× tras 4 días de tratamiento

En nuestro trabajo anterior, descubrimos que el agrandamiento mitocondrial se correlacionaba con la muerte celular dependiente de PARP, que se retrasaba en el tiempo con respecto a la muerte celular apoptótica. Esto dio lugar a una investigación sobre los detalles del mecanismo de muerte celular inducida por DCA combinado con metformina [20], ya que no se observa agrandamiento mitocondrial. Para caracterizar la muerte celular inducida en células tratadas conjuntamente con metformina y DCA, las células MCF7 fueron tratadas con un inhibidor irreversible de caspasas de amplio espectro (Q-Val-Asp-OPh) junto con DCA, metformina o ambos durante un día. Las pruebas de Western blot (Fig. 5a) revelaron un gran aumento de PARP escindida y una disminución de PARP intacta en las células tratadas conjuntamente con DCA y metformina. La adición del inhibidor de caspasas bloqueó por completo la división de PARP. Anteriormente se había observado un efecto similar en células tratadas sólo con metformina durante 2,5 días [20]. Sin embargo, en el punto temporal de un día, la metformina sola induce sólo un ligero aumento de PARP escindido. Por lo tanto, estos datos indican que la apoptosis dependiente de caspasas se acelera con la adición de DCA a la metformina en estas células de cáncer de mama. Para investigar más a fondo si la muerte dependiente de PARP se produce con el tratamiento conjunto de DCA y metformina, también se utilizó un inhibidor de PARP. Se realizó un ensayo SYTOX Green (Fig. 5c) dos días después del tratamiento para cuantificar la muerte celular y revelar si el inhibidor de PARP tenía un efecto aditivo al inhibidor de caspasas. El inhibidor de PARP no tuvo ningún efecto protector por sí solo ni ningún efecto aditivo junto con el inhibidor de caspasas. Un western blot confirmó este hallazgo (Fig. 5b) y reveló que el inhibidor de PARP no impidió la escisión de PARP. Dado que el agrandamiento mitocondrial está asociado a la muerte celular dependiente de PARP en las células tratadas con metformina, la ausencia de agrandamiento mitocondrial cuando se añade DCA sugiere que la apoptosis se está produciendo exclusivamente de forma dependiente de caspasas.

Figura 5. A Las células MCF7 fueron tratadas ± un inhibidor pan-caspasa (Q-Val-Asp-OPh, 10 µM) con metformina (8 mM) y/o DCA (5 mM) durante un día. Los niveles de PARP y PARP escindida se detectaron mediante western blotting y se utilizó β-actina como control de carga. b Las células MCF7 se pretrataron durante un día con o sin un inhibidor de PARP II (5-yodo-6-amino-1,2-benzopirona, 100 µM). El día siguiente se añadió DCA (5 mM), metformina (8 mM) o un inhibidor de la caspasa (10 µM). Las células se cosecharon al cabo de un día más y se realizaron pruebas de Western blot para PARP y PARP escindida. se utilizó β-actina como control de carga. c Las células MCF7 se pretrataron durante un día con o sin el inhibidor II de PARP (100 µM). Al día siguiente se añadieron otros tratamientos indicados. Los ensayos SYTOX Green se realizaron dos días después del tratamiento (*p < 0,013, ◊p = 0,006). No se encontraron diferencias significativas entre las células tratadas con DCA, metformina e inhibidor de PARP y las células tratadas con DCA, metformina, inhibidor de caspasas e inhibidor de PARP

Discusión

La metformina es un fármaco de larga tradición utilizado en el tratamiento de la diabetes de tipo dos. Asimismo, el DCA se ha estudiado en ensayos clínicos para el tratamiento de la acidosis láctica y las deficiencias mitocondriales. Se ha demostrado previamente que la metformina ralentiza la proliferación y promueve la muerte celular de muchas líneas celulares de cáncer a través de la apoptosis [9, 10, 12, 32]. La metformina se concentra en las mitocondrias, donde inhibe el complejo I de la cadena de transporte de electrones, provocando un flujo anómalo de electrones hacia el oxígeno y produciendo superóxido dentro de la matriz mitocondrial [22, Fig. 3]. La producción de especies reactivas de oxígeno es problemática para las células de cáncer de mama, ya que muchas de ellas tienen una menor expresión de superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD), que normalmente elimina el superóxido mitocondrial [33]. Aunque los efectos proapoptóticos e inhibidores del crecimiento de la metformina en el cáncer son dignos de mención, nuestra observación de que la metformina potencia la glucólisis, como demuestra el aumento de la producción de lactato in vitro [21], puede limitar su eficacia como agente único. Dado que los niveles elevados de lactato se han descrito como favorecedores de tumores y se asocian a un mal resultado clínico [26, 34-38], intentamos atenuar la producción de lactato inducida por metformina como medio de mejorar potencialmente la eficacia terapéutica. En este estudio, encontramos que el DCA ayuda a atenuar la producción de lactato inducida por la metformina y que el DCA logra esto a través de la inhibición de PDK1.

Nuestros datos demuestran que el DCA y la metformina inducen sinérgicamente la apoptosis a un ritmo mayor que el tratamiento con metformina sola. Nuestros datos también demuestran que el DCA desvía el piruvato hacia su uso en la fosforilación oxidativa, lo que conduce a la acumulación de ROS en el contexto de la inhibición del complejo I por la metformina. Concluimos que este aumento en la producción de ROS conduce a tasas más rápidas de apoptosis.

En nuestro trabajo anterior, demostramos que la metformina inducía no sólo la muerte celular apoptótica dependiente de la caspasa, sino también una muerte celular dependiente de PARP que se producía más tarde y que se puso de manifiesto cuando se utilizó un inhibidor pan-caspasa [20]. Esta forma de muerte celular estaba asociada a cambios morfológicos en las mitocondrias. En este estudio, el DCA impidió los cambios morfológicos mitocondriales inducidos de otro modo por la metformina, mientras que el co-tratamiento también condujo a una tasa más rápida de muerte celular. Además, la inhibición pan-caspasa previno casi por completo la muerte celular y eliminó la escisión PARP asociada al co-tratamiento con metformina y DCA. En conjunto, esto indica que el mecanismo de muerte celular impulsado por el tratamiento concurrente es la apoptosis dependiente de caspasas, y la apoptosis se acelera en comparación con la metformina sola. Es posible que este proceso apoptótico sea demasiado catastrófico y no requiera o no dé tiempo al agrandamiento mitocondrial asociado a la muerte celular dependiente de PARP de la metformina sola.

Durante la preparación de este manuscrito, se publicó un estudio de Choi y Lim [39] que exploraba el tratamiento conjunto de DCA y metformina en células cancerosas. Nuestros resultados confirman y amplían significativamente los hallazgos de este estudio. Mientras que el estudio de Choi y Lim se centró casi exclusivamente en células HeLa, nuestro estudio demuestra la eficacia de la combinación de DCA y metformina en múltiples líneas celulares de cáncer de mama. Es importante destacar que también demostramos que esta combinación de fármacos no mata a las células epiteliales de mama no transformadas, MCF10A, en las mismas condiciones en las que los fármacos matan a las células cancerosas. Hemos realizado cuidadosas titulaciones que demuestran un sinergismo muy fuerte de los fármacos en la inducción de la muerte celular en células de cáncer de mama. Estos resultados indican que el DCA será eficaz a concentraciones que pueden alcanzarse terapéuticamente en humanos [27, 29], y a niveles mucho más bajos que los utilizados en los experimentos del estudio de Choi y Lim (10-20 mM) [39]. Lo ideal sería que la dosis máxima de DCA utilizada para tratar células cancerosas fuera lo suficientemente baja como para evitar efectos adversos como la neuropatía. En un estudio de Michelakis et al., los niveles séricos de DCA alcanzados fueron de 0,5 mM en pacientes con glioblastoma que tomaron 6,25 mg/kg por vía oral dos veces al día [28]. Las dosis más altas, como 25 mg/kg, se asocian a neuropatía relacionada dependiente de la dosis. En consecuencia, es probable que las concentraciones clínicamente relevantes se sitúen en el intervalo de 0,5-5 mM.

Tanto los resultados aquí presentados como los de Choi y Lim [39] mostraron que la muerte celular causada por la combinación de DCA y metformina está asociada al estrés oxidativo. Demostramos además que esto está asociado con la producción de superóxido inducida por metformina por las mitocondrias. El dicloroacetato elevó aún más la producción de superóxido mitocondrial en presencia de metformina, provocando daños oxidativos en las mitocondrias, los lípidos celulares y el ADN. Combinaciones novedosas como la metformina y el DCA resultan prometedoras para ampliar las terapias contra el cáncer de mama.

Agradecimientos

Este artículo ha sido financiado con subvenciones de Susan G. Komen for the Cure (KG100497) y del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (1R01CA180033). Los núcleos de citometría de flujo e imágenes recibieron el apoyo de las subvenciones COBRE P20GM103548 y P20GM103620 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Normas éticas

Los autores declaran que los experimentos cumplen la legislación vigente del país en el que se realizaron.

REFERENCIAS


1 Warburg O (1956) Sobre el origen de las células cancerosas. Science 123(80):309-314. doi:10.1016/S0306-9877(96)90136-X
2 DeBerardinis RJ, Lum JJ, Hatzivassiliou G, Thompson CB (2008) The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metab 7:11-20. doi:10.1016/j.cmet.2007.10.002
3 Zamzami N, Kroemer G (2001) The mitochondrion in apoptosis : how Pandora’ s box opens. Nat Rev Mol Cell Biol 2:67-71. doi:10.1038/35048073
4 Gottfried E, Kunz-Schughart LA, Ebner S et al (2006) Tumor-derived lactic acid modulates dendritic cell activation and antigen expression. Blood 107:2013-2021. doi:10.1182/blood-2005-05-1795
5 Fischer K, Hoffmann P, Voelkl S et al (2007) Inhibitory effect of tumor cell-derived lactic acid on human T cells. Blood 109:3812-3819. doi:10.1182/blood-2006-07-035972
6 Jiralerspong S, Palla SL, Giordano SH et al (2009) Metformin and pathologic complete responses to neoadjuvant chemotherapy in diabetic patients with breast cancer. J Clin Oncol 27:3297-3302. doi:10.1200/JCO.2009.19.6410
7 Evans JMM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM et al (2005) Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients. BMJ 330:1303-1304. doi:10.1136/bmj.38393.572188.EB
8 Libby G, Donnelly LA, Donnan PT et al (2009) New users of Metformin are at low risk of incident cancer. Diabetes Care 32:1620-1625. doi:10.2337/dc08-2175
9 Zakikhani M, Dowling R, Fantus IG et al (2006) Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells. Cancer Res 66:10269-10273. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1500
10 Isakovic A, Harhaji L, Stevanovic D et al (2007) Dual antiglioma action of metformin: cell cycle arrest and mitochondria-dependent apoptosis. Cell Mol Life Sci 64:1290-1302. doi:10.1007/s00018-007-7080-4
11 Hadad SM, Appleyard V, Thompson AM (2008) Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERα negative MDA-MB-435 breast cancer model. Breast Cancer Res Treat 114:391. doi:10.1007/s10549-008-0016-3
12 Buzzai M, Jones RG, Amaravadi RK et al (2007) Systemic treatment with the antidiabetic drug metformin selectively impairs p53-deficient tumor cell growth. Cancer Res 67:6745-6752. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-4447
13 Sarbassov DD, Ali SM, Sabatini DM (2005) Growing roles for the mTOR pathway. Curr Opin Cell Biol 17:596-603. doi:10.1016/j.ceb.2005.09.009
14 Zhuang Y, Miskimins WK (2008) Cell cycle arrest in Metformin treated breast cancer cells involves activation of AMPK, downregulation of cyclin D1, and requires p27Kip1 or p21Cip1. J Mol Signal 3:1-11. doi:10.1186/1750-2187-3-18
15 Hinke SA, Martens GA, Cai Y et al (2007) Methyl succinate antagonises biguanide-induced AMPK-activation and death of pancreatic beta-cells through restoration of mitochondrial electron transfer. Br J Pharmacol 150:1031-1043. doi:10.1038/sj.bjp.0707189
16 Zou M-H, Kirkpatrick SS, Davis BJ et al (2004) Activation of the AMP-activated protein kinase by the anti-diabetic drug metformin in vivo. Role of mitochondrial reactive nitrogen species. J Biol Chem 279:43940-43951. doi:10.1074/jbc.M404421200
17 Owen MR, Doran E, Halestrap AP (2000) Evidence that metformin exerts its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain. Biochem J 614:607-614. doi:10.1042/0264-6021:3480607
18 Carvalho C, Correia S, Santos MS et al (2008) Metformin promotes isolated rat liver mitochondria impairment. Mol Cell Biochem 308:75-83. doi:10.1007/s11010-007-9614-3
19d Kefas BA, Cai Y, Kerckhofs K et al (2004) Metformin-induced stimulation of AMP-activated protein kinase in beta-cells impairs their glucose responsiveness and can lead to apoptosis. Biochem Pharmacol 68:409-416. doi:10.1016/j.bcp.2004.04.003
20 Zhuang Y, Miskimins WK (2012) Metformin induces both caspase-dependent and poly(ADP-ribose) polymerase-dependent cell death in breast cancer cells. Mol Cancer Res 9:603-615. doi:10.1158/1541-7786.MCR-10-0343.Metformin
21 Bailey CJ, Wilcock C, Day C (1992) Effect of metformin on glucose metabolism in the splanchnic bed. Br J Pharmacol 105:1009-1013
22StacpoolePW, Lorenz AC, Thomas RG, Harman EM (1988) Dicloroacetato en el tratamiento de la acidosis láctica. Ann Intern Med 108:58-63. doi:10.1056/NEJM198308183090702
23 Whitehouse BSUE, Cooper RH, Randle PJ (1974) Mechanism of activation of pyruvate dehydrogenase by dichloroacetate and other halogenated carboxylic acids. Biochem J 141:761-774. doi:10.1056/NEJM198308183090702
24 Hussien R, Brooks GA (2011) Mitochondrial and plasma membrane lactate transporter and lactate dehydrogenase isoform expression in breast cancer cell lines. Physiol Genomics 43:255-264. doi:10.1152/physiolgenomics.00177.2010
25 Kim J, Tchernyshyov I, Semenza GL, Dang CV (2006) HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab 3:177-185. doi:10.1016/j.cmet.2006.02.002
26 Wigfield SM, Winter SC, Giatromanolaki A et al (2008) PDK-1 regula la producción de lactato en hipoxia y se asocia con un mal pronóstico en el cáncer escamoso de cabeza y cuello. Br J Cancer 98:1975-1984. doi:10.1038/sj.bjc.6604356
27 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T (2008) Role of dichloroacetate in the treatment of genetic mitochondrial diseases. Adv Drug Deliv Rev 60:1478-1487. doi:10.1016/j.addr.2008.02.014
28 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P et al (2010) Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med 2:31ra34. doi:10.1126/scitranslmed.3000677
29 Mori M, Yamagata T, Goto T et al (2004) Dichloroacetate treatment for mitochondrial cytopathy: long-term effects in MELAS. Brain Develop 26:453-458. doi:10.1016/j.braindev.2003.12.009
30 Chou T (2010) drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay Method drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay Method. Cancer Res 70:440-446. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1947
31 Mah L, Karagiannis TC (2010) γH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia 24:679-686. doi:10.1038/leu.2010.6
32 Alimova IN, Liu B, Fan Z et al (2009) Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro. Cell Cycle 8:909-915. doi:7933 [pii]
33 Soini Y, Vakkala M, Kahlos K et al (2001) MnSOD expression is less frequent in tumour cells of invasive breast carcinomas than in situ carcinomas or non-neoplastic breast epithelial cells. J Pathol 195:156-162. doi:10.1002/path.946
34 Walenta S, Wetterling M, Lehrke M et al (2000) High lactate levels predict likelihood of metastases, tumor recurrence, and restricted patient survival in human cervical cancers los niveles elevados de lactato predicen la probabilidad de metástasis, la recurrencia del tumor y la supervivencia restringida del paciente en el cáncer de cuello uterino humano. Cancer Res 60:916-921
35 Leek R, Harris AL (2009) Lactate dehydrogenase 5 expression in squamous cell head and neck cancer relates to prognosis following radical or postoperative radiotherapy. Oncology 77:285-292. doi:10.1159/000259260
36 Isidoro A, Casado E, Redondo A et al (2005) Breast carcinomas fulfill the Warburg hypothesis and provide metabolic markers of cancer prognosis. Carcinogenesis 26:2095-2104. doi:10.1093/carcin/bgi188
37 Isidoro A, Martínez M, Fernández PL et al (2004) Alteration of the bioenergetic phenotype of mitochondria is a hallmark of breast, gastric, lung and oesophageal cancer. Biochem J 378:17-20. doi:10.1042/BJ20031541
38 Walenta S, Schroeder T (2004) Lactate in solid malignant tumors: potential basis of a metabolic classification in clinical oncology. Curr Med Chem 11:2195-2204
39 Choi YW, Lim IK (2014) Sensitization of metformin-cytotoxicity by dichloroacetate via reprogramming glucose metabolism in cancer cells. Cancer Lett 346:300-308. doi:10.1016/j.canlet.2014.01.015

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