📖 28 mins.

Krishan Kumar1, Simon Wigfield2, Harriet E. Gee2,5, Cecilia M. Devlin1, Dean Singleton2, Ji-Liang Li2, Francesca Buffa2, Melanie Huffman1, Anthony L. Sinn3, Jayne Silver3, Helen Turley2, Russell Leek2, Adrian L. Harris2 & Mircea Ivan4

1 Department of Medicine, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA
2 Department of Oncology, Weatherall Institute of Molecular
Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford OX3 9DS, UK
e-mail: [email protected]
3 In Vivo Therapeutics Core, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA
4 Department of Medicine, Immunology and Microbiology, Indiana University, 980W. Walnut Street, Room C225, Indianapolis, IN 46202, USA
e-mail: [email protected]
5 Department of Radiation Oncology, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital, Camperdown, New South Wales 2050, Australia


Recibido: 7 de noviembre de 2012
Revisado: 20 de diciembre de 2012
Aceptado: 2 de enero de 2013
Publicado en línea: 30 de enero de 2013

Resumen

La inhibición del factor de crecimiento endotelial vascular aumenta las tasas de respuesta a la quimioterapia y la supervivencia libre de progresión en el glioblastoma. Sin embargo, invariablemente se producen resistencias, lo que plantea la necesidad urgente de identificar agentes sinérgicos. Una posible estrategia consiste en comprender la adaptación del tumor a los cambios microambientales inducidos por los fármacos antiangiogénicos y ensayar agentes que exploten este proceso. Utilizamos un modelo de xenoinjerto in vivo derivado de glioblastoma de escape tumoral en presencia de tratamiento continuo con bevacizumab. Se implantaron células U87-MG o U118-MG por vía subcutánea en ratones BALB/c SCID o en ratones atímicos desnudos. Se administró bevacizumab por inyección intraperitoneal cada 3 días (2,5 mg/kg/dosis) y/o dicloroacetato (DCA) por sonda oral dos veces al día (50 mg/kg/dosis) cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 0,3 cm3 y se continuó hasta que los tumores alcanzaron aproximadamente 1,5-2,0 cm3. El análisis de microarrays de tumores U87 resistentes reveló cambios coordinados a nivel de genes metabólicos, en particular, una brecha cada vez mayor entre la glucólisis y la respiración mitocondrial. Se observó una diferencia altamente significativa entre los tumores U87-MG implantados en ratones atímicos desnudos 1 semana después del tratamiento farmacológico. A las 2 semanas de tratamiento, bevacizumab y DCA juntos bloquearon drásticamente el crecimiento tumoral en comparación con cualquiera de los dos fármacos por separado. Se observaron resultados similares en ratones desnudos atímicos implantados con células U118-MG. Demostramos por primera vez que la inversión del cambio metabólico inducido por bevacizumab mediante DCA es perjudicial para el crecimiento neoplásico in vivo. Dado que el DCA se considera un prometedor agente dirigido al metabolismo tumoral, nuestros datos establecen la oportuna prueba de concepto de que su combinación con la terapia antiangiogénica representa una potente estrategia antineoplásica.


Palabras clave: Dicloroacetato; Hipoxia; Bevacizumab; Fosforilación oxidativa; Glucólisis

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013


INTRODUCCIÓN

Las terapias moleculares dirigidas a la neoangiogénesis y, en particular, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) han demostrado actividad antitumoral en diversos contextos clínicos [1]. El glioblastoma (GBM) es un tumor cerebral primario altamente vascularizado y letal, con una supervivencia media de aproximadamente 12-14 meses, y por lo tanto, representa un objetivo importante para los fármacos antiangiogénicos [2]. El bevacizumab, un anticuerpo humanizado contra el VEGF, está actualmente aprobado por la Food and Drug Administration como tratamiento de segunda línea del GBM, y los ensayos clínicos en curso pretenden evaluar su potencial como agente de primera línea [3]. Sin embargo, dado que el bloqueo del VEGF prolonga la supervivencia libre de progresión pero no la supervivencia global, es imperativo identificar estrategias que aumenten su impacto y retrasen la aparición de resistencias [4]. Por ejemplo, se han logrado avances limitados en combinación con irinotecán; sin embargo, no se ha podido demostrar ningún impacto en la supervivencia global [5]. Una limitación importante en el desarrollo de combinaciones sinérgicas centradas en agentes anti-VEGF es la falta de datos clínicos sólidos, ya que los tumores que se están volviendo resistentes a estos agentes no están disponibles de forma rutinaria para análisis posteriores. Además, todavía no se conocen suficientemente las consecuencias celulares y moleculares del tratamiento con anti-VEGF. Disponer de información detallada a nivel molecular sobre cómo afecta bevacizumab al GBM durante un periodo de tiempo prolongado no sólo es esencial para nuestra comprensión de las respuestas adaptativas del tumor y el posterior fracaso del tratamiento, sino también para el desarrollo de terapias combinadas racionales.

Por lo tanto, hemos intentado determinar la respuesta tumoral a bevacizumab a nivel fenotípico y molecular en modelos de xenoinjerto derivados de líneas celulares de GBM. Extendiendo los modelos hasta el fracaso terapéutico final a pesar del tratamiento continuado con bevacizumab, pretendíamos captar los programas adaptativos tumorales y el correspondiente recableado de las vías moleculares mediante el análisis de microarrays. Nuestra hipótesis era que los mecanismos centrales de resistencia se reflejarían en la alteración de estas vías, y que las moléculas pequeñas que interfieren con estos procesos representan candidatos realistas para aumentar la potencia de bevacizumab. El análisis bioinformático reveló que los tumores resistentes presentan una fuerte firma del factor inducible por hipoxia (HIF) y un cambio de la respiración mitocondrial a la glucólisis. La reactivación de la respiración mitocondrial con el fármaco huérfano dicloroacetato (DCA) mejora el efecto transitorio de bevacizumab, en contraste con la falta de efecto aditivo de la 2-deoxiglucosa (2-DG), que se dirige principalmente a la glucólisis. Nuestros datos proporcionan información sobre la plasticidad del metabolismo tumoral en respuesta a los desafíos terapéuticos y sugieren nuevas oportunidades para las intervenciones sinérgicas.

Materiales y métodos

Tumorigenicidad in vivo

Todos los protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Indiana y los protocolos y reglamentos aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido. se implantaron107 células U87-MG (compradas a ATCC) en ratones hembra BALB/c SCID (Harlan Sprague Dawley, Inc.) de 6 a 8 semanas de edad por vía subcutánea, como suspensiones celulares de 100-μL con un volumen igual de Matrigel (BD Bioscience). Los tumores se midieron dos veces por semana con un calibrador, y los volúmenes se calcularon mediante la fórmula longitud × anchura × altura × 0,52. Una vez que el volumen tumoral alcanzó los 150 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos con tamaños de cohorte iniciales de cinco ratones por grupo y se inició el tratamiento con bevacizumab (Roche) inyectado por vía intraperitoneal cada 3 días a una dosis de 10 mg/kg o control salino. El tratamiento se continuó hasta que los tumores crecieron hasta un volumen aproximado de 600-800 mm3, momento en el que los ratones fueron eutanasiados y los tumores se extirparon quirúrgicamente con rapidez. Para los modelos de xenoinjerto en ratones atímicos desnudos, se implantaron células U87-MG como se ha indicado anteriormente en ratones hembra de 4 a 8 semanas de edad (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EE.UU.), o bien se injertaron 7 ×106 células U118-MG (adquiridas a ATCC). Los fragmentos tumorales se procesaron mediante fijación en formol antes de su inclusión en parafina para IHC o se congelaron para la posterior extracción de ARN, tal como se ha descrito previamente [6].

Protocolos de administración de fármacos para estudios de combinación

El DCA se administró por sonda oral dos veces al día a 50 mg/kg/dosis en agua estéril (el vehículo de control fue agua estéril). Esta dosis se basó en informes publicados y en un escalado alométrico. Así, 100 mg/kg por ratón y día se traducen en aproximadamente 13 mg/kg en humanos (http://home.fuse.net/clymer/minor/allometry.html), lo que concuerda con las dosis utilizadas en entornos clínicos. El bevacizumab se administró por vía intraperitoneal a una concentración de 2,5 mg/kg/dosis (U87-MG) o 2,0 mg/kg/dosis (U118-MG). El tratamiento se continuó hasta que los tumores alcanzaron un diámetro aproximado de 20 mm, momento en el que los ratones fueron eutanasiados y los tumores rápidamente extirpados. se administró diariamente 2-Deoxiglucosa (Sigma, 500 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.

Los detalles del cultivo celular, el análisis de matrices de genes, el análisis histológico y la inmunohistoquímica, los esferoides tratados con DCA y el aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR cuantitativa (QPCR) se describen en el Material electrónico suplementario.

Análisis estadístico

La significación estadística de las diferencias observadas entre los distintos grupos experimentales se calculó mediante una prueba t de dos colas. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Establecimiento del modelo tumoral de resistencia a bevacizumab

Se inyectaron por vía subcutánea suspensiones de células U87-MG en el flanco derecho de ratones SCID. El tratamiento con bevacizumab (inyección intraperitoneal de 10 mg/kg cada 3 días) se inició cuando los tumores alcanzaron una media de 100-200 mm3. La divergencia entre las cohortes tratadas y no tratadas fue evidente 1 semana después, y aproximadamente en el día 40 se alcanzó la resistencia completa al bevacizumab (Fig. 1). Los tumores se extirparon por separado para los controles y las cohortes tratadas en puntos temporales en los que sus tasas de crecimiento y tamaños medios eran similares. Se observó una respuesta análoga (es decir, respuesta inicial seguida de resistencia) utilizando una dosis submáxima de bevacizumab (2,5 mg/kg; cada 3 días mediante inyección intraperitoneal) en ratones atímicos nude. Esto se describirá en detalle como parte de los estudios de combinación más adelante. Mediante inmunohistoquímica para marcadores vasculares estándar (CD31 y CD34) seguida de recuento de la densidad de microvasos, confirmamos que los tumores resistentes presentan una vasculatura significativamente más dispersa (Fig. 1). Por lo tanto, la resistencia terapéutica no parece estar relacionada principalmente con una vascularización renovada debida a un cambio a factores de crecimiento angiogénicos alternativos, como se ha demostrado en otros modelos de resistencia a bevacizumab [7]. La expresión de HIF-1α, así como de la anhidrasa carbónica IX (CA9), una diana robusta de HIF y un marcador bien establecido de hipoxia, aumentó drásticamente en los tumores resistentes, lo que indica que su crecimiento continuó en un entorno significativamente más pobre en oxígeno, en consonancia con los datos comunicados por Rapisarda et al. [8].

Figura 1: Análisis de tumores U87-MG tratados con bevacizumab.(A) Crecimiento tumoral de U87-MG in vivo, tratado con bevacizumab (BVC) o control con vehículo (CTRL), desde el día 12 hasta el final del experimento. media ± SE, N= 5. Doble asterisco (**) P< 0,01.(B) Las tinciones inmunohistoquímicas de las secciones tumorales de los tumores tratados con CTRL o BVC muestran un aumento de la hipoxia mediante HIF-1 y CA9, y un marcador de la morfología de los vasos mediante CD34. Las imágenes principales corresponden a aumentos de ×10 y las recuadradas a aumentos de ×20. Las secciones se tiñeron y se puntuaron para(C) Q vascular (CD31),(D) niveles de CA9 y(E) necrosis. Media ± SE. Asterisco simple (*) P< 0,05; asterisco triple (***) P< 0,001

Caracterización molecular del modelo de resistencia a bevacizumab
Con el fin de obtener un conocimiento exhaustivo de los procesos moleculares asociados y potencialmente críticos para el proceso de resistencia, el ARN total de tumores tratados y no tratados se sometió a análisis de expresión utilizando matrices HGU133plus2 de Affymetrix. El conjunto completo de datos del análisis de expresión de las matrices de Affymetrix está disponible en http://www.ncbi.nlm.gog/geo/query/acc.cgi?acc=GSE37956. Un tema central en los tumores resistentes a bevacizumab fue la activación coordinada del programa de transcripción impulsado por HIF (Fig. 2). Una gran proporción de dianas de HIF mostraron una regulación al alza coordinada, en la mayoría de los casos con más de una sonda del array. En particular, las dianas glucolíticas de HIF, como las aldolasas A y C, la triosa-fosfato isomerasa 1 y la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa 3, así como los transportadores inducibles de glucosa GLUT1/SLC2A1 y GLUT3/SLC2A3, se indujeron de forma robusta, lo que apunta a una mayor dependencia de la utilización glucolítica de la glucosa. Por el contrario, en los tumores resistentes a bevacizumab se observó una represión significativa a nivel de los genes de la piruvato deshidrogenasa (PDH) alfa 1 y beta, que gobiernan la entrada de piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) [9]. La actividad de la PDH es inhibida por la fosforilación de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK). Las isoformas PDK1 y PDK3, que están bien documentadas como dianas de HIF [10-12], estaban fuertemente reguladas al alza en los tumores resistentes a bevacizumab, lo que apoya aún más un cambio bioquímico que se aleja de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) (Fig. 2). Podría decirse que el cambio de expresión génica más llamativo en los tumores resistentes a bevacizumab fue la regulación a la baja global de los genes del metabolismo mitocondrial, en particular, los miembros de los cinco complejos mitocondriales OXPHOS (Fig. 2). Por último, varios componentes del ciclo TCA, incluyendo la fumarato hidratasa (FH) y la succinato deshidrogenasa (SDH) fueron regulados a la baja (Fig. 2), lo que puede contribuir al crecimiento tumoral, ya que también funcionan como supresores tumorales [13].

Figura 2: Cambios en la expresión génica en los grupos de control frente a los tratados con bevacizumab. El eje X representa los tumores de control y tratados con bevacizumab. Los datos del array se preprocesaron utilizando GCRMA, se normalizaron utilizando normalización cuantílica y log base 2. La expresión se muestra estandarizada por gen. La expresión se muestra normalizada por gen( valoresZ; clave de color en la parte superior). Eje Y: símbolos de genes mostrados a la derecha. Las bandas azules laterales indican los complejos génicos mitocondriales (de azul claro= I a azul oscuro= V). La banda verde indica los genes del ciclo de Krebs. La banda roja indica las dianas de HIF

El análisis de las vías KEGG confirmó que el metabolismo energético representaba uno de los cambios dominantes asociados a los tumores resistentes al bevacizumab. Así, los genes glucolíticos fueron los más abundantes entre los genes regulados al alza, junto con genes pertenecientes al metabolismo de la fructosa y la manosa, la vía de las pentosas fosfato, el metabolismo de los aminoazúcares y los nucleótidos azúcares, y el metabolismo del inositol fosfato (Tabla Suplementaria S1A). Los valores p hipergeométricos e hipergeométricos corregidos fueron inferiores a 0,01 para todas estas vías. Por el contrario, entre los genes regulados a la baja, la OXPHOS fue la vía más reprimida, con valores de p inferiores a 1,00E-28, y el metabolismo del piruvato y el ciclo del TCA también mostraron una represión muy significativa (Tabla suplementaria S1B). Otra característica observada en los tumores resistentes a bevacizumab fue un aumento del estrés del retículo endoplásmico y de la respuesta a proteínas no plegadas. En particular, los mediadores clave de estas respuestas ATF4, 5, 6 y DDIT3/CHOP estaban fuertemente sobreexpresados (Tabla Suplementaria S2), en consonancia con nuestras observaciones previas de que la hipoxia más severa que se desarrolla durante el curso de la terapia antiangiogénica activa vías no-HIF [14].

Efectos in vitro de la hipoxia crónica en la expresión génica de la OXPHOS mitocondrial

Para investigar si la hipoxia representa la causa principal de la regulación a la baja de los genes de la respiración mitocondrial y del ciclo de Krebs, realizamos un estudio exhaustivo in vitro de los efectos del oxígeno bajo en las células U87. Curiosamente, varios genes OXPHOS y componentes del ciclo de Krebs que se encontraron regulados a la baja en los arrays también respondieron con regulación a la baja en hipoxia, incluyendo ATP5A1, ATP5G3, NDUFA9, FH y MDH1 (Fig. 3). MRPL36 y MRPS11, dos genes considerados críticos en el ensamblaje de los complejos OXPHOS [15, 16], también mostraron una regulación a la baja en hipoxia, similar al efecto de bevacizumab (Fig. 3). Sin embargo, la mayoría de los genes regulados a la baja en las matrices no mostraron regulación a la baja durante la exposición hipóxica, lo que sugiere que otros factores pueden ser los principales responsables [17]. Un nuevo examen de las matrices reveló que varios factores de transcripción que regulan la expresión génica mitocondrial (incluida la OXPHOS) estaban regulados a la baja: NRF1, TFAM y TFB2M [18-20] (Tabla Suplementaria S3).

Figura 3: Regulación a la baja de genes metabólicos mitocondriales en tumores resistentes a bevacizumab. Se realizó un análisis cuantitativo de PCR para investigar los efectos del tratamiento con BVC o la hipoxia en las células U87. Para las comparaciones entre normoxia e hipoxia, las células se incubaron al 1 % de oxígeno durante 72 h. Se analizaron los siguientes genes mitocondriales:(A) genes ribosómicos mitocondriales,(B) enzimas del ciclo de Krebs y(C) componentes de los complejos I y V de transporte de electrones. Los niveles génicos se expresan como cambios de pliegues por comparación in vivo con controles PBS e in vitro con controles normóxicos. Media ± SE. Asterisco simple (*) P< 0,05; asterisco doble (**) P< 0,01; asterisco triple (***) P< 0,001

Explotación de la brecha glucolítica aumentada: sinergismo in vivo entre bevacizumab y DCA
Basándonos en la marcada firma de señalización HIF aumentada y OXPHOS mitocondrial disminuida, planteamos la hipótesis de que los tumores resistentes a bevacizumab serían particularmente sensibles a los reactivadores mitocondriales. La principal molécula pequeña candidata de esta clase es el DCA, que inhibe la actividad de la PDK, aumentando así el flujo de piruvato a la mitocondria y promoviendo la oxidación de glucosa frente a la glucólisis [21, 22]. Teniendo en cuenta los efectos secundarios bien conocidos de la terapia antiangiogénica, así como del DCA, para la evaluación de la combinación de fármacos, elegimos una dosis submáxima del agente antiangiogénico (2,5 mg/kg; cada 3 días mediante inyección intraperitoneal), una estrategia que se emplea ampliamente in vivo [23]. También se prevé que este enfoque aumente nuestra capacidad para detectar el sinergismo entre los dos fármacos, tanto desde el punto de vista de la respuesta tumoral como de los efectos sobre la señalización de HIF. De hecho, el tratamiento con bevacizumab y DCA bloqueó drásticamente el crecimiento tumoral en comparación con cada fármaco por separado (Fig. 4A y Fig. suplementaria S1). Para evaluar la generalidad de la respuesta, investigamos un tipo celular adicional de GBM, U118. La respuesta en injertos basados en U118 fue también mucho más robusta con la combinación, en comparación con los fármacos por separado (Fig. 4B y Fig. Suplementaria S1).

Figura 4: El DCA amplifica los efectos del BVC sobre el crecimiento tumoral in vivo.(A) Crecimiento tumoral de U87-MG in vivo, tratado con CTRL, BVC, DCA, o BVC/DCA, desde el día 7 hasta el final del experimento. Media ± SE, N= 4-6. Un asterisco (*) P< 0,05;(B) crecimiento tumoral de U118 in vivo, tratado con CTRL, BVC, DCA o BVC/DCA. Los tumores U118 eran de crecimiento lento, por lo que el día 0 es la hora de inicio del tratamiento. Media ± SE, N= 4-8. Asterisco simple (*) P< 0,05; asterisco doble (**) P< 0,01;(las estrellas negras son la comparación con CTRL, las estrellas grises con BVC solo);(C) crecimiento de esferoides U87-MG tratados con el vehículo de control (CTRL) o con 10 mM de DCA. Se dejó que los esferoides crecieran hasta 0,2 mm3 antes de tratarlos con DCA cada 3 días. NB: las barras de error son pequeñas y están dentro de los símbolos.(D) Las fotografías (con un aumento de ×5) muestran imágenes representativas de los esferoides tratados con CTRL y DCA

La eficacia de los inhibidores glucolíticos para superar la resistencia al bevacizumab se había propuesto anteriormente [24] sin confirmación experimental. El DCA y la 2-DG se analizaron conjuntamente como parte de este concepto. Sin embargo, cuando se probó 2-DG en paralelo a DCA, no se observó ningún efecto aditivo a bevacizumab. Esto fue así a pesar del efecto transitorio de la 2-DG como agente único, administrada a la concentración descrita en la bibliografía (Fig. suplementaria S2). Así pues, la reactivación mitocondrial y la inhibición directa de la glucólisis tienen efectos diferentes en combinación con bevacizumab.

Efectos in vitro del DCA

Los modelos esferoides proporcionan un sistema de complejidad intermedia entre los sistemas de cultivo bidimensionales estándar y los tumores in vivo debido a los gradientes de oxígeno y nutrientes. A diferencia de los sistemas monocapa, los esferoides en expansión imitan la mayor avascularidad de las estructuras in vivo que crecen en presencia de bevacizumab. Se generaron esferoides U87, como se describe [25], y se cultivaron durante 7 días hasta que alcanzaron 0,2 mm3. Los esferoides de este tamaño son lo suficientemente grandes como para permitir la difusión de un fármaco a través del esferoide, pero también empiezan a formar una pequeña zona central de hipoxia y muestran gradientes de nutrientes, pH y O2. A los 3 días de tratamiento se observó una fuerte divergencia en la cinética de crecimiento entre los grupos tratados con DCA y los no tratados. Este efecto fue persistente, y a partir de los 6 días, el DCA comprometió significativamente la expansión de los esferoides (Fig. 4C, D ).

Efecto de la combinación de bevacizumab y DCA sobre las dianas de HIF y los marcadores histológicos de crecimiento tumoral

Para determinar si el efecto de la combinación sobre el crecimiento tumoral estaba determinado principalmente por un aumento de la muerte celular o por una disminución de la proliferación, realizamos análisis histológicos de estos tumores utilizando marcadores bien establecidos. La necrosis fue mayor en los tumores tratados que en los no tratados, pero no se observaron diferencias significativas entre los fármacos solos o en combinación (Fig. 5). La tasa de proliferación, evaluada mediante la cuantificación de la tinción de Ki-67 (MIB-1), fue significativamente menor en el grupo de combinación en comparación con los tumores no tratados y los tratados sólo con bevacizumab, lo que sugiere que el efecto de la combinación fue predominantemente citostático (Fig. 5). A continuación, evaluamos los efectos de la combinación de fármacos sobre la señalización de HIF, utilizando una combinación de inmunohistoquímica/ RT-PCR cuantitativa (Figs. 5, 6). Sorprendentemente, aunque se sabe que aumenta el consumo de oxígeno en varios sistemas experimentales, el DCA por sí solo no fue suficiente para aumentar de forma mensurable la expresión de las dianas de HIF in vivo. Sin embargo, en combinación con bevacizumab, la expresión de CA9 aumentó drásticamente en las células tumorales U87 viables. En U118, en cambio, el bevacizumab submáximo provocó por sí solo un aumento espectacular de todas las dianas de HIF analizadas, sin que se produjera ningún otro aumento mensurable en los tumores tratados con la combinación (Fig. 6 y Fig. suplementaria S3). Sin embargo, la principal advertencia es que los tumores que sobrevivieron en presencia de la combinación eran dramáticamente más pequeños y prácticamente estacionarios, factores que deberían mitigar el alcance de la hipoxia.

Figura 5: Efecto de bevacizumab y DCA sobre la histología tumoral del U87-MG.(A) Tinción inmunohistoquímica para CA9, CD31, Ki-67 (MIB-1) y necrosis en secciones FFPE de xenoinjertos tumorales U87-MG tratados con BVC, DCA, una combinación de BVC y DCA, o control con vehículo (CTRL). Cuantificación de(B) porcentaje del tejido viable positivo para CA9;(C) puntuación de vasos, VQ, (CD31);(D) índice de proliferación, PQ, (Ki-67); y(E) necrosis. Todas las imágenes se muestran con un aumento de ×20. Media ± SE. Asterisco simple (*) P< 0,05; asterisco doble (**) P< 0,01; asterisco triple (***) P< 0,001

Figura 6: Efecto de la terapia combinada de bevacizumab y DCA sobre genes metabólicos clave. Se realizó un análisis cuantitativo de PCR para investigar los efectos del tratamiento con CTRL, BVC, DCA o BVC/DCA en los tumores U87-MG y U118 midiendo los cambios de pliegues en el ARN(A y B) PDK1(C y D) CA9. Media ± SE, N= 4-8. Asterisco simple (*) P< 0,05; asterisco doble (**) P< 0,01; asterisco triple (***) P< 0,001

Discusión

El objetivo principal de nuestro estudio era profundizar en el conocimiento de la adaptación tumoral a bevacizumab, identificando las vías asociadas a la resistencia, con especial atención a las respuestas metabólicas. Nos centramos en un modelo heterotópico en lugar de ortotópico, principalmente para garantizar la viabilidad de la monitorización del crecimiento neoplásico y el escape. Además, dado que los tumores subcutáneos alcanzan volúmenes significativamente mayores que sus homólogos ortotópicos, podría decirse que son más relevantes para modelar neoplasias malignas avanzadas e hipóxicas.

En un modelo ortotópico de GBM publicado recientemente, se ha descrito un aumento de la hipoxia tras la administración de bevacizumab [24, 26]; sin embargo, investigar las diferencias de crecimiento a largo plazo es menos factible en estos sistemas. A pesar del estatus «clásico» del metabolismo tumoral en la investigación del cáncer y su reciente resurgimiento, ningún fármaco que actúe principalmente a este nivel ha sido aprobado para uso clínico rutinario [27]. El DCA, una pequeña molécula que atraviesa la barrera hematoencefálica [22], mostró resultados prometedores en un ensayo clínico en GBM en combinación con cirugía, temozolomida y radiación [21], con múltiples ensayos adicionales actualmente en curso http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=+Dichloroacetate). Sin embargo, el efecto del DCA como agente único es transitorio en el mejor de los casos, y nuestros modelos tumorales reflejan sin duda esta limitación. En un estudio reciente se discutió la posibilidad de que el tratamiento con bevacizumab sensibilizara los tumores tanto a la 2-DG como al DCA [24], pero estas predicciones sólo se han confirmado para el DCA en nuestras manos. La falta de un efecto aditivo o sinérgico mensurable de la 2-DG es poco probable que se deba a una inactividad biológica o a una dosificación inadecuada, ya que fue transitoriamente eficaz como agente único. Sigue habiendo dudas sobre el mecanismo de inhibición tumoral mediado por DCA en presencia de bevacizumab. Aunque se ha informado de que el DCA bloquea la angiogénesis por sí mismo [21], la medición de la densidad media de vasos no lo confirmó en nuestro sistema.

Se ha demostrado que el DCA aumenta los efectos citotóxicos en condiciones de hipoxia en diversas líneas celulares [28]. El paradigma actual es que el DCA acelera el consumo de oxígeno por reactivación mitocondrial y disminuye aún más la tensión local de oxígeno [29], planteando así un reto adicional a las células tumorales para sobrevivir y/o proliferar. Además, se ha demostrado que en las células «programadas» para utilizar selectivamente la glucólisis para la generación de ATP debido a mutaciones del ADN mitocondrial, la OXPHOS forzada inducida por el DCA tenía un efecto tóxico. El DCA también muestra citotoxicidad sinérgica in vitro en combinación con cisplatino y topotecan, dos agentes antineoplásicos conocidos por dañar el ADN mitocondrial [30]. Se podría especular que la regulación a la baja de los genes mitocondriales en los tumores resistentes al bevacizumab representa una forma de disfunción mitocondrial que sensibiliza a los efectos del DCA.

Curiosamente, el efecto del DCA, como agente único, sobre las dianas de HIF en los xenoinjertos fue, en el mejor de los casos, sutil, a pesar de su reconocido efecto positivo sobre el consumo de oxígeno. En cambio, junto con bevacizumab, el DCA produjo un aumento de la expresión de la mayoría de las dianas de HIF analizadas en los tumores supervivientes frente a bevacizumab solo. Una posible explicación de estos resultados es que la OXPHOS forzada inducida por el DCA en presencia de niveles muy bajos de oxígeno puede conducir a un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que, a su vez, puede contribuir a una inducción adicional de HIF [31]. Además, o alternativamente, el DCA en presencia de bevacizumab puede conducir a una disminución adicional de la concentración local de oxígeno a niveles en los que la inducción de dianas de HIF se hace más evidente mediante el ensayo cuantitativo RT-PCR. Además del aumento de la expresión de CA9, se observó una mayor expresión de las dianas de HIF PDK1, 3 y GLUT1 en los tumores que sobrevivieron en presencia de la combinación de fármacos en células U87 o U118. Esto puede reflejar un cambio metabólico de «último recurso» más drástico, crítico para la supervivencia de las células tumorales. En particular, el aumento de la expresión de PDK1/3 puede ser parte de un «último intento» de las células tumorales para contrarrestar en parte el efecto del DCA e inactivar la OXPHOS mitocondrial. Estos cambios metabólicos en tumores que sobreviven en presencia de bevacizumab más DCA también pueden proporcionar pistas importantes sobre cómo aumentar aún más la eficacia de esta combinación. Por ejemplo, se podría especular que los tumores resistentes pueden mostrar al menos cierta sensibilidad a un aumento adicional de la concentración de DCA, aunque la toxicidad de este compuesto puede convertirse en un factor limitante. El aumento de CA9 específico del tumor también puede desempeñar un papel importante en la supervivencia de los tumores tratados con la combinación, ya que acelera la eliminación del exceso deCO2 generado por la reactivación del ciclo de Krebs [25]. Por lo tanto, los inhibidores de CA9 que recientemente han mostrado efectos anticancerígenos prometedores [32, 33

] pueden considerarse candidatos realistas para un tercer componente de una estrategia de combinación.

En conclusión, la disección molecular de la adaptación tumoral a los agentes anti-VEGF puede ofrecer pistas valiosas para la construcción de combinaciones más eficientes que incluyan como diana el metabolismo del cáncer.

Contribuciones de los autores

Concepción y diseño: M.I. y A.L.H. Obtención de datos: K.K., S.W., H.E.G., H.T., J.L., J.S., A.L.S., R.L., D.S., C.M.D. y M.H. Análisis e interpretación de los datos: M.I. y A.L.H. Redacción, revisión y/o corrección del manuscrito: M.I. y A.L.H. Apoyo administrativo, técnico o material: F.B. Supervisión del estudio: M.I. y A.L.H.

Fuente de financiación

Este trabajo ha sido financiado con subvenciones de Cancer Research United Kingdom [S.W., A.L.H., H.T., R.L., J.L.], METOXIA p-Medicine European Union Framework 7 [D.S., F.B.], Rhodes Scholar [H.G.], fondos iniciales del Indiana University Cancer Center y American Cancer Society [M.I., C.M.D., K.K.].

Conflicto de intereses

No hay posibles conflictos de intereses que declarar.

REFERENCIAS


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