📖 52 mins.

Tiziana Tataranni 1, Francesca Agriesti 1, Consiglia Pacelli 2, Vitalba Ruggieri 1, Ilaria Laurenzana 1, Carmela Mazzoccoli 1 , Gerardo Della Sala 1, Concetta Panebianco 3, Valerio Pazienza 3, Nazzareno Capitanio 2 y Claudia Piccoli 1,2,*

1 Laboratorio de Investigación Preclínica y Traslacional, IRCCS-CROB, Centro Oncológico de Referencia de Basilicata, 85028 Rionero in Vulture (Pz), Italia; [email protected] (T.T.); [email protected] (F.A.); [email protected] (V.R.); [email protected] (I.L.); [email protected] (C.M.); [email protected] (G.D.S.)
2 Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Foggia, 71100 Foggia, Italia; [email protected] (C.P.); [email protected] (N.C.)
3 División de Gastroenterología, Hospital IRCCS «Casa Sollievo della Sofferenza», 71013 San Giovanni Rotondo, Italia; [email protected] (C.P.); [email protected] (V.P.

)

* Correspondencia: [email protected]; Tel.: +39-0881-588-060

Recibido: 21 de febrero de 2019
Aceptada: 15 de mayo de 2019
Publicado: 18 de mayo de 2019

Resumen

Dirigirse al metabolismo representa un posible enfoque exitoso para tratar el cáncer. El dicloroacetato (DCA) es un fármaco conocido por desviar el metabolismo de la glucólisis anaeróbica a la fosforilación oxidativa mitocondrial mediante la estimulación de la PDH. En este estudio, investigamos la respuesta de dos líneas celulares de cáncer de páncreas al DCA, en cultivos celulares bidimensionales y tridimensionales, así como en un modelo de ratón. PANC-1 y BXPC-3 tratadas con DCA mostraron una marcada disminución de la proliferación y migración celular que no se correlacionó con un aumento de la apoptosis, lo que indica un efecto citostático más que citotóxico. A pesar de la activación de la PDH, el tratamiento con DCA redujo el consumo mitocondrial de oxígeno sin afectar a la glucólisis. Además, el DCA provocó un aumento de la producción de ROS, del ADNmt y del marcador de mitofagia LC3B-II en ambas líneas celulares, pero redujo los marcadores de fusión mitocondrial sólo en BXPC-3. En particular, el DCA reguló a la baja el consumo de oxígeno mitocondrial, lo que indica un efecto citostático más que citotóxico. En particular, el DCA redujo la expresión de los marcadores de células madre cancerosas CD24/CD44/EPCAM sólo en PANC-1, pero inhibió la formación de esferoides/viabilidad en ambas líneas celulares. En un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de páncreas, el tratamiento con DCA retrasó la progresión del cáncer. En conjunto, nuestros resultados indican claramente que la eficacia del DCA en la inhibición del crecimiento del cáncer depende mecánicamente del fenotipo celular y de múltiples vías no diana. En este contexto, la novedad de que el DCA pueda afectar al compartimento de células madre cancerosas es terapéuticamente relevante.


Palabras clave: metabolismo; mitocondrias; células madre cancerosas

2019 por los autores. Titular de la licencia MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).


INTRODUCCIÓN

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un cáncer muy agresivo, con un bajo porcentaje de pacientes afectados susceptibles de resección quirúrgica y altamente refractario a las terapias convencionales [1,2]. Por ello, urge disponer de fármacos más eficaces para mejorar los regímenes de tratamiento actuales. Además del crecimiento celular, la reparación del ADN, la invasividad y la angiogénesis, las células del PDAC se caracterizan por mutaciones en genes implicados en el metabolismo [1,3]. Las nuevas estrategias terapéuticas dirigidas al metabolismo se perfilan como enfoques prometedores para superar la quimiorresistencia [4]. Sin embargo, la heterogeneidad inter e intratumoral suele dar lugar a diferentes fenotipos metabólicos, también como consecuencia de las múltiples interacciones con el microambiente tumoral [5]. Esto plantea limitaciones terapéuticas y subraya la importancia de las caracterizaciones metabólicas preliminares de los linajes tumorales, preparatorias para la administración de fármacos eficaces. Recientemente hemos demostrado que dos líneas celulares de cáncer de páncreas, caracterizadas por un perfil metabólico diferente, producen una respuesta disímil a la privación de glucosa/sustitución por galactosa, un enfoque capaz de recablear el metabolismo energético [6]. Además, nuestro grupo ya había demostrado la eficacia del dicloroacetato (DCA), un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK), para matar células cultivadas derivadas de carcinomas orales humanos, un efecto inversamente correlacionado con la capacidad respiratoria mitocondrial de las células tumorales [7]. Varios estudios in vivo e in vitro describen la capacidad del DCA para aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos), revirtiendo el efecto Warburg y dirigiéndose selectivamente a las células tumorales [8,9]. Asimismo, una extensa literatura demuestra la eficacia del DCA para aumentar la quimiosensibilidad en varios tipos de cáncer [10,11]. El tratamiento con DCA se ha propuesto tanto para estudios in vitro como in vivo también en cáncer de páncreas [8,12,13,14]. Sin embargo, son necesarias más investigaciones para definir mejor la eficacia del fármaco en este tipo de cáncer, para aclarar posibles mecanismos adicionales que conducen a la muerte celular, y para explorar otras posibles formas de limitar los efectos secundarios encontrados. En este estudio, analizamos los efectos del DCA en dos líneas celulares de PDAC, PANC-1 y BXPC-3, elegidas entre otras por sus condiciones de crecimiento similares y su geno/fenotipo bien caracterizado [6,15,16]. Un amplio perfil metabólico y transcriptómico de las líneas celulares de PDAC identificó tres subtipos tumorales, de los cuales PANC-1 y BXPC-3 pertenecen a un grupo lipogénico caracterizado por una clara dependencia de la oxidación de la glucosa y del metabolismo relacionado con las mitocondrias [17]. Probando el DCA en cultivos 2D y 3D de las líneas celulares de PDAC, demostramos que el fármaco afecta negativamente a parámetros vitales reduciendo la actividad respiratoria mitocondrial y, sobre todo, el compartimento de células madre cancerosas. Además, demostramos que el DCA también es capaz de mitigar el crecimiento tumoral in vivo en un modelo de ratones xenoinjertados con PDAC.

Materiales y métodos

Cultivo celular
Las células PANC-1 y BXPC-3 se adquirieron en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificadacon un 5% deCO2 en medio RPMI completo suplementado con un 10% de suero bovino fetal, penicilina-estreptomicina (100 U/mL) y 2 mM de glutamina, y la concentración de glucosa fue normalmente de 10 mM o 1 mM cuando se indicó. El dicloroacetato (DCA) se adquirió a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Para cada experimento in vitro, las células se trataron con DCA 4 mM y 10 mM en los momentos indicados.

Curvas de crecimiento celular
Las curvas de crecimiento celular se realizaron como se ha descrito previamente [18].

Monitorización de la proliferación celular en tiempo real mediante el sistema xCELLigence
Los experimentos xCELLigence se realizaron utilizando el instrumento RTCA (analizador celular en tiempo real), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ACEA Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). El número óptimo de siembra se determinó previamente mediante experimentos de titulación y crecimiento celular (datos no mostrados). A continuación, se sembraron 2500 células/pocillo y se monitorizó automáticamente su proliferación cada 30 min. 24 h después de la siembra, las células se trataron con DCA. El índice celular se monitorizó hasta 90 horas después de la siembra. Los datos se analizaron utilizando el software xCELLigence (Versión 2.0, Acea biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) y se expresaron como media ± DE del índice celular normalizado con respecto al último índice celular registrado antes del momento de la adición de DCA.

Ensayo de apoptosis
Tras la incubación con DCA, las células se tiñeron con Annexin-V-FITC y PI (BD Biosciences). Las células vivas, apoptóticas y necróticas se detectaron mediante citometría de flujo (Navios, Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.). Se realizaron tres experimentos independientes. Se adquirió un total de104 eventos para cada muestra.

Ensayo de migración
Los efectos del DCA sobre las capacidades de migración de PANC-1 y BXPC-3 se evaluaron mediante un ensayo de herida por rascado. Brevemente, se sembraron células en placas de cultivo de seis pocillos y se cultivaron hasta confluencia completa. Posteriormente, se produjeron tres heridas lineales paralelas en cada placa con una punta de pipeta de plástico de 200 μL. A continuación, se trataron las células con DCA y se cuantificó la capacidad de cicatrización de las heridas, monitorizada en diferentes puntos temporales, al cabo de 48 h. Se fotografiaron tres imágenes representativas de zonas arañadas de cada plato para estimar la migración de las células. La tasa de migración celular se calculó mediante la siguiente fórmula: [1 – (48 h anchura del arañazo/0 h anchura del arañazo)] × 100%.

Mediciones de lactato
Se utilizó un kit de ensayo colorimétrico de lactato (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y la concentración de lactato detectada (intracelular o liberado) se normalizó al número de células.

Análisis del flujo metabólico y actividad enzimática del complejo respiratorio mitocondrial
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se midieron en células PANC-1 y BXPC-3 adherentes con un analizador de flujo extracelular XF96 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, EE.UU.) como se ha descrito previamente [19]. Brevemente, para el análisis OCR, tras medir la respiración basal, se inyectaron oligomicina (1 μM), FCCP (1 μM) y rotenona + antimicina A (1 μM + 1 μM) en cada pocillo secuencialmente para evaluar, respectivamente, el acoplamiento de la cadena respiratoria y el consumo de oxígeno máximo y no mitocondrial. Para el análisis ECAR, se analizó el flujo glucolítico (glucólisis basal, capacidad glucolítica y reserva glucolítica) mediante la adición secuencial de 10 mM de glucosa, 1 μM de oligomicina y 100 mM de 2-deoxiglucosa. Los valores de OCR y ECAR se normalizaron con respecto al contenido proteico de cada pocillo, determinado mediante el ensayo BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).

Cuantificación de ADN mitocondrial
La medición del número de copias de ADNmt, en relación con el número de copias de ADN nuclear, se determinó como se describió

previamente

[6].

Imágenes de células vivas de mtΔΨ y ROS
Las células
cultivadas a baja densidad en placas de fondo de vidrio de 35 mm recubiertas de fibronectina (Eppendorf, Amburgo, Alemania) se incubaron durante 20 minutos a 37 °C con 2 μM de TMRE, 10 μM de DCF (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) para monitorizar mtΔΨ y ROS, respectivamente. Las células teñidas se lavaron con PBS y se examinaron con un microscopio confocal de barrido láser Leica TCS SP8. La adquisición, el almacenamiento y el análisis de datos se realizaron con un software instrumental específico de Leica (LAS-X, Wetzlar, Alemania).

Análisis Western Blotting
Las alícuotas, que contenían 40 μg de proteínas de cada célula lisada, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno utilizando un sistema Trans Blot Turbo Transfer. Las membranas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) se sondaron con los siguientes anticuerpos primarios: piruvato deshidrogenasa E1-alfa (PDH) y pPDHSer293 (1:500, Abcam, Cambridge, Reino Unido), LC3B (1:1000 Cell Signaling Technology), TOM20 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), DRP1 (1:1000, BD Bioscences), OPA-1 (1:1000, BD Bioscences), MFN1 (1:1000, Santa Cruz), MFN2 (1:1000, Abnova, Tapei, Taiwán) y CASPASE 3 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.). Tras la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2500; Cell Signaling Technology) correspondientemente adecuado, las señales se revelaron utilizando el kit de quimioluminiscencia mejorada (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad) y el sistema de captura de imágenes ChemiDoc XRS + (BioRad), y después se analizaron utilizando el software Image Lab (versión 4.1, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La intensidad de las bandas de LC3B-II (correspondiente a la fracción escindida), TOM20, DRP1, OPA-1, MFN1 y MFN2 se normalizó con respecto a la señal de β-actina, mientras que la fosforilación de PDH se normalizó con respecto a las proteínas totales.

Detección citométrica de flujo de marcadores de superficie
Las expresiones de marcadores de superficie CD44, CD24 y EPCAM se evaluaron mediante análisis citofluorimétrico en PANC-1 y BXPC-3 tratadas con DCA durante 24 h. En resumen, tras la tripsinización, las células se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min con anticuerpos monoclonales CD44-APC, EPCAM-FITC y CD24-PE directamente conjugados (BDB). El análisis citofluorimétrico se realizó con Navios (Beckman Coulter). La señal fluorescente emitida de 10.000 eventos para cada muestra se adquirió y analizó utilizando el software Kaluza Analysis (versión 1.3, Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.).

Transcripción inversay análisis de PCR en tiempo real
Se utilizó un microgramo de ARN total, aislado con el reactivo Trizol (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante y cuantificado en un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), en una reacción de transcripción inversa (RT) utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Transcriptor (Roche Diagnostic, Penzberg, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real se realizó por duplicado, utilizando el ensayo QuantiTect Primer (Qiagen, Basilea, Suiza) para detectar el ARNm de Lin28. La cuantificación de los niveles de ARNm se realizó en un instrumento de PCR en tiempo real LightCycler® 480. Las cantidades relativas de Lin28 se normalizaron con la expresión de GAPDH mediante el software Light Cycler® 480 versión 1.5 (ROCHE) utilizando el método 2ΔΔCt.

cultivo 3D
Las células PANC-1 y BXPC-3 se desprendieron con tripsina-EDTA y se contaron. A continuación, se sembraron 1000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo con fijación ultrabaja y se cultivaron en RPMI. Para evaluar el efecto DCA de los esferoides preformados, se mantuvieron cultivos 3D durante 7 días, obteniéndose esferoides. A continuación, se sustituyó el medio por medio fresco y se trataron los esferoides con DCA 4 mM y 10 mM durante 72 h. Para evaluar el efecto del DCA en la formación de esferoides, se añadió DCA a la suspensión celular cuando se sembraron en placas de fijación ultrabaja y se mantuvo el cultivo durante 7 días. Los esferoides se fotografiaron en un microscopio óptico invertido (Axio Vert A1, Zeiss, Oberkochen, Alemania) y su diámetro se midió utilizando el software de imágenes ZEISS ZEN. La viabilidad de los esferoides se evaluó mediante un ensayo MTS. Se añadió una solución de reactivo MTS acuoso en polvo cellTiter 96® (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y PMS (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.) a cada pocillo de cultivo de esferoides 3D. Tras 2 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia a 490 nm y se calculó el porcentaje de viabilidad en cada pocillo utilizando los esferoides no tratados como el 100%.

Estudios con animales
Los ensayos con animales se realizaron en una instalación experimental acreditada por la AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, Frederick, MD EE.UU.) con el número de aprobación ANM14_002/468862. Se cultivó un número total de 5 ×106 células cancerosas BxPC-3-luc, se resuspendieron en 0,1 mL de mezcla PBS/matrigel (1:1) y se inyectaron por vía s.c. en el flanco derecho de ratones nude Nu/Nu de 5-6 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen medio de 100 mm3, los ratones desnudos portadores de tumores BxPC-3-luc se asignaron aleatoriamente a 2 grupos (6 ratones/grupo). Grupo 1 (solución salina normal, i.p, qw), grupo 2 (DCA, mg/kg, i.p, qw). Los animales tuvieron libre acceso al agua. El DCA se disolvió para generar una concentración final de 100 mg/kg/día (s.c: subcutáneo; i.p: intraperitoneal; qw: una vez a la semana).

Análisis estadístico
Los datos experimentales se expresan como media ± error estándar medio (SEM) o media ± desviación estándar (SD). Los datos se compararon mediante la prueba t de Student no apareada o Anova unidireccional, seguida de la prueba de Bonferroni. Un valor p < 0,05 se aceptó como estadísticamente significativo.

Resultados

El DCA afecta negativamente a la proliferación celular, la supervivencia y la migración en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3
Las dos líneas celulares de PDAC seleccionadas para este estudio fueron PANC-1 y BXPC-3. PANC-1 es una línea celular derivada de carcinoma pancreático de origen ductal. Puede metastatizar pero tiene poca capacidad de diferenciación y alberga mutaciones en KRAS y TP53 y deleción homocigota en CDKN2A/p16 [16]. El BxPC-3 es una línea celular primaria derivada de adenocarcinoma con diferenciación moderada y morfología epitelial. Expresa mucina y altos niveles de factores angiogénicos y marcadores de células madre cancerosas [16,20] y carece de mutaciones en KRAS pero alberga mutaciones en TP53 y deleciones homocigotas en CDKN2A/p16 y SMAD4/DPC4 [16].El efecto del DCA sobre los parámetros de viabilidad en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3 se evaluó en las concentraciones de 4 mM y 10 mM, ya probadas y de eficacia demostrada en nuestro estudio anterior [7]. En primer lugar, realizamos un ensayo de crecimiento celular durante 72 h, que reveló una sensibilidad significativa dependiente de la dosis y del tiempo de ambas líneas celulares al tratamiento con DCA (Figura 1A,B). En particular, PANC-1 y BXPC-3 mostraron un bloqueo similar del crecimiento celular cuando se trataron con 10 mM de DCA a partir del primer día de incubación y, por el contrario, a la dosis más baja de 4 mM ensayada, la línea celular PANC-1 pareció significativamente más sensible al fármaco.

Figura 1. Efecto del dicloroacetato Efecto del dicloroacetato (DCA) sobre el crecimiento y la proliferación celular. Curvas de crecimiento celular de cultivos de PANC-1(A) y BXPC-3(B) sembrados a la misma densidad, cultivados durante 72 h sin DCA (línea negra) o con 4 mM de DCA (línea gris) y 10 mM de DCA (línea de puntos). Las células se contaron cada 24 h y los valores mostrados son medias ± SEM de tres cursos temporales independientes. Efecto dependiente de la dosis y del tiempo del tratamiento con DCA sobre la proliferación de PANC-1(C) y BXPC-3(D) evaluada mediante el sistema xCELLigence. Se muestra un perfil representativo para ambas líneas celulares, indicando el índice celular normalizado con respecto al último índice celular registrado antes de la adición de DCA, medido en tiempo real durante 72 h. El índice celular normalizado cuantificado en células PANC-1(E) y BXPC-3(F) tratadas con DCA se indica como media ± DE de tres experimentos independientes, registrados en los puntos temporales indicados. El análisis se realizó mediante Anova unidireccional y postest de Bonferroni. * p < 0,001 frente a CTRL; ** p < 0,05 frente a CTRL 24h; ° p < 0,001 frente a CTRL 48 h; # p < 0,001 frente a CTRL 72 h.

La observación anterior, particularmente interesante debido a la conocida quimiorresistencia mostrada por la línea celular PANC-1 [21,22], nos llevó a verificar la inhibición del crecimiento celular mediada por DCA mediante un enfoque diferente. Para ello, monitorizamos en tiempo real los cambios dinámicos en la proliferación y viabilidad celular mediante tecnología basada en impedancia. Como se muestra en la Figura 1C-F, el tratamiento con 10 mM de DCA redujo drásticamente la proliferación celular en ambas líneas celulares, mientras que el tratamiento con 4 mM de DCA causó un efecto inhibidor mucho mayor en PANC-1 en comparación con las líneas celulares BXPC-3. El efecto del DCA en PANC-1 fue mucho mayor que en las líneas celulares BXPC-3. Cabe destacar que los efectos del DCA fueron claramente visibles a partir de las 24 h de incubación con el fármaco. El análisis del crecimiento celular en tiempo real también se llevó a cabo con glucosa baja en el medio de cultivo (es decir, 1 mM en RPMI). Como era de esperar, la tasa de crecimiento de ambas líneas celulares de PDAC se vio severamente reducida dada su dependencia metabólica de la oxidación de la glucosa [17]. Sin embargo, la diferente sensibilidad al tratamiento con DCA 4 mM se confirmó también con un régimen bajo en glucosa (Figura Suplementaria S1).Para evaluar los parámetros vitales, utilizamos el ensayo de anexina V-FITC/PI y evaluamos mediante citometría de flujo la cantidad relativa de células necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas tempranas. Los resultados obtenidos mostraron que, tras 24 h de incubación con DCA, tanto las líneas celulares PANC-1 como BXPC-3 mostraban un ligero pero significativo aumento de la apoptosis dependiente de la dosis en comparación con las células no tratadas. Sin embargo, la cantidad de células apoptóticas fue relativamente baja (< 10% a la concentración más alta de DCA probada) y no siguió aumentando a las 48 h de tratamiento con DCA (Figura 2A). Por consiguiente, la expresión de la caspasa 3 sin escindir no cambió tras el tratamiento con DCA y no se detectó ninguna cantidad apreciable de su forma escindida (Figura 2B). Este resultado sugiere una actividad citostática más que citotóxica del fármaco en ambas líneas celulares para explicar la marcada disminución de la tasa de crecimiento mostrada en las figuras 1A-D.

A continuación, evaluamos el efecto del DCA sobre la motilidad celular, realizando el ensayo de cicatrización por rascado. La capacidad de migración, observada en diferentes puntos temporales, se midió tras 48 h de tratamiento con DCA 4 mM y 10 mM. Tanto las células PANC-1 como las BXPC-3 disminuyeron su motilidad al ser tratadas con la dosis más alta de DCA, mientras que la capacidad de migración de las BXPC-3 no se vio afectada por el tratamiento con DCA 4 mM, que, en cambio, provocó un retraso en la capacidad de cierre de la herida en las células PANC-1, lo que confirma su mayor sensibilidad al fármaco detectable a una concentración más baja (Figura suplementaria S2).

Figura 2. Efecto del DCA sobre los parámetros vitales y la capacidad de migración celular,(A) la medición de células apoptóticas y necróticas tempranas y tardías se realizó mediante citometría de flujo como se describe en Material y Métodos, las células fueron tratadas con 4 y 10 mM de DCA durante 24 h (panel izquierdo) y 48 h (panel derecho), los datos se expresan como porcentaje del total de eventos analizados y son la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes (* p < 0.05 frente a CTRL, ** p < 0,01 frente a CTRL);(B) expresión de caspasa 3, (panel superior) Western blot representativo de lisado de proteína total, (panel inferior) análisis densitométrico (normalizado a β-actina) de la banda de caspasa 3 no descompuesta, las barras son medias ± SEM de tres experimentos independientes en cada condición; NS, no significativo.

ElDCA alterael metabolismoenergético celular en las líneas celulares de PDAC
Para investigar la relación entre el efecto antiproliferativo inducido por el DCA y las alteraciones en el metabolismo de las líneas celulares de PDAC, evaluamos la eficacia del compuesto para inhibir su diana reconocida, la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK), evaluando el estado de fosforilación de la subunidad E1α (residuo S293) del complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) mediante Western blotting en PANC-1 y BXPC-3. La Figura 3A,B muestra el estado de fosforilación de la subunidad E1α (residuo S293) del complejo piruvato deshidrogenasa (PDC). Como se muestra en la Figura 3A,B, el nivel normalizado de P-PDH-E1 disminuyó significativamente en ambas líneas celulares, mientras que el nivel de expresión de PDH total fue comparable y, como era de esperar, no se modificó por el tratamiento farmacológico. Inesperadamente, la producción extracelular e intracelular de lactato no se vio afectada en las dos líneas celulares de PDAC tratadas con DCA (Figura suplementaria S3).

Figura 3. Efecto del DCA sobre la pirólisis Efecto del DCA sobre la fosforilación de la piruvato deshidrogenasa E1-alfa (PDH) y los flujos metabólicos,(A) inmunotransferencia representativa de la fosfo-S293 E1αPDH (pPDH) y la subunidad enzimática total en células PANC-1 y BXPC-3 tras 24 h de incubación con DCA 4 mM y 10 mM, se utilizó β-actina como control de carga;(B) análisis cuantitativo de los valores densitométricos de la fosfo-S293 E1αPDH en relación con la PDH total, normalizados respecto a la β-actina; los resultados son la media ± SEM de tres experimentos independientes, * p < 0.05 vs. CTRL, # p < 0.05 vs. BXPC-3 DCA 4 mM;(C,D) tasa de consumo de oxígeno (OCR) realizada por la plataforma SeaHorse como se describe en la sección Material y Método y normalizada al contenido proteico de las células al final del ensayo, basal: OCR en reposo; oligo: OCR medida tras la adición del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina; FCCP: OCR medida después de que el desacoplador FCCP produjera la capacidad respiratoria máxima, la OCR se corrigió para la OCR residual medida después de la adición del inhibidor de CxI rotenona (no mostrado);(E,F) tasa de acidificación extracelular (ECAR) medida en PANC-1 y BXPC-3 tratadas con DCA 4 mM y 10 mM durante 48 h, glicólisis: ECAR en reposo; capacidad glicolítica: ECAR medida tras la adición de oligomicina y FCCP y se refiere a la actividad glucolítica máxima con la OxPhos inhibida; reserva glucolítica: diferencia entre ECAR medida en presencia de oligomicina + FCCP y en condiciones de reposo, las barras representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes realizados en 3 réplicas técnicas bajo cada condición (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 vs. CTRL respectivo);(G,H) mapas de energía obtenidos trazando las capacidades ECAR y OCR basales y máximas obtenidas en PANC-1 y en BXPC-3, respectivamente.

A continuación, analizamos los principales flujos metabólicos midiendo la acidificación extracelular y el consumo de oxígeno mediante la tecnología SeaHorse. Cuando se evaluaron los flujos metabólicos tras 24 h de incubación con DCA, no se observaron cambios significativos en ambas líneas celulares de PDAC (Figura suplementaria S4). Una exposición más prolongada (es decir, 48 h) al DCA provocó una disminución dependiente de la dosis de las tasas de consumo de oxígeno mitocondrial (OCR) en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3 tanto en condiciones basales como en presencia del inhibidor de la ATP-sintasa oligomicina o del desacoplador FCCP (es decir, la capacidad respiratoria máxima) (Figura 3C,D). Cabe señalar que la actividad respiratoria mitocondrial fue significativamente mayor en PANC-1 que en BXPC-3, lo que indica un fenotipo metabólico más dependiente de OxPhos. Las tasas de acidificación extracelular (ECAR), que están relacionadas con el flujo glucolítico, no experimentaron cambios significativos tras el tratamiento con DCA de PANC-1, mientras que se observó una inhibición de la ECAR basal en BXPC-3 a la concentración más alta de DCA y, en función de la dosis, de la capacidad glucolítica (Figura 3E,F). En consecuencia, los perfiles bioenergéticos globales de las capacidades de flujo basal y estimulado de ambas células PDAC se vieron afectados por el DCA, con PANC-1 mostrando una disminución de la capacidad OxPhos y BXPC-3 mostrando un deterioro más severo de ambos flujos metabólicos (Figura 3G,H). La medición de los flujos metabólicos en condiciones de crecimiento con baja glucosa dio lugar a una reducción de la OCR en ambas líneas celulares (más consistente en BXPC-3) y a un aumento de la ECAR en BXPC-3. El tratamiento con DCA (48 h) dio lugar a una reducción de la OCR en PANC-1 y BXPC-3, respectivamente. El tratamiento con DCA (48 h) causó en ambas líneas celulares un efecto inhibitorio significativamente menor sobre la OCR (particularmente a 4 mM) en condiciones de glucosa baja en comparación con el régimen de glucosa alta. En PANC-1, el tratamiento con DCA no provocó ningún cambio significativo en la ECAR, mientras que en BxPC-3 se observó una inhibición del 40-50%, aunque independiente de la disponibilidad de glucosa (Figura S5).En conjunto, estas observaciones inesperadas indicaron que en las células PDAC, aunque y a pesar de que el DCA era aparentemente capaz de activar la PDH, no se consiguió invertir el efecto Warburg. Por el contrario, el tratamiento con DCA causó una crisis bioenergética, que condujo a la disminución del crecimiento celular por un mecanismo fuera del objetivo.

El DCAinduce la producción de ROS en las líneas celulares de PDAC y afecta de forma diferencial a la biogénesis y dinámica mitocondrial
La disminución de la respiración mitocondrial causada por el DCA nos llevó a investigar otras funciones mitocondriales. En primer lugar, evaluamos la arquitectura morfofuncional del compartimento mitocondrial mediante microscopía confocal utilizando la sonda fluorescente ΔΨ TMRE, que se acumula en las mitocondrias en respiración. La Figura 4A muestra que en PANC-1 la señal relacionada con TMRE mostraba un aspecto de partículas difusas repartidas en gran medida en el citoplasma, indicativo de una estructura predominantemente fragmentada en lugar de interconectada. Una característica similar se observó también en las células más pequeñas BXPC-3, que, sin embargo, mostraban una compartimentación perinuclear anular. El tratamiento de 24 h con DCA no provocó cambios importantes ni en la intensidad de la señal fluorescente TMRE ni en su aspecto morfológico.

Figura 4. Efecto del DCA sobre los parámetros morfofuncionales mitocondriales en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3,(A) imágenes representativas de microscopía confocal de barrido láser de Δψm mediante la sonda fluorescente TMRE en PANC-1 (paneles superiores) y BXPC-3 (paneles inferiores), también se muestra la ampliación digital de la fluorescencia relacionada con TMRE del compartimento mitocondrial para los detalles indicados por los cuadrados (software ImageJ de http://imagej.nih.gov/ij/);(B) histograma que muestra el análisis cuantitativo de la fluorescencia relacionada con TMRE/célula, los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes bajo cada condición en los que se analizaron las imágenes de fluorescencia digitalizadas de al menos cinco campos ópticos seleccionados aleatoriamente (cada uno con unas 25 células); NS, no significativo.

A continuación, analizamos el tono redox de las dos líneas celulares de PDAC utilizando la sonda de peróxido DCF. La Figura 5A,B muestra que el tratamiento con DCA 10 mM durante 24 h provocó un aumento significativamente mayor de la señal relacionada con DCF en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3 en comparación con sus niveles basales sin tratar. Este resultado indicaba un desequilibrio pro-oxidativo o del estado redox causado por la exposición al DCA.

Figura 5. Efecto del DCA sobre la producción de ROS Efecto del DCA sobre la producción de ROS en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3,(A) imágenes representativas de LSCM de la producción de ROS en células PANC-1 vivas (panel superior) y BXPC-3 (panel inferior) tratadas con DCA evaluadas mediante DCF, las imágenes son representativas de tres preparaciones diferentes que dieron resultados similares;(B) histograma que muestra el análisis cuantitativo de la fluorescencia relacionada con DCF/célula, los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes bajo cada condición en los que se analizaron las imágenes de fluorescencia digitalizadas de al menos cinco campos ópticos seleccionados aleatoriamente (cada uno contenía unas 25 células); * p < 0.01, ** p < 0,001 frente a CTRL.

El análisis anterior se complementó con la medición del ADN mitocondrial (ADNmt). Como se muestra en la Figura 6A, el número de copias de ADNmt/célula fue significativamente mayor en PANC-1 que en BXPC-3, en consonancia con una actividad respiratoria más activa. Tras el tratamiento con DCA, se observó un aumento progresivo dosis-dependiente del ADNmt en ambas líneas celulares de PDAC. Esto se debió probablemente a una respuesta compensatoria a la disfunción de OxPhos causada por el DCA.

Figura 6. Efecto del DCA sobre el ADNmt Efecto del DCA sobre la biogénesis mitocondrial, la dinámica mitocondrial y la mitofagia en las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3,(A) número de copias de ADNmt evaluado mediante q-RT-PCR, el histograma de barras muestra los valores normalizados con respecto al ADN nuclear y son las medias ± SEM de tres experimentos independientes (* p < 0,05 vs. PANC-1 CTRL, ** p < 0,05 vs. PANC-1 CTRL). PANC-1 CTRL, ** p < 0,05 vs. BXPC-3 CTRL);(B) inmunotransferencia representativa de los niveles de expresión proteica de LC3B y TOM20 en PANC-1 y BXPC-3 tratadas con DCA y análisis densitométrico (histograma inferior) realizados en tres experimentos independientes y expresados como media ± SEM (* p < 0,05, ** p < 0,05).05, ** p < 0.05 vs. CTRL 0 mM DCA respectivo);(C) inmunotransferencia representativa de la expresión proteica de los factores implicados en la fisión mitocondrial (panel superior) y fusión (panel inferior), el panel superior muestra una inmunotransferencia representativa del nivel de expresión proteica de DRP1 con análisis densitométrico (* p < 0.05 vs. CTRL-0 mM DCA).05 vs. CTRL-0 mM DCA), el panel inferior muestra una inmunotransferencia representativa de OPA-1, MFN1, MFN2 y β-actina.

A continuación, evaluamos mediante inmunotransferencia el nivel de expresión de proteínas que se sabe que están implicadas en el aclaramiento mitocondrial (es decir, mitofagia) y la dinámica. La Figura 6B,C muestra que la expresión del marcador de autofagosomas LC3B-II fue significativamente mayor en BXPC-3 que en PANC-1, y que el DCA causó un aumento progresivo dosis-dependiente del marcador en ambas líneas celulares. Sin embargo, TOM20, un marcador de la membrana mitocondrial externa, disminuyó significativamente sólo en la línea celular BXPC-3. El análisis de los factores implicados en el procesamiento de fusión/fisión de las mitocondrias reveló que todos se expresaban a niveles más altos en PANC-1 en comparación con BXPC-3, pero con un efecto diferencial sobre ellos causado por el tratamiento con DCA (Figura 6C). En particular, sólo DRP1, un factor implicado en la fisión mitocondrial, disminuyó tras el tratamiento con DCA en BXPC-3. No se produjeron cambios significativos en DRP1, un factor implicado en la fisión mitocondrial. En conjunto, estas observaciones sugieren un perfil más dinámico del compartimento mitocondrial en PANC-1, que experimenta una fusión-fisión mitocondrial activa, con un nivel aparentemente bajo de procesamiento de mitofagia. Por el contrario, las células BXPC-3 parecen más propensas fenotípicamente a perseguir el control de calidad del orgánulo. Esto podría ser coherente con la apariencia más fragmentada de la red mitocondrial en las células BXPC-3. El tratamiento con DCA provocó un evidente aumento del marcador mitofágico LC3B en ambas líneas celulares, que, sin embargo, siguió siendo mucho mayor en BXPC-3.

ElDCA afecta de forma diferencial al compartimentode células madre cancerosasen las líneas celulares de PDAC
Para investigar posibles mecanismos adicionales del efecto citostático del DCA, decidimos comprobar su impacto en la fracción de células madre cancerosas (CSC) de las líneas celulares de PDAC. Para ello, evaluamos la expresión del factor Lin28 de las células madre embrionarias, que ha demostrado estar implicado en el metabolismo celular [23] y es conocido como biomarcador de mal pronóstico en la progresión del cáncer [24,25]. La Figura 7A muestra que 48 h de tratamiento con DCA provocaron una reducción significativa de la expresión de Lin28 en ambas líneas celulares, siendo BXPC-3 más sensible que PANC-1. Un resultado similar se obtuvo en los cultivos 3D de BXPC-3 y PANC-1, respectivamente. Se obtuvo un resultado similar en los cultivos 3D obtenidos de ambas líneas celulares (Figura 7B).

Figura 7. Efecto del DCA en PANC-1 Efecto del DCA sobre los marcadores de células madre cancerosas PANC-1 y BXPC-3,(A) análisis cuantitativo RT-PCR del transcrito Lin28 realizado en PANC-1 y BXPC-3 cultivadas en monocapa durante 24 h con DCA 4 mM y 10 mM, los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes (* p < 0.05 vs. CTRL, ** p < 0,01 vs. CTRL);(B) análisis RT-PCR cuantitativo del transcrito Lin28 realizado en esferoides PANC-1 y BXPC-3 cultivados durante 7 días y tratados con DCA durante 72 h, los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes (** p < 0,01 vs. CTRL); (C) análisis RT-PCR cuantitativo del transcrito Lin28 realizado en esferoides PANC-1 y BXPC-3 cultivados durante 7 días y tratados con DCA durante 72 h, los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes (** p < 0,01 vs. CTRL). CTRL);(C) análisis representativo de la expresión de CD44 (eje y) y EPCAM (eje x) en PANC-1 (panel tripartito superior) tratado con DCA 4 mM y 10 mM durante 24 h, el panel tripartito inferior muestra la expresión correspondiente de CD24 en células CD44+/EPCAM+;(D) análisis representativo de la expresión de CD44 (eje y) y EPCAM (eje x) en BXPC-3 (panel tripartito superior) tratadas con DCA 4 mM y 10 mM durante 24 h, el panel tripartito inferior muestra la expresión correspondiente de CD24 en células CD44+/EPCAM+; se muestra el porcentaje en cada diagrama de puntos de(C) y(D) de células CD44+/EPCAM+ y CD24+/CD44+/EPCAM+; los histogramas de la derecha de(C) y(D) muestran la media ± SEM de células CD24+/CD44+/EPCAM+ positivas (expresadas como porcentaje del total de eventos analizados) de al menos tres experimentos; * p < 0.05, ** p < 0,01 frente a CTRL.

Esta observación nos llevó a profundizar en el efecto del DCA sobre las CSC mediante análisis FACS de los marcadores de superficie específicos de las CSC pancreáticas CD24, CD44 y EPCAM [26,27]. La Figura 7C muestra una reducción significativa dependiente de la dosis de células CD24+/CD44+/EPCAM+ en células PANC-1 tratadas durante 48 h con DCA. Cabe destacar que la intensidad de fluorescencia se redujo casi un 50% tras el tratamiento con DCA 4 mM en células PANC-1, mientras que con 10 mM ya se observó una mayor reducción de la intensidad de fluorescencia tras 24 h de tratamiento y no cambió tras 48 h de tratamiento (datos no mostrados). Por el contrario, aunque los marcadores CSC se expresaban en aproximadamente el 90% de las células BXPC-3, su expresión no parecía verse afectada por el tratamiento con DCA (Figura 7D). Recientemente se ha señalado que, más que el nivel absoluto de expresión de determinados marcadores, es su proporción la que permite identificar la subpoblación con características más genuinas de células madre. En particular, el cociente CD44/CD24 parece ser el marcador más fiable de las CSC en la tumorigénesis y la metástasis [28]. En consonancia con esta noción, es relevante que el ratio de expresión CD44/CD24 en PANC-1 resultó 8 veces mayor que en BXPC-3 (Figura Suplementaria S7), indicando así que, aunque menos poblado, el compartimento CSC es cualitativamente más parecido a células madre. Por el contrario, el bajo nivel de expresión de los marcadores CSC ampliamente extendidos en la población BXPC-3 los fenotiparía como progenitores tempranos.

Efecto del DCA en cultivos 3D
Para investigar más a fondo las propiedades antitumorales del DCA, analizamos sus efectos biológicos en un banco de pruebas alternativo constituido por cultivos 3D de PANC-1 y BXPC-3. Cada vez hay más evidencias que sugieren que los esferoides derivados de células cancerosas están enriquecidos en CSCs o células con características relacionadas con las células madre [29,30]. La Figura 8A muestra micrografías de los esferoides obtenidos tras 7 días de cultivo en las que puede observarse claramente una diferencia en el tamaño y la compacidad de la capa límite entre las líneas celulares PANC-1 y BXPC-3. En particular, los esferoides derivados de las células PANC-1 parecían más grandes y con bordes irregulares en comparación con los derivados de las células BXPC-3. El tratamiento con DCA durante 72 h alteró la morfología de los esferoides, que se volvieron progresivamente menos definidos. Esto fue particularmente evidente en los esferoides derivados de PANC-1 a 10 mM de tratamiento con DCA. En consonancia con esta observación, se detectó claramente una reducción progresiva de la viabilidad celular en los esferoides de PANC-1 y BXPC-3, dependiente de la dosis.

Figura 8. Efecto del DCA en el cultivo 3D de PANC-1 y BXPC-3 Efecto del DCA en el cultivo 3D de células PANC-1 y BXPC-3,(A) imágenes representativas del cultivo 3D obtenido de PANC-1 (panel superior) y BXPC-3 (panel inferior) sembradas en placas de fijación ultrabaja, cultivadas durante 7 días para obtener esferoides y tratadas con DCA 4 mM y DCA 10 mM durante 72 h, viabilidad de los esferoides (expresada como valor porcentual en comparación con la condición no tratada) medida mediante ensayo MTS, * p < 0.05, ** p < 0,01 frente a CTRL;(B) inhibición de la formación de esferoides a partir de células PANC-1 y BXPC-3 tratadas con DCA 4 mM y DCA 10 mM durante 7 días; se sembró una suspensión celular de 1000 células en placas de fijación ultrabaja y se trató con DCA; la viabilidad de los esferoides (expresada como valor porcentual frente a la condición no tratada) se midió mediante el ensayo MTS; * p < 0,05, ** p < 0,01 frente a CTRL.

También investigamos la capacidad del DCA para afectar a la formación de esferoides tratando la suspensión celular en el momento de la siembra. Como se muestra en la Figura 8B, el DCA afectó fuertemente a la formación de esferoides en ambas líneas celulares de PDAC, siendo PANC-1 más sensible al fármaco. En consecuencia, la viabilidad celular de los esferoides PANC-1 se vio significativamente más afectada que la de los esferoides BXPC-3.

ElDCA mitiga la progresión del cáncer en un modelode ratón de xenoinjerto deCP
Por último, evaluamos el efecto de la administración de DCA en un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de páncreas. La línea celular BXPC-3 que expresa luciferasa se inyectó en ratones desnudos y tras alcanzar un volumen de 100 mm3 se trataron con DCA o vehículo durante tres semanas. La Figura 9A muestra las imágenes de bioluminiscencia de la masa tumoral en ratones tratados con DCA y ratones de control. La cuantificación de la señal de bioluminiscencia reveló una progresión retardada del tumor pancreático en los ratones tratados con DCA, documentada por una reducción del 25-30% tanto de la intensidad de la señal de bioluminiscencia de la masa tumoral como de su volumen en comparación con los ratones tratados con vehículo (Figura 9B,C). Sin embargo, debido a la gran variabilidad interindividual, las diferencias no alcanzaron significación estadística.


Figura 9. Efecto in vivo del DCA en el tumor PDAC. La señalización de bioluminiscencia se midió como fotones/seg en el grupo CTRL 1 que recibió solución salina normal, i.p., qw, y en el grupo DCA 2 que recibió DCA(A,B). Se cosecharon las masas tumorales y se midió el volumen tumoral(C). Véanse los detalles en Materiales y métodos.

4. Discusión

En las células cancerosas suelen producirse procesos metabólicos aberrantes, por lo que atacar el metabolismo representa una estrategia emergente para tratar tumores, incluido el cáncer de páncreas [31,32,33]. La heterogeneidad tumoral puede dar lugar a células malignas con un fenotipo metabólico distinto y, en consecuencia, una sensibilidad diferente a los fármacos metabólicos, como en el caso de la gemcitabina, hacia la que la mayoría de los pacientes con cáncer de páncreas desarrollan resistencia [17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34].

En el presente estudio, probamos la eficacia del fármaco metabólico DCA en cultivos 2D y 3D de dos líneas celulares diferentes de cáncer de páncreas bien caracterizadas (es decir, PANC-1 y BXPC-3), así como en un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas. Ambas líneas celulares, cultivadas en monocapa, mostraron una marcada sensibilidad al DCA a la concentración más alta ensayada (es decir, 10 mM), que detuvo la proliferación celular e inhibió gravemente su capacidad de migración. El ensayo del fármaco a una concentración más baja (es decir, 4 mM de DCA) puso de manifiesto una mayor sensibilidad de la línea celular PANC-1. Esta observación es interesante porque la línea PANC-1 es muy sensible al DCA. Esta observación es interesante porque PANC-1 se considera una línea celular agresiva y quimiorresistente [21,22,35].

El análisis de los parámetros de viabilidad en ambas líneas celulares de PDAC tratadas con DCA reveló un porcentaje limitado de células apoptóticas/necróticas, sugiriendo así un efecto citostático más que citotóxico ejercido por el fármaco, confirmando informes anteriores [36,37].

Uno de los principales efectos del DCA se atribuye generalmente a su capacidad para inducir un cambio metabólico de la glucólisis a la oxidación mitocondrial de la glucosa. Esto se consigue mediante la inhibición de la PDH quinasa PDK, desplazando así la PDH hacia su estado no fosforilado más activo [38,39]. En consecuencia, el piruvato se convierte en acetil-CoA, que entra en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y alimenta la fosforilación oxidativa mitocondrial.

Sin embargo, en este estudio, encontramos que a pesar de una sustancial desfosforilación de la PDH inducida por el DCA, no se observó ninguna activación de la actividad respiratoria mitocondrial en ambas líneas celulares de PDAC tratadas con fármacos. Por el contrario, el DCA provocó una reducción dependiente de la dosis de la OxPhos mitocondrial que se acopló a la inhibición de la capacidad glucolítica en BXPC-3.

Este resultado también fue algo sorprendente teniendo en cuenta que en un estudio previo con líneas celulares de cáncer oral demostramos que las células PE15, caracterizadas por una OxPhos sostenida, eran resistentes al tratamiento con DCA, mientras que las células HSC2/3, que mostraban un perfil glucolítico, parecían más sensibles al fármaco con un marcado efecto también sobre los parámetros morfofuncionales mitocondriales [7]. Además, en otro estudio con líneas celulares PANC-1 y BXPC-3, demostramos una sensibilidad diferencial a la privación de glucosa/sustitución de galactosa, una condición que también fomenta el metabolismo oxidativo, siendo las células BXPC-3 más glucolíticas más vulnerables [6]. Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que la diferente sensibilidad de las distintas líneas celulares a los fármacos o condiciones que promueven un cambio metabólico pro-oxidativo dependía de su perfil metabólico basal, siendo más vulnerables las que dependen más de la glucólisis y/o tienen una capacidad respiratoria baja.

El efecto depresor del DCA sobre la respiración mitocondrial no se tradujo aparentemente en cambios de la morfología mitocondrial, aunque se observó una reducción significativa del factor Drp1, promotor de la fisión, en las células BXPC-3 tratadas con DCA. Es probable que el fenotipo fragmentado basal de la red mitocondrial en BXPC-3 se ocultara para apreciar una mayor fragmentación mitocondrial. Sin embargo, el número de copias de ADNmt/célula aumentó significativamente en ambas líneas celulares de PDAC, probablemente debido a un mecanismo compensatorio como consecuencia de la disfunción mitocondrial que conduce a la activación de la mitofagia, como demuestra el aumento de la forma escindida de LC3B-II. La mayor producción de ROS observada en las líneas celulares de PDAC tratadas con DCA podría provocar el control de calidad de los orgánulos para eliminar las mitocondrias dañadas. El desequilibrio de la homeostasis de ROS se relaciona habitualmente con la disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial, aunque la relación no suele estar clara (es decir, causa, efecto, círculo vicioso). Generalmente considerado un mecanismo pro-supervivencia que protege a las células en condiciones de estrés (función oncogénica) [40], más recientemente se ha demostrado que la desregulación de la mitofagia contribuye a la resistencia a fármacos (función supresora de tumores) [41]. En cualquier caso, la inducción e inhibición de la mitofagia en la progresión del cáncer sigue siendo controvertida.

En conjunto, las observaciones antes mencionadas no nos permiten racionalizar el efecto citostático del DCA como simplemente ligado a la recombinación metabólica de las células PDAC. Debe tenerse en cuenta que el DCA puede dirigirse a otras vías celulares además de la PDK. De hecho, se ha informado de que el DCA afecta a la vía biosintética de la CoA [42], activa la vía de señalización de la AMPK [43], antagoniza con el acetato [44] y altera el catabolismo de la tirosina [45]. Además, la comparación de los perfiles de metabolitos en células tratadas con DCA o con nuevos inhibidores más selectivos de PDK dio lugar a resultados diferentes [46]. Esto nos llevó a investigar otros posibles efectos no diana del DCA para explicar su eficacia para atacar células tumorales.

Las células madre tumorales (CSCs) representan una fracción de toda la masa tumoral emergiendo como responsables de la refractariedad a la terapia oncológica así como de la diseminación de metástasis y recaída tumoral [47], atrayendo así un creciente interés como dianas para el desarrollo de nuevas terapias anticancerígenas [48]. Hasta donde sabemos, no existe ningún informe sobre el efecto del DCA en las células madre del cáncer de páncreas. Para diseccionar este intrigante aspecto, en primer lugar, evaluamos el efecto del tratamiento con DCA sobre la expresión de Lin 28, revelando una significativa disminución dependiente de la dosis detectable en ambas líneas celulares. Cabe destacar que la expresión de Lin28 está estrictamente relacionada con el metabolismo, ya que es capaz de regular la progresión de las células cancerosas a través de PDK1 y de inducir un cambio energético [49]. Lin28 está implicado en la formación de CSCs [50] y su expresión aberrante está asociada a muchas enfermedades neoplásicas humanas, incluyendo el cáncer de páncreas [51,52]. El análisis FACS de la expresión de los antígenos de superficie CD44, CD24 y EPCAM que caracterizan típicamente a las CSCs pancreáticas [53 ] reveló que el tratamiento con DCA redujo el porcentaje de la fracción triple positiva en PANC-1. En cambio, no apreciamos ninguna modulación inducida por el DCA en BXPC-3, que estaban constituidas principalmente por células triple positivas. Debe tenerse en cuenta que, aunque más del 90% de las BXPC-3 eran positivas para marcadores de troncalidad, su nivel de expresión era relativamente bajo. Por el contrario, PANC-1 expresaba niveles más altos de marcadores de troncalidad, aunque sólo en menos del 30% de la población celular, lo que sugiere un fenotipo de CSC más joven que caracteriza a este subconjunto celular. En consonancia con esta observación está la noción de que, más que la expresión absoluta de los marcadores de CSC, es su proporción la que «califica» la propensión al tronco de las células cancerosas [28]. Teniendo en cuenta que el ratio de expresión CD44/CD24 en PANC-1 es mucho mayor que en BXPC-3, esto indicaría que, aunque menos poblado, el compartimento CSC en PANC-1 es cualitativamente más parecido a células madre. Por el contrario, el bajo nivel de expresión de los marcadores CSC ampliamente extendidos en la población celular de BXPC-3 los fenotiparía como progenitores tempranos. Esta diferencia en las dos líneas celulares de cáncer de páncreas podría explicar sus distintos fenotipos metabólicos y su sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos, así como al DCA.

La tecnología de cultivo celular tridimensional (3D) se ha convertido en un foco de investigación en biología celular tumoral. Comparados con los 2D, los cultivos 3D de líneas celulares implican un enriquecimiento en CSCs [30,54] y al imitar los gradientes metabólicos y proliferativos de los tumores in vivo, proporcionan una predicción más fiable de la respuesta a un posible tratamiento [55,56]. Desde esta perspectiva, probamos la eficacia del DCA en cultivos 3D obtenidos de PANC-1 y BXPC-3 y demostramos que el tratamiento con DCA comprometía la estructura y viabilidad de los esferoides ya formados y comprometía la formación de esferoides de ambas líneas celulares. En particular, a la dosis más alta, el DCA fue capaz de inhibir casi por completo la formación de esferoides de PANC-1. En consonancia con nuestras observaciones en cultivos 2D, los esferoides BXPC-3 fueron menos sensibles que los PANC-1 al tratamiento con DCA. Asimismo, en cultivos 2D también se observó una disminución significativa de Lin28 en los esferoides de ambas líneas celulares. Aunque los cambios descritos anteriormente en el nivel de expresión de marcadores de CSC ampliamente reconocidos en cultivos 2D y 3D no implican pruebas concluyentes del efecto del DCA en el compartimento de células madre del PDAC, proporcionan indicios hasta ahora no apreciados que merecen una mayor investigación. A nivel in vivo, el tratamiento con DCA provocó un crecimiento más lento, aunque no significativo, del cáncer en ratones portadores de tumores BxPC-3-luc en comparación con los ratones control, según se evaluó por la reducción del recuento de fotones y la disminución del volumen tumoral.

Para racionalizar los desconcertantes efectos del DCA sobre las líneas celulares de PDAC descritos en nuestro estudio, proponemos la siguiente secuencia hipotética de acontecimientos con el fin de estimular nuevas investigaciones (Figura 10). Sugerimos que, como consecuencia de una mayor oxidación del piruvato, se transfieren más equivalentes reductores a la cadena respiratoria mitocondrial con generación de ROS. Los complejos respiratorios son a la vez productores y diana de ROS [57], fomentando así un círculo vicioso que conduce a la inhibición progresiva de la transferencia funcional de electrones a lo largo de la cadena respiratoria, promoviendo un mayor desvío ROS-genético de electrones a O2. Además, la amortiguación de la actividad respiratoria puede causar la acumulación de intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico, así como de acetil-CoA. Cuando este último se acumula, se sabe que causa la lisina-acetilación y la inhibición de la función de varias proteínas mitocondriales, incluidos los complejos de la cadena respiratoria [58,59]. El daño/disfunción mitocondrial progresivo resultante se contrarresta mediante la regulación de la mitofagia. Todavía no se ha establecido cómo y si estas alteraciones mitocondriales mediadas por el DCA causan la detención del crecimiento y el recableado del fenotipo celular, en particular del compartimento de células madre cancerosas. Sin embargo, varias evidencias publicadas indican que un estado pro-oxidativo hace que las células madre salgan de su estado indiferenciado e induce/favorece el compromiso [60,61]. Además, las modificaciones epigenéticas, como las que causan la remodelación de la cromatina, regulan el equilibrio entre la pluripotencia y la diferenciación de las células madre [62,63]. Posiblemente, el estancamiento del ciclo TCA puede causar el eflujo de citrato en el citosol, donde libera acetil-CoA, aumentando así su disponibilidad para la acetilación de histonas. Obviamente, otros objetivos no caracterizados del DCA pueden contribuir o incluso dominar los efectos observados del fármaco.

Figura 10. Modelo de trabajo para los efectos del DCA Modelo de trabajo para los efectos del DCA descritos en este estudio. La vía de la oxidación mitocondrial del piruvato mediada por el DCA se muestra con flechas negras. PDK: piruvato deshidrogenasa cinasa; PDH: piruvato deshidrogenasa; TCA: ácido tricarboxílico; OAA: oxaloacetato. Las líneas rojas y los signos de interrogación en la mitocondria y el núcleo indican efectos hipotéticos directa o indirectamente relacionados con la acción del DCA. Véase la Discusión para más detalles.

En conclusión, nuestros resultados indican claramente que la eficacia del DCA en la inhibición del crecimiento de las células cancerosas no siempre está relacionada causalmente con su documentado efecto estimulante sobre la actividad PDH y, en consecuencia, con el efecto Warburg inverso. Deben considerarse mecánicamente otros objetivos secundarios en función del fenotipo celular. En este contexto, es relevante la evidencia, que emerge de este estudio, de que el compartimento CSC en líneas celulares derivadas de PDAC podría verse afectado por el tratamiento con DCA. Merecería la pena comprobar si esto ocurre en otros tipos celulares de cáncer, y en nuestro laboratorio se está trabajando en esta dirección. Los recientes proyectos de investigación que desarrollan nanopartículas cargadas de dicloroacetato y funcionalizadas en superficie [64], y fármacos multifunción obtenidos por agentes quimioterapéuticos con DCA como ligando [65 ] podrían ayudar a diseñar la formulación farmacológica dirigida adecuada para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas eficaces para combatir el cáncer de páncreas, así como otros tipos de cáncer.

Materiales complementarios

Los siguientes están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/2073-4409/8/5/478/s1: Figura S1: Efecto del DCA sobre la proliferación celular evaluada mediante XCELLigence en medio con bajo contenido en glucosa; Figura S2: Cicatrización por rascado; Figura S3: Efecto del DCA en la producción de lactato; Figura S4: Efecto del tratamiento con DCA durante 24 h sobre los flujos metabólicos; Figura S5: Efecto comparativo del DCA sobre los flujos metabólicos en líneas celulares de PDAC en condiciones de cultivo con glucosa baja (LG) y glucosa alta (HG); Figura S6: Expresión proteica de factores implicados en la fusión-fisión de mitocondrias (OPA1, MFN1/2); Figura S7: Evaluación de la capacidad de crecimiento de las líneas celulares de PDAC.

Contribuciones de los autores

T.T. planificación, investigación y redacción; F.A., C.P. (Consiglia Pacelli) y C.M. investigación; V.R. e I.L. conservación de datos; G.D.S. visualización; C.P. (Concetta Panebianco) y V.P. modelo animal; N.C. revisión y edición, y C.P. (Claudia Piccoli) conceptualización, supervisión.

Financiación

Esta investigación ha sido financiada por fondos de investigación actuales del Ministerio de Sanidad italiano al IRCCS CROB y por subvenciones del Ministerio de Sanidad italiano a través de la División de Gastroenterología (RC1703GA31 y RC1803GA30) Hospital IRCCS «Casa Sollievo della Sofferenza».

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.


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