Mao-fa Zheng1, Si-yu Shen, Wei-da Huang
1Departamentode Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Fudan, Handan Road 220, Shanghái, 200433, China.
Correo electrónico: e-mail: [email protected]
Recibido: 16 de mayo de 2013
Aceptado: 27 de agosto de 2013
Publicado: 17 de septiembre de 2013
Resumen
Propósito: La capecitabina es uno de los pocos fármacos de quimioterapia con alta disponibilidad oral. Recientemente, el dicloroacetato de sodio (DCA) ha mostrado un gran potencial como agente anticancerígeno. En el presente estudio, se evaluó el efecto anticancerígeno de DCA en combinación con capecitabina para los cánceres que modestamente expresado TP.
Métodos: Se utilizaron un aloinjerto de melanoma B16 de ratón y un xenoinjerto de cáncer de pulmón no microcítico humano A549 para evaluar el efecto del tratamiento combinado de DCA y capecitabina. Se utilizaron la histología y la inmunohistoquímica para detectar la apoptosis y la proliferación de las células cancerosas. Se realizaron PCR en tiempo real y Western blot para detectar la expresión de TP y caspasas, respectivamente.
Resultados: Por primera vez, informamos de que el DCA aumentó los efectos antitumorales de la capecitabina en un aloinjerto B16 de ratón y en un xenoinjerto A549 humano mediante la promoción de la apoptosis de las células tumorales. El DCA tiene poco efecto sobre la expresión de TP.
Conclusiones: Nuestro hallazgo sugiere que el DCA en combinación con capecitabina podría ser potencial como un nuevo régimen terapéutico contra algunos tipos de cáncer.
Palabras clave: DCA, Capecitabina, Combinación, Efecto antitumoral
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013
Cancer Chemother Pharmacol (2013) 72:1031-1041
DOI: 10.1007/s00280-013-2281-z
INTRODUCCIÓN
El dicloroacetato de sodio (DCA) es una pequeña sal molecular del ácido dicloroacético con un peso molecular de 150 Da. El DCA inhibe la actividad de la piruvato deshidrogenasa cinasa, activando así el complejo enzimático mitocondrial piruvato deshidrogenasa [1] y convirtiendo la vía metabólica glucolítica en fosforilación oxidativa. En los últimos 40 años, el DCA se ha utilizado como medicamento huérfano en el tratamiento de la acidosis láctica congénita infantil y otras acidosis lácticas complicadas por otras enfermedades [ 2] y ha demostrado una alta eficacia y una baja toxicidad tanto en ensayos preclínicos como clínicos [3]. Recientemente, el DCA ha mostrado un gran potencial como agente anticancerígeno debido a las similitudes en la remodelación metabólica de algunas células tumorales con la que se produce durante la acidosis láctica [4]. Las células cancerosas, especialmente las células madre cancerosas (CSC), se resisten a la apoptosis produciendo energía a través de la glucólisis y la fermentación del ácido láctico, en lugar de la fosforilación oxidativa, debido a la naturaleza hipóxica del microambiente tumoral, un fenómeno conocido como efecto Warburg [5,6]. Tras su administración oral, se ha demostrado que el DCA restaura la función mitocondrial y promueve selectivamente la apoptosis de las células tumorales en una vía dependiente de las mitocondrias [7,8]. Las actividades terapéuticas del DCA contra el glioblastoma se han probado en ensayos clínicos (NCT00540176) y han mostrado algunos resultados positivos [9]. Pero el ensayo de fase II NCT01029925 para determinar la tasa de respuesta del dicloroacetato oral en pacientes con cáncer de mama y de pulmón no microcítico recurrente y/o metastásico y pretratado se dio por finalizado debido a un riesgo superior al esperado y a problemas de seguridad. Así pues, la utilidad clínica del DCA para el control del cáncer necesita una estimación más cuidadosa.
Como sensibilizador de la apoptosis, el DCA también se ha utilizado en combinación con otras terapias contra el cáncer. Cao et al. [ 10] informaron que el DCA sensibilizaba las células de cáncer de próstata a la radiación in vitro. Xiao et al. [11 ] determinaron que el DCA potenciaba la muerte de células tumorales cuando se combinaba con un adenovirus oncolítico que expresaba el supresor tumoral MDA-7/IL-24. Recientemente, se ha demostrado que la terapia dirigida al metabolismo con DCA es una estrategia de tratamiento novedosa para mejorar el resultado de la terapia fotodinámica [12]. Tong et al. [13 ] descubrieron que el DCA y el 5-fluorouracilo mostraban un efecto antitumoral sinérgico en células de cáncer colorrectal in vitro. Sin embargo, sigue habiendo resultados controvertidos y dudas sobre el uso del DCA solo o en combinación con otros fármacos. Shahrzad et al. [14] demostraron que el DCA reducía la apoptosis de las células cancerosas en condiciones de hipoxia tanto in vitro como in vivo. Heshe et al. [ 15] advirtieron que el DCA reducía la citotoxicidad de algunos fármacos estándar contra el cáncer, como el cisplatino y la doxorrubicina, pero no afectaba a la actividad de la temozolomida en 7 de las 10 líneas celulares de su estudio. Estos resultados contradictorios implican que el uso de DCA solo o en combinación con otras terapias puede ser específico del tipo de cáncer y del agente.
La capecitabina es uno de los pocos fármacos quimioterápicos con alta disponibilidad oral y está autorizada como tratamiento de primera línea para el cáncer de recto metastásico o como tratamiento alternativo para el cáncer de mama metastásico cuando se combina con docetaxel [16,17]. La capecitabina es un profármaco del 5-fluorouracilo (5-FU) y requiere 3 reacciones enzimáticas para su conversión final a 5-FU en las células tumorales. La reacción final es catalizada por la timidina fosforilasa (TP), que se expresa en mayor medida en algunos tumores que en los tejidos normales [18]. Por tanto, el 5-FU citotóxico se genera en mayor grado en las células tumorales que en los tejidos no diana, lo que convierte a la capecitabina en un fármaco quimioterapéutico de baja toxicidad [18]. Los niveles de expresión de TP son diversos en los distintos tipos de tumores [18]; esto limita el uso de capecitabina sólo a algunos tipos de cáncer. En el presente estudio, evaluamos el efecto anticancerígeno del DCA en combinación con capecitabina en cánceres que expresaban modestamente TP. Nuestra hipótesis es que el DCA aumenta los efectos anticancerígenos y reduce la dosis efectiva de capecitabina. La combinación de DCA con capecitabina podría producir un buen régimen de tratamiento porque ambos agentes pueden tomarse por vía oral con una buena adherencia del paciente. Además, las formas genéricas de DCA pueden reducir la dosis efectiva de capecitabina, disminuyendo así los efectos secundarios y el coste del tratamiento del cáncer.
Materiales y métodos
Materiales
El dicloroacetatosódico(DCA, CSA:2156-56-1), con una pureza del 99 %, se obtuvo de Shanghai Jieshi Chemical Co., Ltd.
ltd. (China). el 5-fluorouracilo (5-FU) y la 5′-desoxifluorouridina (5-DFUR) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). El MTT se obtuvo de Shanghai Biological Engineering Co. ltd. (China). Los comprimidos de capecitabina (Xeloda) se obtuvieron de Roche (EE.UU.). El melanoma B16 de ratón y la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano A549 se obtuvieron de la American Type Cell Culture Collection (ATCC, EE.UU.).
Estudios en modelos animales
Modelo de aloinjerto
Los ratones C57BL/6, hembras de 6-8 semanas de edad y un peso aproximado de 18-20 g, se adquirieron en el Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) y se dejaron aclimatar durante 1 semana. Se inocularon por vía subcutánea (s.c.) un millón de células individuales B16 en el flanco derecho de los ratones C57BL/6. Los ratones se agruparon aleatoriamente, con 6 ratones por grupo en una jaula. Había dos grupos de ratones. A estos dos conjuntos de ratones se les administró DCA y capecitabina a los 3 y 10 días de la inoculación, respectivamente. El DCA se añadió al agua de bebida estéril hasta una concentración final de 1,4 g/L. La medición del volumen de agua consumida mostró que la cantidad de DCA administrada a cada ratón era aproximadamente igual a 100 mg/kg/día. Se molieron comprimidos de capecitabina y se suspendieron en agua estéril con 4 % de carboximetilcelulosa para hacer diferentes concentraciones. Se administraron por vía intragástrica 200 microlitros de las suspensiones de capecitabina a cada ratón. Cada 2 días, se midieron los diámetros largo (a) y corto (b) de los tumores con un calibre vernier y se registró el peso corporal. El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula V = 0,5ab2. Veintidós días después de la inoculación, se sacrificó a los ratones y se extrajeron y pesaron los tumores.
Modelo de xenoinjerto
Los ratones BALB/c-nu, machos, de 5-6 semanas de edad y un peso aproximado de 18-20 g, se adquirieron en el Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) y se dejaron aclimatar durante 1 semana. Se inocularon s.c. en la región del flanco derecho de ratones BALB/c-nu machos secciones de aproximadamente 2 × 2 mm de tejidos tumorales A549 recién picados, procedentes de ratones BALB/c-nu previamente inoculados con células A549. Se administró DCA y capecitabina a los ratones cuando su volumen tumoral alcanzó ~0,2 cm3. Entre treinta y treinta y cinco días después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se extrajeron y pesaron los tumores. Los demás métodos fueron los mismos que los descritos en el experimento de aloinjerto.
Los estudios con animales fueron aprobados por el Grupo de Ética y Bienestar Animal del Departamento de Ciencia de Animales de Laboratorio de la Universidad de Fudan.
Histología e inmunohistoquímica
El examen histológico de los nódulos tumorales se realizó con animales adicionales (3 ratones por grupo) que no se tuvieron en cuenta para el seguimiento del crecimiento tumoral. Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% (p/v) y, tras una noche de fijación a temperatura ambiente, las muestras se deshidrataron en etanol graduado y se incrustaron en parafina. A continuación, se cortaron aleatoriamente diferentes partes del tumor para realizar secciones de 4 μm en el micrótomo Leica. Tras la desparafinación y rehidratación, se eligieron tres secciones de diferentes partes de cada muestra para las operaciones de seguimiento. Se realizaron las tinciones TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling) y DAPI (4′6-diamidino-2-phenylindole) siguiendo las instrucciones del fabricante de los kits TUNEL y DAPI (Beyotime, China). Las secciones se analizaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Olympus, Japón). La detección del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) se llevó a cabo tras la desparafinación de la sección y la incubación a 96-100 °C durante 20 minutos. La actividad de la peroxidasa endógena se apagó con peróxido de hidrógeno al 0,3% (v/v) en metanol al 60% (v/v) durante 30 minutos. La adsorción no específica se redujo al mínimo incubando las secciones en suero normal de cabra al 2 % (v/v) en PBS durante 20 minutos. Las secciones de tejido se incubaron durante toda la noche con anticuerpo policlonal de conejo anti-PCNA (Abcam; 1:100 en PBS), se lavaron con PBS 3 veces, 30 min por vez, y se incubaron con un IgG de cabra anti-conejo conjugado con biotina durante 2 h a 37 °C y con el complejo avidina-biotina-peroxidasa durante 1 h a 37 °C. Las secciones se contrateñían con hemoglobina y suero de cabra normal en PBS durante 20 min. Los cortes se contrateñían con hematoxilina (Sigma-Aldrich) y se analizaban mediante microscopía óptica (Olympus, Japón). Se utilizaron tres tumores por grupo para el análisis inmunohistoquímico. Se seleccionaron ciegamente una o dos secciones por tumor para medir las células positivas para PCNA o TUNEL. Se midieron ciegamente cinco campos aleatorios por portaobjetos con un aumento de 400× (n = 250 células por grupo). Al realizar el análisis cuantitativo de las células TUNEL-positivas, se excluyeron las posibles células necróticas observando la morfología nuclear con tinción DAPI. Se realizaron controles positivos y negativos para garantizar la exactitud de los resultados.
Extracción de proteínas y Western blot
Los tejidos tumorales de cada grupo (3 ratones adicionales por grupo) se agruparon y trituraron bajo nitrógeno líquido y, a continuación, se lisaron en 150 μL de tampón de lisis tisular (Beyotime, China). Los tubos se agitaron enérgicamente durante 1 min, se colocaron en hielo durante 20 min y se centrifugaron a 5.000 g durante 5 min a 4 °C. La concentración de proteína total se determinó utilizando un kit de determinación de proteína BCA (BioRad). Treinta microgramos de proteína total de cada muestra se separaron mediante SDS-PAGE en un gel al 10 %, se transfirieron a una membrana de PVDF, se bloquearon, se incubaron durante una noche con el anticuerpo primario, se incubaron durante 1 h con el anticuerpo secundario y se revelaron con el sustrato cromogénico NBT/BCIP. El anticuerpo monoclonal de ratón anticaspasa 3 (1:500), el anticuerpo anticaspasa 9 (1:1.000), el anticuerpo anti-β-actina (1:2.000) y el anticuerpo policlonal de conejo anticaspasa 8 (1:1.000) se obtuvieron de Beyotime (Nanjing, China). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-TP (1:2.000) procedía de Abcam (Reino Unido). la β-actina se utilizó como control interno. La densidad de bandas del Western blot se analizó con Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, China).
PCR en tiempo real
Los tumoresB16y los tejidos hepáticos se resecaron del mismo ratón C57BL/6 previamente inoculado con células B16 (se utilizaron 3 ratones, regalo de Wenlong Ren del Instituto de Industria Farmacéutica de Shanghai). Colo205/A549 y tejidos hepáticos fueron resecados del mismo ratón BALB/c-nu previamente inoculado con células Colo205/A549 (se utilizaron 3 ratones, respectivamente, regalo de Wenlong Ren en el Instituto de Industria Farmacéutica de Shanghai). Para el análisis de la expresión de TP tras el tratamiento, se agruparon muestras tumorales de 3 tejidos tumorales de igual peso de cada grupo. El ARN total se aisló con el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y se transcribió inversamente con el kit reactivo PrimeScript® RT (Takara, Japón). El ADNc se normalizó con β-actina. La PCR en tiempo real se realizó por métodos de tres pasos utilizando el kit SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Japón) con una temperatura de recocido de 55 °C y 40 ciclos de amplificación. Cada prueba se realizó por triplicado. se utilizó β-actina como control interno. La cantidad relativa de cada ADNc se analizó mediante2-△△Ct. Cebadores para la PCR en tiempo real: β-actina F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ y β-actina R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ y hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ y mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.
Estadísticas
Se utilizaron comparaciones múltiples ANOVA con análisis post hoc (prueba de Tukey), utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., EE.UU.). Los datos se presentan como media ± SEM, y P < 0,05 se consideró significativo.
Resultados
Expresión de TP en melanoma B16 de ratón y en tumores humanos de NSCLC A549
La expresión de TP en tumores B16 y A549 extirpados de ratones se analizó mediante PCR en tiempo real. El hígado humano expresa relativamente más TP que otros tejidos normales [18]. En un tipo de cáncer típico que es adecuado para el tratamiento con capecitabina, la expresión de TP en el tumor es cercana o superior a la de los hígados, los cánceres colorrectal y de mama, por ejemplo [18,19]. En xenoinjertos de cáncer humano, los cánceres con alta actividad de TP fueron más susceptibles al tratamiento con capecitabina que aquellos con baja actividad de TP [20]. Se eligió como referencia la línea celular de cáncer colorrectal Colo205 por su moderada expresión de TP y su moderada sensibilidad a la capecitabina [21]. Como se muestra en la Fig. 1a, los niveles de transcripción de TP en Colo205 fueron un poco más altos que en el hígado del ratón BALB/c-nu. Como se muestra en la Fig. 1b, c, los niveles de transcripción de TP en los tumores B16 y A549 eran cercanos a los de los hígados de ratón. Por lo tanto, B16 y A549 también eran líneas celulares moderadamente expresivas de TP. Podemos deducir que B16 y A549 responderán al tratamiento con capecitabina hasta cierto punto sin cubrir el efecto del DCA. Así pues, los modelos de aloinjerto B16 y xenoinjerto A549 eran adecuados para estudiar el efecto antitumoral del DCA y la capecitabina en combinación.
El DCA aumenta el efecto antitumoral de la capecitabina en un aloinjerto de melanoma B16 de ratón sin toxicidad adicional
Dado que la naturaleza hipóxica del microambiente tumoral es crítica para una actividad óptima del DCA, el efecto antitumoral del DCA más la capecitabina se probó en modelos animales en lugar de en líneas celulares. Se inocularon 36 ratones C57BL/6 con 1 ×106 células de melanoma B16 y se dividieron aleatoriamente en 6 grupos (n = 6): un grupo de control que no recibió ningún fármaco, un grupo de DCA solo, un grupo de 10 mg/día de capecitabina sola y 3 grupos de DCA más 5, 10 o 20 mg/día de capecitabina. Tres días después de la inoculación de células tumorales, se administró a los ratones DCA en agua potable y capecitabina oral (p.o.) como agentes únicos o en combinación con concentraciones crecientes de capecitabina. Como se muestra en el panel superior de la Fig. 2a, tanto el tratamiento con DCA como con 10 mg/día de capecitabina por sí solos inhibieron modestamente el crecimiento de los tumores de melanoma B16 en comparación con el grupo control. Por el contrario, el DCA más 10 mg/día de capecitabina aumentó significativamente la inhibición del crecimiento tumoral (P < 0,05). El efecto antitumoral del DCA más 20 mg/día de capecitabina fue similar al observado con el DCA más 10 mg/día de capecitabina; el crecimiento tumoral se inhibió casi por completo. Cabe destacar que los ratones tratados con DCA más 20 mg/día de capecitabina experimentaron una pérdida aguda de peso corporal (Fig. 2a, panel inferior), mientras que el DCA más 10 mg/día de capecitabina tuvo poco efecto sobre el peso corporal en comparación con el control.
Para evaluar el efecto antitumoral del DCA más capecitabina contra tumores palpables y detectables, 10 días después de la inoculación de células tumorales, se administró DCA y capecitabina solos o en combinación a un segundo grupo de 36 ratones C57BL/6 inoculados con 1 ×106 células de melanoma B16. Los ratones con tumores palpables se separaron aleatoriamente en 4 grupos (n = 9, 3 ratones se utilizaron para el análisis inmunohistoquímico), control, DCA solo, capecitabina sola a 7,5 mg/día, y DCA más capecitabina a 7,5 mg/día. Como se muestra en el panel superior de la Fig. 2b, el DCA más 7,5 mg/día de capecitabina inhibió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el DCA o la capecitabina solos (P < 0,05). Veintidós días después de la inoculación, el DCA más 7,5 mg/día de capecitabina inhibieron el crecimiento tumoral en un 75% (P < 0,05), mientras que el DCA y la capecitabina solos sólo inhibieron el crecimiento en un 25% y un 35%, respectivamente (P < 0,05). El DCA no causó ninguna pérdida aguda de peso corporal en comparación con el tratamiento con capecitabina sola (Fig. 2b, panel inferior). Estos resultados muestran que el DCA y la capecitabina pueden tener un efecto antitumoral sinérgico en los tumores de melanoma B16.
El DCAaumenta el efecto antitumoral de la capecitabina en un modelo de xenoinjerto de CPNM humano A549 sin toxicidad adicional
Anteriormente se había descrito que el CPNM humano podía tratarse con DCA [7] o capecitabina [22-24]. En el presente estudio, investigamos el efecto antitumoral del DCA más capecitabina en un modelo de xenoinjerto de CPNM humano A549. Sesenta y seis ratones machos BALB/c-nu con tumores humanos NSCLC A549 (~2 × 2 mm) inoculados s.c. en el flanco derecho fueron separados aleatoriamente en 9 grupos: control; DCA solo; 2,5, 5, 7,5 o 10 mg/día de capecitabina sola; o DCA más 2,5, 5 o 7.5 mg/día de capecitabina (n = 6, excepto control, DCA solo, 7,5 mg/día de capecitabina y DCA más 7,5 mg/día de capecitabina; en estos grupos, n = 9, se utilizaron 3 ratones para el análisis inmunohistoquímico y el análisis Western blot o PCR en tiempo real). La capecitabina a 10 mg/día se estableció como control de dosis alta. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 0,15-0,2 cm3, se administraron los fármacos a los ratones. La capecitabina se administró p.o. en una pauta de 14 días de encendido/7 días de apagado. Como se muestra en los paneles izquierdos de la Fig. 3a, b y c, el DCA solo tuvo un ligero efecto inhibidor del crecimiento en los tumores A549; este hallazgo fue inconsistente con los de informes anteriores [7] en los que el DCA solo mostró un mayor efecto antitumoral. La capecitabina sola a 10 mg/día inhibió enérgicamente el crecimiento de los tumores A549, pero se observó una drástica pérdida de peso corporal, lo que implicaba una toxicidad grave (Fig. 3a, b, c, paneles derechos). Como se muestra en el panel izquierdo de la Fig. 3a, 2,5 mg/día de capecitabina sola redujeron significativamente el crecimiento de los tumores A549; la combinación de DCA más 2,5 mg/día de capecitabina aumentó la inhibición del crecimiento. La curva de aumento del volumen tumoral del tratamiento con DCA solo sugiere que la capecitabina ejerce el efecto antitumoral dominante en el tratamiento combinado. El efecto del DCA más 5 mg/día de capecitabina fue ligeramente mejor que el del DCA más 2,5 mg/día de capecitabina, aunque peor que el de 10 mg/día de capecitabina sola, y no se observó una pérdida significativa de peso corporal (Fig. 3b, panel derecho). Cabe destacar que el DCA más 5 mg/día de capecitabina aumentó significativamente la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con 5 mg/día de capecitabina sola (Fig. 3b, panel izquierdo). El efecto antitumoral de la combinación fue similar al del tratamiento con 10 mg/día de capecitabina, pero sin pérdida significativa del peso corporal (Fig. 3b, panel derecho). El efecto de 7,5 mg/día de capecitabina sola (Fig. 3c) fue ligeramente mejor que el de 5 mg/día de capecitabina sola; sin embargo, cuando se combinó con DCA, no hubo diferencias significativas entre DCA más 7,5 mg/día de capecitabina y DCA más 5 mg/día de capecitabina. Estos resultados implican que el DCA puede reducir la dosis de capecitabina sin perder los efectos antitumorales ni aumentar la toxicidad.
El DCA aumenta el efecto apoptótico de la capecitabina sobre las células B16 y A549 in vivo
El examen histológico de los tumores de melanoma B16 se realizó 7 días después del inicio del tratamiento. La tinción TUNEL reveló que el tratamiento de los tumores de melanoma B16 con DCA o capecitabina 7,5 mg/día solos inducía una apoptosis celular del 8 y el 17 %, respectivamente. En combinación, el DCA más 7,5 mg/día de capecitabina indujeron apoptosis hasta aproximadamente el 30 %, más que la suma de los tratamientos individuales combinados (Fig. 4a, c, panel izquierdo). La tinción de PCNA en los tumores de melanoma B16 reveló que el DCA por sí solo tenía poco impacto en la proliferación, mientras que 7,5 mg/día de capecitabina por sí sola reducía significativamente la proliferación. El DCA más 7,5 mg/día de capecitabina no aumentó la inhibición de la proliferación de la capecitabina sola en las células tumorales B16 (Fig. 4b, c, panel derecho).
De forma similar a los tumores de melanoma B16, el tratamiento de los tumores NSCLC A549 con DCA o 7,5 mg/día de capecitabina solos indujo la apoptosis en un 15 y un 30 %, respectivamente. Cuando se combinaron, el DCA más 7,5 mg/día de capecitabina indujeron la apoptosis en un 50%, más que la suma de los tratamientos con agentes únicos (Fig. 5a, b). Estos resultados sugieren que el DCA y la capecitabina tienen un efecto sinérgico sobre la apoptosis de las células tumorales NSCLC A549. El DCA no aumentó la inhibición de la proliferación de la capecitabina en las células tumorales NSCLC A549 (datos no mostrados).
Western blot mostró que el DCA tenía poco efecto sobre la expresión y activación de procaspasa 8, procaspasa 9 y procaspasa 3 en tumores NSCLC A549 en comparación con el control en el día 7 después del tratamiento (Fig. 5c, d). La capecitabina sola a 7,5 mg/día aumentó la activación de las 3 procaspasas (Fig. 5c, d). Curiosamente, aunque el DCA solo tuvo poco efecto sobre la expresión y la activación de las 3 procaspasas, el DCA más capecitabina promovió la expresión de la procaspasa 8 y la procaspasa 3 en comparación con el tratamiento con capecitabina sola y aumentó la activación de la procaspasa 8, la procaspasa 9 y la procaspasa 3. El DCA más capecitabina aumentó la expresión de la procaspasa 8 y la procaspasa 3 en comparación con el tratamiento con capecitabina sola.
ElDCA tiene poco efecto sobre la expresión de TP en el tumor
Analizamos la expresión de TP en muestras tumorales del xenoinjerto A549 en el día 7 post-tratamiento. Tanto la PCR en tiempo real (Fig. 6a) como el Western blot (Fig. 6b) mostraron que el DCA como agente único o en combinación con capecitabina tiene poco efecto sobre la expresión de TP, lo que significa que el mecanismo de combinación de DCA y capecitabina fue diferente de otros sinergistas de capecitabina reportados previamente [19,25-27]. La PCR en tiempo real también mostró que el DCA no afectaba a la expresión de otras enzimas metabólicas de la capecitabina (timidilato sintasa, orotato fosforribosil transferasa, dihidropirimidina deshidrogenasa, timidina quinasa 1 y citidina deaminasa, datos no mostrados). Los resultados sugieren que el DCA tiene poco efecto sobre el metabolismo de la capecitabina, lo que no aumentaría la toxicidad de ésta.
Discusión
El DCA solo o en combinación con otras terapias se ha probado en ensayos clínicos; sin embargo, no se dispone de informes sobre los efectos antitumorales del DCA en combinación con capecitabina. Nuestra hipótesis era que el efecto promotor de la apoptosis del DCA sobre las células tumorales sólidas las haría más sensibles a la capecitabina. En el presente estudio, 1,4 g/L de DCA por sí solo tuvo escaso efecto sobre el crecimiento tumoral del NSCLC A549 en ratones. Sin embargo, la administración combinada de DCA y capecitabina fue capaz de reducir la dosis efectiva de capecitabina en un 50 %. El DCA aumentó el efecto antitumoral de la capecitabina in vivo a través de la sensibilización a la apoptosis. El DCA tiene poco efecto sobre el metabolismo de la capecitabina, lo que no aumentaría la toxicidad de la capecitabina.
Dado que se han notificado resultados tanto positivos como negativos (como se muestra en la sección Introducción), sigue existiendo controversia sobre el uso del DCA como agente anticanceroso. Esta discrepancia puede deberse a las diferentes condiciones experimentales, especialmente entre los resultados in vivo e in vitro. Los ensayos celulares utilizados en el presente estudio mostraron que las células tumorales son insensibles al DCA cuando se cultivan in vitro, el IC50 es superior a 50 mM. (datos no mostrados). El efecto del DCA sobre las células cancerosas no se debe a una citotoxicidad directa, sino que depende del patrón metabólico de las células cancerosas [7, 28]. Las líneas celulares cultivadas in vitro no pueden replicar el microambiente tumoral y pueden perder el «efecto Warburg». Por lo tanto, los ensayos in vitro basados en células pueden no ser los sistemas modelo más relevantes para determinar el uso del DCA. Por ello, en el presente estudio se evaluó en primer lugar el efecto antitumoral combinado del DCA y la capecitabina en modelos tumorales de ratón in vivo. También observamos que el efecto del DCA en el xenoinjerto de NSCLC A549 en el presente estudio fue menor que el descrito por Bonnet et al. [7], aunque se utilizó una dosis mayor de DCA. Esto puede deberse a la diferencia en la capacidad metabólica del DCA entre ratones y ratas. Los resultados sugieren que el efecto del DCA puede verse afectado por el estado de las células cancerosas y de los pacientes, lo que requiere un estudio cuidadoso en el uso clínico del DCA en el tratamiento del cáncer.
En el presente estudio, los estudios en modelos animales demostraron que el DCA por sí solo mostraba un efecto antitumoral leve contra tumores establecidos. Pero cuando se combinó con capecitabina, el DCA aumentó drásticamente el efecto antitumoral de la capecitabina, lo que puede observarse tanto en los estudios de modelos animales como en los resultados de la inmunohistoquímica de la apoptosis. En consonancia con ello, el análisis Western blot mostró que el DCA por sí solo tenía poco efecto sobre la expresión y la escisión de las procaspasas. Pero cuando se combina con capecitabina, el DCA aumenta notablemente la expresión y la división de las procaspasas 8, 9 y 3. Se ha informado de que los agentes citotóxicos, como el 5-Fu, pueden provocar un aumento de la expresión y activación de la caspasa 8 [29,30]. La razón por la que la capecitabina conduce a un aumento de la expresión y activación de la caspasa 9 aún no está clara. Podría estar relacionado con el efecto antiangiogénico de la capecitabina. Se ha descrito que el DCA puede normalizar el eje mitocondria-canal K+ y actuar como sensibilizador de la apoptosis [7]. Especulamos que el DCA puede despolarizar el potencial mitocondrial de las células cancerosas normalizando el eje, y por lo tanto aumentar la activación de la caspasa 8 y la caspasa 9 por la capecitabina. El aumento de la activación de la caspasa 8 y la caspasa 9 conduce a un aumento de la activación de la caspasa 3.
Recientemente se ha puesto de relieve la contribución crítica de las CSC, con su mayor capacidad tumorigénica y su resistencia a la radioterapia y la quimioterapia, al comportamiento maligno [31]. Se ha informado de que las CSCs en tumores sólidos juegan un papel importante en las características antiquimioterapia y antirradioterapia de los tumores [32, 33]. Se han discutido muchas terapias dirigidas a las CSCs [34,
], y las terapias combinadas dirigidas tanto a las CSCs como a las células cancerosas «normales» han despertado un gran interés [36-38]. Se ha descrito que el DCA induce la apoptosis en células madre putativas de glioblastoma, tanto in vitro como in vivo [9]. En nuestro estudio, después de 7 días de tratamiento con DCA, el número de células CD133-positivas en los portaobjetos de tumores A549 determinado por inmunohistoquímica se redujo al 0,5% en comparación con el 6% en el grupo de control (datos no mostrados), lo que nos lleva a especular que el DCA también puede tener efecto en la inducción de la apoptosis en CSCs de cáncer de pulmón. Especulamos que el DCA puede sensibilizar las células tumorales, especialmente las CSC, a la capecitabina. La combinación de DCA y capecitabina actúa de dos maneras contra las células tumorales: la capecitabina se dirige a las células cancerosas «normales», evitando las CSC, y el DCA se dirige a las CSC y promueve la apoptosis de la capecitabina. Otro escenario probable para explicar los efectos de la combinación es que el DCA suprimiera la angiogénesis del cáncer in vivo [9], en la que el DCA no muestra un efecto directo sobre las células cancerosas. Además de su actividad antitumoral clásica, la capecitabina también puede actuar como antiangiogénico molecular según estudios recientes [39]. El DCA puede aumentar el efecto antiangiogénico de la capecitabina, lo que explica el efecto antitumoral combinado. Se realizarán estudios en profundidad para determinar el mecanismo detallado.
En conclusión, utilizamos modelos de tumores injertados singenéticos y xenoinjertados para estudiar el efecto antitumoral combinado del DCA y la capecitabina y descubrimos que el DCA potenciaba el efecto antitumoral de la capecitabina por primera vez. Determinamos que el DCA tenía la capacidad de sensibilizar las células cancerosas y aumentar los efectos apoptóticos de la capecitabina. Cuando se administraba en combinación, el DCA era capaz de reducir la dosis efectiva de capecitabina sin aumentar la toxicidad. El DCA oral, genérico y de bajo coste, en combinación con la capecitabina oral, puede ser un buen régimen terapéutico contra el cáncer.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a Wenlong Ren, del Instituto de Industria Farmacéutica de Shanghai, por su ayuda en la preparación de los modelos tumorales de ratón.
Conflicto de intereses
Ninguno.
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