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TATSUAKI ISHIGURO1,2, MIYU ISHIGURO1, RYUMEI ISHIGURO1 y SAYURI IWAI1

1 Departamento de Terapéutica Experimental, Kamui Medical Co., Ltd., Tokio 1120002
2 ClínicaHibiya Uchisaiwaicho, Tokio 1050004, Japón.

Correspondencia: Dr. Tatsuaki Ishiguro, Kamui Medical Co., Ltd., 2-20-13 Koishikawa Bunkyo-ku, Tokio 1120002, Japón
Correo electrónico: [email protected]

Recibido: 14 de noviembre de 2011
Aceptado: 28 de diciembre de 2011
DOI: 10.3892/ol.2012.552

Resumen

Se ha informado de que el tratamiento de células cancerosas con dicloroacetato (DCA), un tratamiento aprobado para la acidosis láctica congénita, revierte el efecto Warburg e inhibe el crecimiento tumoral). Además, el omeprazol (OMP) es un conocido agente que potencia los efectos de los fármacos contra el cáncer. El objetivo de este estudio era encontrar fármacos de uso clínico que potenciaran los efectos del DCA. La combinación de DCA y OMP mostró una actividad antitumoral más potente que el DCA solo en células de fibrosarcoma HT1080 y células de cáncer de colon RKO, mientras que los fármacos no afectaron a la proliferación de fibroblastos humanos WI-38. El efecto inhibidor del DCA combinado con OMP se invirtió con vitamina E y Z-VAD-FMK; por lo tanto, se sugirió la inhibición convencional del crecimiento celular dependiente de la caspasa a través de la producción de superóxido como mecanismo de inhibición. La combinación de estos fármacos también tuvo efecto sobre las células de fibrosarcoma HT1080 inoculadas en ratones. Dado que OMP y DCA pueden administrarse por vía oral y se han utilizado clínicamente durante varios años sin efectos secundarios importantes, creemos que esta terapia combinada podría trasladarse fácilmente al tratamiento de tumores malignos.

Palabras clave: fibrosarcoma, cáncer de colon, dicloroacetato, omeprazol
Abreviaturas: DCA: dicloroacetato; IBP: inhibidor de la bomba de protones; OMP: omeprazol; SOD: superóxido; ROS: especies reactivas del oxígeno


Introducción

Warburg observó por primera vez que, incluso en presencia de oxígeno suficiente, las células cancerosas prefieren metabolizar la glucosa y producir ácido láctico [1-4]. El aumento concomitante de la captación de glucosa puede aprovecharse clínicamente para la detección de la mayoría de los tumores malignos sólidos mediante tomografía por emisión de positrones con fluorodesoxiglucosa (FDG-PET). Una posible razón por la que los cánceres adoptan esta vía menos eficiente para producir trifosfato de adenosina (ATP) en comparación con la fosforilación oxidativa es su ventaja para la supervivencia y proliferación en el entorno tumoral hipóxico único [5]. Esta preferencia por la respiración anaeróbica también se considera la razón de la resistencia que muestran las células cancerosas a los fármacos contra el cáncer que inducen la apoptosis a través de la vía mitocondrial. Bonnet et al han informado de que el tratamiento de células cancerosas con dicloroacetato (DCA), un tratamiento aprobado para la acidosis láctica congénita, invierte el efecto Warburg e inhibe el crecimiento tumoral (3,4,6-8). El DCA aumenta el flujo de piruvato hacia la mitocondria mediante la inhibición de la piruvato deshidrogenasa cinasa y promueve la oxidación de la glucosa frente a la glucólisis. Como resultado, el DCA disminuye la producción de ácido láctico por el tumor y aumenta el pH intracelular. El DCA induce la apoptosis a través de dos vías, una en la mitocondria, donde la despolarización y la producción de superóxido (SOD) activan la apoptosis dependiente de la mitocondria, y la otra a nivel plasmalemmal, donde la activación/regulación de los canales Kv1.5 disminuye el (K+)i, activando las caspasas [6]. El DCA es un fármaco anticanceroso prometedor debido a la comodidad de su administración oral, su bajo coste, sus escasos efectos secundarios y su larga experiencia de uso clínico [7,8]. Aunque parecía ser un tratamiento prometedor para los tumores malignos, su efecto es limitado en un informe en curso de ensayos clínicos. Por lo tanto, nos propusimos encontrar fármacos de uso clínico que potenciaran los efectos del DCA.
El omeprazol (OMP) es un inhibidor de la bomba de protones (IBP) y también se sabe que potencia los efectos de los fármacos contra el cáncer [9]. El OMP inhibe la actividad de la V-ATPasa además de dirigirse a la bomba de ácido gástrico. Se ha descrito que inhibe la proliferación de células tumorales, posiblemente mediante la alcalinización de los lisosomas y la permeabilización de las membranas de los lisosomas, seguida de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [10,11].
Como se ha descrito, se cree que el DCA y el OMP inhiben el crecimiento de las células tumorales a través de la vía común de producción de ROS influyendo en los niveles de pH intracelular. Dado que estos dos fármacos se utilizan clínicamente con efectos secundarios menores, creemos que su combinación es un protocolo prometedor para el tratamiento del cáncer.

Materiales y métodos

Productos químicos
El DCA y la vitamina E (acetato de tocoferol) se adquirieron en Wako Chemical Industries, Ltd. (Tokio, Japón). (Tokio, Japón). El OMP se adquirió a Astra Zeneca Japan (Osaka, Japón). Z-VAD-FMK se adquirió en el Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japón).

Cultivo celular
Las células de fibrosarcoma humano HT1080, las células de fibroblastos humanos WI-38 y las células de cáncer de colon RKO se sembraron y cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y se mantuvieron en una incubadora a 37˚C y un 5% deCO2. Para los experimentos de proliferación celular, las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se incubaron en las mismas condiciones. Al cabo de 7 días, las células se trataron con tripsina-EDTA y se contaron al microscopio.

Experimentos con animales
Se inocularon células HT1080 (5×106 ) por vía subcutánea en ratones desnudos (hembras 8w). Los fármacos se añadieron al agua de bebida para conseguir una dosis diaria similar a la utilizada clínicamente (DCA 50 mg/kg, OMP 2 mg/kg). El tamaño de cada tumor se midió con un calibre y el volumen tumoral se calculó multiplicando tres diámetros.

Resultados

Eltratamiento combinado de DCA y OMP inhibió la proliferación celular
Se cultivaron células de fibrosarcoma humano HT1080 con concentraciones crecientes de DCA y OMP durante 7 días, lo que produjo una inhibición de la proliferación dependiente de la dosis (Fig. 1). Como se muestra en la Fig. 2A, la combinación de DCA y OMP bloqueó notablemente la proliferación de las células de fibrosarcoma HT1080, mientras que la misma combinación no afectó a la proliferación de las células de fibroblastos humanos normales WI-38.

Figura 1. Inhibición dependiente de la dosis de células de fibrosarcoma HT1080 Inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células de fibrosarcoma HT1080 por DCA y OMP. Se cultivaron células humanas HT1080 (5×103) con concentraciones crecientes de DCA (0,45-1,35 mM) y OMP (20-160 μM). Las células se cosecharon al cabo de 7 días y se contaron al microscopio. DCA, dicloroacetato; OMP, omeprazol.


Figura 2. (A) Efecto del tratamiento combinado de DCA y OMP sobre células de fibrosarcoma HT1080 y fibroblastos humanos normales WI-38. Se cultivaron células de fibrosarcoma HT1080 (5×103) o fibroblastos humanos normales WI-38 con 0,9 mM de DCA y 40 μM de OMP. Las células se cosecharon al cabo de 7 días y se contaron al microscopio. *P<0,05 frente al control. (B) Efectos de la vitamina E y Z-VAD-FMK sobre los efectos inhibidores del crecimiento celular del DCA y OMP. Se cultivaron células de fibrosarcoma HT1080 (5×103) con 1,2 mM de DCA o 40 μM de OMP. Se añadió vitamina E (10 μM) o Z-VAD-FMK (50 μM). Las células se cosecharon a los 7 días y se contaron al microscopio. * P<0,05 frente a DCA solo, +p<0,05 frente a OMP solo. DCA: dicloroacetato; OMP: omeprazol; Vit E: vitamina E.


Vitamina Einhibió los efectos de DCA y OMP
Aunque ha habido controversia sobre el mecanismo de la inhibición del crecimiento celular dependiente de caspasas por OMP [10,11], se ha informado de que DCA y OMP inhiben el crecimiento de células tumorales a través de la producción de SODs (6,10). Para establecer si se aplicaba el mismo mecanismo en las células de fibrosarcoma HT1080, utilizamos vitamina E como inhibidor de la SOD. La vitamina E inhibió con éxito los efectos del DCA y el OMP, por lo que se pensó que la producción de SOD estaba implicada en la inhibición del crecimiento de las células tumorales (Fig. 2B). El inhibidor pan-caspasa Z-VAD-FMK también inhibió los efectos de estos fármacos; por tanto, se pensó que un mecanismo antitumoral dependiente de caspasas estaba implicado, al menos en parte, en estos procesos (Fig. 2B). En conjunto, el DCA y el OMP inhiben el crecimiento de las células de fibrosarcoma HT1080, posiblemente a través de una vía dependiente de la caspasa mediante la producción de SOD. Como resultado, los fármacos pueden exhibir un efecto sinérgico cuando se combinan. Este efecto sinérgico y el efecto inhibidor con vitamina E también se observaron en células de cáncer de colon RKO (Fig. 3).

Figura 3. Efecto del tratamiento combinado de Efecto del tratamiento combinado de DCA y OMP en células de cáncer de colon RKO. Las células de cáncer de colon RKO (5×103) se cultivaron con 0,9 mM de DCA, 40 μM de OMP, 0,9 mM de DCA+40 μM de OMP o 0,9 mM de DCA+40 μM de OMP+10 μM de vitamina E. Las células se cosecharon al cabo de 7 días y se contaron al microscopio. *P<0,05 frente a control, +p<0,05 frente a DCA+OMP. DCA: dicloroacetato; OMP: omeprazol; Vit E: vitamina E.


Realizamos experimentos con animales para investigar los efectos del DCA y el OMP in vivo.
Como
se muestra en la Fig. 4, el efecto antitumoral de la combinación de DCA y OMP también fue mayor que el de cualquiera de los fármacos por separado.

Figura 4. Se inocularon células HT1080 (5×106) por vía subcutánea en ratones desnudos. Los fármacos se añadieron al agua de bebida para alcanzar una dosis diaria similar a la utilizada clínicamente (DCA 50 mg/kg, OMP 2 mg/kg). El tamaño de cada tumor se midió con un calibre y el volumen tumoral se calculó multiplicando tres diámetros. *P<0,05 frente al control. DCA, dicloroacetato; OMP, omeprazol.

Discusión

Hemos demostrado que un tratamiento combinado de DCA y OMP es más eficaz que el tratamiento con cualquiera de los dos fármacos por separado en células de fibrosarcoma humano HT1080 y células de cáncer de colon RKO. La terapia combinada también fue eficaz en experimentos con animales.
El DCA y el OMP se han utilizado con seguridad durante varios años, pero no están clasificados como medicamentos contra el cáncer. El DCA se ha utilizado para tratar la acidosis metabólica congénita y el OMP se ha utilizado para tratar enfermedades relacionadas con el ácido, ambos sin efectos secundarios importantes [7,8,12,13]. Se espera que la combinación de DCA y OMP reduzca la dosis necesaria de cada fármaco y los riesgos que conlleva.
Se ha notificado que dosis orales de 20 mg de OMP una vez al día conducen a una concentración plasmática máxima en pacientes de ~2,5 µg/ml (7 µM) 2 h después de administrar la dosis[14]. Se ha utilizado una dosis de 120 mg de PDO tres veces al día para el tratamiento del síndrome de Zollinger-Ellison, con efectos secundarios leves y poco frecuentes incluso tras un uso prolongado [15,16]. Esta dosis corresponde a una hipotética concentración máxima in vivo de ~15 µg/ml (42 µM). Se han tolerado sobredosis de hasta 2.400 mg [una hipotética concentración plasmática máxima de 300 µg/ml (840 µM)] con efectos secundarios menores [17]. El DCA ya está establecido en la práctica clínica. El valor de Cmáx del DCA en adultos tras 6 meses de tratamiento continuo (dosis orales de 25 mg/kg/día) fue de 53±18 µg/ml (0,35±0,12 mM) [18]. Los pacientes fueron tratados crónicamente de forma segura con DCA a la dosis máxima de 50 mg/kg/día [19]. A varios niños con acidosis láctica se les administró >100 mg/kg diarios de DCA durante un largo periodo (8). A partir de estos datos, consideramos que la dosis necesaria de los dos fármacos es tolerable. Además, se han desarrollado análogos candidatos del DCA con menor toxicidad y mejor afinidad de unión [20]. Así pues, la combinación de DCA y OMP se considera una opción terapéutica potencial para los tumores malignos y puede conducir al desarrollo de una nueva estrategia terapéutica.

REFERENCIAS

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