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Tatjana Harting1, Mandy Stubbendorff 2, Saskia Willenbrock1, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek3, Anaclet Ngezahayo3, Hugo Murua Escobar1, Ingo Nolte1

1 Clínica de Pequeños Animales, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación, D-30559 Hannover
2 División de Medicina Clínica III, Hematología, Oncología y Medicina Paliativa, Universidad de Rostock, D-18057 Rostock
3 Evotec AG, D-22419 Hamburgo
4 Instituto de Biofísica, Universidad Leibniz, D-30419 Hannover, Alemania


Correspondencia: Profesor Ingo Nolte, Clínica de Pequeños Animales, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación, Bünteweg 9, D-30559 Hannover, Alemania; Correo electrónico: [email protected]

Recibido: 12 de julio de 2016
Aceptado: 5 de septiembre de 2016
Publicado en línea: 5 de octubre de 2016

Resumen

El efecto Warburg describe la capacidad de las células cancerosas para producir energía a través de la glucólisis aeróbica en lugar de la fosforilación oxidativa del piruvato. Esta desviación en el metabolismo mitocondrial inhibe la apoptosis, permitiendo una mayor proliferación en condiciones de niveles reducidos de oxígeno. El dicloroacetato (DCA) se utilizó con éxito en varias líneas celulares de cáncer humano para reactivar la fosforilación oxidativa en las mitocondrias. El objetivo de este estudio fue la caracterización y respuesta de líneas celulares de cáncer canino tras la exposición a DCA. Se caracterizó in vitro el efecto de 10 mM de DCA en un conjunto de seis líneas celulares caninas derivadas de adenocarcinoma de próstata y carcinoma de células transicionales (TCC). Se analizaron los recuentos celulares, los niveles de lactato, la apoptosis, la expresión de proteínas apoptóticas, los factores de supervivencia y diferentes miARN. Además, se investigaron la actividad metabólica, la actividad mitocondrial y la proliferación. El DCA disminuyó significativamente el número de células de todas las líneas celulares utilizadas, excepto una, y provocó una reducción significativa de la liberación de lactato. Se encontraron niveles reducidos de survivina en todas las líneas celulares, dos de las cuales presentaron una reducción significativa de la actividad metabólica. Se midieron niveles aumentados de miR-375 en todas las líneas celulares de TCC. La reactivación de la piruvato deshidrogenasa y el aumento de la actividad mitocondrial parecen inducir la transición de la glucólisis aeróbica a la fosforilación oxidativa. Además, estos resultados muestran que el tratamiento con DCA tiene un efecto supresor sobre la proliferación de las células cancerosas caninas.


Palabras clave: dicloroacetato, adenocarcinoma de próstata canino, carcinoma de células de transición canino, efecto Warburg
DOI: 10.3892/ijo.2016.3720


INTRODUCCIÓN

En los últimos años, los tratamientos contra el cáncer, como la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía, tal y como se utilizan en el tratamiento del cáncer humano, cobraron importancia en la medicina veterinaria. Los agentes quimioterapéuticos convencionales se dirigen a las células en división, tanto cancerosas como no neoplásicas, causando varios efectos secundarios como mielosupresión, diarrea, vómitos y anorexia [1]. Además, debido al estadio avanzado de la enfermedad y a la resistencia del cáncer de próstata y vejiga, el tratamiento es difícil y a menudo se asocia a un mal pronóstico [2,3]. Por lo tanto, hay que investigar nuevas alternativas que sean más eficaces.

El dicloroacetato (DCA), una molécula pequeña y rentable, afecta a diferentes vías metabólicas mediante la inhibición de la piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK) [4,5]. Esto implica que la piruvato deshidrogenasa (PDH) es potencialmente activada indirectamente por el DCA, lo que produce un cambio metabólico para favorecer la oxidación del piruvato a acetil-co-enzima-A en la mitocondria [5]. A pesar de este hecho, en las últimas décadas el DCA se ha utilizado en el tratamiento de multitud de trastornos como la acidosis láctica congénita [6,7], la hipercolesterolemia [8], la hiperglucemia [9], la insuficiencia cardiaca congestiva [10] y, sólo recientemente, en la investigación del cáncer [11-16]. El DCA se probó en diferentes enfoques in vitro en el campo de la oncología humana, incluidos el cáncer colorrectal [17,18], el cáncer de endometrio [14], el carcinoma oral de células escamosas [19] y el cáncer de mama [20]. En un ensayo clínico en el que se analizó a pacientes afectados por glioblastoma y otros tumores sólidos, el DCA disminuyó el crecimiento tumoral y la angiogénesis [15]. A excepción de varios estudios que investigan los efectos farmacocinéticos del DCA en perros [21-23

], actualmente no existen publicaciones sobre el efecto del DCA en el cáncer canino. Sin embargo, el DCA se utilizó con éxito en perros con acidosis láctica [24] y se ha informado de que es bien tolerado en perros [22]. Sólo se observaron efectos secundarios graves, como muerte y parálisis, en un estudio a largo plazo con dosis altas [21].

En condiciones aeróbicas, las células no neoplásicas recurren a la oxidación de la glucosa a través de las mitocondrias, que oxidan el piruvato a acetil-co-enzima-A [25]. La PDH permite que el piruvato entre en la mitocondria. La producción de energía de las células cancerosas se desplaza principalmente de la oxidación de la glucosa a la glucólisis aeróbica, lo que conduce a un aumento de la producción de lactato citosólico a pesar de que haya suficiente oxígeno disponible [26]. Este comportamiento se conoce como efecto Warburg. El bioquímico Otto Warburg informó por primera vez de estas características en 1926 e hipotetizó que el fallo mitocondrial podría ser la razón [26]. La carcinogénesis se establece preferentemente en tejidos hipóxicos donde el consumo de glucosa es bajo. En consecuencia, el factor 1α inducible por hipoxia se activa y conduce a una regulación al alza de los transportadores de glucosa y de la PDK. La activación de la PDK provoca la inhibición de la PDH y, por tanto, de la glucólisis [27,28]. Debido a este cambio metabólico y a la disminución de la despolarización mitocondrial, las células cancerosas tienen una ventaja de supervivencia y no se ven afectadas por las vías intrínsecas de apoptosis [29,30].

Para la evaluación preclínica de fármacos anticancerígenos, los experimentos in vitro con líneas celulares son enfoques importantes tanto en la investigación humana como en la veterinaria. Las investigaciones in vitro ofrecen la posibilidad de obtener más información sobre la eficacia y la sensibilidad de varias entidades tumorales [31-33]. En este estudio se utilizaron varias líneas celulares establecidas [34] y nuevas.

Por lo que sabemos, éste es el primer estudio en el que se ha investigado el efecto del DCA en células de adenocarcinoma de próstata canino y de carcinoma de células transicionales (TCC). Se determinó la influencia del DCA en el recuento celular, los niveles de lactato, la actividad mitocondrial, la apoptosis y la actividad metabólica. Además, se evaluó el efecto del DCA en la PDH y en las proteínas implicadas en la apoptosis. El efecto del DCA sobre varios microRNAs (miR) no se ha determinado antes. Además, no existe bibliografía sobre la influencia del DCA en el cáncer de vejiga en medicina humana o veterinaria.

Materiales y métodos

Líneas celulares y cultivo celular

Para los experimentos se utilizaron tres adenocarcinomas de próstata caninos (DT08/46, CT1258, DT15/08) y tres TCC caninos (DT08/40, DT15/06, DT15/09). Dos líneas celulares de TCC (DT08/40 y DT15/09) procedían de tejido prostático y una de TCC (DT15/06) de tejido vesical femenino. Las líneas celulares se clasificaron como adenocarcinoma de próstata o CCT tras el examen patohistológico de los tejidos iniciales. Todas las líneas celulares se establecieron en la Clínica de Pequeños Animales de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover (Alemania). Las líneas celulares se cultivaron en matraces de 75 cm2 (TPP, Faust Lab Science, Klettgau, Alemania) con 10 ml de medio 199 (Gibco™, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemania), 10% de suero fetal de ternera (Hyclone®, Thermo Fisher Scientific), 2% de penicilina-estreptomicina (Biochrom, Berlín, Alemania); se realizó un cambio de medio cada 48 h. Se dejó que las células crecieran hasta una densidad del 90% antes de dividirlas 1:3. Las células se incubaron a 37ºC y se mezclaron con agua. Las células se incubaron a 37°C y 5% deCO2 en aire humidificado. Para los experimentos, las células se trataron con DCA 10 mM (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 48 h. Para la división celular o tras el periodo de tratamiento, las células se tripsinizaron con TrypLE™ Express (Gibco™, Thermo Fisher Scientific) y el número de células se contó con un Cellometer™ Auto T4 automatizado (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EE.UU.) y se comparó con el control negativo. Las células se lavaron con PBS (Biochrom) y se almacenaron a -80 °C para exámenes posteriores (RT-PCR cuantitativa y análisis de proteínas). El DCA se disolvió en agua desionizada, se esterilizó por filtración y se ajustó el pH a 7,4 con NaOH. La dosis de 10 mM se seleccionó de acuerdo con estudios previos con células HeLa humanas [14]. Aunque esta concentración podría no alcanzarse con seguridad in vivo, se eligió para poder compararla con otros estudios in vitro en humanos.

Niveles de lactato

Para las mediciones de los niveles de lactato se centrifugó el sobrenadante del cultivo celular a 1.000 rpm durante 10 min para eliminar las células flotantes y los restos y se transfirieron 1,3 ml a un recipiente de fluoruro sódico (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Para eliminar las alteraciones debidas al rojo de fenol y al lactato procedente nativamente del suero de ternera fetal, se utilizó el medio como control negativo y se dedujo de las mediciones. La determinación colorimétrica del lactato se realizó con Cobas® C311 (Hitachi, Tokio, Japón). Para relacionar los niveles de lactato evaluados con el número y el volumen celular, el contenido total de lactato se normalizó con la concentración de proteína intracelular, que se determinó con el ensayo Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Actividad metabólica

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (Falcon, Corning, Ámsterdam, Países Bajos) con 200 μl de medio 199, 10% de suero fetal de ternera, 2% de penicilina-estreptomicina y se incubaron a 37 °C y 5% deCO2 humidificado. El medio se cambió cada 24 h y para la medición se añadieron 20 μl de MTT (CellTiter96® Aqueous One Solution assay, Promega, Mannheim, Alemania) en cada pocillo. La absorbancia se determinó al cabo de 2 h con un lector de placas Synergy2 (BioTek, Bad Friedrichshall, Alemania). Las mediciones se realizaron cada 24 h durante un periodo de cuatro días. Los datos se analizaron con el software Gen5™ 1.11 (BioTek) y se normalizaron con respecto al control negativo del medio.

Citometría de flujo

Para la determinación de la apoptosis se cultivaron105 células en una placa de 6 pocillos (TPP, Faust Lab Science) con 4 ml de medio y se trataron con 10 mM de DCA como se ha descrito anteriormente durante 48 h. Tras este periodo, se tripsinizaron las células y se centrifugaron junto con el medio que contenía las células no adherentes y muertas a 1.000 rpm durante 6 min. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 500 μl de tampón de ensayo. La tinción se realizó con 5 μl de Annexin-FITC y 1 μl de Sytox (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg, Alemania). Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se analizaron104 células con BD FACScalibur™ (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y el software CellQuest™ Pro 6.0 (BD Biosciences). Annexin y Sytox se detectaron en FL-1. El análisis de datos se realizó con FlowJo Versión 10.0.8r1 (FlowJo, Ashland, OR, EE.UU.). Las puertas se establecieron por la media de los controles positivos (células permeabilizadas con saponina) y los controles negativos de cada línea celular (células viables no tratadas).

Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

El ARN total se aisló a partir de106 células utilizando el kit NucleoSpin Small RNA (Macherey Nagel, Düren, Alemania) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc se preparó con 35 ng de ARN total mediante transcripción inversa utilizando el kit TaqMan® MicroRNA Reverse Transkription (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificación relativa de la expresión de microARN de las células tratadas en comparación con el control negativo se realizó con Eppendorf realplex4 Cycler (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemania) utilizando 1.33 μl de ADNc en un volumen total de 20 μl que contenía TaqMan® Universal Master Mix NoAmpErase® UNG (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y ensayos TaqMan® MicroRNA para Mir-141 (ID 245445_mat), Mir-145 (ID 002278), Mir-375 (ID 000564) adquiridos a Thermo Fisher Scientific. El procedimiento se mantuvo según lo descrito en el protocolo del fabricante. Los datos se normalizaron con respecto al gen de mantenimiento RNU6B (ID 001093) y el análisis se realizó con Rest2009 (Qiagen, Hilden, Alemania).

Análisis de microesferas magnéticas Luminex

El análisis de expresión de proteínas se realizó con la tecnología xMAP® Luminex Bead utilizando un instrumento Luminex 200™ (Luminex Corp., Hertogenbosch, Países Bajos). Los datos se muestran como cantidad total (pg/ml de survivina) o MFI neta (otras dianas) y se mostraron con el software xPONENT 3.1 (Luminex Corp.). Los resultados de las muestras con valores inferiores como MFI < MFI de fondo + 2× desviación estándar se excluyeron del análisis. La cuantificación de survivina se realizó con el kit ProcartaPlex Human Survivin Simplex (eBioscience, Fráncfort del Meno, Alemania) utilizando sobrenadante de cultivo celular tal como se describe en el protocolo del fabricante. La cantidad de Survivin se normalizó a la concentración de proteína que se estableció utilizando el ensayo Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). La PDH y las proteínas apoptóticas (BAD y JNK) se detectaron con ensayos multiplex de Merck Millipore (Multi-species PDH Complex Magnetic Bead Panel y 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead kit, Darmstadt, Alemania). Las muestras se procesaron como se describe en las instrucciones del fabricante. Además, las muestras para las mediciones de PDH se filtraron con unidades centrífugas de filtro ultrafree con un tamaño de poro de 0,65 μm (Merck Millipore) a 7.000 rpm durante 4 min.

Actividad mitocondrial

Las células cultivadas en placas μ de 8 pocillos (Ibidi, Martinsried, Alemania) tratadas con y sin 10 mM de DCA se fijaron con paraformaldehído al 4%, se lavaron tres veces con HBSS que contenía calcio y magnesio y se tiñeron con 4 μM de MitoSox (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) durante 15 min. Tras la tinción, las células se lavaron tres veces con HBSS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y el núcleo celular se contrateñó con DAPI (dilución de 1:1.000, Sigma-Aldrich GmbH) durante 5 min. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un microscopio confocal invertido de barrido láser (Eclipse TE2000-E, Nikon, Düsseldorf, Alemania) utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60× (Nikon). Las imágenes se tomaron con el software EZ-C1 1.80 (Nikon). La excitación se produjo con un láser de diodo a 408 nm (DAPI) y con un láser de helio/neón a 543 nm (MitoSox). La fluorescencia celular total de MitoSox deduciendo el fondo se analizó con ImageJ y se normalizó al recuento celular.

Tinción de inmunofluorescencia de Ki67 y TUNEL

Las células se sembraron, fijaron y lavaron como se ha descrito anteriormente. Tras lavarlas con HBSS, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% durante 20 minutos, se lavaron y se incubaron durante la noche con un anticuerpo policlonal de conejo específico canino Ki67 con una dilución de 1:150 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Para la tinción, se incubó durante 1 h un anticuerpo monoclonal anti-conejo Alexa Fluor® 555 (Cell Signaling Technology, Leiden, Países Bajos) con una dilución de 1:250 y las células se contrateñían con DAPI (1:1.000) durante 5 min. El protocolo de obtención de imágenes de fluorescencia fue el mismo que el descrito anteriormente. La fluorescencia celular total se estableció como se ha descrito anteriormente. Para la tinción TUNEL se utilizó el kit Apoptag Fluorescein Direct (Merck Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. La excitación se produjo con un argonlaser a 488 nm y la obtención de imágenes se realizó como se ha descrito anteriormente. Se evaluó el porcentaje de células TUNEL positivas.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se realizó con el software SAS 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). Para la comparación de dos medias, se utilizó la prueba t de dos colas. El valor de confianza se fijó en el 5% (P<0,05) y se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Recuento de células tras el tratamiento con DCA

En comparación con los controles negativos no tratados, las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata DT08/46 (P<0,0001) y CT1258 (P=0,0122) mostraron un número de células significativamente menor tras el tratamiento con DCA 10 mM durante 48 h (Fig. 1A). La tercera línea celular de próstata DT15/08 DCA no mostró una reducción significativa (P=0,0748) pero se observó una tendencia a una menor cantidad celular, respectivamente una menor tasa de proliferación en cultivo celular nativo (Fig. 1A ). Como se muestra en la Fig. 1B, se observó el mismo efecto reductor del DCA en todas las líneas celulares TCC examinadas DT08/40 (P=0,0031), DT15/06 (P=0,0016) y en DT15/09 (P=0,0143).

Figura 1 – Efecto del DCA 10 mM en diferentes células de cáncer canino después de 48 h. Tras la exposición al DCA, el número de células de todas las líneas celulares disminuyó significativamente, excepto en una línea celular de adenocarcinoma de próstata (DT15/08). Los datos se muestran como media ± DE, n=3. La figura muestra el número relativo de células en comparación con el control negativo (%). El control se fijó en el 100%. El análisis estadístico se determinó con una prueba t de dos colas, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Líneas celulares de adenocarcinoma de próstata canino. (B) Líneas celulares de carcinoma de células de transición canino.

Niveles de lactato en el sobrenadante del cultivo celular tras la exposición al DCA
Para evaluar el efecto reductor de la liberación de lactato del tratamiento con DCA tras 48 h, se midió la cantidad de lactato en el sobrenadante del cultivo celular, respectivamente. En todas las líneas celulares de ambas entidades cancerosas caninas, el DCA 10 mM tuvo un efecto significativo de disminución del lactato (Fig. 2).

Figura 2 – Efecto de 10 mM DCA en los niveles de lactato después de 48 h en el sobrenadante del cultivo celular. Tras el tratamiento con DCA, los niveles de lactato disminuyeron significativamente en todas las líneas celulares. Los niveles relativos de lactato comparados con el control negativo se ilustran como media ± SD (%), n=3. El control se fijó al 100%. El control se fijó en el 100%. El análisis estadístico se realizó con una prueba t de dos colas, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Líneas celulares de adenocarcinoma de próstata canino. (B) Líneas celulares de carcinoma de células de transición canino.

Actividad metabólica tras el tratamiento con DCA durante un periodo de 96 h

Para confirmar el efecto negativo sobre la proliferación celular, se analizó la actividad metabólica como indicador de proliferación y viabilidad celular mediante ensayos MTT. Como se muestra en la Fig. 3A, la actividad metabólica en DT15/08 se redujo significativamente en comparación con el control negativo respectivo tras 48 h de tratamiento con DCA (P=0,0202). Tras 96 h de tratamiento continuo con DCA, la actividad metabólica fue significativa (P=0,007). Se observó un efecto similar en DT08/40 (Fig. 3B) tras 96 h (P=0,0025) y en DT15/06 (P=0,0419) tras 96 h (datos no mostrados) de tratamiento con DCA. Las líneas celulares DT08/46, CT1258 y DT15/09 no mostraron ningún efecto estadísticamente significativo del DCA sobre la actividad metabólica (datos no mostrados).

Figura 3 – Influencia de 10 mM DCA en la actividad metabólica durante un periodo de 96 h utilizando el test MTT. La evaluación estadística se realizó con ANOVA, *P<0,05, **P<0,01. Los datos se muestran como media ± DE, n=3. (A) Línea celular de adenocarcinoma de próstata canino DT15/08. Se observó una disminución significativa de la actividad metabólica después de 48 h y se determinó una reducción adicional ≤96 h. (B) Línea celular de carcinoma de células de transición canino DT08/40. En el transcurso del tiempo, la actividad metabólica disminuyó. Con el paso del tiempo, la actividad metabólica disminuyó ligeramente a las 24 h y alcanzó un nivel significativo a las 96 h.
Proliferación tras el tratamiento con DCA durante 48 h

La proliferación celular en líneas celulares expuestas a 10 mM de DCA se analizó mediante tinción Ki67 y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia confocal. El DCA disminuyó la cantidad de Ki67 indicando una proliferación celular reducida tras 48 h en todas las líneas celulares evaluadas con significación (P<0,05) (Fig. 4).

Figura 4 – Efecto de 10 mM DCA en la proliferación celular con microscopía de fluorescencia confocal después de 48 h. Se determinó una disminución significativa de las cantidades de Ki67, lo que indica proliferación, en todas las líneas celulares. Las imágenes de fluorescencia muestran una disminución de la fluorescencia celular total de las células Ki67 positivas en comparación con el control no tratado (A-D). Los datos se muestran como media ± DE (%), n=3. El control se estableció en el 100%. El control se fijó en el 100%. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de dos caras, *P<0,05. (A) DT15/08 sin tratar. (B) DT15/08 tratado con 10 mM de DCA. (C) DT15/06 sin tratar. (D) DT15/06 tratado con 10 mM DCA. Se observó una disminución de la fluorescencia Ki67 tanto en DT15/08 como en DT15/06. (E) Líneas celulares de adenocarcinoma de próstata canino. (F) Líneas celulares de carcinoma de células de transición canino.
Efecto del DCA sobre la apoptosis

El efecto del DCA 10 mM sobre la apoptosis y la viabilidad se evaluó con Annexin y Sytox mediante citometría de flujo. En cuanto a la apoptosis y las células muertas, no se observaron efectos estadísticamente significativos en ninguna de las líneas celulares (datos no mostrados). La confirmación de los índices de apoptosis FACS se realizó mediante tinción TUNEL para eliminar los efectos negativos de la tripsinización en las células cultivadas. La obtención de imágenes se realizó mediante microscopía confocal de fluorescencia. Los resultados confirman el índice de apoptosis en todas las líneas celulares tratadas con DCA excepto en DT15/06. Se observó una disminución significativa de los niveles de apoptosis en DT15/08 (P=0,022) y DT15/09 (P=0,0265). DT15/06 mostró valores de apoptosis significativamente aumentados (P=0,041) (datos no mostrados). Las demás líneas celulares no mostraron valores de apoptosis significativos.

Expresión de Survivin analizada con la tecnología de perlas magnéticas xMAP

El DCA disminuyó significativamente la producción de survivina en la línea celular de adenocarcinoma de próstata DT08/46 (P=0,0053) y en las líneas celulares TCC DT15/06 (P=0,0027) y DT15/09 (P=0,0206). Las líneas celulares CT1258 (P=0,0761), DT15/08 (P=0,1551) y DT08/40 (P=0,0598) no mostraron efectos significativos en la producción de survivina (Fig. 5).

Figura 5 – Efecto de 10 mM DCA sobre la expresión de survivina en el sobrenadante después de 48 h. Los niveles de survivina se normalizaron con respecto a la concentración de proteína intracelular. En comparación con el control respectivo, la cantidad de survivina disminuyó significativamente en una línea celular de adenocarcinoma de próstata (DT08/46) y en dos líneas celulares de TCC (DT15/06 y DT15/09). Las demás líneas celulares también mostraron una tendencia decreciente pero insignificante. Los datos se muestran como media relativa en comparación con el control negativo ± DE (%), n=3. El control se fijó al 100%. El control se fijó en el 100%. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de dos colas con *P<0,05, **P<0,01. (A) Líneas celulares de adenocarcinoma de próstata canino. (B) Líneas celulares de carcinoma de células de transición canino.
Expresión de Bcl-2-antagonista de la muerte celular (BAD) y c-jun quinasa N-terminal (JNK) analizada con la tecnología de microesferas magnéticas xMAP

Tras 48 h de incubación con DCA, la forma fosforilada y, por tanto, inactiva de BAD sólo aumentó significativamente en DT08/46 (P=0,0285), CT1258 (P=0,0039) y DT15/06 (P=0,0235). Además, no pudo observarse ningún efecto del DCA sobre la JNK fosforilada activa, a excepción de DT08/46 (P=0,0044), que mostró valores reducidos (datos no mostrados).

Expresión de la piruvato deshidrogenasa (PDH) analizada con la tecnología de perlas magnéticas xMAP

Para confirmar la disminución de los niveles de lactato como consecuencia de una menor glucólisis, se midió la cantidad de PDH fosforilada (PDH-P) (Ser232, Ser293, Ser300) con la tecnología de microesferas magnéticas Luminex. La disminución de los niveles de PDH-P y, por tanto, el aumento de enzimas activas se asocian con un aumento de la oxidación del piruvato y del metabolismo de la acetil coenzima A, lo que conduce a un aumento de la actividad del ciclo TCA [35]. En la PDH-P (Ser232) se observó una disminución estadísticamente significativa en comparación con los controles no tratados en todas las líneas celulares excepto en la DT08/46. Esta línea celular mostró una disminución mayor pero no significativa en la PDH-P (Ser232). Esta línea celular mostró un nivel de PDH-P (Ser232) superior pero no significativo. La PDH-P en el residuo Ser293 sólo se vio afectada significativamente por el DCA en las líneas celulares DT15/08 (P=0,0082) y DT15/06 (P=0,0122). En todas las demás líneas celulares no se observó ningún efecto tras el tratamiento con DCA. La PDH-P en Ser300 se vio comprometida por el DCA de forma significativa en DT08/46 (P=0,0060), CT1258 (P=0,0215), DT15/08 (P=0,0002) y DT15/06 (P=0,0097) (Tabla I).

Tabla I

Expresión de PDH-P tras la exposición al DCA con valores medios relativos ± SD (%).

Línea celularPDH-P Ser232P-valorPDH-P Ser293P-valorPDH-P Ser300P-valor
Control100100100
Adenocarcinoma de próstata
dT08/46121.2±31.50.2715127.7±27.80.090047.7±28.00.0060b
cT125811.0±5.10.0011b73.7±30.50.274024.3±19.50.0215a
dT15/0818.0±17.60.0026b39.7±19.20.0082b18.4±6.80.0002c
Carcinoma de células transicionales
dT08/4014.3±10.20.0047b84.5±22.80.359448.6±32.10.1090
dT15/0628.2±17.70.0039b72.3±5.40.0122a39.1±10.40.0097b
dT15/0920.5±24.80.0308a99.8±71.30.996734.1±41.00.1085
Tabla I – Expresión de PDH-P tras la exposición al DCA con valores medios relativos ± DE (%).
PDH-P, piruvato deshidrogenasa fosforilada; Ser, serina; DCA, dicloroacetato; ±, más menos.
a P<0,05;
b P<0,01;
c P<0,001;
DE, desviación estándar; %, porcentaje.
Actividad mitocondrial tras el tratamiento con DCA

La verificación de la alteración metabólica de la actividad mitocondrial de oxidación de la glucosa se realizó mediante la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas de la mitocondria. En las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata (Fig. 6E) se observó un aumento significativo de la actividad mitocondrial en CT1258 (P=0,0153). Las líneas celulares DT08/46 (P=0,2829) y DT15/08 (P=0,3082) no mostraron ningún efecto de disminución tras el tratamiento con DCA. Por el contrario, el DCA fue capaz de aumentar la actividad mitocondrial de forma significativa (P<0,05) en todas las líneas celulares TCC (Fig. 6F).

Figura 6 – Determinación de la actividad mitocondrial con microscopía confocal de fluorescencia tras la exposición a 10 mM de DCA durante 48 h. Las ROS derivadas de las mitocondrias se tiñeron con MitoSox (rojo) y los núcleos se contrateñieron con DAPI (azul). La actividad mitocondrial expresada como aumento de la producción de ROS aumentó significativamente en la línea celular de adenocarcinoma de próstata CT1258. DT08/46 mostró una disminución significativa y DT15/08 ningún efecto sobre la producción de ROS. Por el contrario, todas las líneas celulares de TCC presentaron un aumento significativo de las actividades mitocondriales (F). En comparación con el control negativo, las células tratadas muestran una fluorescencia roja aparentemente mayor (A-D). Los datos se muestran como media ± DE (%), n=3. El control se estableció en el 100%. El control se fijó en el 100%. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de dos colas, *P<0,05. (A) CT1258 sin tratar. (B) CT1258 tratado. (C) DT15/06 sin tratar. (D) DT15/06 tratado. (E) Líneas celulares de adenocarcinoma de próstata canino. (F) Líneas celulares de carcinoma transicional canino.
RT-PCR cuantitativa de miARN

Para evaluar si las menores tasas de proliferación observadas se correlacionan con cambios en los micro-ARN, se evaluaron tres miR implicados en la proliferación o la apoptosis. La expresión de miR-141 reveló cambios significativos con niveles disminuidos en DT15/08 (P=0,0451) y niveles aumentados en DT08/40 (P=0,0135) en comparación con los controles no tratados, mientras que DT08/46 (P=0,9285) y DT15/06 (P=0,1520) no mostraron diferencias en comparación con los controles. En CT1258 y DT15/09 miR-141 estaba regulado a la baja y se excluyó del análisis. DT08/46 (P=0,0322) mostró una expresión más baja y DT15/06 (P=0,0267) así como DT15/09 (P=0,0031) una expresión más alta de miR-375. La línea celular de adenocarcinoma de próstata CT1258 no mostró cambios significativos en todos los microARN examinados, respectivamente. La expresión de miR-145 no se vio influida por el tratamiento con DCA en ninguna de las líneas celulares (excluidas del análisis debido a valores Ct >30). En resumen, las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata tienden a mostrar una regulación a la baja de miR-141 (DT15/08) y miR-375 (DT08/46, DT15/08), mientras que las líneas celulares de CTC mostraron una regulación al alza de ambos (Fig. 7).

Figura 7 – Efecto de 10 mM DCA en la expresión de miR-141 y miR-375 tras 48 h. (A) Expresión de microRNA-141. (B) Expresión de miRNA-375. miR-141 se redujo significativamente en la línea celular de adenocarcinoma de próstata DT15/08, mientras que DT08/46 no mostró ningún efecto observable en comparación con el control negativo. A diferencia de las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata, las líneas celulares de CTC DT08/40 y DT15/06 expresan niveles más altos de miR-141. CT1258 y DT15/09 mostraron expresiones reguladas a la baja y se excluyeron del análisis. El análisis de la expresión de miR-375 mostró resultados comparables. Tras el tratamiento con DCA, las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata mostraron patrones de expresión inconsistentes. DT08/46 presentó un aumento significativo y CT1258 así como DT15/08 no mostraron efectos sobre los niveles de miR-375. Por el contrario, las líneas celulares de CTC mostraron una expresión aumentada de miR-375, especialmente DT15/06 y DT15/09. La expresión relativa se muestra como media relativa ± DE, n=3. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de dos colas, *P<0,05, **P<0,01.

Discusión

El DCA redujo el número de células en el adenocarcinoma de próstata y en las líneas celulares de TCC. Esto puede deberse a una reducción de la proliferación o a un aumento de la apoptosis. En este estudio se observó un efecto reductor de la proliferación indicado por la disminución de Ki67 en todas las líneas celulares y menores actividades metabólicas en DT15/08 y DT08/40. Este hallazgo concuerda con resultados anteriores presentados por Bonnet et al en varias líneas celulares humanas [35] y Sun et al en cáncer de mama [12]. Además, también se observó una disminución de la proliferación celular tras la exposición al DCA en el carcinoma de próstata humano [36], colorrectal [37 ], de colon [11] y de pulmón [38]. Sin embargo, en este estudio no se pudo observar la inducción de apoptosis dependiente de mitocondrias por el DCA, tal y como habían informado previamente varios grupos de investigación [14,35,39]. Sin embargo, este fenómeno también fue observado por Feuerecker et al en células de neuroblastoma murino y humano (40). Stockwin et al informaron de que se requieren altas concentraciones de DCA para la inducción de la apoptosis [38]. Los resultados inconsistentes en una línea celular (DT15/06) entre la citometría de flujo y la tinción TUNEL no permiten evaluar si el DCA afecta a la apoptosis. Los resultados de la expresión de proteínas apoptóticas JNK y BAD son coherentes con los efectos observados en todas las demás líneas celulares y apoyan la hipótesis de que el DCA no mostró ninguna influencia sobre la apoptosis en las células cancerosas caninas de próstata y TCC.

La survivina, un inhibidor de la apoptosis y promotor tumoral [41,42], disminuyó significativamente en todas las líneas celulares que mostraron un aumento de la actividad mitocondrial (DT15/06, DT15/09). Se ha descrito que la disminución de los niveles de survivina induce la apoptosis a través de vías intrínsecas mediante la activación de la caspasa-3 [41 ] y se observó en líneas celulares de cáncer de endometrio tras la exposición al DCA [14]. Inesperadamente, no pudo observarse un aumento de la apoptosis en estas líneas celulares, con la excepción de DT15/06 (P=0,041), que mostró un ligero pero inconsistente aumento de la muerte celular. Esto lleva a la conclusión de que la disminución de los niveles de survivina posiblemente conlleve una disminución de la proliferación. Además, es concebible una desregulación de otros genes implicados en la inducción de la apoptosis, lo que explicaría por qué la disminución de los niveles de survivina no produjo apoptosis.

El DCA es un inhibidor de la PDK que activa indirectamente la PDH. Debido a valores disminuidos de PDH-P, el piruvato puede ser oxidado por la mitocondria [4,5]. Se ha observado una disminución de la fosforilación de la PDH en varias líneas celulares de cáncer humano [16,37,43]. De acuerdo con los resultados publicados en líneas celulares humanas, este estudio confirmó la disminución de la fosforilación de la PDH en todas las células tratadas con DCA, lo que se confirma por la reducción de la liberación de lactato en todas las líneas celulares. Esto indica que el DCA promueve la oxidación de la glucosa en las células cancerosas caninas, así como en las células cancerosas humanas. Además, en este estudio se comprobó un aumento de los niveles de ROS en las mitocondrias de todas las líneas celulares, excepto en dos líneas celulares de adenocarcinoma de próstata. El aumento de las especies ROS en las mitocondrias, que se produce debido a la respiración celular, confirma la disminución de los valores de PDH-P y la reducción del lactato. Es posible que el aumento de la actividad mitocondrial no provoque la apoptosis, sino un aumento de la respiración celular que impida la supervivencia de las células cancerosas con un metabolismo modificado. Esto podría aclarar el aumento de la viabilidad de las células tras la exposición al DCA. El aumento de la viabilidad tras la exposición al DCA también fue observado por McPherson et al, que informaron sobre el aumento de la oxidación del piruvato y la viabilidad de los embriones en un modelo de ratón envejecido [44].

se ha descrito que la regulación al alza de miR-375 tiene efectos antiproliferantes en muchas células, como el cáncer gástrico [45 ], el cáncer de páncreas [46], las células similares a los cardiomiocitos fetales [47] y el cáncer de colon [48]. En la carcinogénesis de próstata, el microARN-375 tiene efectos variables en función del fenotipo tumoral. Costa-Pinheiro et al demostraron efectos antiproliferativos en células PC-3 debido a su regulación al alza, así como un aumento de la apoptosis en células 22Rv1 tras el knockdown de miR-375 [49]. Nuestros resultados ilustran que la regulación al alza o a la baja de miR-375 tras el tratamiento con DCA no es consistente en las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata, lo que concuerda con los hallazgos descritos anteriormente. En comparación con las células de cáncer de próstata, todas las líneas celulares de CTC mostraron niveles aumentados de miR-375. No existe bibliografía que describa los efectos de miR-375 en el cáncer de vejiga. Es posible que estos resultados concuerden con los efectos antiproliferativos descritos en muchas otras células. Los mismos resultados se observaron en microRNA-141. Una regulación al alza de miR-141 inhibió la proliferación del cáncer y la progresión del ciclo celular en células de neuroblastoma [50]. Además, miR-141 se regula a la baja en el cáncer de vejiga con invasión muscular [51]. En nuestro estudio, miR-141 y miR-375 se encontraron regulados al alza en todas las líneas celulares de CTC tras el tratamiento con DCA, lo que indica que estos cambios provocan menores tasas de proliferación. En el cáncer de próstata se ha descrito la regulación al alza de miR-141 [52]. En este estudio los niveles de miR-141 disminuyeron ligeramente, pero suponemos que este efecto es demasiado leve para afectar a las células cancerosas. Sin embargo, un análisis que permita determinar si un vínculo directo entre el DCA y los cambios en diferentes microRNAs es causante de las respuestas biológicas observadas requeriría un enfoque transcriptómico exhaustivo.

En conclusión, este estudio ilustra que las líneas celulares de cáncer canino responden al tratamiento con DCA y el efecto puede reducirse a la disminución de las tasas de proliferación, el aumento de la oxidación del piruvato y la actividad mitocondrial. Los resultados también muestran diferencias entre las entidades cancerosas examinadas. Así, las líneas celulares de TCC parecen responder de forma consistente y son más susceptibles al tratamiento con DCA que las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata. En comparación con la mayoría de las líneas celulares humanas, el DCA no afectó a la apoptosis, lo que puede constituir que el DCA podría ser útil para la restricción del crecimiento tumoral en el cáncer canino, pero no para la reducción del tamaño.

Además, el DCA puede ser ventajoso para sensibilizar las células cancerosas caninas a otros fármacos anticancerígenos y, por lo tanto, podría ser apropiado para terapias combinadas [53]. Para asegurar concentraciones más altas de DCA en tejidos cancerosos y evitar efectos secundarios generalizados graves, una terapia intralesional, comparable a la quimioterapia intravesical en humanos [54] y perros con TCC [55,56], podría ser otra posibilidad. La concentración de 10 mM de DCA se eligió para permitir la comparabilidad con otros estudios in vitro en humanos [

14

,18,37]. Para los estudios clínicos, la concentración de DCA tiene que ser reevaluada con respecto a la compatibilidad y los efectos secundarios negativos. Por lo tanto, deben examinarse otros estudios con concentraciones de DCA inferiores.

Abreviaturas:

DCAdicloroacetato
PDHpiruvato deshidrogenasa
PDKpiruvato deshidrogenasa cinasa
TCCcarcinoma de células transicionales
ARNácido ribonucleico
PCRreacción en cadena de la polimerasa
JNKc-jun quinasa N-terminal
BADBcl-2-antagonista de la muerte celular
ROSespecies reactivas del oxígeno
PBSsolución salina tamponada con fosfato

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