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Ramon C Sun1,2, Philip G Board1 und Anneke C Blackburn1*

1 Molekulargenetik-Gruppe, Abteilung fĂŒr translationale Biowissenschaften, John Curtin School of Medical Research, GebĂ€ude 131, Australian National University, Postfach 334, Canberra ACT 0200, AUSTRALIEN
2 Abteilung fĂŒr Strahlenonkologie, Stanford School of Medicine, Stanford CA 94305 USA.
1*Korrespondenz: [email protected]©

2011 Sun et al; Lizenznehmer BioMed Central Ltd. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) verbreitet wird, die die uneingeschrĂ€nkte Nutzung, Verbreitung und VervielfĂ€ltigung in jedem Medium erlaubt, sofern das Originalwerk ordnungsgemĂ€ĂŸ zitiert wird.


Empfangen: 3. Mai
2011Akzeptiert: 18. November 2011Veröffentlicht
: 18. November 2011









Zusammenfassung

Hintergrund
Krebszellen weisen im Vergleich zu normalen Zellen ein anderes Stoffwechselprofil auf. Der Warburg-Effekt (erhöhte aerobe Glykolyse) und die Glutaminolyse (erhöhte mitochondriale AktivitÀt durch Glutaminkatabolismus) sind bekannte Kennzeichen von Krebs und gehen mit einer erhöhten Laktatproduktion, einer hyperpolarisierten mitochondrialen Membran und einer erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies einher.
MethodenIn
dieser Studie zielen wir auf den Warburg-Effekt mit Dichloracetat (DCA) und die erhöhte mitochondriale AktivitÀt der Glutaminolyse mit Arsentrioxid (ATO) in Brustkrebszellen ab und messen die Zellproliferation, den Zelltod und mitochondriale Eigenschaften.
ErgebnisseDie
Kombination von DCA und ATO war bei der Hemmung der Zellproliferation und der HerbeifĂŒhrung des Zelltods wirksamer als jedes der beiden Medikamente allein. Wir haben die Auswirkungen dieser Behandlungen auf das mitochondriale Membranpotenzial, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und den ATP-Spiegel untersucht und sowohl fĂŒr ATO als auch fĂŒr DCA neue molekulare Mechanismen innerhalb der Mitochondrien identifiziert: ATO reduziert die mitochondriale Funktion durch die Hemmung der Cytochrom-C-Oxidase (Komplex IV der Elektronentransportkette), wĂ€hrend DCA die Expression der ATP-Synthase b-Untereinheit hochreguliert. Die Potenzierung der ATO-ZytotoxizitĂ€t durch DCA korreliert mit einer starken UnterdrĂŒckung der Expression von c-Myc und HIF-1a sowie einer verminderten Expression des Überlebensproteins Bcl-2. SchlussfolgerungDiese
Studie zeigt zum ersten Mal, dass die Beeinflussung von zwei wichtigen Stoffwechselmerkmalen von Krebs eine wirksame Anti-Krebs-Strategie mit therapeutischem Potenzial ist.
SchlĂŒsselwörterDichloracetat
, Brustkrebs, Elektronentransportkette, Mitochondrien, Arsentrioxid






Einleitung

Arsentrioxid (ATO) wird seit ĂŒber 2000 Jahren als Therapeutikum eingesetzt. UrsprĂŒnglich stammt es aus China [1]es wird derzeit zur Behandlung der akuten promyeloischen LeukĂ€mie (APL) bei Patienten eingesetzt, die nach einer Alltrans-RetinsĂ€ure/Anthrazyklin-Therapie einen RĂŒckfall erlitten haben, und wird fĂŒr die Erstlinientherapie der de novo APL gefördert [2-4]. ATO ist als hyperreaktives MolekĂŒl bekannt und könnte potenziell an Thiolgruppen in vielen Proteinen binden [2,5]. Seine FĂ€higkeit, an das thiolreiche, mutierte Protein PML-RAR-α zu binden, das durch eine Chromosomentranslokation bei APL entsteht, hat es zu einem wirksamen Medikament bei APL gemacht [2,5,6]. Es hat sich gezeigt, dass ATO bei einer Reihe von Krebszelllinien in vitro und in vivo die Apoptose auslöst [7,8]es war jedoch schwierig, ATO fĂŒr den klinischen Einsatz bei anderen Tumorarten als der APL in Betracht zu ziehen, da die molekularen Ziele, die zu seiner ZytotoxizitĂ€t fĂŒhren, nicht bekannt sind. In den letzten 10 Jahren wurden die physiologischen VerĂ€nderungen in den Krebszellen als Reaktion auf eine ATO-Behandlung gut charakterisiert, und viele klinische Versuche fĂŒr neue Anwendungen von ATO sind im Gange [5]. ATO wurde als mitochondriales Toxin vorgeschlagen [9]. ATO kann das mitochondriale Membranpotenzial (MMP) depolarisieren [10]die intrazellulĂ€re Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erhöhen [8]und Apoptose auslösen [8]. Der vorgeschlagene Angriffspunkt fĂŒr ATO, der diese phĂ€notypischen VerĂ€nderungen bewirken kann, ist die mitochondriale Übergangspore (MTP) [11]. Es hat sich gezeigt, dass ATO die Öffnung der MTP induziert, was zur Freisetzung von Cytochrom c fĂŒhrt, und es wird angenommen, dass es die MMP auflöst und die Freisetzung von ROS aus den Mitochondrien erhöht [12]. In jĂŒngerer Zeit wurde auch das Thioredoxin-System, insbesondere die Thioredoxin-Reduktase, als ein Ziel von ATO identifiziert, das zu erhöhtem oxidativem Stress und verĂ€nderten Redox-Signalen nach ATO-Behandlung von Krebszellen beitragen könnte [9,13].
Der Warburg-Effekt ist ein weit verbreitetes PhĂ€nomen, das bei ĂŒber 90 % aller Tumorarten festgestellt wurde. Zellen, die den Warburg-Effekt aufweisen, nutzen alternative Wege der Energiehomöostase, um ihren proliferativen PhĂ€notyp aufrechtzuerhalten [14]. Der NobelpreistrĂ€ger Dr. Otto Warburg stellte fest, dass Krebszellen auf Glykolyse oder Substratphosphorylierung angewiesen sind, um ATP zu erzeugen, und ihre MitochondrienaktivitĂ€ten unterdrĂŒcken [15]. Mit fortschrittlicheren Technologien haben neuere Studien den Aspekt der ATP-Erzeugung der Warburg-Hypothese bestĂ€tigt, aber gezeigt, dass die mitochondriale AktivitĂ€t in Krebszellen nicht unterdrĂŒckt wird. Stattdessen spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Substraten zur Aufrechterhaltung der Zellteilung [16].
Die krebshemmende Wirkung der Umkehrung des Warburg-Effekts wurde kĂŒrzlich beschrieben, und ein altes Medikament, Dichloracetat (DCA), das die ATP-Synthese von der Glykolyse auf die oxidative Phosphorylierung umlenken kann, hat sowohl in vitro [17-19] als auch in vivo [20-23] eine gute krebshemmende Wirkung gezeigt. DCA ist ein Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Inhibitor, der zu einer erhöhten Pyruvat-Dehydrogenase-AktivitĂ€t fĂŒhrt [19]. Dies fĂŒhrt zu einer verstĂ€rkten Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA anstelle von MilchsĂ€ure, wie durch den Warburg-Effekt beschrieben, und stimuliert die mitochondriale Atmung, indem es das Angebot an Acetyl-CoA erhöht. Folglich zeigten Krebszellen nach einer DCA-Behandlung erhöhte ROS-Werte, eine Depolarisierung der MMP in vitro und eine erhöhte Apoptose sowohl in vitro als auch in vivo [17,20].
Da DCA Substrate in die mitochondriale Atmung und ATP-Produktion umlenken kann, könnte es eine synergistische Wirkung mit Krebsmedikamenten haben, die die mitochondriale AktivitĂ€t beeintrĂ€chtigen. Wir schlagen vor, dass durch die Umkehrung des glykolytischen PhĂ€notyps mit DCA und die Umleitung von mehr Pyruvat in die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien bei gleichzeitiger Ausrichtung auf die Mitochondrien mit ATO eine schwerwiegende Störung der Energiehomöostase in den Krebszellen eintreten wird. In dieser Studie zeigen wir, dass DCA und ATO in Kombination das Wachstum von Brustkrebszelllinien in vitro hemmen. DarĂŒber hinaus haben wir neue molekulare Mechanismen innerhalb der Mitochondrien identifiziert, die zur ZytotoxizitĂ€t von ATO beitragen können, was den Einsatz von ATO gegen solide Tumore zusĂ€tzlich unterstĂŒtzt.



Materialien und Methoden

Reagenzien
JC-1, CFSE und H2DCFDA stammen von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), CellTiter-Glo und Caspase-Glo Assay-Kits wurden von Promega Co (San Luis, CA, USA) erworben. Die ĂŒbrigen Chemikalien wurden von Sigma Co (St. Louis, MO, USA) bezogen.
Zellkultur
Die Zelllinien wurden in den angegebenen Jahren von den folgenden Quellen bezogen. Dr. Anna DeFazio, Westmead Millenium Institute, Sydney, Australien: T-47D (2003), BT-20 (2003), MCF-10A (2005) und MCF-10AT1 (2005); Prof. Chris Parish, Australian National University, Canberra, Australien: 13762 MAT (2007), MDA-MB-468 (2003) und MDA-MB-231 (2003). Die Zelllinien haben ein Erscheinungsbild, das mit den veröffentlichten Morphologien ĂŒbereinstimmt, wurden aber in letzter Zeit nicht authentifiziert. Menschliche Brustepithelkarzinomzellen (T-47D) wurden in RPMI-1640-Medium gezĂŒchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum in Gegenwart von 0,1 % PSN (3 % Penicillin, 5 % Streptomycin und 5 % Neomycin) ergĂ€nzt wurde. Die Zelllinien BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468 und 13762 MAT wurden in DMEM/F12-Medium mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin supplementiert. FĂŒr MCF-10A- und MCF-10AT1-Zellen wurde DMEM/F-12-Medium mit 25 % Pferdeserum, 0,01 % EGF, 0,28 IE/ml Insulin, 0,01 % Choleratoxin und 0,5 ÎŒg/ml Hydrocortison verwendet. Alle Zelllinien wurden bei 37°C und 5% CO2 gehalten.
LebensfÀhigkeit der Zellen
FĂŒr die Bewertung der ZelllebensfĂ€higkeit wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Well und 8 Wells pro Gruppe ausplattiert. Nach einer 24- bis 72-stĂŒndigen DCA- und ATO-Exposition wurden die Zellen 3 Stunden lang mit Neutralrot (30 ÎŒg/ml) in frischem Medium inkubiert, dann mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Lysepuffer (EssigsĂ€ure/Methanol, 80%/20%), und die Absorption bei 540 nm wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. ausgedrĂŒckt, Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
Zellproliferation
T-47D-Zellen wurden geerntet und in 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml PBS mit 5 ÎŒM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) markiert und anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die markierten Zellen wurden dann zweimal gewaschen, gezĂ€hlt und mit105 Zellen pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte ausgesĂ€t. Am Tag der Analyse wurden die T-47D-Zellen geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und anschließend die CFSE-IntensitĂ€t mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
Zelltod Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, nachdem die Zellen mit FITC-markiertem Annexin-V (AV) (Invitrogen Co.) und Propidiumjodid (PI) gefĂ€rbt worden waren. Nach der Medikamentenbehandlung wurden die T-47D-Zellen geerntet und 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert; die Pellets wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in 100 ÎŒl Annexin-V-Bindungspuffer (0,14 M NaCl, 2,5 mM CaCl2, 0,01 M HEPES pH 7,4) resuspendiert. Annexin-V (1 ÎŒl) und 5 ÎŒl PI (50 ÎŒg/ml) wurden zu den Proben gegeben und 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Proben wurden nach der Inkubation bis zur DurchfĂŒhrung der FACS-Analyse auf Eis gelagert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
ROS-Generierung
Zur Bewertung der intrazellulĂ€ren ROS-Konzentration wurden die Zellen in 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 1 ×105 Zellen pro Well plattiert und 12 Stunden lang mit Medikamenten behandelt. 2′,7′-Dihydrochlorfluroresceinacetat (H2DCFDA) wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 10 ÎŒM zugesetzt, und die Zellen wurden eine Stunde lang im Dunkeln gefĂ€rbt. Nach derH2DCFDA-FĂ€rbungwurden die Zellen trypsinisiert, zweimal gewaschen und in 100 ÎŒl PBS resuspendiert. DieH2DCFDA-IntensitĂ€twurde mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
ATP-Konzentration und Caspase-AktivitÀt Der
interne ATP-Spiegel und die Caspase-AktivitĂ€t in T-47D-Zellen wurden mit CellTiter-Glo- und Caspase-Glo 3/7-Assay-Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemĂ€ĂŸ den Anweisungen des Herstellers bestimmt. T-47D-Zellen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von Arzneimitteln 12 Stunden lang in weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platten (4 Wells pro Gruppe) kultiviert. Gleiche Volumina der CellTiter-Glo-Reagenzien wurden zugegeben, woraufhin die Proben 15 Minuten lang auf einem SchĂŒttler bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Lumineszenz wurde mit dem Glomax Mikroplatten-Luminometer (Promega Co., Madison, WI) nach dem voreingestellten CellTiter-Protokoll gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 4) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
Mitochondriales Membranpotenzial
Ähnlich wie bei der Messung von ROS wurden die Zellen in 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 1 ×105 Zellen pro Well plattiert und 12 Stunden lang mit Medikamenten behandelt. 5, 5′, 6, 6′-Tetrachlor-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazol-Carbocyaninjodid (JC-1) wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 0,2 ÎŒM zugesetzt, und die Zellen wurden 30 Minuten lang im Dunkeln gefĂ€rbt. Nach der JC-1-FĂ€rbung wurden die Zellen trypsinisiert, zweimal mit PBS gewaschen und in 100 ÎŒl PBS resuspendiert. Die JC-1-IntensitĂ€t wurde mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
Cytochrom-C-Oxidase-AktivitÀt Der
Cytochrom-C-Oxidase-Assay wurde auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Methode [24] bewertet. Kurz gesagt, wurden die T-47D-Zellen nach der Arzneimittelbehandlung in 96-Well-Platten (8 Vertiefungen pro Gruppe) mit 50 ÎŒl 0,01 % Saponin permeabilisiert, gefolgt von der Zugabe von 100 ÎŒl Substratmedium (4 mM 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB), 100 ÎŒM reduziertes Cytochrom C, 2 ÎŒg/ml Katalase in 0,1 M Na-Phosphat, pH 7,0). Die Absorption bei 450 nm wurde unmittelbar nach der Zugabe des Substratmediums gemessen und ĂŒber 30 Minuten ĂŒberwacht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 8) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
PDH-AktivitÀt Die
PDH-AktivitĂ€t wurde mit dem MitoSciences PDH-EnzymaktivitĂ€ts-Mikrotiterplatten-Assay-Kit (#MSP18, MitoSciences, Oregon USA) gemessen. Zur Messung der Wirkung von Arzneimitteln auf die PDH-AktivitĂ€t in Zellen wurden T-47D-Zellen 3 Stunden lang mit Arzneimitteln in den Medien behandelt, danach wurden sie gewaschen und in PBS resuspendiert. Zellextrakte wurden hergestellt und auf PDH-AktivitĂ€t in einer Konzentration von 15 mg Protein/ml gemĂ€ĂŸ den Anweisungen des Kits untersucht. Zur Messung der direkten Hemmung der PDH durch ATO wurde die PDH aus unbehandelten T-47D-Zellen isoliert, indem Zellextrakte auf die Antikörper-Fangplatte aufgetragen wurden. Nach dem Waschen der Platte wurde die Testlösung mit dem Arzneimittel in die Vertiefungen gegeben und anschließend sofort auf die PDH-AktivitĂ€t untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 4) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgefĂŒhrt, und die Daten beziehen sich auf ein reprĂ€sentatives Experiment.
Immunoblotting und densitometrische Analyse Die
Zellen (1 ×106 ) wurden in T25-Gewebekulturflaschen ausgeplattet und 12 Stunden lang mit ATO oder DCA behandelt. Zelllysate wurden durch Zugabe von 500 ÎŒl des MPERÂź SĂ€ugetierprotein-Extraktionsreagenzes (Thermo Scientific, IL, USA) hergestellt. Immunoblotting wurde wie zuvor beschrieben [25] mit den Antikörpern fĂŒr c-Myc (Roche, IN, USA, Klon 9E10), HIF-1α (Abcam, Cambridge, UK, #ab82832), Bcl-2 (Abcam #ab692), ATP Synthase ÎČ-Untereinheit (Abcam #ab14730) und ÎČ-Actin (Abcam #ab8227) durchgefĂŒhrt. Die Western Blots wurden mit Chemilumineszenz und Röntgenfilmbelichtung nachgewiesen. Die Bilder wurden mit einem CanoScan 8600F Flachbettscanner aufgenommen und mit der ImageJ-Software (Version 1.4, NIH, USA) quantifiziert und auf ÎČ-Actin in jeder Spur standardisiert. Die Ergebnisse wurden aus drei separaten Experimenten gepoolt und als Mittelwert ± S.D. (n = 3) ausgedrĂŒckt. Die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgefĂŒhrt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.













Ergebnisse

DCA und ATO zusammen sind wirksamer bei der Reduzierung der Zellproliferation und der HerbeifĂŒhrung des Zelltods
Um die kombinierte Wirkung von ATO und DCA auf die Hemmung des Zellwachstums zu untersuchen, wurden die Brustkrebszelllinien mehrere Tage lang mit beiden Medikamenten behandelt und die Gesamtzellzahl mit Hilfe des neutralen roten ZellviabilitĂ€tstests bestimmt. Die Zelllinien reprĂ€sentieren die wichtigsten Subtypen des menschlichen Brustkrebses (luminal (T-47D), basal A (MDAMB-468, BT-20), basal B (MDA-MB-231)) oder sind als experimentelle Modelle von Bedeutung (13762MAT – Mammaria-Adenokarzinom der Ratte, das in vivo empfindlich auf DCA [22]mCF10AT1 – malignes Derivat der immortalisierten Zellen MCF-10A). MDA-MB-468-, MDA-MB-231- und T-47D-Zellen zeigten alle eine signifikante Verringerung der Gesamtzellzahl von 10 % bis 40 % nach 72 Stunden Behandlung mit 5 mM DCA (Abbildung 1A), wĂ€hrend 13762 MAT-, BT-20- und MCF-10AT1-Zellen wĂ€hrend des Behandlungszeitraums nicht reagierten. Alle getesteten Krebszelllinien waren empfindlich gegenĂŒber ATO, allerdings in unterschiedlichen Konzentrationen. Eine Verringerung der Gesamtzellzahl wurde bei BT-20, T-47D, MCF-10AT1 und MDA-MB-468 mit nur 5 ÎŒM ATO-Behandlung festgestellt, wĂ€hrend 15 ÎŒM ATO erforderlich waren, um die gleiche Wirksamkeit bei den Zelllinien MDA-MB-231 und 13726 MAT zu erzielen. Auffallend ist, dass DCA und ATO in Kombination bei allen getesteten Krebszelllinien eine grĂ¶ĂŸere Wirkung zeigten als jedes der beiden Medikamente allein. In den FĂ€llen, in denen ATO und DCA als Einzelwirkstoffe eine Verringerung der Zellzahlen bewirkten, entsprach die Wirkung der kombinierten Behandlung in etwa der Summe der Einzelwirkungen der Wirkstoffe (T-47D, MDA-MB-468 und MDA-MB-231). DCA allein bewirkte zwar keine Verringerung der Zellzahl, konnte aber die Wachstumshemmung durch ATO um das 2-3fache steigern (13762 MAT, BT-20 und MCF10AT1) (Abbildung 1A). Die nicht krebsartige Zelllinie MCF-10A zeigte keine Verringerung der Zellzahl nach einer Behandlung mit ATO (15 ÎŒM), DCA (5 mM) oder einer kombinierten Behandlung.
Die Wirkung von ATO und DCA wurde weiter mit T-47D-Zellen untersucht, einer der Zelllinien, die empfindlicher auf DCA allein reagieren. Die Reaktion der T-47D-Zellen auf DCA war dosisabhĂ€ngig, und nach 72 Stunden hatten die mit 5 mM DCA behandelten Zellen 42 ± 6 % weniger Zellen als die Kontrollkultur (Abbildung 1B). ATO allein (5 ÎŒM) verringerte die Gesamtzahl der Zellen um 56 ± 4 %, und die sowohl mit DCA als auch mit ATO behandelten Zellen zeigten einen weiteren RĂŒckgang im Vergleich zu der Gruppe, die nur ATO erhielt (Abbildung 1C). Die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von DCA (5 mM) und ATO die IC50 auf das 0,25-fache derjenigen von ATO allein senken kann (Abbildung 1C). Dieser Effekt tritt innerhalb des Konzentrationsbereichs auf, der klinisch fĂŒr ATO erreicht wird (bis zu 5-7 ÎŒM [26]).
Der CFSE-Proliferationsassay zeigte, dass entweder mit ATO (5 ÎŒM) oder mit DCA (5 mM) behandelte Zellen nach 72 Stunden Behandlung eine signifikant höhere CFSE-Fluoreszenz (2,1- bzw. 2,2-fach) aufwiesen, was auf eine Wachstumshemmung hindeutet. Zellen, die sowohl mit ATO als auch mit DCA behandelt wurden, zeigten eine 3,4-fache Erhöhung der CFSE-IntensitĂ€t im Vergleich zu unbehandelten Zellen, was darauf hindeutet, dass die Medikamente gemeinsam die Zellproliferation hemmen (Abbildung 1D).
Die Wirkung von ATO und DCA auf den Zelltod von T-47D wurde mittels AV- und PI-DoppelfĂ€rbung bewertet und die Zellen wurden mittels fluoreszierender Zellsortierung analysiert. DCA allein (5 mM) löste bei T-47D-Zellen keinen Zelltod aus (Abbildung 1E), Ă€hnlich wie die Wirkung von DCA auf 13762 MAT-Zellen, ĂŒber die bereits berichtet wurde [22]. ATO (5 ÎŒM) löste nach 12 Stunden Behandlung ebenfalls keinen Zelltod aus, jedoch zeigten Zellen, die sowohl mit 5 ÎŒM ATO als auch mit 5 mM DCA behandelt wurden, einen geringen (15 %) Anstieg der AV+/PI+-Population (13,2 ± 0,6 % apoptotische Zellen im Vergleich zu 11,5 ± 1,0 % fĂŒr ATO/DCA bzw. unbehandelt, p = 0,07), was darauf hindeutet, dass DCA die apoptotischen Effekte von ATO verstĂ€rken könnte. Bei höheren Konzentrationen und einer 48-stĂŒndigen Behandlung erhöhte ATO (20 ÎŒM) die Zahl der absterbenden Zellen um 35 ± 8 % (P = 0,029) im Vergleich zur unbehandelten Kultur (Abbildung 1E). Die Kombination von 5 mM DCA mit 20 ÎŒM ATO-Behandlung fĂŒhrte zu einem vierfachen Anstieg der AV+/PI+-Population im Vergleich zu ATO allein, was darauf hinweist, dass DCA den durch ATO induzierten Zelltod in T-47D-Brustkrebszellen verstĂ€rken kann (Abbildung 1E).


Abbildung 1 Hemmung des Krebszellwachstums durch ATO und DCA. (A) Kombinierte Wirkung von ATO (5 oder 15 ÎŒM) und DCA (5 mM) auf das Wachstum von Brustkrebszellen, gemessen mit dem Neutralrot-VitalitĂ€tstest nach 3 Tagen Behandlung. BT-20, T-47D, MDA-MB-468 und MCF-10AT1 Zellen wurden mit 5 ÎŒM ATO behandelt. MDA-MB-231-, MAT- und MCF-10A-Zellen wurden mit 15 ÎŒM ATO behandelt. (B) Dosisreaktion von T-47D-Zellen auf DCA (t = 72 Stunden). (C) Dosis-Antwort von T-47D-Zellen auf die Behandlung mit ATO und ATO/DCA (5 mM) (t = 72 Stunden). (D) T-47D-Proliferation, gemessen als mittlere CFSE-IntensitĂ€t nach Behandlung mit 5 ÎŒM ATO und/oder 5 mM DCA (t = 72 Stunden) (höhere CFSE-IntensitĂ€t bedeutet geringere Proliferation). (E) Zelltod (AV +/PI+) Population, ausgedrĂŒckt als Prozentsatz der Gesamtzellzahl nach 48 Stunden Behandlung mit 20 ÎŒM ATO und/oder 5 mM DCA. * P ≀ 0,05, ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt). ## P ≀ 0,001, ### P ≀ 0,0001 (ATO/DCA vs. ATO).


ATO und DCA wirken zusammen auf die Depolarisierung der MMP, haben aber gegensÀtzliche Auswirkungen auf die Induktion der ATP- und ROS-Produktion
Sowohl ATO als auch DCA verĂ€ndern nachweislich die mitochondriale Funktion, depolarisieren MMP und erhöhen die ROS-Produktion [20]. Daher wurden diese Parameter zusammen mit dem ATP-Spiegel untersucht, um festzustellen, ob sie zu den verstĂ€rkten Anti-Krebs-Effekten der kombinierten Behandlung mit ATO/DCA beitragen. Gemessen durch JC-1-FĂ€rbung wurde die Anzahl der T-47D-Zellen mit hyperpolarisiertem MMP (oberer rechter Quadrant) durch die Behandlung mit DCA (5 mM) oder ATO (5 ÎŒM und 20 ÎŒM) signifikant verringert (t = 12 Stunden) (28 ± 6 %, 38 ± 4 % bzw. 69 ± 7 % RĂŒckgang im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen), was mit zuvor veröffentlichten Daten ĂŒbereinstimmt [20,27]. Die Kombination von ATO (5 ÎŒM oder 20 ÎŒM) mit 5 mM DCA fĂŒhrte zu einem noch stĂ€rkeren RĂŒckgang (53 ± 9 % bzw. 77 ± 12 %) im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Abbildung 2A), was zeigt, dass DCA und ATO bei der Depolarisierung der MMP zusammenwirken können. Der ATP-Spiegel wurde sowohl durch niedrig als auch durch hoch dosiertes ATO (14 ± 3 % bzw. 32 ± 5 %) nach 12-stĂŒndiger Behandlung gesenkt, wĂ€hrend mit DCA behandelte Zellen einen Anstieg des ATP-Spiegels um 6 ± 1 % aufwiesen (Abbildung 2B und 2C). Bei der hohen ATO-Dosis war DCA nicht in der Lage, die ATP-Produktion zu steigern (Abbildung 2B), wĂ€hrend bei der niedrigen ATO-Dosis die mit DCA und ATO behandelten Zellen einen geringen Anstieg der ATP-Produktion im Vergleich zur alleinigen ATO-Behandlung zeigten (Abbildung 2C). Diese Daten deuten darauf hin, dass DCA und ATO die ATP-Produktion ĂŒber separate Ziele innerhalb der Zellen beeinflussen.

Abbildung 2 IntrazellulĂ€re Reaktionen von T-47D-Zellen auf die Behandlung mit ATO und DCA. (A) JC-1-FĂ€rbung, die die kombinierte Wirkung von DCA und ATO auf die Depolarisierung der MMP zeigt (t = 12 Stunden). (B und C) Die Auswirkungen von ATO (20 ÎŒM (B) oder 5 ÎŒM (C)) und DCA (5 mM) auf den ATP-Spiegel. * P ≀ 0,05, ** P ≀ 0,001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Erhöhte intrazellulĂ€re ROS-Konzentrationen werden als Grund fĂŒr die ZytotoxizitĂ€t von ATO vorgeschlagen [2,9]. Die kombinierte Wirkung von ATO und DCA auf ROS wurde mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs H2DCFDA untersucht. Zellen, die mit 20 ÎŒM ATO oder 5 mM DCA behandelt wurden, wiesen erhöhte intrazellulĂ€re ROS-Werte auf (2,8- bzw. 1,9-fach) (Abbildung 3A), Ă€hnlich wie die zuvor veröffentlichten Ergebnisse [27]wĂ€hrend Zellen, die sowohl mit ATO als auch mit DCA behandelt wurden, einen weiteren Anstieg (5,2-fach) der ROS-Produktion aufwiesen (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu bewirkte ATO in niedriger Konzentration (5 ÎŒM) eine 0,5-fache Abnahme der ROS-Produktion (Abbildung 3B). Dies stand im Gegensatz zu frĂŒheren Berichten ĂŒber die ROS-Produktion und die ATO-Behandlung, weshalb die Dosis-Wirkungsbeziehung und der zeitliche Verlauf der ROS-Produktion nach der ATO-Behandlung analysiert wurden. Dabei zeigte sich, dass niedrigere ATO-Konzentrationen die intrazellulĂ€re ROS-Produktion verringerten, wĂ€hrend hohe ATO-Konzentrationen die ROS-Produktion anregten (Abbildung 3C). In Ă€hnlicher Weise fĂŒhrte eine Behandlung mit 10 ÎŒM ATO zu einem deutlichen RĂŒckgang der ROS-Produktion in den ersten 4 Stunden, bevor die ROS-Werte nach 8 Stunden auf das von anderen Autoren berichtete Niveau anstiegen (Abbildung 3D). Die kombinierte Behandlung von Zellen mit 5 mM DCA und 5 ÎŒM ATO fĂŒhrte zu einer intermediĂ€ren ROS-Produktion (Abbildung 3B), die mit der von unbehandelten Zellen vergleichbar war.

Abbildung 3 Auswirkungen von ATO und DCA auf die ROS-Produktion. (A und B) Die Auswirkungen von ATO und DCA auf die ROS-Konzentration in T-47D-Zellen nach einer Behandlung mit 20 ÎŒM (A) oder 5 ÎŒM (B) ATO, allein und in Kombination mit 5 mM DCA. (C) Dosis-Wirkung der ROS-Konzentrationen auf verschiedene ATO-Konzentrationen (t = 12 Stunden). (D) Zeitlicher Verlauf der ROS-Produktion nach 10 ÎŒM ATO-Behandlung. ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Die intermediĂ€ren Auswirkungen der DCA/ATO-Kombinationsbehandlung auf die ATP- und ROS-Konzentrationen können durch konkurrierende Auswirkungen auf die PDH-AktivitĂ€t erklĂ€rt werden. DCA zielt auf PDK ab und sollte daher die PDH-AktivitĂ€t erhöhen, wĂ€hrend ATO Berichten zufolge PDH entweder direkt durch Reaktion mit vicinalen Thiolen auf PDH oder indirekt ĂŒber eine erhöhte Wasserstoffperoxidproduktion hemmt [28]. Um die Auswirkungen von ATO und/oder DCA auf die PDH-AktivitĂ€t zu untersuchen, wurden intakte Zellen oder aus T-47D-Zellen isolierte PDH mit dem Medikament behandelt und die PDH-AktivitĂ€t bestimmt. Wie vorhergesagt, fĂŒhrte eine dreistĂŒndige Behandlung intakter Zellen mit DCA zu einer erhöhten PDH-AktivitĂ€t, wĂ€hrend ATO (bis zu 20 ÎŒM) die PDH-AktivitĂ€t intakter Zellen nicht verĂ€nderte (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu verĂ€nderte DCA die AktivitĂ€t der isolierten PDH nicht, aber hohe Konzentrationen von ATO konnten die PDH-AktivitĂ€t hemmen (Abbildung 4b). In T-47D-Zellen verringerte ATO also die PDH-AktivitĂ€t bei den in dieser Studie verwendeten Konzentrationen nicht.

Abbildung 4 Auswirkungen von ATO und DCA auf die PDH-AktivitĂ€t. (A) Auswirkungen auf die PDH-AktivitĂ€t in T-47D-Zellen nach 3 Stunden Behandlung mit ATO und DCA. (B) Wirkung der ATO-Behandlung auf die PDH-AktivitĂ€t der isolierten PDH (Antikörpergewinnung aus T-47D-Zellen). * P ≀ 0,05, ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


ATO ist ein Inhibitor von Komplex IV der Elektronentransportkette
Die Elektronentransportkette (ETC) befindet sich in der inneren Membran der Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion. Die ETC ist dafĂŒr verantwortlich, den Protonengradienten fĂŒr den inneren Membranraum der Mitochondrien zu erzeugen, um die MMP fĂŒr die ATP-Produktion aufrechtzuerhalten [29]. Der ETC ist auch nachweislich der Hauptort der ROS-Produktion innerhalb der Zellen als Ergebnis des Elektronenverlusts aus Komplex I und III [30]. Aufgrund seiner FĂ€higkeit, ROS zu reduzieren, die MMP zu depolarisieren und gleichzeitig die ATP-Produktion zu verringern, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass ATO als ETC-Inhibitor wirkt. Eine Reihe von ETC-Inhibitoren wurde mit ATO (5 ÎŒM) verglichen, um festzustellen, ob sie die gleichen phĂ€notypischen VerĂ€nderungen wie ATO in T-47D-Zellen hervorrufen. Rotenon (0,1 ÎŒM, Komplex I), Thenolytrifluoraceton (TTFA) (10 ÎŒM, Komplex II), Antimycin (0,1 ÎŒM, Komplex III) und NaCN (10 mM, Komplex IV) wurden zur Behandlung von T-47D-Zellen verwendet, und die ROS-, MMP- und ATP-Werte wurden mit denen von ATO behandelter Zellen verglichen. Alle Inhibitoren waren in der Lage, die MMP zu depolarisieren (Abbildung 5A) und den ATP-Spiegel zu senken (Abbildung 5B), Ă€hnlich wie ATO. Im Gegensatz zu ATO gelang es Rotenon, Antimycin und TTFA jedoch nicht, die ROS-Produktion in den Zellen zu reduzieren, sondern erhöhten die ROS nach 12 Stunden Behandlung um das 3- bis 6-fache (Abbildung 5C). Zellen, die mit NaCN (10 mM) behandelt wurden, zeigten jedoch einen RĂŒckgang der ROS-Produktion um 52 % (Abbildung 5C), Ă€hnlich wie bei der Behandlung mit ATO. Auf der Grundlage dieser Daten kamen wir zu dem Schluss, dass in T47D-Brustkrebszellen die Hemmung des Komplexes IV der ETC, nicht aber der Komplexe I-III, zu einer Verringerung der ROS-Produktion fĂŒhrt, und es ist daher wahrscheinlich, dass die durch ATO induzierten phĂ€notypischen VerĂ€nderungen durch die Hemmung des Komplexes IV (Cytochrom-C-Oxidase) der ETC verursacht werden. Um dies zu bestĂ€tigen, wurde die Cytochrom-C-Oxidase-AktivitĂ€t in T-47D-Zellen spektrophotometrisch gemessen. Der Cytochrom-C-Oxidase-Assay zeigte eindeutig, dass DCA keine Auswirkungen auf die Komplex-IV-AktivitĂ€t hatte, wĂ€hrend ATO (5 ÎŒM, 5 min) die Komplex-IV-AktivitĂ€t hemmen kann, was unsere Hypothese bestĂ€tigt (Abbildung 5D). Ähnliche Ergebnisse wurden nach 10-minĂŒtigen, 3-stĂŒndigen und 12-stĂŒndigen Medikamentenbehandlungen erzielt. Die Kombination von ATO und DCA zeigte eine Ă€hnliche Enzyminhibition wie ATO allein.

Abbildung 5 Hemmung der ETC durch ATO. (A bis C) Die Auswirkungen einer Reihe von ETC-Inhibitor-Behandlungen wurden mit 5 ÎŒM ATO verglichen (t = 12 Stunden): (A) MMP durch JC-1-FĂ€rbung; (B) ATP-Spiegel; (C) ROS-Spiegel. (D) Cytochrom-C-Oxidase-AktivitĂ€t nach Behandlung (5 min) mit DCA (5 mM) und/oder ATO (5 ÎŒM). ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Mitochondriale Transition-Pore-Inhibitoren blockierten teilweise die ATO-induzierte Caspase-Aktivierung, hatten aber keine Auswirkungen auf ROS, ATP und MMP
Ein Mechanismus, der zuvor als SchlĂŒssel zur ZytotoxizitĂ€t von ATO beschrieben wurde, ist die Öffnung der mitochondrialen Übergangspore (MTP). Es hat sich gezeigt, dass ATO die Öffnung der MTP in isolierten Mitochondrien induziert und die Freisetzung von Cytochrom C [11] und Kernapoptose in zellfreien Systemen induzieren [31]. Es wird angenommen, dass die Öffnung des MTP durch ATO eine mitochondriale Permeabilisierung auslöst, die MMP auflöst und die intrazellulĂ€re ROS erhöht. Um zu prĂŒfen, ob das MTP fĂŒr die ToxizitĂ€t von ATO in T-47D-Zellen von Bedeutung ist, wurden BongkrekinsĂ€ure (BA) und Cyclosporin A (CsA), beides starke MTP-Porenblocker [32]wurden mit ATO kombiniert, um festzustellen, ob sie die ATO-induzierten intrazellulĂ€ren VerĂ€nderungen hemmen können. Die Zugabe von 5 ÎŒM CsA oder 50 ÎŒM BA zu mit ATO (5 ÎŒM) behandelten Zellen beeintrĂ€chtigte nicht die FĂ€higkeit von ATO, die ROS-Produktion nach 12 Stunden Behandlung zu senken, die ATP-Produktion zu verringern oder die MMP zu depolarisieren (P > 0,05) (Abbildung 6B, C und 6D). Ähnliche Ergebnisse sind fĂŒr die Behandlung mit NaCN und CsA/BA zu beobachten (P > 0,05) (Abbildung 6B, C und 6D). Um die AktivitĂ€t von CsA und BA unter unseren Versuchsbedingungen zu bestĂ€tigen, wurde die AktivitĂ€t von Caspase 3/7, einem Apoptosemarker, der der MTP-Öffnung nachgeschaltet ist und durch die Freisetzung von Cytochrom C aktiviert wird, nach einer ATO-Behandlung in hoher Konzentration bestimmt (Abbildung 6A). Die ATO-Behandlung (20 ÎŒM) verdoppelte die Caspase 3/7-AktivitĂ€t im Vergleich zu unbehandelten Zellen (2,1-fach, Abbildung 6A), und dieser Effekt wurde durch BA und CsA verringert (1,7-fach bzw. 1,4-fach), was darauf hinweist, dass CsA oder BA die MTP-Öffnung in T-47D-Zellen blockieren können. Diese Daten zeigen deutlich, dass ATO (20 ÎŒM) zwar die Öffnung von MTP induzieren kann, dieser Mechanismus jedoch nicht die VerĂ€nderungen von ROS, MMP und ATP erklĂ€ren kann, die wĂ€hrend einer Behandlung mit 5 ÎŒM ATO auftreten. Wir schließen daraus, dass diese VerĂ€nderungen wahrscheinlich auf die Hemmung des ETC-Komplexes IV zurĂŒckzufĂŒhren sind.

Abbildung 6 Wirkung der MTP-Blocker CsA und BA auf mit ATO behandelte Zellen. (A) CsA und BA können beide die 20 ÎŒM ATO-induzierte Caspase 3/7-Aktivierung teilweise blockieren. (B bis D) Im Gegensatz dazu konnten sowohl CsA als auch BA die durch NaCN oder 5 ÎŒM ATO induzierte Verringerung der ROS (B), die Verringerung des ATP-Spiegels (C) und die Depolarisierung der MMP (D) nicht blockieren. * P ≀ 0,05, ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001 (behandelt vs. unbehandelt). # P ≀ 0,05, ## P ≀ 0,001 (im Vergleich zu ATO allein). NS – nicht signifikant im Vergleich zu ATO oder NaCN allein.


DCA und ATO haben gegensĂ€tzliche Auswirkungen auf die ATP-Synthase-ÎČ-Untereinheit und die Bcl-2-Expression, wĂ€hrend sie bei der Herabregulierung der c-Myc- und HIF-1α-Proteinspiegel zusammenwirken
Wir untersuchten die Wirkung einer Behandlung mit 5 mM DCA und 5 ÎŒM ATO (12 Stunden) auf die Expression von c-Myc und HIF1α, zwei wichtigen Transkriptionsfaktoren, die bekanntermaßen den Warburg-Effekt regulieren [33] und die mitochondriale AktivitĂ€t [34]sowie auf die Expression der mitochondrialen Proteine ATP-Synthase ÎČ-Untereinheit (ATPÎČ) und Bcl-2. Immunoblotting fĂŒr c-Myc zeigte keine VerĂ€nderung nach der Behandlung mit DCA, wĂ€hrend ATO die Hochregulierung von c-Myc induzierte (Abbildung 7A und 7B), jedoch reduzierte ATO in Kombination mit DCA den c-Myc-Spiegel im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Der HIF-1α-Spiegel hingegen wurde sowohl nach DCA- als auch nach ATO-Behandlung herunterreguliert. Die Kombination von ATO und DCA fĂŒhrte zu einer weiteren Herabregulierung von HIF-1α im Vergleich zu den mit einem einzelnen Wirkstoff behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen (Abbildung 7A und 7C). Bcl-2 ist ein Mitglied der BH3-Proteinfamilie, das direkt an Bad und Bax bindet und Apoptose verhindert [35]. Immunoblotting fĂŒr ATPÎČ ergab, dass die DCA-Behandlung die ATPÎČ-Konzentration erhöhte, wĂ€hrend ATO einen gegenteiligen Effekt zeigte, indem es die ATPÎČ-Konzentration senkte (Abbildung 7A und 7D), und die kombinierte Behandlung mit ATO und DCA zeigte eine mittlere Reaktion im Vergleich zu den mit ATO oder DCA behandelten Gruppen. Immunoblotting fĂŒr das Pro-Survival-Protein Bcl-2 zeigte eine Hochregulierung nach DCA, eine Herabregulierung bei ATO-Behandlung und eine mittlere Reaktion auf die Kombination der beiden Medikamente (Abbildung 7A und 7E). Diese Ergebnisse sind auch sehr Ă€hnlich zu den ATP-Spiegeln und der ROS-Produktion, wo DCA und ATO entgegengesetzte Wirkungen hatten (Abbildung 2C und 3B). Die Ergebnisse fĂŒr Bcl-2 und ATPÎČ korrelieren direkt mit der FĂ€higkeit von DCA und ATO, die ROS-Produktion und den ATP-Spiegel zu beeinflussen.

Abbildung 7 VerĂ€nderungen der Proteinexpression nach ATO- und DCA-Behandlung. (A) Immunoblotting von T-47D-Zellen, die mit ATO und/oder DCA behandelt wurden. (B-E) Die densiometrische Analyse fĂŒr c-Myc (B), HIF-1α (C), ATPÎČ (D), Bcl-2 (E) und ÎČ-Actin (Kontrolle) wurde mit Blotting von Ganzzell-Lysaten durchgefĂŒhrt, die aus T-47D-Zellen hergestellt wurden, die 12 Stunden lang mit 5 mM DCA und/oder 5 ÎŒM ATO behandelt wurden. * P ≀ 0,05, ** P ≀ 0,001, *** P ≀ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt). # P ≀ 0,05, ## P ≀ 0,001, ### P ≀ 0,0001 (DCA/ATO vs ATO).



Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde ATO wirksam zur Behandlung sowohl von neu diagnostizierten als auch von rezidivierten APL-Patienten eingesetzt, wobei die Patienten nach einer niedrig dosierten ATO-Behandlung eine vollstĂ€ndige Remission zeigten [4]. Die krebshemmende Wirkung von ATO ist nicht auf APL [36] und viele andere Tumoren haben sich in Tiermodellen als empfindlich gegenĂŒber der Behandlung mit ATO erwiesen [37,38]. Das Fehlen von Informationen ĂŒber die Wirkorte der ATO-ZytotoxizitĂ€t bei anderen Tumorarten als der APL hat jedoch bis vor wenigen Jahren die Akzeptanz von ATO bei der Behandlung anderer Krebsarten eingeschrĂ€nkt [5].
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Komplex IV des ETC ein Ziel fĂŒr ATO ist. Von einer Reihe von ETC-Inhibitoren konnte der durch eine niedrig dosierte ATO-Behandlung von T-47D-Zellen verursachte RĂŒckgang der ROS, der ATP-Produktion und der MMP-Depolarisierung nur durch Cyanid, einen gut charakterisierten Komplex-IV-Inhibitor, reproduziert werden (Abbildung 5). Die direkte Messung der Cytochrom-C-Oxidase-AktivitĂ€t in ganzen Zellen, die mit ATO behandelt wurden, bestĂ€tigte die FĂ€higkeit von ATO, diese EnzymaktivitĂ€t direkt zu hemmen. Es ist bekannt, dass der Cytochrom-C-Oxidase-Komplex der ETC eng beieinander liegende Cysteinreste aufweist [39], und diese reagieren wahrscheinlich mit ATO.
Die meisten Krebszellen weisen im Vergleich zu normalenZellenerhöhte ROS-Werte auf [40], und die ETC gilt als Hauptquelle fĂŒr intrazellulĂ€re ROS. Die Reduzierung der ROS um bis zu 60 % durch NaCN oder ATO zeigt, dass Komplex IV fĂŒr den Großteil der ROS-Produktion in T-47D-Zellen verantwortlich ist. Der oxidative Stress einer erhöhten ROS-Produktion ist als zweischneidiges Schwert beschrieben worden. Es hat sich gezeigt, dass ein moderater Anstieg von ROS mit einem erhöhten proliferativen Potenzial [41], erhöhten antioxidativen Enzymen wie Glutathiontransferase [42], Superoxiddismutase und Katalase [43] und erhöhten Prosurvival-Proteinen wie Bcl-2 [42] und Survivin [44] verbunden ist. UnertrĂ€gliche Mengen an ROS fĂŒhren jedoch schließlich zum Zelltod [45]. Die Verringerung der ROS nach einer 12-stĂŒndigen Behandlung mit 5 ÎŒM ATO korrelierte auch direkt mit einem RĂŒckgang der Bcl-2-Werte (Abbildung 7E), was darauf hindeutet, dass sich die T-47D-Zellen aufgrund erhöhter ROS-Werte in einem apoptotisch resistenten Zustand befinden. Eine fortgesetzte Hemmung des Komplexes IV der ETC fĂŒhrt zu einer Depolarisierung der MMP und einer Hemmung der ATP-Produktion. Der Zelltod, der sich aus dieser mitochondrialen Dysregulation ergibt, fĂŒhrt zu den erhöhten ROS-Werten, die nach 4 Stunden oder bei höheren ATO-Konzentrationen beobachtet werden (Abbildung 3C und 3D), wie von anderen Autoren [46] nach ATO-Behandlung berichtet. Erhöhte ROS sind also eine Folge, nicht die Ursache des ATO-induzierten Zelltods.
Das zuvor vorgeschlagene mitochondriale Ziel fĂŒr ATO ist die MTP. Zheng et al. wiesen nach, dass ATO die Öffnung des MTP in isolierten Mitochondrien der Rattenleber induziert [11], was zu dem Vorschlag fĂŒhrte, dass MTP fĂŒr die Freisetzung von ROS und die Depolarisierung des MMP, die wĂ€hrend der Arsenbehandlung zu beobachten ist, und die anschließende Apoptose verantwortlich ist [47]. Unsere Studie schließt MTP als Ziel fĂŒr ATO nicht aus. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Hemmung des MTP durch CsA und BA die durch ATO in hoher Konzentration induzierte Caspase 3/7-Aktivierung teilweise blockieren kann. Die MTP-Blocker konnten jedoch die durch ATO in niedriger Konzentration verursachte Depolarisierung der MMP und die Verringerung des ROS- und ATP-Spiegels nicht hemmen. Obwohl ATO das MTP öffnen kann, sind also alternative Ziele erforderlich, um die Wirkung von ATO bei niedrigen Konzentrationen zu erklĂ€ren. Eine Hemmung des Thioredoxin-Systems wurde in MCF-7-Zellen nach einer Behandlung mit 2-5 ÎŒM ATO nachgewiesen und könnte einige zellulĂ€re Wirkungen von ATO bei niedrigen Konzentrationen vermitteln [13], allerdings wĂŒrde dieser Mechanismus zu erhöhtem oxidativem Stress fĂŒhren und kann die in der aktuellen Studie beobachtete Verringerung der ROS nicht erklĂ€ren.
DCA kann als Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Inhibitor die glykolytische Wirkung umkehren und hat sowohl in vitro als auch in vivo signifikante krebshemmende Eigenschaften gezeigt [17-23]. Einige Studien zeigen eine erhöhte Apoptose durch DCA [17,18,20]. Unsere Studien bei Brustkrebs und Studien von Stockwin et al. deuten jedoch darauf hin, dass DCA bei einer Reihe von Zelllinien eher zytostatisch als zytotoxisch wirkt, außer bei sehr hohen Konzentrationen [22,48]. Michelakis berichtete vor kurzem ĂŒber DCA-Trog-Serumspiegel von 0,5 mM bei Glioblastom-Patienten, die zweimal tĂ€glich 6,25 mg/kg oral einnahmen [23], so dass die klinisch relevanten Konzentrationen wahrscheinlich im Bereich von 0,5-5 mM liegen. DCA induziert nachweislich einen geringen, aber signifikanten Anstieg der Caspase 3/7-AktivitĂ€t, auch wenn keine Apoptose beobachtet wurde, und es wurde vorgeschlagen, dass DCA Krebszellen gegenĂŒber zytotoxischen Wirkstoffen sensibilisieren könnte [22]. Die aktuelle Studie bestĂ€tigte diese Hypothese, indem sie zeigte, dass DCA die T-47D-Zellen gegenĂŒber einer ATO-Behandlung sensibilisierte, wie aus der AV+/PI+-DoppelfĂ€rbung hervorgeht (Abbildung 1E und Text). ATO wurde aufgrund seiner anti-mitochondrialen Eigenschaften als Testwirkstoff ausgewĂ€hlt, da wir davon ausgingen, dass durch die Umkehrung des glykolytischen PhĂ€notyps mit DCA und die Lenkung von mehr Pyruvat in die mitochondriale oxidative Phosphorylierung bei gleichzeitiger Ausrichtung auf die Mitochondrien mit ATO ein kooperativer Effekt mit dieser Wirkstoffkombination erzielt werden wĂŒrde. Das Prinzip dieser dualen Targeting-Strategie wird durch die Ergebnisse zweier neuerer Veröffentlichungen gestĂŒtzt, in denen festgestellt wurde, dass Zellen mit mitochondrialen Defekten (z. B. rho (0) oder nach Behandlung mit nichtmedikamentösen mitochondrialen Inhibitoren wie Rotenon) eine höhere Empfindlichkeit gegenĂŒber den wachstumshemmenden Wirkungen von DCA aufweisen [48,49]. Die Wirksamkeit dieser dualen Targeting-Strategie muss zwar noch in vivo nachgewiesen werden, aber die verstĂ€rkten Kombinationswirkungen von ATO/DCA wurden sowohl bei der Wachstumshemmung als auch bei der Apoptose bei Arzneimittelkonzentrationen in klinisch relevanten Bereichen beobachtet. Einige Wirkungen am unteren Ende des Konzentrationsbereichs waren nicht sehr groß (z. B. 15 % Anstieg der apoptotischen Zellen), aber die Auswirkungen in vivo ĂŒber Wochen statt Stunden der Behandlung rechtfertigen weitere Untersuchungen.
Es ist gut dokumentiert, dass DCA das mitochondriale Verhalten verĂ€ndern kann, d. h. die MMP depolarisiert [18,20]. Dieses PhĂ€nomen ist jedoch nicht gut erklĂ€rt worden. Wir beobachteten, dass DCA das ATP erhöhen und gleichzeitig die MMP in T-47D-Zellen depolarisieren kann (Abbildung 2). Auf der Grundlage dieser Daten schlugen wir vor, dass DCA die mitochondriale Funktion ĂŒber den Komplex V der ETC, die ATP-Synthase, verĂ€ndert. Die ATP-Synthase ist der letzte Schritt der ETC und verwendet das von der ETC erzeugte MMP zur Herstellung von ATP. ATPb ist bei Lungen-, Gehirn-, Brust- und Magenkrebs herunterreguliert [50], was die hyperpolarisierte Mitochondrienmembran erklĂ€ren könnte, die in vielen Krebszellen zu finden ist [51]. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass DCA die ATP-Synthase-AktivitĂ€t entweder ĂŒber eine allosterische Regulierung aufgrund seiner Homologie zu Pyruvat oder ĂŒber eine Erhöhung der ATP-Synthase-Proteinspiegel nach Umkehrung des Warburg-Effekts und verringerter HIF-1α-Spiegel erhöhen kann. Immunoblotting zeigte eindeutig, dass ATPÎČ nach DCA-Behandlung hochreguliert ist (Abbildung 7D), was darauf hindeutet, dass DCA die ATP-Synthase-AktivitĂ€t erhöhen kann, was wiederum zu einer erhöhten ATP-Produktion und Erschöpfung der MMP beitrĂ€gt.
HIF-1α und c-Myc sind zwei wichtige onkogene Transkriptionsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie den Stoffwechsel in Krebszellen regulieren. HIF-1α kann die Enzyme des glykolytischen Weges und der MilchsĂ€ure-Dehydrogenase hochregulieren und so den Warburg-Effekt in Krebszellen aufrechterhalten [33]. Dadurch wird nicht nur die ATP-Produktion erhöht, sondern auch die Versorgung mit VorlĂ€ufersubstanzen wie Glukose-6-Phophat und Fruktose-6-Phosphat fĂŒr die Produktion von NukleinsĂ€uren ĂŒber den Pentosephosphatweg [16]. c-Myc wiederum spielt nicht nur eine zentrale Rolle bei der Förderung des Übergangs von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus durch die Regulierung der Cycline und ihrer Kinasen und Inhibitoren, sondern reguliert auch Proteinkomponenten des ETC wie COXI-IV hoch und trĂ€gt zur Steigerung der mitochondrialen AktivitĂ€t bei [52]. Somit ist die Kombination von c-Myc und HIF-1α-Überexpression wichtig fĂŒr die Auslösung des Warburg-Effekts bei gleichzeitiger Erhöhung der mitochondrialen AktivitĂ€t, die den Glutamin-TCA-Hub unterstĂŒtzt, der fĂŒr den Anabolismus von AminosĂ€uren und FettsĂ€uren, die fĂŒr die Zellteilung benötigt werden, wesentlich ist [16]. Diese Stoffwechselsignatur trĂ€gt zur Karzinogenese und zum malignen PhĂ€notyp vieler Tumoren bei [33,34]. Sowohl ATO als auch DCA können die HIF-1α-Spiegel deutlich senken, was auf eine Verringerung des Warburg-Effekts hindeutet (Abbildung 7C). WĂ€hrend DCA allein keine Auswirkung auf die c-Myc-Konzentration hatte, regulierte ATO die c-Myc-Konzentration ĂŒberraschenderweise deutlich nach oben (Abbildung 7B). Dies könnte eine positive RĂŒckkopplungsschleife sein, bei der die Zellen versuchen, die ETC-AktivitĂ€t nach der Hemmung von Komplex IV zu erhöhen. Auffallend ist, dass DCA die Wirkung von ATO auf c-Myc umkehrte und die Kombination von ATO und DCA die c-Myc-Expression stark unterdrĂŒckte, was mit der FĂ€higkeit dieser Wirkstoffe korreliert, gemeinsam die Zellproliferation zu reduzieren und den Zelltod herbeizufĂŒhren (Abbildung 1).
Die Wirksamkeit von ATO gegen PML wird auf mehrere besondere Merkmale dieser malignen Erkrankung zurĂŒckgefĂŒhrt: Differenzierung durch Inaktivierung von PML-RARα, geringe antioxidative KapazitĂ€t der PML-Zellen zum Schutz vor erhöhten ROS-Werten und Akkumulation des Wirkstoffs aufgrund einer gestörten Osmoregulation [5]. Derzeit laufen zahlreiche Studien zum Einsatz von ATO bei einer Reihe von soliden malignen Erkrankungen, obwohl bisher nur wenige Ergebnisse veröffentlicht wurden. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass ATO als Einzelwirkstoff bei Patienten mit fortgeschrittenem BauchspeicheldrĂŒsen-, Leber- oder Melanomkrebs nicht sehr wirksam ist<ahref=“#5″>[5]</a></sup>. Forscher plĂ€dieren dafĂŒr, ATO in Kombination mit anderen Krebsmedikamenten<sup><a href=“#53″> [53,54]</a></sup> zu untersuchen, wobei einige Phase-I-Studien bereits abgeschlossen sind <sup><a href=“#55″>[55]</a></sup>. In dem Maße, wie unser VerstĂ€ndnis der Mechanismen von ATO weiter zunimmt, insbesondere seiner Auswirkungen auf den Krebsstoffwechsel, werden wir möglicherweise besser in der Lage sein, sein krebsbekĂ€mpfendes Potenzial in vivo in neuartigen Arzneimittelkombinationen zu nutzen</p>

<h2>Schlussfolgerungen</h2&gt <p>Zwei kĂŒrzlich erschienene Berichte haben gezeigt, dass DCA am wirksamsten gegen Zellen mit mitochondrialen Defekten <sup><a href=“#48″>[48,49].</a></sup> Dieser Bericht ist der erste, der zeigt, dass die gezielte Beeinflussung von zwei Aspekten des Stoffwechsels – die Umkehrung des Warburg-Effekts mit DCA und die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung mit ATO – eindeutig eine wirksame Anti-Krebs-Strategie in vitro gegen Brustkrebszelllinien ist. Die Identifizierung der Cytochrom-C-Oxidase als mitochondriales Ziel fĂŒr ATO liefert neue mechanistische Informationen fĂŒr die Anwendung von ATO bei der Behandlung anderer Tumorarten als APL. Die FĂ€higkeit von DCA, die Expression der ATP-Synthase b-Untereinheit zu erhöhen und damit einen anderen weit verbreiteten StoffwechselphĂ€notyp von Krebs umzukehren, deutet ebenfalls darauf hin, dass DCA fĂŒr ein breites Spektrum von Tumorarten relevant sein könnte. Die FĂ€higkeit von DCA, die zytotoxischen Wirkungen anderer Chemotherapeutika als ATO in vitro und in vivo zu verstĂ€rken, ist ebenfalls eine weitere Untersuchung wert. Die fehlende Empfindlichkeit der nicht krebsartigen Zelllinie MCF-10A gegenĂŒber den getesteten klinisch relevanten Konzentrationen von ATO/DCA ist ebenfalls ermutigend und legt nahe, dass diese Behandlungsstrategie gegen solide Tumore in vivo weiter getestet werden sollte.</p&gt <h2>Liste der AbkĂŒrzungen</h2&gt <p>APL: akute promyeloische LeukĂ€mie; ATO: Arsentrioxid; ATPÎČ: ATP-Synthase ÎČ-Untereinheit; AV: Annexin V; BA: BongkrekinsĂ€ure; CFSE: Carboxyfluorescein-Succinimidylester; CsA: Cyclosporin A; DCA: Dichloracetat; ETC: Elektronentransportkette; H2DCFDA: 2′, 7′-Dihydrochlorfluroresceinacetat; JC-1: 5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazol-Carbocyaninjodid; MMP: mitochondriales Membranpotenzial; MTP: mitochondriale Übergangspore; NaCN: Natriumcyanid; PI: Propidiumjodid; ROS: Reaktive Sauerstoffspezies; TTFA: Thenolytrifluoroaceton.</p&gt <h2>Danksagungen</h2&gt <p>Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Breast Cancer Foundation Australia (AB) und durch den NHMRC 366787 R.D. Wright Career Development Award (AB) unterstĂŒtzt. PB wird vom NHRMC und der Australian National University unterstĂŒtzt. RS wurde durch ein Postgraduiertenstipendium der Australian National University unterstĂŒtzt</p&gt <h2>Autorenangaben</h2&gt <p>1 Molecular Genetics Group, Department of Translational Biosciences, John Curtin School of Medical Research, Building 131, Australian National University, P.O. Box 334, Canberra ACT 0200, AUSTRALIEN. 2 Abteilung fĂŒr Strahlenonkologie, Stanford School of Medicine, Stanford CA 94305 USA.</p&gt <h2>BeitrĂ€ge der Autoren</h2&gt <p>RS hat die Experimente geplant, durchgefĂŒhrt und das Manuskript verfasst. PB beteiligte sich an der Analyse der Daten und der Erstellung des Manuskripts. AB beteiligte sich an der Planung und Analyse der Daten und bereitete das Manuskript zur Veröffentlichung vor. Alle Autoren haben das endgĂŒltige Manuskript gelesen und genehmigt.</p&gt <h2>Konkurrierende Interessen</h2&gt <p>Die Autoren erklĂ€ren, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.<br></p&gt <p>Received: 3 May 2011 Accepted: 18 November 2011<br>Veröffentlicht: 18 November 2011</p&gt <h2>REFERENZEN</h2&gt <br><span id=“1″ class=“referencess blue-text“>1</span> Antman KH: Introduction: the history of arsenic trioxide in cancer therapy. Onkologe 2001, 6(Suppl 2):1-2. <br><span id=“2″ class=“referencess blue-text“>2</span> Emadi A, Gore SD: Arsenic trioxide – An old drug rediscovered. Blood Rev 2010, 24:191-199. <br><span id=“3″ class=“referencess blue-text“>3</span> Powell BL, Moser B, Stock W, Gallagher RE, Willman CL, Stone RM, Rowe JM, Coutre S, Feusner JH, Gregory J, et al: Arsentrioxid verbessert das ereignisfreie und das GesamtĂŒberleben bei Erwachsenen mit akuter promyelozytĂ€rer LeukĂ€mie: North American Leukemia Intergroup Study C9710. 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