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Ramon C Sun1,2, Philip G Board1 und Anneke C Blackburn1*

1 Molekulargenetik-Gruppe, Abteilung für translationale Biowissenschaften, John Curtin School of Medical Research, Gebäude 131, Australian National University, Postfach 334, Canberra ACT 0200, AUSTRALIEN
2 Abteilung für Strahlenonkologie, Stanford School of Medicine, Stanford CA 94305 USA.
1*Korrespondenz: [email protected]©

2011 Sun et al; Lizenznehmer BioMed Central Ltd. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) verbreitet wird, die die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Vervielfältigung in jedem Medium erlaubt, sofern das Originalwerk ordnungsgemäß zitiert wird.


Empfangen: 3. Mai
2011Akzeptiert: 18. November 2011Veröffentlicht
: 18. November 2011









Zusammenfassung

Hintergrund
Krebszellen weisen im Vergleich zu normalen Zellen ein anderes Stoffwechselprofil auf. Der Warburg-Effekt (erhöhte aerobe Glykolyse) und die Glutaminolyse (erhöhte mitochondriale Aktivität durch Glutaminkatabolismus) sind bekannte Kennzeichen von Krebs und gehen mit einer erhöhten Laktatproduktion, einer hyperpolarisierten mitochondrialen Membran und einer erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies einher.
MethodenIn
dieser Studie zielen wir auf den Warburg-Effekt mit Dichloracetat (DCA) und die erhöhte mitochondriale Aktivität der Glutaminolyse mit Arsentrioxid (ATO) in Brustkrebszellen ab und messen die Zellproliferation, den Zelltod und mitochondriale Eigenschaften.
ErgebnisseDie
Kombination von DCA und ATO war bei der Hemmung der Zellproliferation und der Herbeiführung des Zelltods wirksamer als jedes der beiden Medikamente allein. Wir haben die Auswirkungen dieser Behandlungen auf das mitochondriale Membranpotenzial, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und den ATP-Spiegel untersucht und sowohl für ATO als auch für DCA neue molekulare Mechanismen innerhalb der Mitochondrien identifiziert: ATO reduziert die mitochondriale Funktion durch die Hemmung der Cytochrom-C-Oxidase (Komplex IV der Elektronentransportkette), während DCA die Expression der ATP-Synthase b-Untereinheit hochreguliert. Die Potenzierung der ATO-Zytotoxizität durch DCA korreliert mit einer starken Unterdrückung der Expression von c-Myc und HIF-1a sowie einer verminderten Expression des Überlebensproteins Bcl-2. SchlussfolgerungDiese
Studie zeigt zum ersten Mal, dass die Beeinflussung von zwei wichtigen Stoffwechselmerkmalen von Krebs eine wirksame Anti-Krebs-Strategie mit therapeutischem Potenzial ist.
SchlüsselwörterDichloracetat
, Brustkrebs, Elektronentransportkette, Mitochondrien, Arsentrioxid






Einleitung

Arsentrioxid (ATO) wird seit über 2000 Jahren als Therapeutikum eingesetzt. Ursprünglich stammt es aus China [1]es wird derzeit zur Behandlung der akuten promyeloischen Leukämie (APL) bei Patienten eingesetzt, die nach einer Alltrans-Retinsäure/Anthrazyklin-Therapie einen Rückfall erlitten haben, und wird für die Erstlinientherapie der de novo APL gefördert [2-4]. ATO ist als hyperreaktives Molekül bekannt und könnte potenziell an Thiolgruppen in vielen Proteinen binden [2,5]. Seine Fähigkeit, an das thiolreiche, mutierte Protein PML-RAR-α zu binden, das durch eine Chromosomentranslokation bei APL entsteht, hat es zu einem wirksamen Medikament bei APL gemacht [2,5,6]. Es hat sich gezeigt, dass ATO bei einer Reihe von Krebszelllinien in vitro und in vivo die Apoptose auslöst [7,8]es war jedoch schwierig, ATO für den klinischen Einsatz bei anderen Tumorarten als der APL in Betracht zu ziehen, da die molekularen Ziele, die zu seiner Zytotoxizität führen, nicht bekannt sind. In den letzten 10 Jahren wurden die physiologischen Veränderungen in den Krebszellen als Reaktion auf eine ATO-Behandlung gut charakterisiert, und viele klinische Versuche für neue Anwendungen von ATO sind im Gange [5]. ATO wurde als mitochondriales Toxin vorgeschlagen [9]. ATO kann das mitochondriale Membranpotenzial (MMP) depolarisieren [10]die intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erhöhen [8]und Apoptose auslösen [8]. Der vorgeschlagene Angriffspunkt für ATO, der diese phänotypischen Veränderungen bewirken kann, ist die mitochondriale Übergangspore (MTP) [11]. Es hat sich gezeigt, dass ATO die Öffnung der MTP induziert, was zur Freisetzung von Cytochrom c führt, und es wird angenommen, dass es die MMP auflöst und die Freisetzung von ROS aus den Mitochondrien erhöht [12]. In jüngerer Zeit wurde auch das Thioredoxin-System, insbesondere die Thioredoxin-Reduktase, als ein Ziel von ATO identifiziert, das zu erhöhtem oxidativem Stress und veränderten Redox-Signalen nach ATO-Behandlung von Krebszellen beitragen könnte [9,13].
Der Warburg-Effekt ist ein weit verbreitetes Phänomen, das bei über 90 % aller Tumorarten festgestellt wurde. Zellen, die den Warburg-Effekt aufweisen, nutzen alternative Wege der Energiehomöostase, um ihren proliferativen Phänotyp aufrechtzuerhalten [14]. Der Nobelpreisträger Dr. Otto Warburg stellte fest, dass Krebszellen auf Glykolyse oder Substratphosphorylierung angewiesen sind, um ATP zu erzeugen, und ihre Mitochondrienaktivitäten unterdrücken [15]. Mit fortschrittlicheren Technologien haben neuere Studien den Aspekt der ATP-Erzeugung der Warburg-Hypothese bestätigt, aber gezeigt, dass die mitochondriale Aktivität in Krebszellen nicht unterdrückt wird. Stattdessen spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Substraten zur Aufrechterhaltung der Zellteilung [16].
Die krebshemmende Wirkung der Umkehrung des Warburg-Effekts wurde kürzlich beschrieben, und ein altes Medikament, Dichloracetat (DCA), das die ATP-Synthese von der Glykolyse auf die oxidative Phosphorylierung umlenken kann, hat sowohl in vitro [17-19] als auch in vivo [20-23] eine gute krebshemmende Wirkung gezeigt. DCA ist ein Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Inhibitor, der zu einer erhöhten Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität führt [19]. Dies führt zu einer verstärkten Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA anstelle von Milchsäure, wie durch den Warburg-Effekt beschrieben, und stimuliert die mitochondriale Atmung, indem es das Angebot an Acetyl-CoA erhöht. Folglich zeigten Krebszellen nach einer DCA-Behandlung erhöhte ROS-Werte, eine Depolarisierung der MMP in vitro und eine erhöhte Apoptose sowohl in vitro als auch in vivo [17,20].
Da DCA Substrate in die mitochondriale Atmung und ATP-Produktion umlenken kann, könnte es eine synergistische Wirkung mit Krebsmedikamenten haben, die die mitochondriale Aktivität beeinträchtigen. Wir schlagen vor, dass durch die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps mit DCA und die Umleitung von mehr Pyruvat in die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien bei gleichzeitiger Ausrichtung auf die Mitochondrien mit ATO eine schwerwiegende Störung der Energiehomöostase in den Krebszellen eintreten wird. In dieser Studie zeigen wir, dass DCA und ATO in Kombination das Wachstum von Brustkrebszelllinien in vitro hemmen. Darüber hinaus haben wir neue molekulare Mechanismen innerhalb der Mitochondrien identifiziert, die zur Zytotoxizität von ATO beitragen können, was den Einsatz von ATO gegen solide Tumore zusätzlich unterstützt.



Materialien und Methoden

Reagenzien
JC-1, CFSE und H2DCFDA stammen von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), CellTiter-Glo und Caspase-Glo Assay-Kits wurden von Promega Co (San Luis, CA, USA) erworben. Die übrigen Chemikalien wurden von Sigma Co (St. Louis, MO, USA) bezogen.
Zellkultur
Die Zelllinien wurden in den angegebenen Jahren von den folgenden Quellen bezogen. Dr. Anna DeFazio, Westmead Millenium Institute, Sydney, Australien: T-47D (2003), BT-20 (2003), MCF-10A (2005) und MCF-10AT1 (2005); Prof. Chris Parish, Australian National University, Canberra, Australien: 13762 MAT (2007), MDA-MB-468 (2003) und MDA-MB-231 (2003). Die Zelllinien haben ein Erscheinungsbild, das mit den veröffentlichten Morphologien übereinstimmt, wurden aber in letzter Zeit nicht authentifiziert. Menschliche Brustepithelkarzinomzellen (T-47D) wurden in RPMI-1640-Medium gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum in Gegenwart von 0,1 % PSN (3 % Penicillin, 5 % Streptomycin und 5 % Neomycin) ergänzt wurde. Die Zelllinien BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468 und 13762 MAT wurden in DMEM/F12-Medium mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin supplementiert. Für MCF-10A- und MCF-10AT1-Zellen wurde DMEM/F-12-Medium mit 25 % Pferdeserum, 0,01 % EGF, 0,28 IE/ml Insulin, 0,01 % Choleratoxin und 0,5 μg/ml Hydrocortison verwendet. Alle Zelllinien wurden bei 37°C und 5% CO2 gehalten.
Lebensfähigkeit der Zellen
Für die Bewertung der Zelllebensfähigkeit wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Well und 8 Wells pro Gruppe ausplattiert. Nach einer 24- bis 72-stündigen DCA- und ATO-Exposition wurden die Zellen 3 Stunden lang mit Neutralrot (30 μg/ml) in frischem Medium inkubiert, dann mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Lysepuffer (Essigsäure/Methanol, 80%/20%), und die Absorption bei 540 nm wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. ausgedrückt, Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
Zellproliferation
T-47D-Zellen wurden geerntet und in 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml PBS mit 5 μM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) markiert und anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die markierten Zellen wurden dann zweimal gewaschen, gezählt und mit105 Zellen pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte ausgesät. Am Tag der Analyse wurden die T-47D-Zellen geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und anschließend die CFSE-Intensität mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
Zelltod Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, nachdem die Zellen mit FITC-markiertem Annexin-V (AV) (Invitrogen Co.) und Propidiumjodid (PI) gefärbt worden waren. Nach der Medikamentenbehandlung wurden die T-47D-Zellen geerntet und 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert; die Pellets wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in 100 μl Annexin-V-Bindungspuffer (0,14 M NaCl, 2,5 mM CaCl2, 0,01 M HEPES pH 7,4) resuspendiert. Annexin-V (1 μl) und 5 μl PI (50 μg/ml) wurden zu den Proben gegeben und 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Proben wurden nach der Inkubation bis zur Durchführung der FACS-Analyse auf Eis gelagert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
ROS-Generierung
Zur Bewertung der intrazellulären ROS-Konzentration wurden die Zellen in 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 1 ×105 Zellen pro Well plattiert und 12 Stunden lang mit Medikamenten behandelt. 2′,7′-Dihydrochlorfluroresceinacetat (H2DCFDA) wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 10 μM zugesetzt, und die Zellen wurden eine Stunde lang im Dunkeln gefärbt. Nach derH2DCFDA-Färbungwurden die Zellen trypsinisiert, zweimal gewaschen und in 100 μl PBS resuspendiert. DieH2DCFDA-Intensitätwurde mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
ATP-Konzentration und Caspase-Aktivität Der
interne ATP-Spiegel und die Caspase-Aktivität in T-47D-Zellen wurden mit CellTiter-Glo- und Caspase-Glo 3/7-Assay-Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. T-47D-Zellen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von Arzneimitteln 12 Stunden lang in weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platten (4 Wells pro Gruppe) kultiviert. Gleiche Volumina der CellTiter-Glo-Reagenzien wurden zugegeben, woraufhin die Proben 15 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Lumineszenz wurde mit dem Glomax Mikroplatten-Luminometer (Promega Co., Madison, WI) nach dem voreingestellten CellTiter-Protokoll gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 4) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
Mitochondriales Membranpotenzial
Ähnlich wie bei der Messung von ROS wurden die Zellen in 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 1 ×105 Zellen pro Well plattiert und 12 Stunden lang mit Medikamenten behandelt. 5, 5′, 6, 6′-Tetrachlor-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazol-Carbocyaninjodid (JC-1) wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 0,2 μM zugesetzt, und die Zellen wurden 30 Minuten lang im Dunkeln gefärbt. Nach der JC-1-Färbung wurden die Zellen trypsinisiert, zweimal mit PBS gewaschen und in 100 μl PBS resuspendiert. Die JC-1-Intensität wurde mittels FACS untersucht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 3) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität Der
Cytochrom-C-Oxidase-Assay wurde auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Methode [24] bewertet. Kurz gesagt, wurden die T-47D-Zellen nach der Arzneimittelbehandlung in 96-Well-Platten (8 Vertiefungen pro Gruppe) mit 50 μl 0,01 % Saponin permeabilisiert, gefolgt von der Zugabe von 100 μl Substratmedium (4 mM 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB), 100 μM reduziertes Cytochrom C, 2 μg/ml Katalase in 0,1 M Na-Phosphat, pH 7,0). Die Absorption bei 450 nm wurde unmittelbar nach der Zugabe des Substratmediums gemessen und über 30 Minuten überwacht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. (n = 8) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
PDH-Aktivität Die
PDH-Aktivität wurde mit dem MitoSciences PDH-Enzymaktivitäts-Mikrotiterplatten-Assay-Kit (#MSP18, MitoSciences, Oregon USA) gemessen. Zur Messung der Wirkung von Arzneimitteln auf die PDH-Aktivität in Zellen wurden T-47D-Zellen 3 Stunden lang mit Arzneimitteln in den Medien behandelt, danach wurden sie gewaschen und in PBS resuspendiert. Zellextrakte wurden hergestellt und auf PDH-Aktivität in einer Konzentration von 15 mg Protein/ml gemäß den Anweisungen des Kits untersucht. Zur Messung der direkten Hemmung der PDH durch ATO wurde die PDH aus unbehandelten T-47D-Zellen isoliert, indem Zellextrakte auf die Antikörper-Fangplatte aufgetragen wurden. Nach dem Waschen der Platte wurde die Testlösung mit dem Arzneimittel in die Vertiefungen gegeben und anschließend sofort auf die PDH-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. (n = 4) angegeben, die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, und die Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Experiment.
Immunoblotting und densitometrische Analyse Die
Zellen (1 ×106 ) wurden in T25-Gewebekulturflaschen ausgeplattet und 12 Stunden lang mit ATO oder DCA behandelt. Zelllysate wurden durch Zugabe von 500 μl des MPER® Säugetierprotein-Extraktionsreagenzes (Thermo Scientific, IL, USA) hergestellt. Immunoblotting wurde wie zuvor beschrieben [25] mit den Antikörpern für c-Myc (Roche, IN, USA, Klon 9E10), HIF-1α (Abcam, Cambridge, UK, #ab82832), Bcl-2 (Abcam #ab692), ATP Synthase β-Untereinheit (Abcam #ab14730) und β-Actin (Abcam #ab8227) durchgeführt. Die Western Blots wurden mit Chemilumineszenz und Röntgenfilmbelichtung nachgewiesen. Die Bilder wurden mit einem CanoScan 8600F Flachbettscanner aufgenommen und mit der ImageJ-Software (Version 1.4, NIH, USA) quantifiziert und auf β-Actin in jeder Spur standardisiert. Die Ergebnisse wurden aus drei separaten Experimenten gepoolt und als Mittelwert ± S.D. (n = 3) ausgedrückt. Die Berechnungen wurden mit dem Prism-Softwarepaket durchgeführt, ANOVA mit Tukey-Posttest wurde angewandt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.













Ergebnisse

DCA und ATO zusammen sind wirksamer bei der Reduzierung der Zellproliferation und der Herbeiführung des Zelltods
Um die kombinierte Wirkung von ATO und DCA auf die Hemmung des Zellwachstums zu untersuchen, wurden die Brustkrebszelllinien mehrere Tage lang mit beiden Medikamenten behandelt und die Gesamtzellzahl mit Hilfe des neutralen roten Zellviabilitätstests bestimmt. Die Zelllinien repräsentieren die wichtigsten Subtypen des menschlichen Brustkrebses (luminal (T-47D), basal A (MDAMB-468, BT-20), basal B (MDA-MB-231)) oder sind als experimentelle Modelle von Bedeutung (13762MAT – Mammaria-Adenokarzinom der Ratte, das in vivo empfindlich auf DCA [22]mCF10AT1 – malignes Derivat der immortalisierten Zellen MCF-10A). MDA-MB-468-, MDA-MB-231- und T-47D-Zellen zeigten alle eine signifikante Verringerung der Gesamtzellzahl von 10 % bis 40 % nach 72 Stunden Behandlung mit 5 mM DCA (Abbildung 1A), während 13762 MAT-, BT-20- und MCF-10AT1-Zellen während des Behandlungszeitraums nicht reagierten. Alle getesteten Krebszelllinien waren empfindlich gegenüber ATO, allerdings in unterschiedlichen Konzentrationen. Eine Verringerung der Gesamtzellzahl wurde bei BT-20, T-47D, MCF-10AT1 und MDA-MB-468 mit nur 5 μM ATO-Behandlung festgestellt, während 15 μM ATO erforderlich waren, um die gleiche Wirksamkeit bei den Zelllinien MDA-MB-231 und 13726 MAT zu erzielen. Auffallend ist, dass DCA und ATO in Kombination bei allen getesteten Krebszelllinien eine größere Wirkung zeigten als jedes der beiden Medikamente allein. In den Fällen, in denen ATO und DCA als Einzelwirkstoffe eine Verringerung der Zellzahlen bewirkten, entsprach die Wirkung der kombinierten Behandlung in etwa der Summe der Einzelwirkungen der Wirkstoffe (T-47D, MDA-MB-468 und MDA-MB-231). DCA allein bewirkte zwar keine Verringerung der Zellzahl, konnte aber die Wachstumshemmung durch ATO um das 2-3fache steigern (13762 MAT, BT-20 und MCF10AT1) (Abbildung 1A). Die nicht krebsartige Zelllinie MCF-10A zeigte keine Verringerung der Zellzahl nach einer Behandlung mit ATO (15 μM), DCA (5 mM) oder einer kombinierten Behandlung.
Die Wirkung von ATO und DCA wurde weiter mit T-47D-Zellen untersucht, einer der Zelllinien, die empfindlicher auf DCA allein reagieren. Die Reaktion der T-47D-Zellen auf DCA war dosisabhängig, und nach 72 Stunden hatten die mit 5 mM DCA behandelten Zellen 42 ± 6 % weniger Zellen als die Kontrollkultur (Abbildung 1B). ATO allein (5 μM) verringerte die Gesamtzahl der Zellen um 56 ± 4 %, und die sowohl mit DCA als auch mit ATO behandelten Zellen zeigten einen weiteren Rückgang im Vergleich zu der Gruppe, die nur ATO erhielt (Abbildung 1C). Die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von DCA (5 mM) und ATO die IC50 auf das 0,25-fache derjenigen von ATO allein senken kann (Abbildung 1C). Dieser Effekt tritt innerhalb des Konzentrationsbereichs auf, der klinisch für ATO erreicht wird (bis zu 5-7 μM [26]).
Der CFSE-Proliferationsassay zeigte, dass entweder mit ATO (5 μM) oder mit DCA (5 mM) behandelte Zellen nach 72 Stunden Behandlung eine signifikant höhere CFSE-Fluoreszenz (2,1- bzw. 2,2-fach) aufwiesen, was auf eine Wachstumshemmung hindeutet. Zellen, die sowohl mit ATO als auch mit DCA behandelt wurden, zeigten eine 3,4-fache Erhöhung der CFSE-Intensität im Vergleich zu unbehandelten Zellen, was darauf hindeutet, dass die Medikamente gemeinsam die Zellproliferation hemmen (Abbildung 1D).
Die Wirkung von ATO und DCA auf den Zelltod von T-47D wurde mittels AV- und PI-Doppelfärbung bewertet und die Zellen wurden mittels fluoreszierender Zellsortierung analysiert. DCA allein (5 mM) löste bei T-47D-Zellen keinen Zelltod aus (Abbildung 1E), ähnlich wie die Wirkung von DCA auf 13762 MAT-Zellen, über die bereits berichtet wurde [22]. ATO (5 μM) löste nach 12 Stunden Behandlung ebenfalls keinen Zelltod aus, jedoch zeigten Zellen, die sowohl mit 5 μM ATO als auch mit 5 mM DCA behandelt wurden, einen geringen (15 %) Anstieg der AV+/PI+-Population (13,2 ± 0,6 % apoptotische Zellen im Vergleich zu 11,5 ± 1,0 % für ATO/DCA bzw. unbehandelt, p = 0,07), was darauf hindeutet, dass DCA die apoptotischen Effekte von ATO verstärken könnte. Bei höheren Konzentrationen und einer 48-stündigen Behandlung erhöhte ATO (20 μM) die Zahl der absterbenden Zellen um 35 ± 8 % (P = 0,029) im Vergleich zur unbehandelten Kultur (Abbildung 1E). Die Kombination von 5 mM DCA mit 20 μM ATO-Behandlung führte zu einem vierfachen Anstieg der AV+/PI+-Population im Vergleich zu ATO allein, was darauf hinweist, dass DCA den durch ATO induzierten Zelltod in T-47D-Brustkrebszellen verstärken kann (Abbildung 1E).


Abbildung 1 Hemmung des Krebszellwachstums durch ATO und DCA. (A) Kombinierte Wirkung von ATO (5 oder 15 μM) und DCA (5 mM) auf das Wachstum von Brustkrebszellen, gemessen mit dem Neutralrot-Vitalitätstest nach 3 Tagen Behandlung. BT-20, T-47D, MDA-MB-468 und MCF-10AT1 Zellen wurden mit 5 μM ATO behandelt. MDA-MB-231-, MAT- und MCF-10A-Zellen wurden mit 15 μM ATO behandelt. (B) Dosisreaktion von T-47D-Zellen auf DCA (t = 72 Stunden). (C) Dosis-Antwort von T-47D-Zellen auf die Behandlung mit ATO und ATO/DCA (5 mM) (t = 72 Stunden). (D) T-47D-Proliferation, gemessen als mittlere CFSE-Intensität nach Behandlung mit 5 μM ATO und/oder 5 mM DCA (t = 72 Stunden) (höhere CFSE-Intensität bedeutet geringere Proliferation). (E) Zelltod (AV +/PI+) Population, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzellzahl nach 48 Stunden Behandlung mit 20 μM ATO und/oder 5 mM DCA. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt). ## P ≤ 0,001, ### P ≤ 0,0001 (ATO/DCA vs. ATO).


ATO und DCA wirken zusammen auf die Depolarisierung der MMP, haben aber gegensätzliche Auswirkungen auf die Induktion der ATP- und ROS-Produktion
Sowohl ATO als auch DCA verändern nachweislich die mitochondriale Funktion, depolarisieren MMP und erhöhen die ROS-Produktion [20]. Daher wurden diese Parameter zusammen mit dem ATP-Spiegel untersucht, um festzustellen, ob sie zu den verstärkten Anti-Krebs-Effekten der kombinierten Behandlung mit ATO/DCA beitragen. Gemessen durch JC-1-Färbung wurde die Anzahl der T-47D-Zellen mit hyperpolarisiertem MMP (oberer rechter Quadrant) durch die Behandlung mit DCA (5 mM) oder ATO (5 μM und 20 μM) signifikant verringert (t = 12 Stunden) (28 ± 6 %, 38 ± 4 % bzw. 69 ± 7 % Rückgang im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen), was mit zuvor veröffentlichten Daten übereinstimmt [20,27]. Die Kombination von ATO (5 μM oder 20 μM) mit 5 mM DCA führte zu einem noch stärkeren Rückgang (53 ± 9 % bzw. 77 ± 12 %) im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Abbildung 2A), was zeigt, dass DCA und ATO bei der Depolarisierung der MMP zusammenwirken können. Der ATP-Spiegel wurde sowohl durch niedrig als auch durch hoch dosiertes ATO (14 ± 3 % bzw. 32 ± 5 %) nach 12-stündiger Behandlung gesenkt, während mit DCA behandelte Zellen einen Anstieg des ATP-Spiegels um 6 ± 1 % aufwiesen (Abbildung 2B und 2C). Bei der hohen ATO-Dosis war DCA nicht in der Lage, die ATP-Produktion zu steigern (Abbildung 2B), während bei der niedrigen ATO-Dosis die mit DCA und ATO behandelten Zellen einen geringen Anstieg der ATP-Produktion im Vergleich zur alleinigen ATO-Behandlung zeigten (Abbildung 2C). Diese Daten deuten darauf hin, dass DCA und ATO die ATP-Produktion über separate Ziele innerhalb der Zellen beeinflussen.

Abbildung 2 Intrazelluläre Reaktionen von T-47D-Zellen auf die Behandlung mit ATO und DCA. (A) JC-1-Färbung, die die kombinierte Wirkung von DCA und ATO auf die Depolarisierung der MMP zeigt (t = 12 Stunden). (B und C) Die Auswirkungen von ATO (20 μM (B) oder 5 μM (C)) und DCA (5 mM) auf den ATP-Spiegel. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Erhöhte intrazelluläre ROS-Konzentrationen werden als Grund für die Zytotoxizität von ATO vorgeschlagen [2,9]. Die kombinierte Wirkung von ATO und DCA auf ROS wurde mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs H2DCFDA untersucht. Zellen, die mit 20 μM ATO oder 5 mM DCA behandelt wurden, wiesen erhöhte intrazelluläre ROS-Werte auf (2,8- bzw. 1,9-fach) (Abbildung 3A), ähnlich wie die zuvor veröffentlichten Ergebnisse [27]während Zellen, die sowohl mit ATO als auch mit DCA behandelt wurden, einen weiteren Anstieg (5,2-fach) der ROS-Produktion aufwiesen (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu bewirkte ATO in niedriger Konzentration (5 μM) eine 0,5-fache Abnahme der ROS-Produktion (Abbildung 3B). Dies stand im Gegensatz zu früheren Berichten über die ROS-Produktion und die ATO-Behandlung, weshalb die Dosis-Wirkungsbeziehung und der zeitliche Verlauf der ROS-Produktion nach der ATO-Behandlung analysiert wurden. Dabei zeigte sich, dass niedrigere ATO-Konzentrationen die intrazelluläre ROS-Produktion verringerten, während hohe ATO-Konzentrationen die ROS-Produktion anregten (Abbildung 3C). In ähnlicher Weise führte eine Behandlung mit 10 μM ATO zu einem deutlichen Rückgang der ROS-Produktion in den ersten 4 Stunden, bevor die ROS-Werte nach 8 Stunden auf das von anderen Autoren berichtete Niveau anstiegen (Abbildung 3D). Die kombinierte Behandlung von Zellen mit 5 mM DCA und 5 μM ATO führte zu einer intermediären ROS-Produktion (Abbildung 3B), die mit der von unbehandelten Zellen vergleichbar war.

Abbildung 3 Auswirkungen von ATO und DCA auf die ROS-Produktion. (A und B) Die Auswirkungen von ATO und DCA auf die ROS-Konzentration in T-47D-Zellen nach einer Behandlung mit 20 μM (A) oder 5 μM (B) ATO, allein und in Kombination mit 5 mM DCA. (C) Dosis-Wirkung der ROS-Konzentrationen auf verschiedene ATO-Konzentrationen (t = 12 Stunden). (D) Zeitlicher Verlauf der ROS-Produktion nach 10 μM ATO-Behandlung. ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Die intermediären Auswirkungen der DCA/ATO-Kombinationsbehandlung auf die ATP- und ROS-Konzentrationen können durch konkurrierende Auswirkungen auf die PDH-Aktivität erklärt werden. DCA zielt auf PDK ab und sollte daher die PDH-Aktivität erhöhen, während ATO Berichten zufolge PDH entweder direkt durch Reaktion mit vicinalen Thiolen auf PDH oder indirekt über eine erhöhte Wasserstoffperoxidproduktion hemmt [28]. Um die Auswirkungen von ATO und/oder DCA auf die PDH-Aktivität zu untersuchen, wurden intakte Zellen oder aus T-47D-Zellen isolierte PDH mit dem Medikament behandelt und die PDH-Aktivität bestimmt. Wie vorhergesagt, führte eine dreistündige Behandlung intakter Zellen mit DCA zu einer erhöhten PDH-Aktivität, während ATO (bis zu 20 μM) die PDH-Aktivität intakter Zellen nicht veränderte (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu veränderte DCA die Aktivität der isolierten PDH nicht, aber hohe Konzentrationen von ATO konnten die PDH-Aktivität hemmen (Abbildung 4b). In T-47D-Zellen verringerte ATO also die PDH-Aktivität bei den in dieser Studie verwendeten Konzentrationen nicht.

Abbildung 4 Auswirkungen von ATO und DCA auf die PDH-Aktivität. (A) Auswirkungen auf die PDH-Aktivität in T-47D-Zellen nach 3 Stunden Behandlung mit ATO und DCA. (B) Wirkung der ATO-Behandlung auf die PDH-Aktivität der isolierten PDH (Antikörpergewinnung aus T-47D-Zellen). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


ATO ist ein Inhibitor von Komplex IV der Elektronentransportkette
Die Elektronentransportkette (ETC) befindet sich in der inneren Membran der Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion. Die ETC ist dafür verantwortlich, den Protonengradienten für den inneren Membranraum der Mitochondrien zu erzeugen, um die MMP für die ATP-Produktion aufrechtzuerhalten [29]. Der ETC ist auch nachweislich der Hauptort der ROS-Produktion innerhalb der Zellen als Ergebnis des Elektronenverlusts aus Komplex I und III [30]. Aufgrund seiner Fähigkeit, ROS zu reduzieren, die MMP zu depolarisieren und gleichzeitig die ATP-Produktion zu verringern, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass ATO als ETC-Inhibitor wirkt. Eine Reihe von ETC-Inhibitoren wurde mit ATO (5 μM) verglichen, um festzustellen, ob sie die gleichen phänotypischen Veränderungen wie ATO in T-47D-Zellen hervorrufen. Rotenon (0,1 μM, Komplex I), Thenolytrifluoraceton (TTFA) (10 μM, Komplex II), Antimycin (0,1 μM, Komplex III) und NaCN (10 mM, Komplex IV) wurden zur Behandlung von T-47D-Zellen verwendet, und die ROS-, MMP- und ATP-Werte wurden mit denen von ATO behandelter Zellen verglichen. Alle Inhibitoren waren in der Lage, die MMP zu depolarisieren (Abbildung 5A) und den ATP-Spiegel zu senken (Abbildung 5B), ähnlich wie ATO. Im Gegensatz zu ATO gelang es Rotenon, Antimycin und TTFA jedoch nicht, die ROS-Produktion in den Zellen zu reduzieren, sondern erhöhten die ROS nach 12 Stunden Behandlung um das 3- bis 6-fache (Abbildung 5C). Zellen, die mit NaCN (10 mM) behandelt wurden, zeigten jedoch einen Rückgang der ROS-Produktion um 52 % (Abbildung 5C), ähnlich wie bei der Behandlung mit ATO. Auf der Grundlage dieser Daten kamen wir zu dem Schluss, dass in T47D-Brustkrebszellen die Hemmung des Komplexes IV der ETC, nicht aber der Komplexe I-III, zu einer Verringerung der ROS-Produktion führt, und es ist daher wahrscheinlich, dass die durch ATO induzierten phänotypischen Veränderungen durch die Hemmung des Komplexes IV (Cytochrom-C-Oxidase) der ETC verursacht werden. Um dies zu bestätigen, wurde die Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität in T-47D-Zellen spektrophotometrisch gemessen. Der Cytochrom-C-Oxidase-Assay zeigte eindeutig, dass DCA keine Auswirkungen auf die Komplex-IV-Aktivität hatte, während ATO (5 μM, 5 min) die Komplex-IV-Aktivität hemmen kann, was unsere Hypothese bestätigt (Abbildung 5D). Ähnliche Ergebnisse wurden nach 10-minütigen, 3-stündigen und 12-stündigen Medikamentenbehandlungen erzielt. Die Kombination von ATO und DCA zeigte eine ähnliche Enzyminhibition wie ATO allein.

Abbildung 5 Hemmung der ETC durch ATO. (A bis C) Die Auswirkungen einer Reihe von ETC-Inhibitor-Behandlungen wurden mit 5 μM ATO verglichen (t = 12 Stunden): (A) MMP durch JC-1-Färbung; (B) ATP-Spiegel; (C) ROS-Spiegel. (D) Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität nach Behandlung (5 min) mit DCA (5 mM) und/oder ATO (5 μM). ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt).


Mitochondriale Transition-Pore-Inhibitoren blockierten teilweise die ATO-induzierte Caspase-Aktivierung, hatten aber keine Auswirkungen auf ROS, ATP und MMP
Ein Mechanismus, der zuvor als Schlüssel zur Zytotoxizität von ATO beschrieben wurde, ist die Öffnung der mitochondrialen Übergangspore (MTP). Es hat sich gezeigt, dass ATO die Öffnung der MTP in isolierten Mitochondrien induziert und die Freisetzung von Cytochrom C [11] und Kernapoptose in zellfreien Systemen induzieren [31]. Es wird angenommen, dass die Öffnung des MTP durch ATO eine mitochondriale Permeabilisierung auslöst, die MMP auflöst und die intrazelluläre ROS erhöht. Um zu prüfen, ob das MTP für die Toxizität von ATO in T-47D-Zellen von Bedeutung ist, wurden Bongkrekinsäure (BA) und Cyclosporin A (CsA), beides starke MTP-Porenblocker [32]wurden mit ATO kombiniert, um festzustellen, ob sie die ATO-induzierten intrazellulären Veränderungen hemmen können. Die Zugabe von 5 μM CsA oder 50 μM BA zu mit ATO (5 μM) behandelten Zellen beeinträchtigte nicht die Fähigkeit von ATO, die ROS-Produktion nach 12 Stunden Behandlung zu senken, die ATP-Produktion zu verringern oder die MMP zu depolarisieren (P > 0,05) (Abbildung 6B, C und 6D). Ähnliche Ergebnisse sind für die Behandlung mit NaCN und CsA/BA zu beobachten (P > 0,05) (Abbildung 6B, C und 6D). Um die Aktivität von CsA und BA unter unseren Versuchsbedingungen zu bestätigen, wurde die Aktivität von Caspase 3/7, einem Apoptosemarker, der der MTP-Öffnung nachgeschaltet ist und durch die Freisetzung von Cytochrom C aktiviert wird, nach einer ATO-Behandlung in hoher Konzentration bestimmt (Abbildung 6A). Die ATO-Behandlung (20 μM) verdoppelte die Caspase 3/7-Aktivität im Vergleich zu unbehandelten Zellen (2,1-fach, Abbildung 6A), und dieser Effekt wurde durch BA und CsA verringert (1,7-fach bzw. 1,4-fach), was darauf hinweist, dass CsA oder BA die MTP-Öffnung in T-47D-Zellen blockieren können. Diese Daten zeigen deutlich, dass ATO (20 μM) zwar die Öffnung von MTP induzieren kann, dieser Mechanismus jedoch nicht die Veränderungen von ROS, MMP und ATP erklären kann, die während einer Behandlung mit 5 μM ATO auftreten. Wir schließen daraus, dass diese Veränderungen wahrscheinlich auf die Hemmung des ETC-Komplexes IV zurückzuführen sind.

Abbildung 6 Wirkung der MTP-Blocker CsA und BA auf mit ATO behandelte Zellen. (A) CsA und BA können beide die 20 μM ATO-induzierte Caspase 3/7-Aktivierung teilweise blockieren. (B bis D) Im Gegensatz dazu konnten sowohl CsA als auch BA die durch NaCN oder 5 μM ATO induzierte Verringerung der ROS (B), die Verringerung des ATP-Spiegels (C) und die Depolarisierung der MMP (D) nicht blockieren. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001 (behandelt vs. unbehandelt). # P ≤ 0,05, ## P ≤ 0,001 (im Vergleich zu ATO allein). NS – nicht signifikant im Vergleich zu ATO oder NaCN allein.


DCA und ATO haben gegensätzliche Auswirkungen auf die ATP-Synthase-β-Untereinheit und die Bcl-2-Expression, während sie bei der Herabregulierung der c-Myc- und HIF-1α-Proteinspiegel zusammenwirken
Wir untersuchten die Wirkung einer Behandlung mit 5 mM DCA und 5 μM ATO (12 Stunden) auf die Expression von c-Myc und HIF1α, zwei wichtigen Transkriptionsfaktoren, die bekanntermaßen den Warburg-Effekt regulieren [33] und die mitochondriale Aktivität [34]sowie auf die Expression der mitochondrialen Proteine ATP-Synthase β-Untereinheit (ATPβ) und Bcl-2. Immunoblotting für c-Myc zeigte keine Veränderung nach der Behandlung mit DCA, während ATO die Hochregulierung von c-Myc induzierte (Abbildung 7A und 7B), jedoch reduzierte ATO in Kombination mit DCA den c-Myc-Spiegel im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Der HIF-1α-Spiegel hingegen wurde sowohl nach DCA- als auch nach ATO-Behandlung herunterreguliert. Die Kombination von ATO und DCA führte zu einer weiteren Herabregulierung von HIF-1α im Vergleich zu den mit einem einzelnen Wirkstoff behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen (Abbildung 7A und 7C). Bcl-2 ist ein Mitglied der BH3-Proteinfamilie, das direkt an Bad und Bax bindet und Apoptose verhindert [35]. Immunoblotting für ATPβ ergab, dass die DCA-Behandlung die ATPβ-Konzentration erhöhte, während ATO einen gegenteiligen Effekt zeigte, indem es die ATPβ-Konzentration senkte (Abbildung 7A und 7D), und die kombinierte Behandlung mit ATO und DCA zeigte eine mittlere Reaktion im Vergleich zu den mit ATO oder DCA behandelten Gruppen. Immunoblotting für das Pro-Survival-Protein Bcl-2 zeigte eine Hochregulierung nach DCA, eine Herabregulierung bei ATO-Behandlung und eine mittlere Reaktion auf die Kombination der beiden Medikamente (Abbildung 7A und 7E). Diese Ergebnisse sind auch sehr ähnlich zu den ATP-Spiegeln und der ROS-Produktion, wo DCA und ATO entgegengesetzte Wirkungen hatten (Abbildung 2C und 3B). Die Ergebnisse für Bcl-2 und ATPβ korrelieren direkt mit der Fähigkeit von DCA und ATO, die ROS-Produktion und den ATP-Spiegel zu beeinflussen.

Abbildung 7 Veränderungen der Proteinexpression nach ATO- und DCA-Behandlung. (A) Immunoblotting von T-47D-Zellen, die mit ATO und/oder DCA behandelt wurden. (B-E) Die densiometrische Analyse für c-Myc (B), HIF-1α (C), ATPβ (D), Bcl-2 (E) und β-Actin (Kontrolle) wurde mit Blotting von Ganzzell-Lysaten durchgeführt, die aus T-47D-Zellen hergestellt wurden, die 12 Stunden lang mit 5 mM DCA und/oder 5 μM ATO behandelt wurden. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,001, *** P ≤ 0,0001, NS – nicht signifikant (behandelt vs. unbehandelt). # P ≤ 0,05, ## P ≤ 0,001, ### P ≤ 0,0001 (DCA/ATO vs ATO).



Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde ATO wirksam zur Behandlung sowohl von neu diagnostizierten als auch von rezidivierten APL-Patienten eingesetzt, wobei die Patienten nach einer niedrig dosierten ATO-Behandlung eine vollständige Remission zeigten [4]. Die krebshemmende Wirkung von ATO ist nicht auf APL [36] und viele andere Tumoren haben sich in Tiermodellen als empfindlich gegenüber der Behandlung mit ATO erwiesen [37,38]. Das Fehlen von Informationen über die Wirkorte der ATO-Zytotoxizität bei anderen Tumorarten als der APL hat jedoch bis vor wenigen Jahren die Akzeptanz von ATO bei der Behandlung anderer Krebsarten eingeschränkt [5].
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Komplex IV des ETC ein Ziel für ATO ist. Von einer Reihe von ETC-Inhibitoren konnte der durch eine niedrig dosierte ATO-Behandlung von T-47D-Zellen verursachte Rückgang der ROS, der ATP-Produktion und der MMP-Depolarisierung nur durch Cyanid, einen gut charakterisierten Komplex-IV-Inhibitor, reproduziert werden (Abbildung 5). Die direkte Messung der Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität in ganzen Zellen, die mit ATO behandelt wurden, bestätigte die Fähigkeit von ATO, diese Enzymaktivität direkt zu hemmen. Es ist bekannt, dass der Cytochrom-C-Oxidase-Komplex der ETC eng beieinander liegende Cysteinreste aufweist [39], und diese reagieren wahrscheinlich mit ATO.
Die meisten Krebszellen weisen im Vergleich zu normalenZellenerhöhte ROS-Werte auf [40], und die ETC gilt als Hauptquelle für intrazelluläre ROS. Die Reduzierung der ROS um bis zu 60 % durch NaCN oder ATO zeigt, dass Komplex IV für den Großteil der ROS-Produktion in T-47D-Zellen verantwortlich ist. Der oxidative Stress einer erhöhten ROS-Produktion ist als zweischneidiges Schwert beschrieben worden. Es hat sich gezeigt, dass ein moderater Anstieg von ROS mit einem erhöhten proliferativen Potenzial [41], erhöhten antioxidativen Enzymen wie Glutathiontransferase [42], Superoxiddismutase und Katalase [43] und erhöhten Prosurvival-Proteinen wie Bcl-2 [42] und Survivin [44] verbunden ist. Unerträgliche Mengen an ROS führen jedoch schließlich zum Zelltod [45]. Die Verringerung der ROS nach einer 12-stündigen Behandlung mit 5 μM ATO korrelierte auch direkt mit einem Rückgang der Bcl-2-Werte (Abbildung 7E), was darauf hindeutet, dass sich die T-47D-Zellen aufgrund erhöhter ROS-Werte in einem apoptotisch resistenten Zustand befinden. Eine fortgesetzte Hemmung des Komplexes IV der ETC führt zu einer Depolarisierung der MMP und einer Hemmung der ATP-Produktion. Der Zelltod, der sich aus dieser mitochondrialen Dysregulation ergibt, führt zu den erhöhten ROS-Werten, die nach 4 Stunden oder bei höheren ATO-Konzentrationen beobachtet werden (Abbildung 3C und 3D), wie von anderen Autoren [46] nach ATO-Behandlung berichtet. Erhöhte ROS sind also eine Folge, nicht die Ursache des ATO-induzierten Zelltods.
Das zuvor vorgeschlagene mitochondriale Ziel für ATO ist die MTP. Zheng et al. wiesen nach, dass ATO die Öffnung des MTP in isolierten Mitochondrien der Rattenleber induziert [11], was zu dem Vorschlag führte, dass MTP für die Freisetzung von ROS und die Depolarisierung des MMP, die während der Arsenbehandlung zu beobachten ist, und die anschließende Apoptose verantwortlich ist [47]. Unsere Studie schließt MTP als Ziel für ATO nicht aus. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Hemmung des MTP durch CsA und BA die durch ATO in hoher Konzentration induzierte Caspase 3/7-Aktivierung teilweise blockieren kann. Die MTP-Blocker konnten jedoch die durch ATO in niedriger Konzentration verursachte Depolarisierung der MMP und die Verringerung des ROS- und ATP-Spiegels nicht hemmen. Obwohl ATO das MTP öffnen kann, sind also alternative Ziele erforderlich, um die Wirkung von ATO bei niedrigen Konzentrationen zu erklären. Eine Hemmung des Thioredoxin-Systems wurde in MCF-7-Zellen nach einer Behandlung mit 2-5 μM ATO nachgewiesen und könnte einige zelluläre Wirkungen von ATO bei niedrigen Konzentrationen vermitteln [13], allerdings würde dieser Mechanismus zu erhöhtem oxidativem Stress führen und kann die in der aktuellen Studie beobachtete Verringerung der ROS nicht erklären.
DCA kann als Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Inhibitor die glykolytische Wirkung umkehren und hat sowohl in vitro als auch in vivo signifikante krebshemmende Eigenschaften gezeigt [17-23]. Einige Studien zeigen eine erhöhte Apoptose durch DCA [17,18,20]. Unsere Studien bei Brustkrebs und Studien von Stockwin et al. deuten jedoch darauf hin, dass DCA bei einer Reihe von Zelllinien eher zytostatisch als zytotoxisch wirkt, außer bei sehr hohen Konzentrationen [22,48]. Michelakis berichtete vor kurzem über DCA-Trog-Serumspiegel von 0,5 mM bei Glioblastom-Patienten, die zweimal täglich 6,25 mg/kg oral einnahmen [23], so dass die klinisch relevanten Konzentrationen wahrscheinlich im Bereich von 0,5-5 mM liegen. DCA induziert nachweislich einen geringen, aber signifikanten Anstieg der Caspase 3/7-Aktivität, auch wenn keine Apoptose beobachtet wurde, und es wurde vorgeschlagen, dass DCA Krebszellen gegenüber zytotoxischen Wirkstoffen sensibilisieren könnte [22]. Die aktuelle Studie bestätigte diese Hypothese, indem sie zeigte, dass DCA die T-47D-Zellen gegenüber einer ATO-Behandlung sensibilisierte, wie aus der AV+/PI+-Doppelfärbung hervorgeht (Abbildung 1E und Text). ATO wurde aufgrund seiner anti-mitochondrialen Eigenschaften als Testwirkstoff ausgewählt, da wir davon ausgingen, dass durch die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps mit DCA und die Lenkung von mehr Pyruvat in die mitochondriale oxidative Phosphorylierung bei gleichzeitiger Ausrichtung auf die Mitochondrien mit ATO ein kooperativer Effekt mit dieser Wirkstoffkombination erzielt werden würde. Das Prinzip dieser dualen Targeting-Strategie wird durch die Ergebnisse zweier neuerer Veröffentlichungen gestützt, in denen festgestellt wurde, dass Zellen mit mitochondrialen Defekten (z. B. rho (0) oder nach Behandlung mit nichtmedikamentösen mitochondrialen Inhibitoren wie Rotenon) eine höhere Empfindlichkeit gegenüber den wachstumshemmenden Wirkungen von DCA aufweisen [48,49]. Die Wirksamkeit dieser dualen Targeting-Strategie muss zwar noch in vivo nachgewiesen werden, aber die verstärkten Kombinationswirkungen von ATO/DCA wurden sowohl bei der Wachstumshemmung als auch bei der Apoptose bei Arzneimittelkonzentrationen in klinisch relevanten Bereichen beobachtet. Einige Wirkungen am unteren Ende des Konzentrationsbereichs waren nicht sehr groß (z. B. 15 % Anstieg der apoptotischen Zellen), aber die Auswirkungen in vivo über Wochen statt Stunden der Behandlung rechtfertigen weitere Untersuchungen.
Es ist gut dokumentiert, dass DCA das mitochondriale Verhalten verändern kann, d. h. die MMP depolarisiert [18,20]. Dieses Phänomen ist jedoch nicht gut erklärt worden. Wir beobachteten, dass DCA das ATP erhöhen und gleichzeitig die MMP in T-47D-Zellen depolarisieren kann (Abbildung 2). Auf der Grundlage dieser Daten schlugen wir vor, dass DCA die mitochondriale Funktion über den Komplex V der ETC, die ATP-Synthase, verändert. Die ATP-Synthase ist der letzte Schritt der ETC und verwendet das von der ETC erzeugte MMP zur Herstellung von ATP. ATPb ist bei Lungen-, Gehirn-, Brust- und Magenkrebs herunterreguliert [50], was die hyperpolarisierte Mitochondrienmembran erklären könnte, die in vielen Krebszellen zu finden ist [51]. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass DCA die ATP-Synthase-Aktivität entweder über eine allosterische Regulierung aufgrund seiner Homologie zu Pyruvat oder über eine Erhöhung der ATP-Synthase-Proteinspiegel nach Umkehrung des Warburg-Effekts und verringerter HIF-1α-Spiegel erhöhen kann. Immunoblotting zeigte eindeutig, dass ATPβ nach DCA-Behandlung hochreguliert ist (Abbildung 7D), was darauf hindeutet, dass DCA die ATP-Synthase-Aktivität erhöhen kann, was wiederum zu einer erhöhten ATP-Produktion und Erschöpfung der MMP beiträgt.
HIF-1α und c-Myc sind zwei wichtige onkogene Transkriptionsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie den Stoffwechsel in Krebszellen regulieren. HIF-1α kann die Enzyme des glykolytischen Weges und der Milchsäure-Dehydrogenase hochregulieren und so den Warburg-Effekt in Krebszellen aufrechterhalten [33]. Dadurch wird nicht nur die ATP-Produktion erhöht, sondern auch die Versorgung mit Vorläufersubstanzen wie Glukose-6-Phophat und Fruktose-6-Phosphat für die Produktion von Nukleinsäuren über den Pentosephosphatweg [16]. c-Myc wiederum spielt nicht nur eine zentrale Rolle bei der Förderung des Übergangs von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus durch die Regulierung der Cycline und ihrer Kinasen und Inhibitoren, sondern reguliert auch Proteinkomponenten des ETC wie COXI-IV hoch und trägt zur Steigerung der mitochondrialen Aktivität bei [52]. Somit ist die Kombination von c-Myc und HIF-1α-Überexpression wichtig für die Auslösung des Warburg-Effekts bei gleichzeitiger Erhöhung der mitochondrialen Aktivität, die den Glutamin-TCA-Hub unterstützt, der für den Anabolismus von Aminosäuren und Fettsäuren, die für die Zellteilung benötigt werden, wesentlich ist [16]. Diese Stoffwechselsignatur trägt zur Karzinogenese und zum malignen Phänotyp vieler Tumoren bei [33,34]. Sowohl ATO als auch DCA können die HIF-1α-Spiegel deutlich senken, was auf eine Verringerung des Warburg-Effekts hindeutet (Abbildung 7C). Während DCA allein keine Auswirkung auf die c-Myc-Konzentration hatte, regulierte ATO die c-Myc-Konzentration überraschenderweise deutlich nach oben (Abbildung 7B). Dies könnte eine positive Rückkopplungsschleife sein, bei der die Zellen versuchen, die ETC-Aktivität nach der Hemmung von Komplex IV zu erhöhen. Auffallend ist, dass DCA die Wirkung von ATO auf c-Myc umkehrte und die Kombination von ATO und DCA die c-Myc-Expression stark unterdrückte, was mit der Fähigkeit dieser Wirkstoffe korreliert, gemeinsam die Zellproliferation zu reduzieren und den Zelltod herbeizuführen (Abbildung 1).
Die Wirksamkeit von ATO gegen PML wird auf mehrere besondere Merkmale dieser malignen Erkrankung zurückgeführt: Differenzierung durch Inaktivierung von PML-RARα, geringe antioxidative Kapazität der PML-Zellen zum Schutz vor erhöhten ROS-Werten und Akkumulation des Wirkstoffs aufgrund einer gestörten Osmoregulation [5]. Derzeit laufen zahlreiche Studien zum Einsatz von ATO bei einer Reihe von soliden malignen Erkrankungen, obwohl bisher nur wenige Ergebnisse veröffentlicht wurden. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass ATO als Einzelwirkstoff bei Patienten mit fortgeschrittenem Bauchspeicheldrüsen-, Leber- oder Melanomkrebs nicht sehr wirksam ist<ahref=“#5″>[5]</a></sup>. Forscher plädieren dafür, ATO in Kombination mit anderen Krebsmedikamenten<sup><a href=“#53″> [53,54]</a></sup> zu untersuchen, wobei einige Phase-I-Studien bereits abgeschlossen sind <sup><a href=“#55″>[55]</a></sup>. In dem Maße, wie unser Verständnis der Mechanismen von ATO weiter zunimmt, insbesondere seiner Auswirkungen auf den Krebsstoffwechsel, werden wir möglicherweise besser in der Lage sein, sein krebsbekämpfendes Potenzial in vivo in neuartigen Arzneimittelkombinationen zu nutzen</p>

<h2>Schlussfolgerungen</h2&gt <p>Zwei kürzlich erschienene Berichte haben gezeigt, dass DCA am wirksamsten gegen Zellen mit mitochondrialen Defekten <sup><a href=“#48″>[48,49].</a></sup> Dieser Bericht ist der erste, der zeigt, dass die gezielte Beeinflussung von zwei Aspekten des Stoffwechsels – die Umkehrung des Warburg-Effekts mit DCA und die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung mit ATO – eindeutig eine wirksame Anti-Krebs-Strategie in vitro gegen Brustkrebszelllinien ist. Die Identifizierung der Cytochrom-C-Oxidase als mitochondriales Ziel für ATO liefert neue mechanistische Informationen für die Anwendung von ATO bei der Behandlung anderer Tumorarten als APL. Die Fähigkeit von DCA, die Expression der ATP-Synthase b-Untereinheit zu erhöhen und damit einen anderen weit verbreiteten Stoffwechselphänotyp von Krebs umzukehren, deutet ebenfalls darauf hin, dass DCA für ein breites Spektrum von Tumorarten relevant sein könnte. Die Fähigkeit von DCA, die zytotoxischen Wirkungen anderer Chemotherapeutika als ATO in vitro und in vivo zu verstärken, ist ebenfalls eine weitere Untersuchung wert. Die fehlende Empfindlichkeit der nicht krebsartigen Zelllinie MCF-10A gegenüber den getesteten klinisch relevanten Konzentrationen von ATO/DCA ist ebenfalls ermutigend und legt nahe, dass diese Behandlungsstrategie gegen solide Tumore in vivo weiter getestet werden sollte.</p&gt <h2>Liste der Abkürzungen</h2&gt <p>APL: akute promyeloische Leukämie; ATO: Arsentrioxid; ATPβ: ATP-Synthase β-Untereinheit; AV: Annexin V; BA: Bongkrekinsäure; CFSE: Carboxyfluorescein-Succinimidylester; CsA: Cyclosporin A; DCA: Dichloracetat; ETC: Elektronentransportkette; H2DCFDA: 2′, 7′-Dihydrochlorfluroresceinacetat; JC-1: 5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazol-Carbocyaninjodid; MMP: mitochondriales Membranpotenzial; MTP: mitochondriale Übergangspore; NaCN: Natriumcyanid; PI: Propidiumjodid; ROS: Reaktive Sauerstoffspezies; TTFA: Thenolytrifluoroaceton.</p&gt <h2>Danksagungen</h2&gt <p>Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Breast Cancer Foundation Australia (AB) und durch den NHMRC 366787 R.D. Wright Career Development Award (AB) unterstützt. PB wird vom NHRMC und der Australian National University unterstützt. RS wurde durch ein Postgraduiertenstipendium der Australian National University unterstützt</p&gt <h2>Autorenangaben</h2&gt <p>1 Molecular Genetics Group, Department of Translational Biosciences, John Curtin School of Medical Research, Building 131, Australian National University, P.O. Box 334, Canberra ACT 0200, AUSTRALIEN. 2 Abteilung für Strahlenonkologie, Stanford School of Medicine, Stanford CA 94305 USA.</p&gt <h2>Beiträge der Autoren</h2&gt <p>RS hat die Experimente geplant, durchgeführt und das Manuskript verfasst. PB beteiligte sich an der Analyse der Daten und der Erstellung des Manuskripts. AB beteiligte sich an der Planung und Analyse der Daten und bereitete das Manuskript zur Veröffentlichung vor. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.</p&gt <h2>Konkurrierende Interessen</h2&gt <p>Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.<br></p&gt <p>Received: 3 May 2011 Accepted: 18 November 2011<br>Veröffentlicht: 18 November 2011</p&gt <h2>REFERENZEN</h2&gt <br><span id=“1″ class=“referencess blue-text“>1</span> Antman KH: Introduction: the history of arsenic trioxide in cancer therapy. Onkologe 2001, 6(Suppl 2):1-2. <br><span id=“2″ class=“referencess blue-text“>2</span> Emadi A, Gore SD: Arsenic trioxide – An old drug rediscovered. Blood Rev 2010, 24:191-199. <br><span id=“3″ class=“referencess blue-text“>3</span> Powell BL, Moser B, Stock W, Gallagher RE, Willman CL, Stone RM, Rowe JM, Coutre S, Feusner JH, Gregory J, et al: Arsentrioxid verbessert das ereignisfreie und das Gesamtüberleben bei Erwachsenen mit akuter promyelozytärer Leukämie: North American Leukemia Intergroup Study C9710. 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