📖 20 mins.

Ramon C. Sun, Mitali Fadia, Jane E. Dahlstrom, Christopher R. Parish, Philip G. Board, Anneke C. Blackburn

R.C. Sun, P. G. Board, A. C. Blackburn
Molecular Genetics Group, John Curtin School of Medical Research, Australian National University, P.O. Box 334, Canberra 2601, Australien e-mail:

[email protected].Fadia, J. E. Dahlstrom
Abteilung für Anatomische Pathologie, Canberra Hospital und Australian National University Medical School, Woden ACT 2606, AustralienC

.R. Parish
Cancer and Vascular Biology Group, John Curtin School of Medical Research, Australian National University, Canberra ACT 0200, AustralienEingegangen


: 17. April
2009Angenommen: 2. Juni 2009Veröffentlicht
: 19. Juni 2009








Zusammenfassung

Der glykolytische Phänotyp ist ein weit verbreitetes Phänomen bei soliden Krebsarten, einschließlich Brustkrebs. Dichloracetat (DCA) wurde vor kurzem als neuartiges und relativ ungiftiges Anti-Krebsmittel vorgeschlagen, das den glykolytischen Phänotyp in Krebszellen durch die Hemmung der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase umkehren kann. Wir haben die Wirkung von DCA gegen Brustkrebszellen untersucht, auch in einem stark metastasierenden In-vivo-Modell. Es wurde festgestellt, dass das Wachstum mehrerer Brustkrebszelllinien in vitro durch DCA gehemmt wird. Eine weitere Untersuchung von 13762 MAT-Mammakarzinomzellen der Ratte ergab, dass die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps durch DCA mit einer Hemmung der Proliferation ohne Zunahme des Zelltods einherging. Dies geschah trotz eines geringen, aber signifikanten Anstiegs der Caspase 3/7-Aktivität, die Krebszellen für andere apoptotische Auslöser sensibilisieren könnte. In vivo bewirkte DCA eine 58%ige Verringerung der Anzahl der makroskopisch beobachteten Lungenmetastasen nach Injektion von 13762 MAT-Zellen in die Schwanzvene von Ratten (P = 0,0001, n ≥ 9 pro Gruppe). Diese Ergebnisse zeigen, dass DCA neben den pro-apoptotischen Eigenschaften auch antiproliferative Eigenschaften besitzt und gegen hochgradig metastatische Erkrankungen in vivo wirksam sein kann, was sein Potenzial für den klinischen Einsatz unterstreicht.


Schlüsselwörter: Dichloracetat, Brustkrebs, Glykolyse, Metastasierung, Tiermodell

© Springer Science+Business Media, LLC. 2009


EINLEITUNG

Der glykolytische Phänotyp, der oft als Warburg-Effekt bezeichnet wird, ist ein weit verbreitetes Phänomen bei den meisten Krebsarten, bei denen hohe Raten der Glukoseaufnahme und Glykolyse auftreten, während die mitochondriale Atmung trotz der Anwesenheit von Sauerstoff unterdrückt wird. Es wird angenommen, dass diese Stoffwechselcharakteristik für die Produktion von ATP während der anaeroben Tumorevolution erworben wird; es gibt jedoch zunehmend Hinweise darauf, dass der glykolytische Phänotyp von Veränderungen der Genexpression begleitet wird, die eng mit tumorigenen Prozessen verbunden sind, wie z. B. Resistenz gegen Apoptose und erhöhtes metastatisches Potenzial [1,2].

Das Vorhandensein des glykolytischen Phänotyps bei Brustkrebs ist gut beschrieben worden. Ein veränderter bioenergetischer Zellindex (BEC) und eine tiefgreifende Verschiebung hin zu einem verstärkten glykolytischen Phänotyp wurden bei Brustkrebs im Vergleich zu gepaarten normalen Brustgewebebiopsien festgestellt und mit dem Gesamtüberleben und dem krankheitsfreien Überleben der Patientinnen korreliert [3,4]. Die Invasivität mehrerer Brustkrebszelllinien wurde mit einer höheren konstitutiven Konzentration des Transkriptionsfaktors HIF-1α unter normoxischen Bedingungen und einer verminderten Induktion von HIF-1α unter Hypoxie sowie mit einer höheren Laktatproduktion in Verbindung gebracht [5]. Immunhistochemisch wurde eine Hochregulierung von zwei Markern des glykolytischen Phänotyps (Glukosetransporter GLUT1 und Na+/H+-Austauscher NHE-1) in mikroinvasiven Herden des duktalen Karzinoms in situ (DCIS) beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Anpassung an Hypoxie und Azidose Schlüsselereignisse beim Übergang von in situ zu invasivem Brustkrebs darstellen könnte [6]. Daher ist die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps zur Verhinderung der Metastasierung und des Wiederauftretens von Brustkrebs eine wichtige Behandlungsstrategie.

Die Pyruvatdehydrogenase (PDH) steuert die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-Co-A und kann daher den Fluss der Metaboliten von der Glykolyse zum Zitronensäurezyklus und damit die ATP-Erzeugung in den Mitochondrien kontrollieren. PDH wird durch die Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK) reguliert, die PDH phosphoryliert und inaktiviert [7]. Dichloracetat (DCA) hemmt die PDK und wurde kürzlich als neuartiges und relativ ungiftiges Mittel zur Krebsbekämpfung vorgeschlagen [8]. Es hat sich gezeigt, dass DCA den glykolytischen Phänotyp in einer Reihe von Krebszelllinien umkehrt, indem es das hyperpolarisierte innere mitochondriale Membranpotenzial auf normale Werte depolarisiert und den mitochondrialen Stoffwechsel erhöht [8,9]. Da DCA auf eine Veränderung abzielt, die während der Tumorentstehung stattfindet, kann es gegen Krebszellen wirksam sein, ohne normale Zellen zu vergiften. DCA befindet sich derzeit in klinischen Studien der Phase III zur Behandlung der chronischen Laktatazidose bei angeborenen mitochondrialen Störungen [10,11] und hat somit das Potenzial, schnell für andere Anwendungen in die Klinik zu kommen, da es die Toxizitätstests der Phase I/II am Menschen bestanden hat [12]. Klinische Studien zur Bewertung seiner Toxizität bei Krebspatienten sind im Gange (http://www.clinicaltrials.gov); es sind jedoch kontrollierte Experimente zum Verständnis der krebsbekämpfenden Wirkung von DCA erforderlich, um festzustellen, welche Tumore und welche Patienten am besten mit DCA behandelt werden können.

In dieser Studie wurde eine Adenokarzinom-Zelllinie der Ratte verwendet, um die Wirkung von DCA sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA in diesen Zellen eher eine proliferationshemmende als eine apoptoseinduzierende Wirkung hat, und zeigen, dass DCA in vivo das Wachstum metastasierender Krebszellen wirksam reduzieren kann, was seine Bedeutung für die Behandlung von Brustkrebs erhöht.

Materialien und Methoden

Zellkultur
13762 MAT-Mammaria-Adenokarzinomzellen der Ratte (MAT-Zellen) wurden wie zuvor beschrieben in vitro gehalten [13]. V14-Zellen wurden aus einem spontanen Adenokarzinom der Brustdrüse einer BALB/c-Trp53+/- Maus gewonnen [14].

Zellwachstum
Die Zellen wurden 1-4 Tage lang in 96-Well-Platten 1-5 mM DCA (Sigma Chemical Co St. Louis, MO) ausgesetzt, wobei die Medien und DCA täglich erneuert wurden, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde anhand der Aufnahme von Neutralrot gemessen [15].

Apoptose
Die Caspase 3/7-Aktivitäten in MAT-Zellen wurden mit dem Caspase-Glo 3/7-Assay (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, nachdem die Zellen mit FITC-markiertem Annexin-V (BD Pharmingen, NJ) und Propidiumjodid (PI) (Sigma Chemical Co St. Louis, MO) gefärbt worden waren.

Proliferation
Die Zellen wurden mit 5 μM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) angefärbt und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortieranalyse untersucht [16

]

.

Zellstoffwechsel
Der interne ATP-Gehalt in MAT-Zellen wurde mit dem CellTiter-Glo-Assay (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Der extrazelluläre Laktatgehalt wurde spektrophotometrisch durch Messung der Umwandlung von NAD in NADH bei 340 nm durch Laktatdehydrogenase in neutralisierten Perchlorsäureextrakten des Mediums bestimmt [17].

13762 MAT-Zellmetastasierung in vivo
Die Tierversuche wurden mit Genehmigung des Australian National University Animal Ethics Experimentation Committee gemäß den Richtlinien des Australian National Health and Medical Research Committee durchgeführt. Drei Gruppen von weiblichen Fischer 344 Ratten (10-13 Wochen alt) wurden 2 ×105 13762 MAT-Zellen in die laterale Schwanzvene injiziert [13]. Die Ratten der Gruppe 1 (Kontrolle) waren unbehandelt. Vor der Injektion erhielten die Gruppen 2 (niedrige Dosis) und 3 (hohe Dosis) 7 Tage lang oral in Trinkwasser verabreichtes DCA in einer Konzentration von 0,2 g/l (23 mg/kg), um die GSTZ1-Aktivität zu verringern und die Bioverfügbarkeit von DCA zu maximieren [18]. Am Tag der Zellinjektion wurde die orale Dosis auf 0,75 g/l erhöht (durchschnittlicher Wasserverbrauch 115 ml/kg/Tag), was einer Tagesdosis von 86 mg/kg entspricht, ohne den Wasserverbrauch signifikant zu verändern (Kontrolle 120 ml/kg/Tag). Die Ratten der Gruppe 3 wurden zusätzlich mit DCA (hohe Dosis) behandelt und erhielten 200 mg/kg/Tag intraperitoneal (i.p.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (neutralisiert und filtersterilisiert), wobei die erste Injektion etwa 2 Stunden vor der Zellinjektion verabreicht wurde. Ausgehend von veröffentlichten Daten [18,19] wird geschätzt, dass die orale Verabreichung zu Plasmakonzentrationen im Bereich von 0,5-1 mM DCA führt, während die zusätzliche Verabreichung von 200 mg/kg i.p. diesen Wert um das Dreifache auf 1,5-3,0 mM erhöhen dürfte.

Die Ratten wurden 14 Tage nach der Injektion der Tumorzellen getötet, und die Lungen wurden in Bouins-Lösung fixiert. Die Anzahl der Lungenmetastasen wurde unter einem Seziermikroskop bestimmt. Die beiden größten Lappen jeder Lunge wurden anschließend in Paraffin eingebettet und für die mikroskopische Beurteilung gefärbt. Die Anzahl der mikroskopischen Läsionen, ihre Größe und die Anzahl der Mitosen pro High Power Field (hpf) wurden bewertet. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Tumornekrose wurde angegeben und die Dichte der tumorassoziierten Lymphozyten (gelegentlich/mild/mäßig/schwer) wurde erfasst.

GSTZ-Aktivität
DCA wird in der Leber durch die Glutathion-Transferase GSTZ1-1 zu Glyoxylat verstoffwechselt, aber DCA kann seinen eigenen Abbau hemmen, indem es einen inaktiven Enzym-Substrat-Komplex mit GSTZ1 bildet [20]. Um eine wirksame Verabreichung von DCA zu gewährleisten, wurde die GSTZ1-Aktivität in der Rattenleber nach der zuvor beschriebenen Methode gemessen [21].

Statistische Analyse
FACS-Daten
wurden mit dem Softwarepaket Cell Quest (BD Bioscience, Rockville, MD) erfasst und mit FlowJo (Tree Star Inc, OR) analysiert. Die Berechnungen wurden mit dem GraphPad Prism® Software-Paket durchgeführt, und der Student’s t-Test wurde angewandt, um Unterschiede zwischen DCA-behandelten und Kontrollgruppen zu bewerten. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Ergebnisse

DCA hemmt das Wachstum von Brustkrebszellen
Um die Empfindlichkeit von Brustkrebszellen gegenüber DCA zu untersuchen, behandelten wir eine Reihe von Brustkrebszelllinien mit 5 mM DCA (Abb. 1a). MCF-7-, T-47D-, 13762-MAT- und V14-Zellen zeigten alle eine 60-80%ige Abnahme der Zellzahl am Tag 4 der Behandlung, während 4T1-Zellen unempfindlich waren. Im Gegensatz dazu hatte DCA keine Auswirkung auf das Wachstum einer nicht krebserregenden Kontrollzelllinie, MCF-10A.

Abbildung 1. Wirkung von DCA auf das Zellwachstum. a Ein Panel von Brustkrebszelllinien, die unterschiedlich empfindlich auf eine 4-tägige Behandlung mit 5 mM DCA reagieren. MCF-10A ist eine nicht krebserregende Kontrolle. b Zeitlicher Verlauf der Hemmung des MAT-Zellwachstums durch DCA. c Dosisabhängigkeit der MAT-Zellen gegenüber DCA am Tag 4 der DCA-Behandlung

Die Wirkung von DCA auf MAT-Zellen wurde sowohl in vitro als auch in vivo weiter untersucht. Die Reaktion der MAT-Zellen auf DCA war sowohl zeit- als auch dosisabhängig (Abb. 1b, c). Die stärkste Wirkung wurde an Tag 4 beobachtet, als MAT-Zellen, die mit 5 mM DCA behandelt wurden, 68 ± 5 % weniger Zellen aufwiesen als die Kontrollkulturen (n = 3, P < 0,0001). Um den Grund für die verringerte Zellzahl zu ermitteln, wurden Zellproliferation und Apoptose gemessen. Mit Hilfe des CFSE-Zellproliferationstests wurde festgestellt, dass die mit 5 mM DCA behandelten MAT-Zellen nach drei Tagen eine signifikant höhere Fluoreszenz aufwiesen als die unbehandelten Zellen (P = 0,0009; n = 3), was auf eine verringerte Zellteilung hinweist (Abb. 2a). Dies war sogar bei 1 mM DCA zu beobachten. Im Gegensatz dazu wurde die Apoptose durch DCA nicht erhöht (Abb. 2b-d). Die Behandlung mit 5 mM DCA zeigte einen geringen (15 %), aber statistisch signifikanten Anstieg der Caspase 3/7-Aktivität nach 3 Stunden (Abb. 2b); dies war jedoch ein minimaler Anstieg im Vergleich zur Staurosporin-Positivkontrolle (2,2-fach). Die Annexin V- und PI-Färbung zeigte ebenfalls, dass eine 5 mM DCA-Behandlung auch nach 24 Stunden Inkubation keine Apoptose in MAT-Zellen auslöste (Abb. 2c, d).


Abbildung 2. Wirkung von DCA auf die Zellproliferation a und die Apoptose-Indikatoren b-din MAT-Zellen. a Mittlere CFSE-Zellfluoreszenz nach 3 Tagen DCA-Behandlung. b Caspase 3/7-Aktivitäten nach 3 Stunden Behandlung. Prozentsatz der frühen c und späten d apoptotischen Zellen. Staurosporin ist eine positive Kontrolle für die Induktion der Apoptose

DCA kehrt den glykolytischen Phänotyp um
Die Behandlung von MAT-Zellen mit 5 mM DCA für 30 Minuten führte zu einem Anstieg des Gesamt-ATP-Spiegels um 18 ± 3 % (n = 3, P = 0,009), und dieser Effekt hielt auch nach 3 Stunden an. Nach 12 Stunden DCA-Behandlung war die extrazelluläre Laktatkonzentration um 16,3 ± 5,3 % (n = 4, P = 0,01) verringert. Diese Daten bestätigen die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps von MAT-Zellen durch DCA.

DCA reduzierte das Tumorwachstum in vivo
Nach i.v. Injektion von MAT-Zellen gab es keine Veränderung der Anzahl der Metastasen bei Ratten in der niedrig dosierten DCA-Gruppe (die ∼86 mg/kg DCA allein auf oralem Weg erhielten). Im Gegensatz dazu zeigten die Ratten in der hochdosierten DCA-Gruppe (die zusätzlich zum oralen DCA täglich i.p. 200 mg/kg/Tag DCA injiziert bekamen) eine signifikante Reduktion der makroskopisch beobachteten Lungentumore um 58 ± 17% (P = 0,0001, n ≥ 9 pro Gruppe) (Abb. 3). Mikroskopisch war die Anzahl der Läsionen in den drei Gruppen jedoch unverändert (6,4 ± 2,8, 7,1 ± 3,4 und 6,2 ± 3,2 pro 5 High-Power-Felder für die Kontrolle, die niedrige bzw. die hohe Dosis). Die Läsionen in den mit hochdosiertem DCA behandelten Ratten entwickelten weniger Tumornekrosen und wiesen eine höhere Mitosenzahl auf (9,4 ± 7,0 gegenüber 20,2 ± 9,2 pro 5 hpf in der Kontrollgruppe bzw. bei hochdosiertem DCA, P = 0,03) (Abb. 4). Apoptotische Körper waren in keiner der Gruppen zu finden. Die DCA-Behandlung führte auch zu einer mäßigen lymphozytären Infiltration, insbesondere an den Rändern der Tumore, während in der Kontrollgruppe nur vereinzelt tumorassoziierte Lymphozyten zu finden waren (Abb. 4).

Abbildung 3. In-vivo-Untersuchungen. Die Lungen von Ratten zeigen die Metastasen, die sich in der Kontrollgruppe a und in den mit einer hohen DCA-Dosis behandelten b Fischer-Ratten nach der Injektion von MAT-Zellen in die Schwanzvene gebildet haben. c Lungenmetastasen pro Ratte für die Kontrollgruppe, die mit einer niedrigen und die mit einer hohen DCA-Dosis behandelten Gruppen. d GSTZ1-Aktivität in der Leber der gleichen Ratten

Abbildung 4. Mikroskopische Aufnahmen zeigen eine zentrale Nekrose und c das Fehlen eines lymphozytären Infiltrats bei einer Kontrollratte. Bei Ratten, die mit einer hohen DCA-Dosis behandelt wurden, entwickelten die Tumoren b weniger Nekrose, und d waren mit einem mäßigen lymphozytären Infiltrat verbunden. (H- und E-Färbung, Originalvergrößerung(a, b) ×100,(c, d) ×400)

Die GSTZ1-1-Aktivität wurde in der Leber von DCA-behandelten, tumortragenden Ratten gemessen, um die Exposition der Ratten gegenüber DCA zu bestätigen. In den Behandlungsgruppen mit niedriger und hoher Dosis ging die GSTZ1-1-Aktivität in der Leber nach der DCA-Behandlung um 93 % bzw. 95 % zurück, was auf eine fast vollständige Beseitigung der GSTZ1-1-Aktivität bei beiden Dosen hinweist.

Diskussion

Der glykolytische Phänotyp tritt bei Brustkrebs fast überall auf und wird mit mikroinvasiven Herden und schlechteren Überlebensaussichten in Verbindung gebracht [2-5]. DCA ist ein PDK-Inhibitor und kann den glykolytischen Phänotyp umkehren. In dieser Studie berichten wir, dass eine Reihe von Brustkrebszelllinien empfindlich auf DCA reagieren, wobei eine Wachstumshemmung über mehrere Behandlungstage hinweg zu beobachten ist (Abb. 1). In-vitro-Studien an MAT-Zellen zeigten eindeutig, dass dies auf eine Hemmung der Proliferation zurückzuführen ist, ohne Anzeichen von Apoptose oder Zelltod (Abb. 2). Dies steht im Gegensatz zu den bisher veröffentlichten Studien zur DCA-Behandlung von Endometrium-, Prostata- und Lungenkrebszellen, in denen in den meisten Fällen eine erhöhte Apoptose ohne Auswirkungen auf die Zellzyklusverteilung [9,22] oder eine erhöhte Apoptose bei gleichzeitig verringerter Proliferation [8] festgestellt wurde. Nur zwei der sechs untersuchten Zelllinien zeigten nach der DCA-Behandlung eine Veränderung der Zellzyklusverteilung, eine mit G0/G1-Arrest und die andere mit etwas S- und etwas G2/M-Arrest [9,22]. DCA hemmt zwar das Zellwachstum in einer Vielzahl von Krebszellen, der Mechanismus scheint jedoch zelllinienabhängig zu sein. Bei der menschlichen Brustkrebszelllinie T-47D wurde nach der DCA-Behandlung ebenfalls ein Mangel an Apoptose beobachtet (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass diese Reaktion nicht nur bei MAT-Zellen auftritt, sondern möglicherweise ein Merkmal von Brustkrebszellen ist. Dies ist eine faszinierende Möglichkeit, die Gegenstand weiterer Untersuchungen sein wird. Alternativ kann das Ausbleiben der Apoptose auch auf die hohe Konzentration von Zellüberlebensproteinen wie Bcl-2, Survivin und PUMA in den getesteten Zelllinien zurückzuführen sein. Die Expression dieser Überlebensfaktoren wurde durch die DCA-Behandlung in Prostata-, Lungen- und Endometriumkrebszellen verringert [8,22], und dies könnte zu der beobachteten apoptotischen Reaktion beitragen.

Die Empfindlichkeit der Brustkrebszelllinien gegenüber DCA reichte von 20 bis 80 % Hemmung des Zellwachstums bei einer 4-tägigen Behandlung mit 5 mM (Abb. 1), wobei die 4T1-Zellen am wenigsten empfindlich waren. Die Empfindlichkeit gegenüber DCA kann durch mehrere Faktoren bestimmt werden, darunter die Fähigkeit, DCA über GSTZ1 zu metabolisieren, oder die Überexpression verschiedener PDK-Isoformen. Es gibt vier PDK-Isoformen mit Kis für DCA von 1,0, 0,2, 8,0 bzw. 0,5 mM [23]. Während PDK1, 2 und 4 durch die in dieser Studie verwendeten DCA-Konzentrationen gehemmt würden, wäre dies bei PDK3 nicht der Fall. Die Expression von PDK3 ist normalerweise auf Hoden beschränkt [23], obwohl die Expression und Induktion von PDK3 durch Hypoxie für mehrere Krebszelllinien berichtet wurde [24]. Derzeit werden Studien durchgeführt, um die PDK-Expression mit der DCA-Empfindlichkeit zu korrelieren und festzustellen, welche Tumore am wirksamsten von DCA angegriffen werden.

Es wurde auch ein geringer Anstieg der Caspase-3/7-Aktivitäten festgestellt. Dies ist wahrscheinlich auf die Reaktivierung der Elektronentransportkette durch DCA und die Erhöhung der Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies in den Mitochondrien zurückzuführen [25]. Diese Erhöhung des Grundniveaus der Caspase-Aktivität reicht möglicherweise nicht aus, um Apoptose auszulösen; sie könnte jedoch darauf hindeuten, dass DCA verwendet werden könnte, um Krebszellen für andere apoptotische Auslöser zu sensibilisieren, wie Hypoxie, Strahlung oder andere Chemotherapeutika. Diese potenziellen Synergien müssen weiter untersucht werden.

In vivo hat sich die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps durch gezielte Beeinflussung der Pyruvat-Acetyl-CoA-Kopplung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung bereits in zwei Modellen als wirksam gegen das Wachstum von Primärtumoren erwiesen [1,8]. Wir haben das Potenzial von DCA zur Bekämpfung metastatischer Erkrankungen in vivo im MAT-Zellmodell nachgewiesen. Während die makroskopische Anzahl der Lungenläsionen durch hochdosiertes DCA reduziert wurde, blieb die Anzahl der mikroskopischen Läsionen unverändert, was darauf hindeutet, dass die Hauptwirkung von DCA auf die Größe der Tumore und nicht auf eine Verringerung der Anzahl der Zellen, die sich als Tumore in der Lunge etablieren können, zurückzuführen ist. Die Beobachtung eines geringeren Auftretens von Nekrosen in DCA-behandelten Tumoren steht ebenfalls im Einklang mit einem Wachstumshemmungsmechanismus, wie er in vitro beobachtet wurde. Die erhöhte Anzahl der Mitosen scheint zunächst im Widerspruch dazu zu stehen und deutet auf eine höhere Proliferationsrate hin; wir vermuten jedoch, dass dies auf einen Zellzyklus-Stillstand durch DCA vor der Anaphase zurückzuführen ist, der zu einer Anhäufung von Zellen führt, die als mitotische Figuren vorliegen. Interessanterweise war bei den mit einer hohen DCA-Dosis behandelten Tieren eine Zunahme der tumorassoziierten Lymphozyten festzustellen. Eine stärkere Immunreaktion gegen die Tumore könnte durch eine Verringerung des Tumorlaktatspiegels durch die DCA-Behandlung gefördert werden, da hohe Milchsäurekonzentrationen nachweislich die T-Zell-Funktion verringern [26]. Experimente mit V14-Zellen in vivo deuten darauf hin, dass V14-Zellen in vivo ähnlich empfindlich auf DCA reagieren wie MAT-Zellen, wobei ein verringertes Primärtumorwachstum und eine erhöhte Lymphozytenpräsenz beobachtet wurden (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass diese In-vivo-Effekte nicht nur bei MAT-Zellen auftreten.

Die Verwendung von Wirkstoffen in millimolaren Konzentrationen wird oft als unhaltbar angesehen. Millimolare Serumspiegel von DCA (0,3-1 mM) wurden jedoch bei Patienten durch orale Verabreichung von DCA in Höhe von 25 mg/kg/Tag chronisch aufrechterhalten [27]. Bei der Akutbehandlung von Patienten wurden während einer Lebertransplantation bis zu 80 mg/kg i.v. vertragen [28]. Während die effektive DCA-Dosis in vivo in diesem Rattenmodell hoch war, ist die geschätzte Plasmakonzentration, die in vivo erreicht wird (1,5-3 mM, siehe Methoden), ähnlich wie bei Menschen, die 25 mg/kg/Tag erhalten, und daher für die klinische Situation relevant. Dieser Bereich der Plasmakonzentration korreliert auch mit der Hemmung der Proliferation in vitro (so niedrig wie 1 mM, Abb. 2a) und mit dem Ki-Wert für die Hemmung von PDKs durch DCA [23], was den Vorschlag unterstützt, dass PDK das für die krebshemmende Wirkung von DCA verantwortliche Target ist.

Während die chronische DCA-Behandlung bei MELAS-Patienten zu einer gewissen reversiblen peripheren Neurotoxizität führte [10], ist die Toxizität von DCA für Gewebe, die für klassische zytotoxische Wirkstoffe anfällig sind, minimal [8,29], was es zu einem guten Kandidaten für eine Kombinationstherapie macht. Während DCA beispielsweise GSTZ1 irreversibel hemmt (Abb. 2d), zeigen DCA-behandelte Mäuse nicht die Lymphozytendepletion, die bei Mäusen mit genetischem GSTZ-Mangel beobachtet wurde [21,30]. Daher ist die Umkehrung des glykolytischen Phänotyps bei Brustkrebs durch die Hemmung von PDK mit DCA eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung und zeigt auch eine potenzielle Anwendung für alternative PDK-Inhibitoren, die sich derzeit in der Arzneimittelentwicklung befinden [31]. Dennoch sind weitere mechanistische Studien erforderlich, um den kausalen Zusammenhang zwischen dem glykolytischen Phänotyp und den Tumoreigenschaften zu verstehen, damit der Stoffwechsel von Krebszellen gezielt für therapeutische Zwecke genutzt werden kann.

Danksagung

Diese Forschungsarbeit wurde durch einen Zuschuss der National Breast Cancer Foundation Australia und durch den NHMRC 366787 R.D. Wright Career Development Award unterstützt.

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