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Nathan Patrick Ward


Genehmigt: 7. November 2016

Zusammenfassung

Der robuste glykolytische Stoffwechsel von Glioblastoma multiforme (GBM) hat sich als anfällig für einen Anstieg des oxidativen Stoffwechsels erwiesen, der durch das Pyruvat-Mimetikum Dichloracetat (DCA) ausgelöst wird. Jüngste Berichte zeigen, dass das Antidiabetikum Metformin den schädlichen oxidativen Stress, der mit der DCA-Behandlung in Krebszellen einhergeht, verstärkt. Wir haben versucht, die Rolle der berichteten Aktivität von Metformin als mitochondrialer Komplex I-Inhibitor bei der Verstärkung der DCA-Zytotoxizität im VM-M3-Modell von GBM zu klären. Wir wiesen nach, dass Metformin die DCA-induzierte Superoxid-Produktion verstärkte und dass dies für die erhöhte Zytotoxizität gegenüber VM-M3-Zellen mit der Kombination erforderlich war. In ähnlicher Weise verstärkte Rotenon den durch die DCA-Behandlung verursachten oxidativen Stress, und auch dies war für die festgestellte Steigerung der Zytotoxizität erforderlich. Eine Aktivierung der Adenosin-Monophosphat-Kinase (AMPK) wurde bei der Konzentration von Metformin, die zur Steigerung der DCA-Aktivität erforderlich ist, nicht beobachtet. Darüber hinaus führte die Zugabe eines AMPK-Aktivators nicht zu einer Verstärkung der DCA-Zytotoxizität, während ein AMPK-Inhibitor die Zytotoxizität der Kombination verstärkte. Wir zeigen auch, dass DCA und Metformin als Einzeltherapien die Tumorlast reduzieren und das Überleben in VM-M3-tumorbelasteten Mäusen verlängern. Im Gegensatz zu unserer In-vitro-Arbeit konnten wir in vivo keine Synergie zwischen DCA und Metformin beobachten. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Verstärkung der Zytotoxizität von DCA durch Metformin von der Hemmung des Komplexes I abhängt. Insbesondere kooperiert die Komplex-I-Hemmung mit der DCA-induzierten Glukoseoxidation, um den zytotoxischen oxidativen Stress in VM-M3-GBM-Zellen zu verstärken. Diese Arbeit unterstützt die weitere Untersuchung und Optimierung einer DCA/Metformin-Kombination als potenzielle pro-oxidative Kombinationstherapie für GBM.


Schlüsselwörter: Krebsstoffwechsel, mitochondriale Glukoseoxidation, Komplex-I-Hemmung, oxidativer Stress, DCA, Metformin

Copyright © 2017, Nathan P. Ward


KREBS-STOFFWECHSEL

Zusammenfassung des Kapitels

In diesem Kapitel geben wir einen Überblick über die Stoffwechselprogramme, die von Tumoren eingesetzt werden, um die biosynthetischen Anforderungen der Tumorentstehung zu erfüllen. Der Stoffwechsel von Tumoren ist eng mit den Merkmalen der Krankheit verknüpft und verschafft Krebszellen einen Überlebensvorteil als Reaktion auf die Belastungen durch die Mikroumgebung des Tumors. Das Verständnis der metabolischen Merkmale von Tumoren bildet die Grundlage für eine rationale therapeutische Strategie, die auf diese metabolischen Abhängigkeiten abzielt. Aktuelle Ansätze zur gezielten Beeinflussung des Krebsstoffwechsels werden in diesem Kapitel ebenfalls diskutiert.

Veränderter Energiestoffwechsel

Krebs wird traditionell als genetische Krankheit betrachtet, die durch genomische Instabilität und häufige Mutationen gekennzeichnet ist, die zusammenwirken, um eine besondere zelluläre Umgebung zu schaffen, die eine ungezügelte Vermehrung ermöglicht (1). Die Genomsequenzierung von Tumoren hat eine Vielzahl von Mutationen identifiziert, gegen die Medikamente eingesetzt werden können und die die Forschung und pharmazeutische Entwicklung vorangetrieben haben. Leider haben sich die vielversprechenden präklinischen Ergebnisse nicht immer in klinische Wirksamkeit umgesetzt. Dies hat die Wissenschaft dazu veranlasst, zusätzliche Merkmale der Tumorentwicklung und des Krankheitsverlaufs zu berücksichtigen und alternative Strategien für die Krebsbehandlung zu entwickeln (1).

Diese Initiative führte zu einer neuen Wertschätzung der besonderen Stoffwechselaktivität von Tumoren (2). Neben der Dysregulation des Zellzyklus und dem Verlust der Qualitätskontrolle der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die mit der Vermehrung von Krebszellen einhergehen, besteht ein grundlegender Bedarf an Biomasse. Ein kompliziertes Netz von Stoffwechselwegen läuft zusammen, um die für die Biosynthese erforderlichen molekularen Bausteine zu erzeugen (3). Der Stoffwechsel von Krebszellen ist so verdrahtet, dass er die kontinuierliche Produktion der für die Proliferation erforderlichen Nukleotide, Proteine und Lipidmembranen ermöglicht und gleichzeitig die für das Überleben der Zelle erforderliche Energie und das Reduktionspotenzial erzeugt (4). In den letzten zehn Jahren hat die Forschung über den Krebsstoffwechsel eine methodische Renaissance erlebt, um die metabolischen Abhängigkeiten von Krebszellen und die Schnittmenge zwischen Stoffwechsel und Tumorbiologie zu charakterisieren (5-8). Vor allem aber haben diese Arbeiten gezeigt, dass ein gezielter Eingriff in den Krebsstoffwechsel eine nachhaltige therapeutische Alternative für die Behandlung dieser verheerenden Krankheit darstellen kann.

Aerobe Fermentation
Der Begriff des besonderen Stoffwechsels bei Krebs ist kein neues Phänomen. Otto Warburg beobachtete im frühen 20. Jahrhundert erstmals einen deutlichen Unterschied im Stoffwechsel von Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe (9). Warburg berichtete, dass Tumore deutlich mehr zirkulierende Glukose aufnahmen als normales Gewebe, und während im normalen Gewebe nur sehr wenig Laktat gebildet wurde, berechnete Warburg, dass 66 % der verbrauchten Glukose vom Tumor in Laktat umgewandelt wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Tumore überwiegend Glukose fermentieren, anstatt den Zucker zu veratmen.

Glukose ist der vorherrschende Energiestoffwechselstoff im Körper und wird von den meisten Geweben bevorzugt verstoffwechselt. Beim Eintritt in die Zelle wird Glukose über den Embden-Meyerhof-Weg oder den glykolytischen Weg in Pyruvat umgewandelt. Normalerweise wird Pyruvat dann in die Mitochondrien importiert, wo es vollständig zu Kohlendioxid (CO2) oxidiert wird, solange Sauerstoff, der letzte Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette, nicht limitiert ist. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist das Gewebe ausreichend durchblutet, was die Sauerstoffzufuhr erleichtert und die mitochondriale Glukoseatmung ermöglicht. Bei Sauerstoffmangel, wie z. B. in den Muskeln bei intensiver körperlicher Betätigung, wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat vergoren.

Bemerkenswert an Warburgs Ergebnissen ist, dass die Tumore gut durchblutet waren und somit keine Sauerstofflimitierung vorlag (9). Folglich fermentierten die Tumore in einer aeroben Umgebung vorzugsweise Pyruvat zu Laktat. Diese aerobe Fermentierung von Glukose ist heute weithin als ein charakteristischer Phänotyp der meisten Krebsarten anerkannt und wird als Warburg-Effekt bezeichnet (10). Die robuste Aufnahme von Glukose durch Tumore ist die Grundlage für die diagnostische Fluordesoxyglukose-Positronenemissionstomographie (FDG-PET) (11).

Die Abhängigkeit vom glykolytischen Stoffwechsel scheint aus Sicht der Bioenergetik kontraintuitiv für eine robuste Proliferation. Die Erzeugung der für die Zellteilung erforderlichen Biomasse hängt zum Teil von der potenziellen Energie ab, die in Adenosintriphosphat (ATP), einem Nebenprodukt bestimmter kataboler Reaktionen, gespeichert ist. Die Glykolyse ist ziemlich energieineffizient und erzeugt nur 2 Mol ATP pro Mol Glukose, während die vollständige Oxidation von Glukose ~36 Mol ATP/Mol Glukose ergibt. Dennoch leiden Krebszellen, die diesen Warburg-Stoffwechsel aufweisen, nicht unter einem ATP-Defizit (12). Die Umwandlung von Pyruvat in Laktat durch LDH ist mit der Oxidation von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) zu seiner oxidierten Form, NAD+ , gekoppelt. Durch die Regeneration von NAD+ wird ein hohes zytosolisches NAD+/NADH-Verhältnis aufrechterhalten, das einen schnellen glykolytischen Fluss ermöglicht, da das glykolytische Enzym Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) NAD+ als Cofaktor benötigt.

Mitochondrialer Stoffwechsel
Auf der Grundlage seiner ursprünglichen Beobachtung stellte Warburg die Hypothese auf, dass die aerobe Gärung in Tumoren das Ergebnis einer irreversiblen Beeinträchtigung der oxidativen Kapazität ist, die Krebszellen daran hindert, ausreichend Energie aus dem oxidativen Stoffwechsel zu gewinnen (13). Es gibt Hinweise darauf, dass die ATP-Produktion keine notwendige Funktion der Krebsmitochondrien ist, dass aber der mitochondriale Stoffwechsel für die Proliferation von Krebszellen entscheidend ist (14). Grundsätzlich könnte die reichliche Bildung von Laktat infolge des Warburg-Effekts den Fluss von Pyruvat in die Mitochondrien einschränken, wo es über den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDH) leicht zu Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) und CO2 verstoffwechselt wird.

Acetyl-CoA ist ein wichtiger Kohlenstoffträger, der im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel intensiv genutzt wird. Acetyl-CoA ist für den kontinuierlichen Fluss des Zitronensäurezyklus (TCA) erforderlich, der die reduzierenden Äquivalente NADH und reduziertes Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) erzeugt. Diese reduzierenden Äquivalente werden von Proteinkomplexen in oder in Verbindung mit der inneren Mitochondrienmembran (IMM) in Reaktionen oxidiert, die die Freisetzung von Elektronen mit der Bewegung von Protonen (H+ ) aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum verbinden. Die Bewegung dieser Elektronen durch nachfolgende Proteinkomplexe, die zusammen die Elektronentransportkette (ETC) bilden, ist ebenfalls an die Bewegung von H+ durch die IMM gekoppelt. Die Translokation dieser H+ erzeugt eine Protonenmotivkraft und ein Membranpotential durch das IMM. Die ATP-Synthase macht sich diese Protonenmotivkraft zunutze, um die Bewegung von H+ zurück in die Matrix mit der Erzeugung von ATP aus Adenindiphosphat (ADP) und anorganischem Phosphat (Pi) zu verbinden.

Die Zwischenprodukte des TCA-Zyklus liefern nicht nur die reduzierenden Äquivalente für die oxidative Phosphorylierung, sondern sind auch wichtig für die Biosynthese wichtiger Makromoleküle. Ein verringerter Glukose-Kohlenstoff-Fluss durch den PDH-Komplex würde daher den TCA-Zyklus einschränken und die Menge der TCA-Zyklus-Zwischenprodukte verringern. Krebszellen, insbesondere in Kultur, haben den Glutamin-Stoffwechsel hochreguliert, um Defizite im Glukose-Kohlenstofffluss durch den TCA-Zyklus auszugleichen (15). Glutamin ist eine anaplerotische Aminosäure, die in den Mitochondrien durch Glutaminase (GS) in Glutamat umgewandelt wird. Glutamat kann dann zu ⍺-Ketoglutarat (⍺-KG), einem Zwischenprodukt des TCA-Zyklus, deaminiert werden. ⍺-KG kann dann durch traditionellen Fluss durch den Zyklus zur Auffüllung nachfolgender Zwischenprodukte beitragen oder durch Isocitrat-Dehydrogenase 2 (IDH2) vermittelte reduktive Carboxylierung in den vorgelagerten Metaboliten Isocitrat umgewandelt werden.

In bestimmten Tumorarten können die verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs) Leucin und Valin als anaplerotische Substrate verwendet werden (5). Darüber hinaus kann Glukose-Kohlenstoff in den TCA-Zyklus auf eine PDH-unabhängige Weise durch Pyruvat-Carboxylase (PC) gelangen, die zytosolisches Pyruvat in Oxalacetat umwandelt. Dieses Oxalacetat wird dann über die Malatdehydrogenase (MDH) in Malat umgewandelt. Malat kann über das Malat-Aspartat-Shuttle in die Mitochondrien aufgenommen und in den TCA-Zyklus integriert werden. Zusammen bieten diese Wege alternative Möglichkeiten zur Aufrechterhaltung der TCA-Funktion.

Das Aufkommen isotopenmarkierter Metaboliten hat gezeigt, dass die aerobe Fermentation die Glukoseoxidation nicht vollständig einschränkt, sondern dass die Verfolgung des 13C-Glukosestoffwechsels bei bestimmten Krebsarten eine gleichzeitige Fermentation und Oxidation von Glukosekohlenstoff zeigt (16). Der zelluläre Energiestoffwechsel hängt von der geregelten Bewegung von Elektronen zwischen Stoffwechselintermediaten und enzymatischen Cofaktoren durch eine Reihe von oxidativen Reduktionsreaktionen (Redox) ab. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die mitochondriale Oxidation für die Zellproliferation unabhängig von der ATP-Erzeugung entscheidend ist.

Die Stimulierung der ETC-Aktivität durch die Oxidation von reduzierenden Äquivalenten fördert das Redox-Gleichgewicht durch die Regeneration von NAD+ und oxidiertem Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD+ ), die entscheidende Elektronenakzeptoren sind. Elektronenakzeptoren sind für einen kontinuierlichen Stoffwechselfluss notwendig, insbesondere im Zusammenhang mit der Erfüllung der biosynthetischen Anforderungen einer schnellen Vermehrung (17). Sauerstoff dient als terminaler Elektronenakzeptor im oxidativen Stoffwechsel, und diese Reduktion von Sauerstoff gilt als der wichtigste Aspekt des mitochondrialen oxidativen Stoffwechsels für proliferierende Zellen (18). Auch die Aminosäure Aspartat dient nachweislich als essentieller Elektronenakzeptor für die Proliferation (17, 18).

Die Aufrechterhaltung des mitochondrialen Membranpotenzials (ΔΨm) hängt im Allgemeinen von dem kontinuierlichen, geregelten Elektronenfluss durch die ETC ab, der aus dem oxidativen Stoffwechsel resultiert. Die Aufrechterhaltung von ΔΨm ist entscheidend für die Proliferationsfähigkeit von Zellen, unabhängig von ihrer Kopplung an die ATP-Produktion (19). Tatsächlich sind Krebsmitochondrien häufig hyperpolarisiert, was auf einen ineffizienten Rückfluss von H+ in die Matrix zum Zwecke der ATP-Erzeugung hindeutet (20).

Neben Glukose können auch Fettsäuren als Substrat für den mitochondrialen oxidativen Stoffwechsel dienen. Die Beta-Oxidation von Fettsäuren (FAO) liefert Acetyl-CoA, das in den TCA-Zyklus aufgenommen wird, sowie NADH und FADH2 für den Elektronentransport und die potenzielle Erzeugung von ATP. FAO ist nachweislich für das Überleben und das Wachstum unter metabolischen Stressbedingungen von wesentlicher Bedeutung (21). Bestimmte hämatopoetische Malignome weisen eine erhöhte FAO auf (22, 23). Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL) scheinen weitgehend auf FAO angewiesen zu sein, um den zellulären ATP-Spiegel aufrechtzuerhalten. Leukämiezellen weisen dagegen häufig eine erhöhte FAO auf, die mit der Verhinderung der toxischen Anhäufung von Fettsäuren zusammenhängt (21). Darüber hinaus benötigen einige Leukämiezellen FAO zur Aufrechterhaltung des zytosolischen Redox-Gleichgewichts in Form der citratabhängigen Bildung von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH).

Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts
Wie bereits erwähnt, hängt der zelluläre Stoffwechsel von der koordinierten Bewegung von Elektronen durch intermediäre Metaboliten und dem Oxidationszustand wichtiger Elektronenträger ab. Die Zellen nutzen die Reduktionskraft von NADH und NAPDH für die katabolischen und biosynthetischen Reaktionen, die für Wachstum und Lebensfähigkeit notwendig sind. Das Verhältnis von NAD+ /NADH und oxidiertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP+ )/NADPH ist ein Indikator für den Redoxzustand der Zelle. Der Stoffwechselfluss und die Aktivität der bidirektionalen Stoffwechselenzyme sind vom Zustand dieser Verhältnisse abhängig. Der Redoxzustand der Zelle ist innerhalb der Organellen kompartimentiert, da es beispielsweise im Zytosol und in der mitochondrialen Matrix unterschiedliche Stoffwechselmechanismen zur Regulierung von NAD+ /NADH und NADP+/NADPH gibt. Diese sind jedoch nicht völlig unabhängig voneinander, da es Mechanismen für den Austausch von Metaboliten zwischen den Kompartimenten gibt, die Änderungen dieser Verhältnisse erleichtern.

Die Aufrechterhaltung des NAD+/NADH-Verhältnisses wird vor allem im Zytosol durch die Glykolyse und in der Mitochondrienmatrix durch den TCA-Zyklus vermittelt. Wie bereits erwähnt, weisen Krebszellen eine erhöhte LDH-Aktivität auf, die das durch die Glykolyse erzeugte NADH zu NAD+ recycelt und so den schnellen glykolytischen Fluss im Zusammenhang mit dem Warburg-Stoffwechsel erleichtert (4). Das Pendeln von Pyruvat zwischen dem Zytosol und der Matrix verbindet die NAD+/NADH-Pools der beiden Kompartimente und wird bei Krebs eng reguliert (24).

NADPH liefert die Reduktionskraft für die Biosynthese und ist eine entscheidende Komponente der zellulären antioxidativen Kapazität, die beide später in dieser Übersicht ausführlich behandelt werden. Zytosolisches NADPH wird durch zwei enzymatische Reaktionen im Pentosephosphatweg (PPP) erzeugt, und zwar durch die Umwandlung von Malat in Pyruvat durch das Apfelsäureenzym (ME) und die Oxidation von Isocitrat zu ⍺-KG durch IDH1. Der Austausch von Citrat zwischen der Matrix und dem Cytosol verbindet die NADPH-Pools der beiden Kompartimente. Es hat sich gezeigt, dass die reduktive Carboxylierung von Glutamin über Citrat zu den zytosolischen NADPH-Pools beiträgt, die durch Citratlyase zu Oxalacetat und anschließend durch MDH zu Malat metabolisiert werden können. Letztlich wird dieses aus Citrat gewonnene Malat durch ME in Pyruvat umgewandelt, wobei NADPH entsteht (25, 26). die Rückverfolgung von 13C-Glutamin hat gezeigt, dass ein erheblicher Teil des mitochondrialen NADPH aus dem Folatstoffwechsel stammt (27, 28). Weitere Faktoren, die zum NADPH-Pool in der Matrix beitragen, sind IDH2 und das IMM-assoziierte Enzym Nicotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase (NNT), das die Protonenmotivationskraft durch das IMM und die Reduktionskraft von NADH zur Erzeugung von NADPH nutzt.

Der zelluläre Redoxzustand wird auch durch oxidativen Stress beeinflusst, ein natürliches Nebenprodukt des Stoffwechsels. Oxidativer Stress wird durch die Bildung hochreaktiver freier radikaler sauerstoff- oder stickstoffhaltiger Spezies (ROS, RNS) verursacht, die eine Reihe von biologischen Funktionen haben, sowohl zellerhaltend als auch zytotoxisch. So ist beispielsweise der Elektronentransport kein völlig effizienter Prozess. Elektronen können vorzeitig aus dem ETC freigesetzt werden, um molekularen Sauerstoff zu Superoxidanionen (-O2 – ) zu reduzieren. Dies geschieht auf der Matrixseite des IMM an Komplex I (NADH-Dehydrogenase) und Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) der ETC. Außerdem kann -O2 – sowohl auf der der Matrix als auch auf der dem Intermembranraum (IMS) zugewandten Seite des IMM an Komplex III (Coenzym Q: Cytochrom c-Oxidoreduktase) gebildet werden. -O2 – kann auch im Zytosol und in der Matrix durch einen NADPH-abhängigen Prozess erzeugt werden, der von NADPH-Oxidasen (NOXs) katalysiert wird.

In Gegenwart von Stickstoffmonoxid (NO), einem Nebenprodukt des Argininstoffwechsels, trägt Superoxid zur Bildung des sehr reaktiven Peroxynitrit-Ions (ONOO- ) bei. Außerdem kann dieses -O2- durch Superoxiddismutasen (SOD) zu Wasserstoffperoxid (H2O2) dismutiert werden. H2O2 kann anschließend durch eine Reihe von Enzymsystemen zu Wasser entgiftet werden. Peroxiredoxine (PRX) unterliegen einer H2O2-vermittelten Oxidation, die einen katalytischen Zyklus in Gang setzt, in dem Thioredoxin (TRX), Thioredoxin-Reduktase (TrxR) und NADPH zusammenarbeiten, um reduzierte PRXe zu regenerieren. Glutathionperoxidasen (GPX) nutzen reduziertes Glutathion (GSH) zur Entgiftung von H2O2. Die Glutathion-Reduktase nutzt dann NADPH, um das oxidierte Glutathion (GSSG) in GSH umzuwandeln. Schließlich kann die Katalase auch H2O2 in Wasser umwandeln. Alternativ kann H2O2 in Gegenwart von Eisen- (Fe2+) oder Kupfer- (Cu+ )-Ionen durch Fenton-Reaktionen Hydroxylradikale (-OH) erzeugen.

Zusammengenommen tragen diese entgiftenden Enzyme zur antioxidativen Kapazität der Zelle bei, die die Anhäufung freier Radikale verhindert, die den oxidativen Stress verstärken. Die Transkriptionsregulierung dieser Enzyme wird durch den Hauptregulator der zellulären antioxidativen Maschinerie, den Nuclear Factor-like 2 (Nrf2), gesteuert. Die Nrf2-Aktivität wird durch oxidativen Stress stimuliert, was zur Hochregulierung einer Vielzahl von Entgiftungsenzymen und einem Stoffwechselprogramm führt, das die antioxidative Kapazität erhöht. Das Gleichgewicht zwischen der Bildung von ROS und RNS und der Entgiftung durch Antioxidantien hat großen Einfluss auf die Funktion und Lebensfähigkeit der Zellen und ist eine entscheidende Komponente der Tumorentstehung (29).

Folgen des Krebsstoffwechsels

Tumore bestehen aus einer heterogenen Zellpopulation, die einem starken Selektionsdruck ausgesetzt ist, der eine evolutionäre Reaktion bewirkt. Die während der Tumorentstehung erworbenen Mutationen müssen entweder einen Überlebensvorteil verschaffen oder passiv eine ungezügelte Vermehrung ermöglichen (1, 2). Tumore unterliegen den Zwängen der natürlichen Selektion, und diejenigen Mutationen, die die Fitness der Krebszellen verringern, werden letztlich bekämpft (30). Da ein veränderter Zellstoffwechsel ein durchgängiges Merkmal von Krebs ist, muss es einen Überlebensvorteil im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel neoplastischer Zellen geben. Im Folgenden beschreibe ich die Folgen des Krebsstoffwechsels, die den Krebszellen einen Überlebensvorteil verschaffen und zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.

REFERENZEN


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