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Jingtao Tong, Ganfeng Xie, Jinxia He, Jianjun Li, Feng Pan, und Houjie Liang

Abteilung für Onkologie, Südwestliches Krankenhaus, Dritte Medizinische Militäruniversität, 29 Gaotanyan Street, Chongqing 400038, China

Die Korrespondenz ist zu richten an Houjie Liang, [email protected] Eingegangen am 27. Mai 2010; Überarbeitet am 29. Dezember 2010; Angenommen am 13. Januar 2011

Akademischer Herausgeber: Miguel A. Andrade

Copyright © 2011 Jingtao Tong et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License veröffentlicht wird, die die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Vervielfältigung in jedem Medium erlaubt, sofern die Originalarbeit ordnungsgemäß zitiert wird.

Dichloracetat (DCA), ein Inhibitor der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK), hat sich vor kurzem als vielversprechendes, ungiftiges antineoplastisches Mittel erwiesen, das die Apoptose von Krebszellen fördert. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die antitumorale Wirkung von DCA in Kombination mit 5-Fluorouracil (5-FU) auf Darmkrebszellen (CRC). Vier humane CRC-Zelllinien wurden mit DCA oder 5-FU bzw. einer Kombination aus DCA und 5-FU behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay bestimmt. Die Wechselwirkung zwischen DCA und 5-FU wurde nach dem Median-Effekt-Prinzip bewertet. Die Immunzytochemie mit Bromdesoxyuridin (BrdU) wurde durchgeführt, um die Proliferation von CRC-Zellen zu bestimmen. Zellzyklus und Apoptose wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen, und die Expression von mit Apoptose zusammenhängenden Molekülen wurde mittels Western Blot untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass DCA die Lebensfähigkeit von CRC-Zellen hemmte und in Kombination mit 5-FU eine synergistische Antiproliferation bewirkte. Darüber hinaus wurde die Apoptose von CRC-Zellen, die mit DCA und 5-FU behandelt wurden, im Vergleich zu 5-FU allein verstärkt und durch Veränderungen der Proteine Bcl-2, Bax und Caspase-3 nachgewiesen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA einen synergistischen Antitumor-Effekt mit 5-FU auf CRC-Zelllinien in vitro hat.

1. Einleitung

Kolorektales Karzinom ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen weltweit [1]. Neben der Operation stützt sich die Behandlung von Darmkrebs-Patienten in erster Linie auf die Chemotherapie, insbesondere bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs. Unter den Chemotherapeutika für Darmkrebs ist 5-Fluorouracil (5-FU), ein klassisches Chemotherapeutikum, seit mehreren Jahrzehnten die erste Wahl bei der Behandlung von Darmkrebs [2, 3]. 5-FU allein ist jedoch wenig selektiv für den Tumor und hoch toxisch für Knochenmark, Magen-Darm-Trakt und Haut, wenn es in therapeutischer Dosis eingesetzt wird [4].

Stoffwechselanomalien sind eines der entscheidenden Merkmale von Krebs [5]. Bereits in den 1920er Jahren stellte Otto Warburg fest, dass Krebszellen im Allgemeinen die Glykolyse und nicht die oxidative Phosphorylierung zur Energiegewinnung nutzen [6]. Die Umstellung des Stoffwechsels auf anaerobe Atmung durch Glykolyse aus Pyruvat anstelle der Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA durch die Pyruvatdehydrogenase (PDH) im aeroben Glukosestoffwechsel wird somit zu einem bevorzugten Phänotyp des Krebsfortschritts. Die PDH kann bei vielen glykolytischen Phänotypen, einschließlich Krebs, durch die Pyruvatdehydrogenase-Kinase (PDK) inaktiviert werden, während die Hemmung der PDK den Stoffwechsel auf aerobe Oxidation umstellt, was sich als nachteilig für das Tumorwachstum erweist [7].

Dichloracetat (DCA) ist ein prototypischer Inhibitor der mitochondrialen PDK. Durch die Blockierung des Enzyms verringert DCA die Laktatproduktion, indem es den Pyruvat-Stoffwechsel von der Glykolyse zur Oxidation in den Mitochondrien verlagert. Diese Eigenschaft hat dazu geführt, dass DCA zur Behandlung von Störungen der Milchsäureakkumulation getestet wurde [8]. Kürzlich haben Studien gezeigt, dass DCA das Tumorwachstum durch Hemmung der PDK unterdrückt [9-11]. Michelakis und seine Kollegen fanden heraus, dass DCA die Funktion der Mitochondrien wiederherstellte und so die Apoptose wiederherstellte, Krebszellen in vitro abtötete und die Tumore bei Ratten schrumpfen ließ [12].

Die Kombinationschemotherapie ist weit verbreitet. 5-FU wird in der Regel mit anderen antineoplastischen Wirkstoffen und Bestrahlung kombiniert, um seine antitumorale Wirkung zu verstärken. Die klinische Insuffizienz scheint auf die Resistenz von 5-FU und schwere Nebenwirkungen zurückzuführen zu sein. Die starke und selektive Induktion der Apoptose deutet darauf hin, dass der PDK-Inhibitor DCA die hemmende Wirkung von Krebsmedikamenten verstärken und damit die Wirksamkeit der derzeitigen Behandlung übertreffen könnte. Wir haben die kombinierte antitumorale Wirkung von DCA mit 5-FU auf Darmkrebszellen untersucht, in der Hoffnung, eine relativ wirksame und sichere Therapie für die Darmkrebsbehandlung zu finden.


2. Material und Methoden

2.1. Zellen und Regents. Die menschlichen Dickdarmkrebs-Zelllinien LS174T, LoVo, SW620 und HT29 wurden von American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben. Die Zellkulturreagenzien wurden von Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Die Zelllinien wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium oder Leibovitz L-15 Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin in einem 37◦C, 5 % CO2 befeuchteten Inkubator gehalten. 5-FU und DCA wurden von Sigma-Aldrich Co. Ltd. (St. Louis, MO, USA) erworben, in deionisiertem Wasser zu einer Arbeitslösung von 1 mol/L aufgelöst, filtriert und anschließend zur Behandlung mit dem Wachstumsmedium verdünnt.

2.2. Zellviabilitätstest. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test (Sigma-Aldrich) bestimmt. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (5 × 104 Zellen pro Vertiefung) ausgesät und über Nacht unter Standardwachstumsbedingungen von 60 % bis 70 % Konfluenz bebrütet. Die Zellen wurden dann mit DCA allein (Endkonzentration 0-90 mM) oder mit DCA in Kombination mit 5-FU (5-200 μM) behandelt. Nach einer 48-stündigen Behandlung wurden die Zellen bei 37 °C für weitere 4 Stunden mit MTT (20 μl pro Vertiefung) inkubiert und die Absorption bei 490 nm in einem BioRad Model 550 Plattenlesegerät (Hercules, CA, USA) gemessen.

2.3. Analyse der Medikamenteninteraktion. Die Wechselwirkung zwischen DCA und 5-FU wurde mit Hilfe des von Chou und Talalay [13, 14] beschriebenen Median-Effekt-Prinzips analysiert. Das Programm ermöglicht die Berechnung von Kombinationsindizes (CIs), die, wenn sie kleiner als 1, gleich 1 oder größer als 1 sind, Synergismus, Additivität bzw. Antagonismus zwischen zwei Arzneimitteln anzeigen. Die KIs wurden wie folgt berechnet: (Dx)1 und (Dx)2 sind die Konzentrationen von DCA allein oder 5-FU allein, die eine Wachstumshemmung von x % bewirken, und (D)1 und (D)2 sind die Arzneimittelkonzentrationen in Kombination, die das Zellwachstum ebenfalls zu x % hemmen.

(Dx)1 und (Dx)2 wurden nach der Median-Effekt-Gleichung berechnet:


wobei Dm die Median-effect-Dosis, fa der Anteil affected und m die Steigung des Median-effect-Plots ist.

2.4. Zellproliferationstests. Die Immunzytochemie wurde mit Bromdesoxyuridin (BrdU) (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) in vitro durchgeführt. Die Zellen wurden auf Deckgläsern in 12-Well-Platten unter Standardwachstumsbedingungen vermehrt. Nach 24 Stunden wurden verschiedene Konzentrationen von DCA, 5-FU oder eine Kombination der beiden Medikamente zugegeben. Die Zellen wurden 12 Stunden lang in Wachstumsmedien mit 0,5 % FBS serumarm gehalten, um den Zellzyklus in die G0-Phase zurückzusetzen, und dann wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 10 μmol/L BrdU in Wachstumsmedien gepulst. Anschließend wurden die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert, gewaschen und gefärbt.

Die Zellzyklusanalyse wurde indirekt durch Propidiumjodid (PI, BD Bioscience) mittels Durchflusszytometrie (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) bestimmt. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und mit oder ohne 10 mM DCA oder 20 μM 5-FU kultiviert. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) geerntet. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang bei 4 °C mit 70 %igem Alkohol fixiert und zweimal mit Phosphat-Buffer-Salzlösung (PBS) gewaschen. RNAase (100 μL; 1 mg/mL) (BD Bioscience) wurde zugegeben, und die Zellen wurden 30 Minuten lang in einem 37◦C warmen Wasserbad inkubiert. Nach der Färbung mit 200 μL PI (50 μg/mL) wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 4◦C gehalten. Schließlich wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert.

2.5. Apoptose-Assay. Die Apoptose wurde durchflusszytometrisch mit Annexin-V-FITC (BD Bioscience) und PI nachgewiesen. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät. Nach einer 48-stündigen Inkubation mit oder ohne Arzneimittel wurden die Zellen gewaschen und in 0,5 mL PBS buffer resuspendiert. Nach Färbung mit Annexin-V-FITC und PI wurden die Zellen in drei unabhängigen Experimenten durchflusszytometrisch analysiert.

2.6. Western Blot. Die Zellen wurden geerntet und die Gesamtproteine wurden mit RIPA buffer, das Proteaseinhibitoren enthält, extrahiert. Das Gesamtprotein (50 μg) wurde einer 10%igen oder 12%igen SDS/PAGE unterzogen, und die aufgelösten Proteine wurden elektrophoretisch auf PVDF-Membranen (Millipore, Bedford, MA, USA) übertragen. Die Membranen wurden 2 Stunden lang mit 5% fettfreier Milch in TBS buffer mit 0,05% Tween-20 (TBST) bei 4◦C blockiert. Die Membranen wurden dann mit Antikörpern gegen Bax, Bcl-2, Caspase-3 und GADPH über Nacht bei 4◦C inkubiert. Nach dem Waschen in TBST wurden die Membranen 1 Stunde lang mit den jeweiligen sekundären Antikörpern inkubiert.

Anschließend wurden die Membranen 1 Minute lang mit SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA) inkubiert und mit einem Gel Doc XR System (Bio-Rad) abgebildet. Alle Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) bezogen.

2.7. Statistik. Alle Daten sind als Mittelwerte der Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) durchgeführt. Differenzen zwischen den beiden Gruppen wurden wie angegeben mit dem t-Test für gepaarte Stichproben oder dem t-Test für unabhängige Stichproben (zweiseitig abgesichert) ermittelt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. P < .05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Lebensfähigkeit von CRC-Zellen, die mit DCA allein oder in Kombination mit 5-FU behandelt wurden. Um die Wirkung von DCA auf CRC-Zellen zu bestimmen, wurden die Zellen 48 Stunden lang mit DCA (0-90 mM) behandelt. Das Ergebnis zeigte, dass die hemmende Wirkung dosisabhängig war. Wie in Abbildung 1 dargestellt, war die Hemmung der Lebensfähigkeit der mit 50 mM DCA behandelten Krebszelllinien

wie folgt: SW620 (46,73% ± 5 ,21%), LoVo (30,94% ± 3,57%), LS174t (54,59% ± 3 ,93%) und HT29 (55,31% ± 3,35%). Wir behandelten die Zellen mit 5-FU (20-100 μM) und stellten fest, dass die Lebensfähigkeit von SW620, LoVo und LS174t signifikant gehemmt wurde, mit Ausnahme von HT29, dessen Lebensfähigkeit unter 80 μM 5-FU nicht offensichtlich gehemmt wurde. Bei gleichzeitiger Behandlung mit diesen beiden Medikamenten wurde die Lebensfähigkeit der oben genannten CRC-Zellen im Vergleich zu DCA oder 5-FU allein deutlich verringert (IC50-Werte sind in Tabelle 1 aufgeführt).

3.2. Synergistische Effekte von DCA in Kombination mit 5-FU in CRC-Zelllinien. Die Lebensfähigkeit von CRC-Zellen wurde in Gegenwart von 5-FU und DCA verringert. DCA verstärkte die hemmenden Wirkungen von 5-FU auf CRC-Zellen, und der Einfluss von DCA auf die Wirkungen von 5-FU war dosisabhängig (Abbildung 1). Die Wechselwirkung zwischen 5-FU und DCA wurde mit der Methode der medianen Wirkungen analysiert. Die Kombination von DCA und 5-FU führte zu synergistischen oder additiven Effekten, abhängig vom Bereich der Zellabtötungsrate (Fa). Alle vier CRC-Zelllinien zeigten synergistische Effekte mit 5-FU und DCA. Der Synergismus war statistisch signifikant bei LS174t bei Hemmhöhen von 50 % und 80 %, wobei CI-Werte von 0,46-0,61 erreicht wurden, und bei der HT-29-Zelllinie bei Hemmhöhen von 50 und 80 % mit CI-Werten im Bereich von 0,42 bis 0,52. Bei SW620- und LoVo-Zellen lagen die CI-Werte bei einer Hemmschwelle von 50 % und 80 % bei 0,64-0,75 bzw. 0,75-0,94 (Abbildung 2).

3.3. DCA steigerte die Wirksamkeit der antiproliferativen Wirkung von 5-FU. Um zu bestätigen, dass die verringerte Lebensfähigkeit der Zellen auf eine verminderte Proliferation zurückzuführen ist, wurden Immunzytochemie und Durchflusszytometrie eingesetzt. Die Zellen wurden mit 10 mM DCA in Kombination mit 20 μM 5-FU behandelt. Wie erwartet zeigten die mit DCA behandelten Zellen eine geringere Proliferation als die unbehandelten Zellen. Die Anzahl der BrdU-positiven Zellen bei vier CRC-Zelllinien nach der Behandlung mit 5-FU und DCA betrug 11,4 ± 2,12, 13,55 ± 3,10, 12,84 ± 1,34 bzw. 18,83 ± 1,45 und war damit geringer als bei der Behandlung mit 5-FU oder DCA allein (P < .01, siehe Tabelle 2). Darüber hinaus verstärkte die Behandlung mit DCA den Zellzyklus-Stillstand in der G1-Phase. Bei der Behandlung mit DCA und 5-FU wurden mehr Zellen in der G1/S-Phase blockiert als bei der Behandlung mit DCA oder 5-FU allein (Abbildung 3).

3.4. Erhöhte Apoptose durch DCA in Kombination mit 5-FU in CRC-Zellen. Zur weiteren Untersuchung der verringerten Lebensfähigkeit von CRC-Zellen, die mit einer Kombinationsbehandlung behandelt wurden, wurde die Apoptose mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Wie in Abbildung 4 dargestellt, erhöhte DCA allein den Anteil der apoptotischen CRC-Zellen. Bei Behandlung mit 10 mM DCA betrugen die Apoptoseraten von vier CRC-Zelllinien 15,72 ± 1 ,63 %, 11,32 ± 0 ,74 %, 9,77 ± 0 ,53 % bzw. 14,52 ± 1 ,00 %, während die Apoptoseraten Tabelle 1: IC50-Werte (Konzentrationen, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen um 50 % zu verringern) wurden mit Hilfe linearer oder nichtlinearer Regression (dreiparametrische Hill-Funktion) berechnet (R2> 0 ,9). Sie sind als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten angegeben. IC50-Werte der untersuchten Arzneimittel für die Wachstumshemmung verschiedener Zelllinien (die Zellen wurden 48 Stunden lang mit den Arzneimitteln inkubiert).

Tabelle 2: SW620-, LoVo-, LS174t-, HT29-Zellen und 293T-Kontrollzellen ohne Krebs wurden 48 Stunden lang mit 10 mM DCA und 20 μM 5-FU allein oder in Kombination behandelt und dann mit BrdU gepulst. Die Zellen wurden dann geerntet und angefärbt, und die Anzahl der BrdU+-Zellen wurde als mittlere Anzahl der positiven Zellen in acht verschiedenen Sichtfeldern in einem Bild (400-fache Vergrößerung) berechnet. Diese Berechnung wurde dreimal wiederholt. ∗P< .05, verglichen mit der Kontrolle. BrdU+-Zellen in verschiedenen Medikamentenbehandlungen (%, Mittelwert ± SD).

waren 9,14 ± 119%, 8,82 ± 0 ,41%, 10,31 ± 0 ,71% und 7,27±0 ,96% mit 5-FU. Wenn die Kombination von DCA und 5-FU angewendet wurde, war die Apoptoserate viel höher als 5-FU oder DCA allein (P < .05), was darauf hindeutet, dass der apoptotische Effekt durch die Kombination von DCA und 5-FU erhöht wurde (Abbildung 4).

3.5. Veränderungen an Apoptose-assoziierten Molekülen, die durch DCA und 5-FU stimuliert wurden. Um zu bestätigen, dass die durch die Kombinationstherapie induzierte erhöhte Apoptose auf eine veränderte Expression von Apoptose-assoziierten Molekülen zurückzuführen ist, wurde ein Western-Blot-Assay durchgeführt. In Abbildung 5 zeigen die Ergebnisse, dass 5-FU oder DCA die Expression von Bcl-2 in vier CRC-Zelllinien im Vergleich zu PBS-Kontrollen verringerte, und die Kombination von DCA und 5-FU verringerte die Expression von Bcl-2 im Vergleich zu DCA oder 5-FU allein erheblich. Umgekehrt waren die Expressionen von Bax und Caspase-3 in den vier CRC-Zelllinien, die mit der Kombination von DCA und 5-FU behandelt wurden, im Vergleich zu ihrer alleinigen Anwendung signifikant erhöht. Der deutlichste Anstieg der Bax-Expression wurde in LS174t-Zellen festgestellt, während in LoVo die Caspase-3-Expression am stärksten anstieg (Abbildung 5).

4. Diskussion

In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, dass DCA nicht nur die Lebensfähigkeit und Proliferation von Zellen reduziert, sondern auch eine synergistische Antitumoreffizienz mit dem Chemotherapeutikum 5-FU in CRC-Zellen in vitro aufweist.

Abbildung 1: Lebensfähigkeit von vier CRC-Zelllinien als Reaktion auf die Behandlung mit Dichloracetat (DCA) und 5-Fluorouracil (5-FU). Die Lebensfähigkeit von SW620, LoVo, LS174t und HT29 wurde durch verschiedene Konzentrationen von 5-FU und DCA allein oder in Kombination deutlich verringert. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt; ∗P < .05.

In der Zwischenzeit hat DCA keine signifikanten Auswirkungen auf nicht krebsartige Zellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass DCA-induzierte Apoptose zu seiner synergistischen Antitumor-Wirkung beiträgt. Im Vergleich zu DCA oder 5-FU allein fördert die kombinierte Anwendung dieser beiden Medikamente die Apoptose von CRC-Zellen. 5-FU ist ein Chemotherapeutikum, das zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird, darunter Dickdarm-, Brust-, Speiseröhren- und Magenkrebs [15]. Die mit 5-FU verbundene Toxizität ist jedoch ein ernstes und häufiges Problem für viele Krebspatienten, wobei Myelosuppression und gastrointestinale Toxizität die am häufigsten beobachteten Nebenwirkungen sind [16]. Die klinische Aktivität von 5-FU ist bei Standarddosen bescheiden, und die Dosierung wird im Allgemeinen durch das Sicherheitsprofil begrenzt. Infolgedessen stehen wir in der Regel vor dem Dilemma, Entscheidungen über die therapeutische Dosis von 5-FU treffen zu müssen. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die klinische Wirksamkeit von 5-FU zu verbessern, wie z. B. die biochemische Modulation [17], die Änderung des Verabreichungsschemas [18] und die Verwendung einer Kombinationstherapie [19-22]. DCA ist ein geruchloses, farbloses, kostengünstiges, relativ ungiftiges, kleines Molekül. Es wird seit 1969 klinisch zur Behandlung der Laktatazidose eingesetzt, indem es die Fähigkeit der Mitochondrien zur Energiegewinnung steigert und die Milchsäureakkumulation verringert [23].

Abbildung 2: Mittelwerte des Kombinationsindex bei den affektierten Fraktionen von 50 % (IC50) und 80 % (IC80), wenn 5-Fluoruracil (5-FU) mit Dichloracetat (DCA) in HT-29-, LoVo-, LS174t- und SW620-Zellen kombiniert wurde. Dargestellt sind die mittlere IC50 und IC80 ±SD(n=3). Ein CI-Wert, der signifikant unter 1 liegt, bedeutet Synergie, ein CI, der nicht signifikant von 1 abweicht, bedeutet Addition, und ein CI, der signifikant über 1 liegt, bedeutet Antagonismus; ∗P< .05.
Abbildung 3: Veränderungen der Zellzyklusprogression in SW620-, LoVo-, LS174t- und HT29-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit 5-Fluorouracil (5-FU) und Dichloracetat (DCA) allein oder in Kombination. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar(n = 3 ). Die aus FACS gewonnenen Daten wurden mit SPSS13.0 analysiert; ∗P< .05.

DCA wird als potenzielles Krebstherapiesystem betrachtet, seit eine kanadische Gruppe herausgefunden hat, dass es bei verschiedenen Krebsarten, darunter Lungen-, Brust- und Gehirntumoren, eine Rückbildung bewirkt [24, 25]. Wenn es Krebszellen verabreicht wurde, schalteten die Zellen von der Glykolyse auf die mitochondriale Energieproduktion um. Darüber hinaus helfen funktionierende Mitochondrien den Zellen, funktionelle Anomalien zu erkennen und den Zelltod auszulösen, da sie bei bestimmten Krebsarten das Tumorwachstum hemmen und die Apoptose einleiten. In der vorliegenden Studie fanden wir denselben lebensfähigkeitshemmenden Effekt bei Darmkrebs, der dosisabhängig war und mit unterschiedlichen Graden der Tumordifferenzierung variierte.

Abbildung 4: Induktion der Apoptose in SW620-, LoVo-, LS174t- und HT29-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit 5-Fluoruracil (5-FU) und Dichloracetat (DCA) allein oder in Kombination. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD(n = 3 ) dar; ∗P< .05.

Die Ergebnisse zeigten auch, dass niedrig dosiertes DCA einen synergistischen Effekt mit dem Chemotherapeutikum 5-FU beim Stoppen des Wachstums von CRC-Zellen ausübt, was quantitativ nach der Chou-Talalay-Methode analysiert wurde.

Die Ergebnisse der Zellproliferation zeigten auch, dass DCA die antiproliferative Wirkung von 5-FU verstärkte. Die Zahl der BrdU-positiven Zellen ging bei der Behandlung mit 5-FU oder DCA zurück, während die BrdU-gefärbten Zellen bei der Behandlung mit einer Kombination aus 5-FU und DCA im Vergleich zur alleinigen Anwendung deutlich abnahmen. Die Wachstumshemmung der CRC-Zellen ging mit einem Stillstand des Zellzyklus einher. Die Kombination von DCA und 5-FU induzierte bei CRC-Zelllinien einen Zellzyklus-Stillstand in der G1/S-Phase, während der von 5-FU induzierte Stillstand in der G1-Phase nicht offensichtlich war. Die Induktion des Zellzyklusstillstands kann auf die Hemmung der Fähigkeit zur DNA-Synthese oder -Reparatur zurückzuführen sein, was zur Apoptose der Zellen führen kann.

DCA scheint biochemische Wirkungen zu entfalten, die mit der Umkehrung des Warburg-Effekts und der Abtötung von Krebszellen vereinbar sind. Wir fanden heraus, dass DCA die Apoptose von CRC-Zellen auslöste, was mit den früheren DCA-Studien übereinstimmt. Wichtig ist, dass die Kombination von DCA mit 5-FU die Anzahl der apoptotischen Zellen im Vergleich zu 5-FU allein erhöhte, was zeigt, dass DCA das Zellwachstum über Apoptose hemmte.

Viele Faktoren, die Apoptose vermitteln, konvergieren, um den kritischen Effektor Caspase-3 zu aktivieren, der als Schlüsselprotease der Caspase-Familie bei der Apoptose von Säugetierzellen gilt [26]. Sie liegt immer als inaktiver 23 kD-Vorläufer im Zytoplasma vor, der während der Apoptose aktiviert wird und an der durch mehrere Faktoren ausgelösten Apoptose beteiligt ist. Der Caspase-abhängige Apoptoseweg umfasst hauptsächlich den Mitochondrien-Weg, den Todesrezeptor-Weg und den Weg des endoplasmatischen Retikulums [27].

Abbildung 5: Effekte von 5-Fluorouracil (5-FU) und Dichloracetat (DCA) auf die Expression von Apoptose-assoziierten Molekülen. Die Bcl-2-Expression wurde durch DCA in SW620-, LoVo-, LS174t- und HT29-Zellen signifikant verringert. Die Expressionsniveaus von Bax und Caspase-3 waren nach der Exposition mit 5-FU und DCA im Vergleich zur Kontrolle höher

Der Mitochondrien-Weg wird durch die Bcl-2-Proteinfamilie kontrolliert und reguliert [28, 29], die in zwei Teile unterteilt ist: die antiapoptotischen Mitglieder (Bcl-2) und die proapoptotischen Mitglieder (Bax) [30]. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass Bcl-2 die Apoptose hemmt, indem es die Entfernung von Bax zur äußeren Mitochondrienmembran verhindert [31]. Wir untersuchten die Expression von Caspase-3, Bcl-2 und Bax auf Proteinebene, und das Ergebnis des Western Blot zeigte, dass die Expression von Caspase-3 und Bax erhöht war, während die Expression von Bcl-2 in der Kombination von DCA mit 5-FU-Behandlung im Vergleich zu den Einzelbehandlungen verringert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch die Kombination von DCA und 5-FU induzierte Apoptose mit dem Caspase-abhängigen Mitochondrien-Weg zusammenhängen könnte. Frühere Untersuchungen legten nahe, dass die Induktion der Apoptose durch DCA aus der Rückkehr der Dysfunktion der Mitochondrien und des NFAT-Kv1.5-Wegs resultierte [9, 12], die sich auf den gleichen Punkt wie die vorliegende Studie konzentrierten, nämlich die durch Mitochondrien vermittelte Apoptose.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Nr. 30873015) unterstützt. J. Tong und G. Xie trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

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