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Wolfgang Fiebiger1, Ulrike Olszewski2, Ernst Ulsperger2, Klaus Geissler2, Gerhard Hamilton2,3

1 Abteilung für Innere Medizin I, Abteilung für Onkologie, Krankenhaus St. Pölten, St. Pölten, Österreich2
Ludwig Boltzmann Cluster of Translational Oncology, C/o Balderichgasse, 26/13, 1170 Wien, Österreiche-mail
:
[email protected]. Hamilton3
Abteilung für Chirurgie, Medizinische Universität Wien, Wien, ÖsterreichEingegangen

: 1. April 2010
Angenommen: 6. Juni 2010







Zusammenfassung

Einleitung: Die Chemotherapie bei fortgeschrittenen, gut differenzierten Karzinoiden ist durch geringe Ansprechraten und eine kurze Dauer des Ansprechens gekennzeichnet. In der vorliegenden Studie sollte die In-vitro-Aktivität neuartiger Chemotherapeutika auf Platinbasis in Kombination mit Dichloracetat (DCA), einem Sensibilisator für Apoptose, gegen Lungenkarzinoid-Zelllinien untersucht werden.

Methoden: Drei permanente Zelllinien (UMC-11, H727 und H835) wurden 14 verschiedenen etablierten zytotoxischen Medikamenten und den neuartigen platinbasierten Verbindungen Satraplatin, JM118 und Picoplatin in Kombination mit DCA ausgesetzt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit einem auf Tetrazolium basierenden Farbstoffassay gemessen.

Ergebnisse: Mit Ausnahme der hoch chemoresistenten UMC-11-Linie waren die Karzinoid-Zelllinien (H727, H835) in vitro empfindlich gegenüber den meisten Chemotherapeutika. Unter den platinhaltigen Medikamenten zeigten Carboplatin und Oxaliplatin die höchste Wirksamkeit. H835-Zellen, die als multizelluläre Sphäroide wuchsen, waren im Vergleich zu Einzelzellsuspensionen 2,7-8,7-mal resistenter gegenüber Picoplatin, Satraplatin und dessen Metaboliten. DCA (10 mM) hemmte das Wachstum von UMC-11-Zellen um 22 % und sensibilisierte diese hochresistenten Zellen für Carboplatin, Satraplatin und JM118 um das 1,4- bis 2,4-fache.

Schlussfolgerung: Die hochresistenten UMC-11-Lungenkarzinoidzellen sind empfindlich gegenüber Carboplatin, Oxaliplatin und dem Satraplatin-Metaboliten JM118, doch scheint das multizelluläre sphäroidale Wachstum, wie es bei der H835-Zelllinie und den Lungentumoren beobachtet wurde, die Chemoresistenz deutlich zu erhöhen. Die Aktivität von Carboplatin und JM118 wird in Kombination mit dem Apoptose-Sensibilisator DCA, der die mitochondriale Atmung gegenüber der aeroben Glykolyse fördert, deutlich und spezifisch erhöht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Satraplatin unter den neuen Platinmedikamenten das Potenzial für die Behandlung von Lungenkarzinoiden hat und DCA die Zytotoxizität ausgewählter Platinmedikamente potenziert.


Schlüsselwörter: Karzinoid; Chemosensitivität; Medikamentenresistenz; Platin-Komplex; Picoplatin; Satraplatin; Dichloracetat


EINLEITUNG

Karzinoide entstehen aus enterochromaffinen Zellen des neuroendokrinen Zellsystems, das im Körper weit verbreitet ist [1-3]. Diese eher seltenen Tumoren haben eine Inzidenz von 2,0-2,5 Fällen pro 100.000 Menschen für klinisch auffällige Karzinoide [4]. Karzinoide des Vorderdarms machen 20 % aller Karzinoidtumoren aus und umfassen neben Magen- und Duodenalkarzinoiden auch Thymus- und Lungenkarzinoide (die 2 % der primären Lungenkarzinome ausmachen) [5]. Je nach ihren histologischen Merkmalen werden diese heterogenen Tumoren entweder als gut differenzierte neuroendokrine Tumoren mit kleinen Zellen und regelmäßigen Kernen (typisches Karzinoid) oder als gut differenzierte neuroendokrine Karzinome mit Kernatypien und nekrotischen Bereichen (atypisches Karzinoid) klassifiziert [6, 7]. Das Karzinoid-Syndrom“, das durch die Sekretion vasoaktiver Substanzen ausgelöst wird, tritt bei weniger als 5 % der pulmonalen Karzinoide auf [8]. Zwischen 13 und 22 % der Patienten haben zum Zeitpunkt der Vorstellung Fernmetastasen [4]. Zu den primären Diagnoseverfahren gehören biochemische Tests, insbesondere die Analyse von Serotonin und 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) im Urin. Die empfindlichste Technik zur Lokalisierung der Tumoren ist die Somatostatinrezeptor-Szintigraphie, ergänzt durch eine CT zur Darstellung von Lebermetastasen und eine begleitende Biopsie zur histopathologischen Verifizierung [9]. Da mehr als 80 % der Karzinoidtumoren den Somatostatinrezeptor Typ 2 exprimieren, kann 111-Indium-DTPA-Octreotidals Tracer möglicherweise eine Vorhersage über den Nutzen einer bevorstehenden Somatostatin-Analogtherapie ermöglichen [10, 11].

Eine chirurgische Heilung von Lungenkarzinoid-Patienten kann durch eine Resektion erreicht werden, aber ein Teil der Tumoren führt innerhalb von zwei bis vier Jahren nach der Primäroperation zu einer weitreichenden Metastasierung [12]. Im Gegensatz zu den eher indolenten, gut differenzierten neuroendokrinen Tumoren, die in weniger als 15 % der Fälle Metastasen bilden und eine Fünfjahresüberlebensrate von über 90 % aufweisen, sind die gut differenzierten neuroendokrinen Karzinome aggressiver und bilden in 30 bis 50 % der Fälle Metastasen und haben eine Fünfjahresüberlebensrate von 40 bis 60 % [1, 2, 13]. Patienten mit bösartigen Karzinoiden haben eine Fünfjahresüberlebensrate von etwa 20 % mit einer mittleren Überlebenszeit von zwei Jahren, wenn Lebermetastasen vorhanden sind [14-16]. Die medikamentöse Behandlung der metastasierten Erkrankung umfasst Somatostatin-Analoga, α-Interferone und Chemotherapie [1, 17].

Aufgrund der Seltenheit dieser Tumoren sind die klinischen Studien in der Regel klein und weisen unterschiedliche Einschlusskriterien und Studiendesigns auf [1, 16]. Grundsätzlich kann eine Chemotherapie für Patienten mit progredienter Erkrankung unter nicht-zytotoxischer Therapie in Betracht gezogen werden, sofern sie mit erheblichen Symptomen und einer schlechten Prognose verbunden ist. Doxorubicin, 5-Fluorouracil (5-FU), Dacarbazin, Streptozotocin, Cyclophosphamid, Cisplatin und Etoposid wurden als Einzelwirkstoffe und in Kombinationen eingesetzt, die nur für kurze Zeiträume zu Ansprechraten von weniger als 20 % führten und daher nicht für die klinische Routinepraxis empfohlen wurden [1, 3, 16-18].

In der vorliegenden Studie haben wir die In-vitro-Aktivität neuerer Chemotherapeutika, darunter Gemcitabin, Camptothecin, Oxaliplatin und Paclitaxel, im Vergleich zu den derzeit für die Chemotherapie verwendeten zytotoxischen Medikamenten an den drei permanenten Lungenkarzinoid-Zelllinien UMC11, H727 und H835 getestet. Lungenkarzinoide sind eng mit dem kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC) verwandt, der hauptsächlich mit einer Kombination aus Cisplatin und Etoposid behandelt wird [3,19]. Platin-basierte Medikamente der dritten Generation, wie Satraplatin und Picoplatin, werden derzeit in klinischen Studien für SCLC untersucht und könnten auch gegen Lungenkarzinoide wirksam sein [20]. Daher werden das orale Prodrug Satraplatin [JM216; Bisacetatoammin-Dichlorido-Cyclohexylamin-Platin(IV)], seine aktiven Metaboliten JM149 [cis-Ammin-Dichlorido (Cyclohexylamin) Dihydroxidoplatin(IV)] und JM118 [cis-Ammin-Dichlorido-Cyclohexylamin-Platin(II)] sowie Picoplatin [JM473, ZD-0473, AMD-473; cis-Ammindichlorido-2-Methylpyridin-Platin(II)] wurden in vitro auf ihre zytotoxische Wirksamkeit bei den drei Lungenkarzinoid-Zelllinien untersucht. Es wird erwartet, dass die Wirksamkeit der Platinkomplexe in Kombination mit Dichloracetat (DCA), das auf die Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase abzielt, weiter verbessert wird. Daher wurde die additive Wirkung dieser Verbindung auf die Zytotoxizität der Platinwirkstoffe weiter untersucht [21].

Materialien und Methoden

Chemikalien und Zelllinien
Gemcitabin wurde von Eli Lilly (London, UK) bezogen, Dacarbazin von Medac (Hamburg, Deutschland), Oxaliplatin von Sanofi (Paris, Frankreich), und alle anderen Medikamente stammten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Satraplatin und seine Metaboliten JM149 und JM118 sowie Picoplatin wurden von Chiracon (Luckenwalde, Deutschland) kundenspezifisch synthetisiert. Natrium-DCA wurde als 1 M Stammlösung hergestellt. Die pulmonalen Karzinoid-Zelllinien UMC-11, H727 und H835 des National Cancer Institute (NCI) wurden von der American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erworben. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 4 mM Glutamin (Seromed, Berlin, Deutschland) ergänzt wurde. UMC-11- und H727-Zellen wurden durch Trypsinisierung (2,5%ige Trypsin/EDTA-Lösung, Boehringer Mannheim, Deutschland) subkultiviert, und H835-Zellen, die in Suspension wachsen, wurden durch Austausch des Mediums aufrechterhalten.

Zellzyklus-Verteilung und Verdopplungszeit-Assays
Zur Analyse der Zellzyklus-Verteilung wurden Aliquots der Zellkulturen mit PBS gewaschen, in 100 µl PBS resuspendiert und mit 1 ml 70%igem Ethanol bei -20°C für 30 Minuten fixiert. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert, mit PBS gewaschen und mit einer Lösung von 20 µg/ml Propidiumiodid (PI) in 0,5 % Triton X100/PBS, ergänzt mit 5 µg/ml RNAse A, für 24 h bei Raumtemperatur gefärbt. Die Histogramme wurden mit einem FACS Scan-Durchflusszytometriesystem (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) aufgenommen, und die Zellzyklusverteilung wurde mit der Multicycle AV-Software (Phoenix, San Diego, CA, USA) berechnet. Die Verdopplungszeiten der Zelllinien wurden durch tägliche Messungen der Zellzahlen von drei unabhängigen Kulturen an sechs aufeinanderfolgenden Tagen mit einem Mikrozellenzähler (Sysmex, Tokio, Japan) bestimmt. H835-Zellcluster wurden durch Trypsinbehandlung dispergiert, um einzelne Zellsuspensionen für die Zählung zu erhalten.

Zellproliferationstest
Die Zellen wurden geerntet, gezählt und auf Mikrotiterplatten in 100 µl Medium in einer Dichte von 1×104 Zellen/Vertiefung verteilt. Geeignete Verdünnungen der Prüfsubstanzen wurden zu einem Gesamtvolumen von 200 µl/Vertiefung hinzugefügt und die Platten vier Tage lang unter Gewebekulturbedingungen bebrütet. Stammlösungen der Verbindungen wurden entweder in 70%igem Ethanol oder Dimethylsulfoxid hergestellt und für die Tests mehr als 100-fach verdünnt. Bei allen Tests wurden Lösungsmittelkontrollen durchgeführt. Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden durch Bewertung der Zellproliferation bei zweifacher Wirkstoffverdünnung in dreifacher Ausführung erstellt und für die Berechnung der IC50-Werte verwendet. Das Zellwachstum wurde mit einem modifizierten Tetrazolium-Farbstoff-Assay (MTT; EZ4U, Biomedica, Wien, Österreich) und durch Messung des reduzierten Formazan-Farbstoffs bei 450 nm Wellenlänge quantifiziert (Mediumkontrolle auf 100 % Proliferation eingestellt).

Statistische Analyse
Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurden mit Hilfe der ANOVA und des Mann-Whitney-U-Tests ermittelt. p<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden mit der Software Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, USA) durchgeführt. Die Verdoppelungszeiten der Zelllinien wurden mit einem Online-Rechner analysiert (Roth V. 2006, erhältlich bei ).

Ergebnisse

Zellzyklusverteilung und Verdoppelungszeit der drei Lungenkarzinoid-Zelllinien
Die Prozentsätze der Karzinoidzellen in bestimmten Zellzyklusphasen wurden durch PI-Färbung fixierter Zellen aus subkonfluenten Kulturen, durchflusszytometrische Analyse und Kurvenanpassung der resultierenden Histogramme bestimmt (Abb. 1). Die Zelllinien wiesen einen Anteil von Zellen in der S-Phase von mehr als 17 % und in der G0/1-Phase von weniger als 54 % der Gesamtzellpopulation auf. Die S-Phasen-Anteile der Karzinoid-Zelllinien UMC-11, H727 und H835 unterschieden sich nicht signifikant. Die Verdopplungszeiten der Zelllinien wurden durch tägliches Zählen der Zellen von sechs unabhängigen Kulturen bestimmt und betrugen 20,8 Stunden für H727, 27,0 Stunden für UMC-11 bzw. 35,7 Stunden für H835.

Abb. 1 Zellzyklusverteilung der Karzinoidzelllinien. Mittlere Prozentsätze (Mittelwert±SEM, n=3) der Zellen in der G0/1-, S- und G2/M-Phase wurden durch PI-Färbung der DNA bestimmt. Die Unterschiede in den Fraktionen der S-Phase waren statistisch nicht signifikant

Chemosensitivitätstests mit klinisch etablierten Medikamenten
Die Zellen wurden den einzelnen Chemotherapeutika in vitro ausgesetzt, und die IC50-Werte wurden anhand von Dosis-Wirkungs-Beziehungen berechnet, nachdem die überlebenden Zellen mit MTT-Tests quantifiziert worden waren. Alle Tests wurden über vier Tage durchgeführt, mit Ausnahme der Tests mit Dacarbazin über sieben Tage, da der aktive Metabolit (5-Amino-Imidazol 4-Carboxamid) in vitro nur langsam gebildet wird. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Chemosensitivitätstests für 14 Arzneimittel, die gegen die drei Karzinoidzelllinien getestet wurden. Die IC50-Werte wurden mit den folgenden individuell erreichbaren Spitzenplasmakonzentrationen (PPC) verglichen: Vinblastin 8,5 ng/ml [22], Taxol 3,5±1,4 µM [23], Camptothecinderivat Topotecan (TPT) 65±20 nM [24], 5-FU 0,6 µM/l [25], Doxorubicin 73,5±26.4 ng/ml [26], Gemcitabin 50 µM [27], Tamoxifen 0,4 µM [28], Cisplatin 6,3 µM [29], Oxaliplatin 9,1±1.25 µM [30], Carboplatin 105 µM [31], Mitomycin C 345±151 ng/ml [32], Streptozotocin 100±10 µg/ml [33], Etoposid 5,6±2,5 µg/ml [34] und Dacarbazin 8,6±0,6 µg/ml [35]. UMC-11-Zellen wiesen eine ausgeprägte Chemoresistenz gegenüber den meisten Medikamenten auf, mit Ausnahme von Vinblastin, Camptothecin, Oxaliplatin, Carboplatin, Mitomycin C und Dacarbazin, wo die IC50-Werte für die jeweiligen Medikamente unter PPC lagen. Die beiden anderen permanenten Zelllinien H727 und H835 waren für 10/14 bzw. 9/14 der hier verwendeten Arzneimittel empfindlich. Im Vergleich zur H835-Zelllinie war die H727-Linie, bei der es sich um einen p53-Wildtyp handelt, zusätzlich empfindlich gegenüber Dacarbazin. Alle drei Zelllinien schienen ähnlich empfindlich auf Oxaliplatin und Carboplatin zu reagieren, im Gegensatz zu ihrer hohen Resistenz gegenüber Cisplatin.

DrogeKarzinoid-Zelllinie der LungeLungenkarzinoid-ZelllinieLungenkarzinoid-ZelllinieLungenkarzinoid-Zelllinie
UMC-11 (IC50)H727 (IC50)H835 (IC50)PPC
Vinblastin ( ng/ml) 2.0±0.358.0±2.72.0±0.38.5
Taxol (ng/ml) 10.0±4.4 8.0±3.8 9.0±3.9 1.0
Camptothecin (nM ) 18.0±5.00.5±0.16.5±4.3(65)
5-Fluorouracil (µM ) 30.0±4.620.0±5.945.0±8.70.6
Doxorubicin (nM) 370.7±72.424.1±5.273.1± 2.473.5
Gemcitabin (nM) 833.3±10330.0±6.730.0±2050.0
Tamoxifen (µM) 9.0±3.325.0±8.17.0±2.40.4
Cisplatin (µM) 33.3±1583.3±2133.3±7.06.3
Oxaliplatin (µM ) 5.0±0.2511.3±5.36.3±0.519.1
Carboplatin (µM) 36.4±7.13.4±0.435.8±9.9105
Mitomycin (ng/ml)156.0±1510.0±3.035.0±9.0345.0
Streptozotocin (µg/ml) 180±3350±2160±19100
Etoposid (µg/ml) 45.0±12.30.13±0.030.25±0.025.6
Dacarbazin (µg/ml)4.2±2.32.2±1.316.5±3.98.6
Tabelle 1 Chemosensitivität der drei Lungenkarzinoid-Zelllinien gegenüber 14 gängigen zytotoxischen
MedikamentenIC50-Werte sind als Mittelwert±SD (n=3) angegeben, und zum Vergleich sind klinische PPC dargestellt

Zytotoxische Aktivität von Platin-Arzneimitteln der dritten Generation in Lungenkarzinoid-Zelllinien
Die neuen Platin-Arzneimittel Satraplatin und Picoplatin wurden mit den drei Karzinoid-Zelllinien in vitro auf ihre Zytotoxizität getestet. In vivo wird Satraplatin schnell in JM149 und den hochaktiven Metaboliten JM118 umgewandelt, die in diesen Chemosensitivitätstest einbezogen wurden (Abb. 2). Die erreichbaren PPCs betrugen 15,9 µM für Picoplatin, 1,4 µM für Satraplatin bzw. 2,2 µM für JM118. H835-Zellen wurden entweder als einzelne Zellsuspension oder als kugelförmige Aggregate mit einem Durchmesser von etwa 150-250 µM getestet. Die Chemosensitivitätstests zeigten, dass Picoplatin und JM118 in H727- bzw. H835-Zellen IC50-Konzentrationen unterhalb ihrer PPCs erreichten. Darüber hinaus erwies sich H727 als empfindlich gegenüber JM149. Als multizelluläre Sphäroide gezüchtete H835-Zellen waren resistenter gegenüber Picoplatin (2,7-fach), JM216 (7,9-fach), JM149 (4,3-fach) und JM118 (8,7-fach).

Abb. 2 Chemosensitivität der Lungenkarzinoid-Zelllinien gegenüber neuartigen Medikamenten auf Platinbasis. Die Spalten zeigen die IC50-Werte (Mittelwert±SD, n=3) für die einzelnen Arzneimittel und Zelllinien. Die H835-Zellen wurden entweder als Einzelzellsuspensionen (H835) oder als multizelluläre Sphäroide (H835 Sphäroid) getestet. Alle Unterschiede zwischen den IC50-Werten der einzelnen Platinwirkstoffe und den verschiedenen Zelllinien und H835-Sphäroiden sind statistisch signifikant

Zytotoxizität von Kombinationen platinbasierter Medikamente mit DCA in Lungenkarzinoid-Zelllinien
Chemosensitivitäts-Tests wie oben beschrieben wurden außerdem mit der resistenten UMC-11-Zelllinie entweder in Abwesenheit oder in kontinuierlicher Anwesenheit von 10 mM DCA durchgeführt (Abb. 3). Diese DCA-Konzentration verringerte die Proliferation der UMC-11-Zellen um 22,2±3,2 % und senkte die IC50-Werte (Sensibilisierungsfaktor: Mittelwert±SD der IC50 der Platinverbindung im Medium allein geteilt durch die IC50 der entsprechenden Platinverbindung im mit 10 mM DCA ergänzten Medium; IC50 der Platinverbindung in Gegenwart von DCA) für Carboplatin (2.41±0.19; 13.1±0.2 µM), Satraplatin (1.36±0.11; 7.8±0.4 µM), Metabolit JM118 (1.75±0.18; 1.22±0.05 µM) und Oxoplatin (2.18±0.33; 4.8±0.14 µM). Im Gegensatz dazu zeigten Cisplatin (1,22±0,9; 25,3±0,75 µM), Oxaliplatin (1,01±0,03; 4,4±0,16 µM) und Picoplatin (1,04±0,02; 28,6±0,6 µM) eine geringe oder gar keine Modulation ihrer Zytotoxizität durch DCA. Oxoplatin [cis, trans, cis-Diammin-Dihydroxido-Dichlorido-Platin(IV)] wird derzeit als orales Platinmedikament untersucht.

Abb. 3 Modulation der Chemosensitivität von UMC-11-Lungenkarzinoidzellen gegenüber Platin-basierten Medikamenten durch 10 mM DCA. Die Daten sind das Verhältnis der IC50-Werte in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von DCA (Mittelwert±SD, n=3). Die Wirkungen von DCA sind statistisch signifikant, außer bei der Kombination mit Oxaliplatin bzw. Picoplatin

Diskussion

Die erfolgreiche Behandlung bösartiger Karzinoidtumoren erfordert einen multimodalen Ansatz, der die Resektion, die Tumorverkleinerung durch Ligatur der Leberarterie bei Lebermetastasen und die systemische Therapie mit Zytostatika und/oder zytotoxischen Medikamenten umfasst [1-3, 8]. Octreotid und verschiedene langwirksame Somatostatin-Analoga führten zu biochemischen Ansprechraten im Bereich von 30-70 %, aber zu einer objektiven Tumorschrumpfung bei weniger als 10 % der Patienten [36]. Die Chemotherapie von Karzinoidtumoren mit einem einzigen Wirkstoff führte zu sehr niedrigen Ansprechraten, die bei der Doxorubicin-Monotherapie nicht über 20 % lagen [37]. Klinische Studien mit Streptozotocin plus Cyclophosphamid oder 5-FU ergaben keine signifikant besseren Ansprechraten, die zwischen 26 und 33 % lagen [18]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Karzinoide durch die Behandlung mit Somatostatinanaloga und Interferon sowie mit zytotoxischen Medikamenten wie Streptozotocin, Dacarbazin, 5-FU, Cyclophosphamid und Doxorubicin über einen längeren Zeitraum pharmakologisch kontrolliert werden können; die Tumoren gehen jedoch schließlich in einen refraktären Zustand über [3, 16, 38, 39].

Die Zytotoxizität eines breiten Spektrums von Therapeutika wurde hier unter Verwendung der drei permanenten Zelllinien UMC-11, H727 und H835 aus bronchopulmonalen Karzinoiden von Giaccone et al. getestet [40]. H727 und H835 können hauptsächlich als arzneimittelempfindliche Zellen betrachtet werden, die unempfindlich gegenüber Taxol, 5-FU, Cisplatin und Tamoxifen sind. Im Gegensatz dazu wiesen die UMC-11-Zellen eine ausgeprägte Chemoresistenz auf, mit Ausnahme der Empfindlichkeit gegenüber Dacarbazin, Vinblastin, Mitomycin, Carboplatin und Oxaliplatin. Der Vergleich der in vitro ermittelten IC50-Werte der Chemotherapeutika mit den klinisch erreichbaren PPCs ermöglicht eine grobe Abschätzung der zu erwartenden klinischen Wirksamkeit. Die In-vivo-IC50-Werte von Tumorzellen können bei längerer Anwendung eines Medikaments entweder niedriger oder höher sein, wenn niedrigere Gewebekonzentrationen und eine verminderte Zugänglichkeit der Tumorzellen berücksichtigt werden. Obwohl alle drei Zelllinien bei den Messungen der Zellzyklusverteilung eine ähnliche S-Phasenfraktion aufwiesen, unterschieden sich ihre Verdopplungszeiten und betrugen 20,8 bzw. 35,7 Stunden für die chemosensitiven Linien H727 und H835 und 27,0 Stunden für die chemoresistenten UMC-11-Zellen. Diesen Daten zufolge ist die Chemoresistenz der drei Karzinoid-Zelllinien nicht auf Unterschiede in ihrer S-Phasen-Fraktion oder Verdopplungszeit zurückzuführen. Die In-vitro-Ergebnisse für Streptozotocin, Dacarbazin, Cisplatin, Etoposid, 5-FU, Doxorubicin und Tamoxifen stehen in guter Übereinstimmung mit der begrenzten klinischen Aktivität (<30% Ansprechrate) dieser Medikamente bei Patienten mit fortgeschrittenen Karzinoiden [16]. Carboplatin erwies sich in einer klinischen Studie mit Karzinoid-Patienten als unzureichend wirksam; es ist jedoch nicht klar, ob einer dieser Patienten Karzinoide im Vorderdarm hatte [41]. Eine hohe Expression des Proteins der Exzisionsreparatur-Kreuzkomplementgruppe 1 (ERCC1), einer Schlüsselkomponente des Reparaturmechanismus für durch Platinaddukte geschädigte DNA, in typischen Karzinoiden schien mit der Platinresistenz dieser Patienten in Zusammenhang zu stehen [42].

Seit der Entwicklung von Chemotherapieschemata für fortgeschrittene Karzinoide auf der Grundlage von Streptozotocin/Dacarbazin, 5-FU, Cyclophosphamid oder anderen, wurden mehrere neue Medikamente eingeführt, die sich bei verwandten Tumoren als Einzelwirkstoffe oder in Kombination als signifikant krebshemmend erwiesen haben [3, 43, 44]. Zu diesen Wirkstoffen gehören Oxaliplatin, eine hochaktive Platinverbindung, Paclitaxel, ein Taxan, das auf die Polymerisation von Mikrotubuli abzielt, Analoga des Topoisomerase-I-Hemmers Camptothecin und der Antimetabolit Gemcitabin. Paclitaxel erwies sich als weniger zytotoxisch als Vinblastin und Gemcitabin, die gegen die beiden empfindlichen Karzinoidzelllinien aktiv waren. Paclitaxel wurde kürzlich in einer klinischen Studie an 14 Patienten mit Karzinoidtumoren und neun Patienten mit Inselzelltumoren untersucht und ergab eine Gesamtansprechrate von 8 %, die mit erheblicher hämatologischer Toxizität verbunden war [45]. Die hochwirksame Stammverbindung Camptothecin (CPT) wurde aufgrund der hohen lokalen Toxizität bei intravenöser Verabreichung für den klinischen Einsatz aufgegeben, wird aber derzeit in neuen Formulierungen neu bewertet. Zwei etablierte Derivate, nämlich CPT-11 (Irinotecan) und Topotecan, wurden modifiziert, um eine höhere Wasserlöslichkeit zu erreichen, und es wurde nachgewiesen, dass sie bei einer Vielzahl von Tumoren klinisch wirksam sind [46]. Die erreichbaren PPCs von etwa 65 nM für Topotecan und >70 nM für den aktiven Metaboliten von CPT-11, SN38, liegen im gleichen Bereich wie der für CPT erzielte IC50-Wert [32, 47]. Ein Bericht über Chemoresistenz in Primärkulturen typischer Karzinoide ergab eine relativ hohe Empfindlichkeit gegenüber 5-FU, Doxorubicin, Etoposid und Dacarbazin, aber eine hohe Resistenz gegenüber Cisplatin, Gemcitabin, Vinblastin und Carboplatin [48]. Allerdings handelte es sich bei nur sechs der 60 untersuchten Tumorproben um Vorderdarmkarzinoide, und nicht jeder Wirkstoff wurde bei jeder Tumorprobe angewendet. Daher weisen Lungenkarzinoide möglicherweise ein anderes Chemosensitivitätsmuster auf als Mittel- und Hinterdarmtumore, wie in der vorliegenden Studie festgestellt.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Oxaliplatin gegen alle drei Karzinoid-Zelllinien zytotoxisch ist, einschließlich der UMC-11-Zellen, die eine breite Arzneimittelresistenz aufweisen. Darüber hinaus wurde bei einem einzigen Karzinoid-Patienten über ein klinisches Ansprechen auf Cisplatin berichtet [49]. Die neuartigen Platinkomplexe Satraplatin und Picoplatin wurden bisher nicht an Karzinoid-Patienten getestet, zeigten aber in Lungenkrebsstudien eine vielversprechende klinische Aktivität [20, 50]. UMC-11-Zellen sind unempfindlich gegenüber Picoplatin. JM118, der hochaktive Metabolit von Satraplatin, zeigte eine signifikante Zytotoxizität gegen alle drei Lungenkarzinoid-Zelllinien. Die Empfindlichkeit gegenüber den neuen Platinverbindungen ist in Sphäroiden von H835-Zellen im Vergleich zu Einzelzellsuspensionen deutlich geringer und hängt von der Molekülgröße und der Lipophilie des jeweiligen Wirkstoffs ab. Ein eingeschränkter Zugang der Chemotherapeutika zu den Karzinoidzellen und die daraus resultierenden unzureichenden Wirkstoffkonzentrationen können daher mit einer Arzneimittelresistenz in Karzinoidtumoren in vivo in Verbindung gebracht werden [49].

Eine breite Resistenz gegenüber zytotoxischen Medikamenten kann auf eine verstärkte Unterdrückung des apoptotischen Tumorzelltods durch Veränderungen der Eigenschaften der Mitochondrien zurückgeführt werden [51]. Der Stoffwechsel der meisten soliden Tumore besteht aus aerober Glykolyse (Warburg-Effekt), und unter diesen Bedingungen können die Mitochondrien keine wesentlichen proapoptotischen Faktoren bereitstellen. DCA ist ein oral verfügbarer niedermolekularer Inhibitor der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase, der den Fluss von Pyruvat in die Mitochondrien erhöht und dadurch die Glukoseoxidation gegenüber der Glykolyse begünstigt [52]. Dies kehrt die unterdrückte mitochondriale Apoptose bei Krebs um und führt zu einer Hemmung des Tumorwachstums in vitro und in vivo bei Brust-, Prostata- und Endometriumkrebs [53]. Zusätzlich zu den zellulären Wirkungen, die DCA allein hervorruft, kann es in Kombination mit zytotoxischen Medikamenten den Zelltod verstärken. DCA hatte bei den beiden nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien A549 und H719 keine additive Wirkung mit Paclitaxel, Etoposid oder Cisplatin. Mitaplatin, eine Verbindung, bei der zwei DCA-Moleküle an die axialen Positionen eines sechskoordinierten Pt(IV)-Zentrums angehängt wurden, zeigte jedoch eine vielversprechende Aktivität [54, 55]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass DCA das Wachstum der chemoresistenten UMC-11-Zelllinie hemmt und die Zellen für Carboplatin, JM118 und Oxoplatin in Konzentrationen sensibilisiert, die in vivo erreicht werden können [56]. Der Mechanismus dieser Selektivität von DCA für bestimmte Platinverbindungen muss noch aufgeklärt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Platinkomplexe wie Oxaliplatin, Carboplatin und Satraplatin ein Potenzial für die Behandlung von Lungenkarzinoiden haben könnten, und dass die durch DCA induzierte Sensibilisierung der Tumorzellen für ausgewählte Platinwirkstoffe von breiterer Anwendbarkeit in der zytotoxischen Chemotherapie sein könnte.

Danksagung

Wir danken Dr. Z. Salama für die Bereitstellung von Platinkomplexen und hilfreiche Diskussionen. Dieses Projekt wurde durch ein Stipendium der Österreichischen Nationalbank (# 13345) an Dr. K. Geissler unterstützt. Dr. W. Fiebiger und Dr. U. Olszewski PhD haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieses Manuskripts haben.

REFERENZEN

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