📖 24 mins.

Krishan Kumar1, Simon Wigfield2, Harriet E. Gee2,5, Cecilia M. Devlin1, Dean Singleton2, Ji-Liang Li2, Francesca Buffa2, Melanie Huffman1, Anthony L. Sinn3, Jayne Silver3, Helen Turley2, Russell Leek2, Adrian L. Harris2 & Mircea Ivan4

1 Fachbereich Medizin, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA2
Fachbereich Onkologie, Weatherall Institute of MolecularMedicine
, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford OX3 9DS, UKe-mail
:
[email protected] In Vivo Therapeutics Core, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA4
Fachbereich Medizin, Immunologie und Mikrobiologie, Indiana University, 980W. Walnut Street, Room C225, Indianapolis, IN 46202, USAe-mail
:
[email protected] Abteilung für Strahlenonkologie, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital, Camperdown, New South Wales 2050, Australien







Eingereicht am: 7. November
2012Überarbeitet: 20. Dezember 2012Angenommen
: 2. Januar
2013Online-Veröffentlichung: 30. Januar 2013


Zusammenfassung

Die Hemmung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors erhöht die Ansprechraten auf die Chemotherapie und das progressionsfreie Überleben beim Glioblastom. Allerdings kommt es immer wieder zu Resistenzen, so dass dringend nach synergistischen Wirkstoffen gesucht werden muss. Eine mögliche Strategie besteht darin, die Anpassung des Tumors an die durch antiangiogene Medikamente hervorgerufenen Veränderungen der Mikroumgebung zu verstehen und Wirkstoffe zu testen, die diesen Prozess ausnutzen. Wir haben ein In-vivo-Glioblastom-Xenotransplantatmodell verwendet, bei dem der Tumor in Gegenwart einer kontinuierlichen Behandlung mit Bevacizumab entkommen kann. U87-MG- oder U118-MG-Zellen wurden subkutan entweder in BALB/c SCID- oder athymische Nacktmäuse implantiert. Bevacizumab wurde alle drei Tage intraperitoneal injiziert (2,5 mg/kg/Dosis) und/oder Dichloracetat (DCA) wurde zweimal täglich oral verabreicht (50 mg/kg/Dosis), sobald das Tumorvolumen 0,3 cm3 erreichte, und zwar so lange, bis die Tumoren etwa 1,5-2,0 cm3 erreichten. Die Microarray-Analyse der resistenten U87-Tumoren ergab koordinierte Veränderungen auf der Ebene der Stoffwechselgene, insbesondere eine wachsende Kluft zwischen Glykolyse und mitochondrialer Atmung. Es gab einen hochsignifikanten Unterschied zwischen U87-MG-implantierten athymischen Nacktmäusen 1 Woche nach der Medikamentenbehandlung. Nach zweiwöchiger Behandlung blockierten Bevacizumab und DCA zusammen das Tumorwachstum drastisch im Vergleich zu einem der beiden Medikamente allein. Ähnliche Ergebnisse wurden bei athymischen Nacktmäusen beobachtet, denen U118-MG-Zellen implantiert wurden. Wir zeigen zum ersten Mal, dass die Umkehrung der Bevacizumab-induzierten Stoffwechselverschiebung durch DCA das neoplastische Wachstum in vivo beeinträchtigt. Da DCA als ein vielversprechender Wirkstoff gilt, der auf den Tumorstoffwechsel abzielt, erbringen unsere Daten den rechtzeitigen Nachweis, dass die Kombination mit einer antiangiogenen Therapie eine wirksame antineoplastische Strategie darstellt.


Schlüsselwörter: Dichloracetat; Hypoxie; Bevacizumab; Oxidative Phosphorylierung; Glykolyse

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013


EINFÜHRUNG

Molekulare Therapien, die auf die Neoangiogenese und insbesondere auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) abzielen, haben in einer Reihe von klinischen Kontexten eine antitumorale Wirkung gezeigt [1]. Das Glioblastom (GBM) ist ein stark vaskularisierter und tödlicher primärer Hirntumor mit einer durchschnittlichen Überlebenszeit von etwa 12-14 Monaten und stellt daher ein wichtiges Ziel für antiangiogene Medikamente dar [2]. Bevacizumab, ein humanisierter Anti-VEGF-Antikörper, ist derzeit von der Food and Drug Administration (FDA) als Zweitlinientherapie für GBM zugelassen, und laufende klinische Studien zielen darauf ab, sein Potenzial als Erstlinientherapeutikum zu bewerten [3]. Da die VEGF-Blockade zwar das progressionsfreie Überleben, nicht aber das Gesamtüberleben verlängert, müssen unbedingt Strategien gefunden werden, die ihre Wirkung erhöhen und das Auftreten von Resistenzen verzögern [4]. So wurden beispielsweise in Kombination mit Irinotecan begrenzte Fortschritte erzielt, jedoch konnte kein Einfluss auf das Gesamtüberleben nachgewiesen werden [5]. Eine wesentliche Einschränkung bei der Entwicklung synergistischer Kombinationen mit Anti-VEGF-Wirkstoffen ist der Mangel an belastbaren klinischen Daten, da Tumore, die gegen diese Wirkstoffe resistent werden, nicht routinemäßig für weitere Analysen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus sind die zellulären und molekularen Folgen einer Anti-VEGF-Behandlung noch immer unzureichend bekannt. Detaillierte Informationen auf molekularer Ebene darüber, wie sich Bevacizumab über einen längeren Zeitraum auf das GBM auswirkt, sind nicht nur für unser Verständnis der adaptiven Reaktionen des Tumors und des anschließenden Versagens der Behandlung, sondern auch für die Entwicklung rationaler Kombinationstherapien unerlässlich.

Wir haben daher versucht, die Reaktion des Tumors auf Bevacizumab auf phänotypischer und molekularer Ebene in Xenotransplantationsmodellen zu bestimmen, die von GBM-Zelllinien abgeleitet sind. Indem wir die Modelle trotz kontinuierlicher Bevacizumab-Behandlung bis zum endgültigen Therapieversagen ausdehnten, wollten wir die adaptiven Programme des Tumors und die entsprechende Neuverdrahtung der molekularen Signalwege mit Hilfe der Microarray-Analyse erfassen. Wir stellten die Hypothese auf, dass sich die Kernmechanismen der Resistenz in der Veränderung dieser Signalwege widerspiegeln und dass kleine Moleküle, die in diese Prozesse eingreifen, realistische Kandidaten zur Steigerung der Wirksamkeit von Bevacizumab darstellen. Die bioinformatische Analyse ergab, dass resistente Tumore eine starke Hypoxie-induzierbare Faktor (HIF)-Signatur und eine Verlagerung von der mitochondrialen Atmung zur Glykolyse aufweisen. Die Reaktivierung der mitochondrialen Atmung mit dem Orphan Drug Dichloroacetat (DCA) verstärkt die vorübergehende Wirkung von Bevacizumab, im Gegensatz zur fehlenden additiven Wirkung von 2-Desoxyglukose (2-DG), die in erster Linie auf die Glykolyse abzielt. Unsere Daten geben Aufschluss über die Plastizität des Tumorstoffwechsels als Reaktion auf therapeutische Herausforderungen und lassen neue Möglichkeiten für synergistische Interventionen erkennen.

Materialien und Methoden

In-vivo-Tumorigenität

Alle Protokolle wurden gemäß den Bestimmungen des Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University und den vom britischen Innenministerium genehmigten Protokollen und Vorschriften durchgeführt.107 U87-MG-Zellen (erworben von ATCC) wurden 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-SCID-Mäusen (Harlan Sprague Dawley, Inc.) subkutan in Form von 100-μl-Zellsuspensionen mit einem gleichen Volumen Matrigel (BD Bioscience) implantiert. Die Tumore wurden zweimal wöchentlich mit einer Schieblehre gemessen, und das Volumen wurde nach der Formel Länge × Breite × Höhe × 0,52 berechnet. Sobald das Tumorvolumen 150 mm3 erreicht hatte, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt, die jeweils aus fünf Mäusen bestanden, und die Behandlung mit Bevacizumab (Roche), das alle drei Tage in einer Dosis von 10 mg/kg intraperitoneal injiziert wurde, oder einer Kochsalzlösung als Kontrolle begann. Die Behandlung wurde fortgesetzt, bis die Tumore auf ein Volumen von 600-800 mm3 angewachsen waren; zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse euthanasiert und die Tumore schnell chirurgisch entfernt. Für die Xenograft-Modelle mit athymischen Nacktmäusen wurden entweder U87-MG-Zellen wie oben beschrieben in 4 bis 8 Wochen alte weibliche Mäuse (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) implantiert, oder es wurden 7 ×106 U118-MG-Zellen (erworben von ATCC) transplantiert. Die Tumorfragmente wurden entweder mit Formalin fixiert, bevor sie für die IHC in Paraffin eingebettet wurden, oder für die spätere RNA-Extraktion eingefroren, wie zuvor beschrieben [6].

Protokolle zur Verabreichung von Medikamenten für Kombinationsstudien

DCA wurde zweimal täglich in einer Dosis von 50 mg/kg/Dosis in sterilem Wasser oral verabreicht (die Vehikelkontrolle war steriles Wasser). Diese Dosis basierte auf veröffentlichten Berichten und einer allometrischen Skalierung. So entsprechen 100 mg/kg pro Maus und Tag etwa 13 mg/kg beim Menschen (http://home.fuse.net/clymer/minor/allometry.html), was mit den in der klinischen Praxis verwendeten Dosen übereinstimmt. Bevacizumab wurde intraperitoneal in einer Konzentration von 2,5 mg/kg/Dosis (U87-MG) oder 2,0 mg/kg/Dosis (U118-MG) verabreicht. Die Behandlung wurde so lange fortgesetzt, bis die Tumore einen Durchmesser von etwa 20 mm erreicht hatten; dann wurden die Mäuse eingeschläfert und die Tumore rasch entfernt. 2-Deoxyglucose (Sigma, 500 mg/kg) wurde täglich intraperitoneal injiziert.

Die Einzelheiten der Zellkultur, der Genarray-Analyse, der histologischen Analyse und der Immunhistochemie, der DCA-behandelten Sphäroide sowie der RNA-Isolierung und der quantitativen RT-PCR-Analyse (QPCR) sind im elektronischen Zusatzmaterial beschrieben.

Statistische Auswertung

Die statistische Signifikanz der beobachteten Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen wurde mithilfe eines zweiseitigen t-Tests berechnet. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Etablierung des Bevacizumab-Resistenz-Tumormodells

U87-MG-Zellsuspensionen wurden subkutan in die rechte Flanke von SCID-Mäusen injiziert. Die Behandlung mit Bevacizumab (intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg alle 3 Tage) wurde eingeleitet, wenn die Tumore eine durchschnittliche Größe von 100-200 mm3 erreichten. Die Unterschiede zwischen den behandelten und den nicht behandelten Kohorten wurden 1 Woche später deutlich, und etwa am Tag 40 wurde eine vollständige Resistenz gegen Bevacizumab erreicht (Abb. 1). Die Tumore wurden für die Kontrollen und die behandelten Kohorten getrennt zu Zeitpunkten entfernt, an denen ihre durchschnittlichen Wachstumsraten und Größen ähnlich waren. Eine analoge Reaktion (d. h. anfängliches Ansprechen, gefolgt von Resistenz) wurde mit einer submaximalen Bevacizumab-Dosis (2,5 mg/kg; alle 3 Tage durch intraperitoneale Injektion) in athymischen Nacktmäusen beobachtet. Dies wird im Rahmen der Kombinationsstudien weiter unten ausführlich beschrieben. Durch immunhistochemische Untersuchungen auf Standard-Gefäßmarker (CD31 und CD34) und anschließende Zählung der Mikrogefäßdichte konnten wir bestätigen, dass resistente Tumoren eine deutlich spärlichere Gefäßversorgung aufweisen (Abb. 1). Daher scheint die Therapieresistenz nicht in erster Linie mit einer erneuten Vaskularisierung aufgrund einer Umstellung auf alternative angiogene Wachstumsfaktoren zusammenzuhängen, wie dies in anderen Modellen der Bevacizumab-Resistenz gezeigt wurde [7]. Die Expression von HIF-1α sowie von Kohlensäureanhydrase IX (CA9), einem robusten HIF-Ziel und etablierten Marker für Hypoxie, war in den resistenten Tumoren dramatisch erhöht, was darauf hindeutet, dass ihr Wachstum in einer deutlich sauerstoffärmeren Umgebung fortgesetzt wurde, was mit den von Rapisarda et al. [8].

Abbildung 1: Analyse von mit Bevacizumab behandelten U87-MG-Tumoren.(A) Tumorwachstum von U87-MG in vivo, behandelt mit Bevacizumab (BVC) oder Vehikelkontrolle (CTRL), ab Tag 12 bis zum Ende des Experiments. Mittelwert ± SE, N= 5. Doppeltes Sternchen (**) P< 0,01.(B) Immunhistochemische Färbungen von Tumorschnitten aus CTRL- oder BVC-behandelten Tumoren zeigen eine erhöhte Hypoxie mittels HIF-1 und CA9 sowie einen Marker für die Gefäßmorphologie mittels CD34. Die Hauptbilder sind ×10 Vergrößerung und die Inset-Bilder ×20 Vergrößerung. Die Schnitte wurden gefärbt und auf(C) Gefäß-Q (CD31),(D) CA9-Spiegel und(E) Nekrose untersucht. Mittelwert ± SE. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05; dreifaches Sternchen (***) P< 0,001

Molekulare Charakterisierung des Bevacizumab-Resistenzmodells
Um ein umfassendes Verständnis der molekularen Prozesse zu erlangen, die mit dem Resistenzprozess in Verbindung stehen und möglicherweise dafür entscheidend sind, wurde die gesamte RNA aus behandelten und unbehandelten Tumoren einer Expressionsanalyse mit HGU133plus2 Affymetrix-Arrays unterzogen. Der vollständige Datensatz für die Affymetrix-Array-Expressionsanalyse ist unter http://www.ncbi.nlm.gog/geo/query/acc.cgi?acc=GSE37956 verfügbar. Ein zentrales Thema in den Bevacizumab-resistenten Tumoren war die koordinierte Aktivierung des HIF-gesteuerten Transkriptionsprogramms (Abb. 2). Ein großer Teil der HIF-Targets wies eine koordinierte Hochregulierung auf, in den meisten Fällen mit mehr als einer Array-Sonde. Vor allem glykolytische HIF-Targets wie die Aldolasen A und C, Triosephosphat-Isomerase 1 und 6-Phosphofructo-2-Kinase/Fructose-2,6-Biphosphatase 3 sowie die induzierbaren Glucosetransporter GLUT1/SLC2A1 und GLUT3/SLC2A3 wurden stark induziert, was auf eine erhöhte Abhängigkeit von der glykolytischen Verwertung von Glucose hinweist. Im Gegensatz dazu wurde in Bevacizumab-resistenten Tumoren eine signifikante Unterdrückung der Gene für Pyruvatdehydrogenase (PDH) alpha 1 und beta beobachtet, die den Eintritt von Pyruvat in den Tricarbonsäurezyklus (TCA) steuern [9]. Die PDH-Aktivität wird durch Phosphorylierung durch Pyruvatdehydrogenase-Kinasen (PDK) gehemmt. Die Isoformen PDK1 und PDK3, die gut dokumentierte HIF-Ziele sind [10-12]waren in den Bevacizumab-resistenten Tumoren stark hochreguliert, was eine biochemische Verschiebung weg von der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) unterstützt (Abb. 2). Die wohl auffälligste Veränderung der Genexpression in Bevacizumab-resistenten Tumoren war die globale Herunterregulierung von Genen des mitochondrialen Stoffwechsels, insbesondere von Mitgliedern aller fünf mitochondrialen OXPHOS-Komplexe (Abb. 2). Schließlich wurden mehrere Komponenten des TCA-Zyklus, einschließlich Fumarat-Hydratase (FH) und Succinat-Dehydrogenase (SDH), herunterreguliert (Abb. 2), was zum Tumorwachstum beitragen kann, da sie auch als Tumorsuppressoren fungieren [13].

Abbildung 2: Veränderungen der Genexpression in den Kontrollgruppen und den mit Bevacizumab behandelten Gruppen. Die X-Achse stellt die Kontroll- und Bevacizumab-behandelten Tumoren dar. Die Array-Daten wurden mit GCRMA vorverarbeitet und mit Quantilnormalisierung und Logarithmusbasis 2 normalisiert. Die Expression ist pro Gen standardisiert dargestellt(Z-Werte; Farbschlüssel oben). Y-Achse: Gensymbole auf der rechten Seite. Blaue Banden an der Seite zeigen mitochondriale Genkomplexe an (von hellblau= I bis dunkelblau= V). Grüne Bande zeigt Krebszyklusgene an. Rote Bande zeigt HIF-Ziele an

Die Analyse der KEGG-Signalwege bestätigte, dass der Energiestoffwechsel eine der wichtigsten Veränderungen im Zusammenhang mit den Bevacizumab-resistenten Tumoren darstellt. So waren glykolytische Gene am häufigsten unter den hochregulierten Genen vertreten, zusammen mit Genen, die zum Fruktose- und Mannose-Stoffwechsel, zum Pentosephosphat-Stoffwechsel, zum Aminozucker- und Nukleotidzucker-Stoffwechsel und zum Inositphosphat-Stoffwechsel gehören (ergänzende Tabelle S1A). Die hypergeometrischen und korrigierten hypergeometrischen p-Werte waren für alle diese Stoffwechselwege kleiner als 0,01. Umgekehrt war unter den herunterregulierten Genen die OXPHOS der am stärksten unterdrückte Stoffwechselweg mit p-Werten von weniger als 1,00E-28, wobei auch der Pyruvat-Stoffwechsel und der TCA-Zyklus eine hoch signifikante Unterdrückung aufwiesen (ergänzende Tabelle S1B). Eine weitere Signatur, die in den Bevacizumab-resistenten Tumoren beobachtet wurde, war ein erhöhter Stress des endoplasmatischen Retikulums und eine ungefaltete Proteinantwort. Insbesondere die Schlüsselvermittler dieser Reaktionen ATF4, 5, 6 und DDIT3/CHOP waren alle stark überexprimiert (ergänzende Tabelle S2), was mit unseren früheren Beobachtungen übereinstimmt, dass eine schwerere Hypoxie, die sich im Verlauf einer antiangiogenen Therapie entwickelt, Nicht-HIF-Signalwege aktiviert [14].

In vitro-Auswirkungen chronischer Hypoxie auf die mitochondriale OXPHOS-Genexpression

Um zu untersuchen, ob Hypoxie die Hauptursache für die Herabregulierung der Gene für die mitochondriale Atmung und den Krebszyklus ist, haben wir eine umfassende in vitro-Untersuchung der Auswirkungen von niedrigem Sauerstoffgehalt in U87-Zellen durchgeführt. Interessanterweise reagierten mehrere OXPHOS-Gene und Komponenten des Krebszyklus, die in den Arrays herunterreguliert waren, auch unter Hypoxie mit einer Herunterregulierung, darunter ATP5A1, ATP5G3, NDUFA9, FH und MDH1 (Abb. 3). MRPL36 und MRPS11, zwei Gene, von denen angenommen wird, dass sie für den Aufbau der OXPHOS-Komplexe entscheidend sind [15, 16]zeigten ebenfalls eine Herabregulierung bei Hypoxie, ähnlich der Wirkung von Bevacizumab (Abb. 3). Die Mehrheit der in den Arrays herabregulierten Gene zeigte jedoch keine Herabregulierung während der Hypoxieexposition, was darauf hindeutet, dass andere Faktoren in erster Linie verantwortlich sein könnten [17]. Eine erneute Untersuchung der Arrays ergab, dass mehrere Transkriptionsfaktoren, die die mitochondriale Genexpression (einschließlich OXPHOS) regulieren, herabreguliert wurden: NRF1, TFAM und TFB2M [18-20] (ergänzende Tabelle S3).

Abbildung 3: Herabregulierung von metabolischen mitochondrialen Genen in Bevacizumab-resistenten Tumoren. Die quantitative PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die Auswirkungen einer BVC-Behandlung oder Hypoxie auf U87-Zellen zu untersuchen. Für den Vergleich zwischen Normoxie und Hypoxie wurden die Zellen 72 Stunden lang bei 1 % Sauerstoff inkubiert. Die folgenden mitochondrialen Gene wurden getestet:(A) mitochondriale ribosomale Gene,(B) Enzyme des Krebszyklus und(C) Komponenten des Elektronentransportkomplexes I und V. Die Genniveaus sind als fache Veränderungen im Vergleich zu PBS-Kontrollen in vivo und zu normoxischen Kontrollen in vitro angegeben. Mittelwert ± SE. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05; doppeltes Sternchen (**) P< 0,01; dreifaches Sternchen (***) P< 0,001

Ausnutzung der erhöhten glykolytischen Lücke: In-vivo-Synergismus zwischen Bevacizumab und DCA
Aufgrund der ausgeprägten Signatur der erhöhten HIF-Signalisierung und der verringerten mitochondrialen OXPHOS stellten wir die Hypothese auf, dass die Bevacizumab-resistenten Tumoren besonders empfindlich auf mitochondriale Reaktivatoren reagieren würden. Der Spitzenkandidat unter den kleinen Molekülen dieser Klasse ist DCA, das die PDK-Aktivität hemmt und dadurch den Fluss von Pyruvat in die Mitochondrien erhöht und die Glukoseoxidation gegenüber der Glykolyse fördert [21, 22]. Unter Berücksichtigung der bekannten Nebenwirkungen der antiangiogenen Therapie und von DCA wählten wir für die Bewertung der Wirkstoffkombination eine submaximale Dosis des antiangiogenen Wirkstoffs (2,5 mg/kg; alle 3 Tage durch intraperitoneale Injektion), eine Strategie, die in vivo weit verbreitet ist [23]. Dieser Ansatz dürfte auch unsere Fähigkeit verbessern, Synergieeffekte zwischen den beiden Medikamenten zu erkennen, sowohl im Hinblick auf die Tumorreaktion als auch auf die Auswirkungen auf die HIF-Signalübertragung. In der Tat blockierte die Behandlung mit Bevacizumab und DCA das Tumorwachstum drastisch im Vergleich zu jedem Medikament allein (Abb. 4A und ergänzende Abb. S1). Um die Allgemeingültigkeit der Reaktion zu beurteilen, untersuchten wir einen weiteren GBM-Zelltyp, U118. Das Ansprechen in U118-basierten Transplantaten war mit der Kombination ebenfalls viel robuster als mit den einzelnen Medikamenten (Abb. 4B und ergänzende Abb. S1).

Abbildung 4: DCA verstärkt die Wirkung von BVC auf das Tumorwachstum in vivo.(A) Tumorwachstum von U87-MG in vivo, behandelt entweder mit CTRL, BVC, DCA oder BVC/DCA, beginnend mit Tag 7 bis zum Ende des Experiments. Mittelwert ± SE, N= 4-6. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05;(B) Tumorwachstum von U118 in vivo, behandelt entweder mit CTRL, BVC, DCA oder BVC/DCA. Die U118-Tumore wuchsen nur langsam, daher ist Tag 0 der Zeitpunkt des Behandlungsbeginns. Mittelwert ± SE, N= 4-8. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05; doppeltes Sternchen (**) P< 0,01;(schwarze Sterne im Vergleich zu CTRL, graue Sterne im Vergleich zu BVC allein);(C) Wachstum von U87-MG-Sphäroiden, die entweder mit Vehikelkontrolle (CTRL) oder 10 mM DCA behandelt wurden. Die Sphäroide wurden auf 0,2 mm3 anwachsen gelassen, bevor sie alle 3 Tage mit DCA behandelt wurden. NB: Die Fehlerbalken sind klein und liegen innerhalb der Symbole.(D) Bilder (bei ×5 Vergrößerung) zeigen repräsentative Bilder der CTRL- und DCA-behandelten Sphäroide

Die Wirksamkeit von glykolytischen Inhibitoren bei der Überwindung der Resistenz gegen Bevacizumab wurde bereits früher vorgeschlagen [24] ohne experimentelle Bestätigung. DCA und 2-DG wurden zusammen als Teil dieses Konzepts diskutiert. Als jedoch 2-DG parallel zu DCA getestet wurde, konnte keine additive Wirkung zu Bevacizumab festgestellt werden. Dies gilt trotz der vorübergehenden Wirkung von 2-DG als Einzelwirkstoff, der in der in der Literatur beschriebenen Konzentration verabreicht wurde (ergänzende Abb. S2). Somit haben die mitochondriale Reaktivierung und die direkte Hemmung der Glykolyse in Kombination mit Bevacizumab unterschiedliche Auswirkungen.

In-vitro-Wirkungen von DCA

Sphäroidmodelle stellen aufgrund der Sauerstoff- und Nährstoffgradienten ein System von mittlerer Komplexität zwischen zweidimensionalen Standard-Kultursystemen und Tumoren in vivo dar. Im Gegensatz zu Monolayersystemen ahmen expandierende Sphäroide die erhöhte Avaskularität der in vivo wachsenden Strukturen in Gegenwart von Bevacizumab nach. U87-Sphäroide wurden wie beschrieben erzeugt [25]erzeugt und 7 Tage lang gezüchtet, bis sie eine Größe von 0,2 mm3 erreichten. Sphäroide dieser Größe sind groß genug, um die Diffusion eines Medikaments durch das Sphäroid zu ermöglichen, beginnen aber auch, einen kleinen zentralen Bereich der Hypoxie zu bilden und zeigen Gradienten von Nährstoffen, pH undO2. Nach drei Behandlungstagen wurde eine starke Divergenz der Wachstumskinetik zwischen DCA-behandelten und unbehandelten Gruppen festgestellt. Dieser Effekt blieb bestehen, und ab dem 6. Tag beeinträchtigte DCA die Sphäroidexpansion erheblich (Abb. 4C, D ).

Wirkung der Kombination von Bevacizumab und DCA auf HIF-Targets und histologische Marker des Tumorwachstums

Um herauszufinden, ob die Wirkung der Kombination auf das Tumorwachstum in erster Linie durch einen erhöhten Zelltod oder eine verringerte Proliferation bestimmt wurde, führten wir an diesen Tumoren histologische Analysen unter Verwendung etablierter Marker durch. Die Nekrose war in den behandelten Tumoren höher als in den unbehandelten, aber es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Medikamenten allein oder in Kombination festgestellt (Abb. 5). Die Proliferationsrate, die durch die Quantifizierung der Ki-67 (MIB-1)-Färbung ermittelt wurde, war in der Kombinationsgruppe im Vergleich zu den unbehandelten und den nur mit Bevacizumab behandelten Tumoren signifikant niedriger, was darauf hindeutet, dass die Wirkung der Kombination vorwiegend zytostatisch war (Abb. 5). Anschließend untersuchten wir die Auswirkungen der Medikamentenkombination auf die HIF-Signalübertragung mit einer Kombination aus Immunhistochemie und quantitativer RT-PCR (Abb. 5, 6). Überraschenderweise reichte DCA allein nicht aus, um die Expression der HIF-Ziele in vivo messbar zu erhöhen, obwohl bekannt ist, dass es den Sauerstoffverbrauch in verschiedenen experimentellen Systemen erhöht. In Kombination mit Bevacizumab stieg die CA9-Expression in den lebensfähigen U87-Tumorzellen jedoch drastisch an. In U118 hingegen führte submaximales Bevacizumab allein zu einem dramatischen Anstieg aller getesteten HIF-Targets, ohne dass ein weiterer messbarer Anstieg in den mit der Kombination behandelten Tumoren zu verzeichnen war (Abb. 6 und ergänzende Abb. S3). Der größte Nachteil ist jedoch, dass die Tumoren, die in Gegenwart der Kombination überlebten, dramatisch kleiner und praktisch stationär waren, Faktoren, die das Ausmaß der Hypoxie abmildern sollten.

Abbildung 5: Wirkung von Bevacizumab und DCA auf die Histologie des U87-MG-Tumors.(A) Immunhistochemische Färbung für CA9, CD31, Ki-67 (MIB-1) und Nekrose in FFPE-Schnitten von U87-MG-Tumor-Xenografts, die mit BVC, DCA, einer Kombination aus BVC und DCA oder der Vehikelkontrolle (CTRL) behandelt wurden. Quantifizierung von(B) Prozentsatz des lebensfähigen Gewebes, das positiv für CA9 ist;(C) Gefäßscore, VQ, (CD31);(D) Proliferationsindex, PQ, (Ki-67); und(E) Nekrose. Alle Bilder sind bei ×20 Vergrößerung dargestellt. Mittelwert ± SE. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05; doppeltes Sternchen (**) P< 0,01; dreifaches Sternchen (***) P< 0,001

Abbildung 6: Wirkung der Kombinationstherapie von Bevacizumab und DCA auf wichtige Stoffwechselgene. Es wurde eine quantitative PCR-Analyse durchgeführt, um die Auswirkungen der Behandlung mit CTRL, BVC, DCA oder BVC/DCA auf U87-MG- und U118-Tumoren zu untersuchen, indem die Veränderungen in der RNA(A und B) PDK1(C und D) CA9 gemessen wurden. Mittelwert ± SE, N= 4-8. Einfaches Sternchen (*) P< 0,05; doppeltes Sternchen (**) P< 0,01; dreifaches Sternchen (***) P< 0,001

Diskussion

Das Hauptziel unserer Studie war es, ein tieferes Verständnis der Tumoranpassung an Bevacizumab zu erlangen, indem wir die mit der Resistenz in Verbindung stehenden Stoffwechselwege identifizierten, wobei der Schwerpunkt auf metabolischen Reaktionen lag. Wir haben uns auf ein heterotopes und nicht auf ein orthotopes Modell konzentriert, vor allem um die Durchführbarkeit der Überwachung von neoplastischem Wachstum und Entweichen zu gewährleisten. Da subkutane Tumore zudem ein wesentlich größeres Volumen erreichen als ihre orthotopen Gegenstücke, sind sie für die Modellierung fortgeschrittener und hypoxischer Malignome wohl relevanter.

In einem kürzlich veröffentlichten orthotopen GBM-Modell wurde über eine erhöhte Hypoxie nach der Behandlung mit Bevacizumab berichtet [24, 26]allerdings ist die Untersuchung langfristiger Wachstumsunterschiede in solchen Systemen weniger gut möglich. Trotz des „klassischen“ Status des Tumorstoffwechsels in der Krebsforschung und seiner jüngsten Wiederbelebung ist kein Medikament, das primär auf dieser Ebene wirkt, für den routinemäßigen klinischen Einsatz zugelassen worden [27]. DCA, ein kleines Molekül, das die Blut-Hirn-Schranke überwindet [22]zeigte in einer klinischen Studie bei GBM in Kombination mit Operation, Temozolomid und Bestrahlung vielversprechende Ergebnisse [21]mehrere weitere Studien werden derzeit durchgeführt http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=+Dichloracetat). Die Wirkung von DCA als Einzelwirkstoff ist jedoch bestenfalls vorübergehend, und unsere Tumormodelle spiegeln diese Einschränkung sicherlich wider. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde die Möglichkeit erörtert, dass eine Bevacizumab-Behandlung die Tumoren sowohl für 2-DG als auch für DCA sensibilisieren könnte [24]diese Vorhersagen haben sich in unseren Händen jedoch nur für DCA bestätigt. Das Fehlen einer messbaren additiven oder synergistischen Wirkung von 2-DG war wahrscheinlich nicht auf biologische Inaktivität oder unzureichende Dosierung zurückzuführen, da es als Einzelwirkstoff nur vorübergehend wirksam war. Es bleibt die Frage nach dem Mechanismus der DCA-vermittelten Tumorhemmung in Gegenwart von Bevacizumab. Es wurde zwar berichtet, dass DCA die Angiogenese selbst blockiert [21]die Messung der mittleren Gefäßdichte hat dies in unserem System nicht bestätigt.

Es hat sich gezeigt, dass DCA unter Hypoxie bei einer Reihe von Zelllinien eine verstärkte zytotoxische Wirkung aufweist [28]. Das derzeitige Paradigma besagt, dass DCA den Sauerstoffverbrauch durch mitochondriale Reaktivierung beschleunigt und die lokale Sauerstoffspannung weiter senkt [29]und somit eine zusätzliche Herausforderung für das Überleben und/oder die Vermehrung von Tumorzellen darstellt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass in Zellen, die aufgrund mitochondrialer DNA-Mutationen dazu verdrahtet“ sind, selektiv die Glykolyse zur ATP-Erzeugung zu nutzen, die durch DCA erzwungene OXPHOS eine toxische Wirkung hatte. DCA zeigt in vitro auch eine synergistische Zytotoxizität in Kombination mit Cisplatin und Topotecan, zwei antineoplastischen Wirkstoffen, die bekanntermaßen die mitochondriale DNA schädigen [30]. Man könnte spekulieren, dass die Herunterregulierung mitochondrialer Gene in den Bevacizumab-resistenten Tumoren eine Form der mitochondrialen Dysfunktion darstellt, die für die Wirkung von DCA sensibilisiert.

Interessanterweise war die Wirkung von DCA als Einzelwirkstoff auf HIF-Ziele in Xenotransplantaten bestenfalls subtil, obwohl seine positive Wirkung auf den Sauerstoffverbrauch allgemein bekannt ist. Im Gegensatz dazu führte DCA zusammen mit Bevacizumab zu einer erhöhten Expression der meisten getesteten HIF-Ziele in den überlebenden Tumoren im Vergleich zu Bevacizumab allein. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse ist, dass die durch DCA induzierte forcierte OXPHOS in Gegenwart von sehr niedrigen Sauerstoffkonzentrationen zu einer erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies führen kann, die wiederum zu einer zusätzlichen Induktion von HIF [31]. Zusätzlich oder alternativ kann DCA in Anwesenheit von Bevacizumab zu einem weiteren Rückgang der lokalen Sauerstoffkonzentration auf ein Niveau führen, bei dem die Induktion von HIF-Zielen durch quantitative RT-PCR-Tests deutlicher wird. Neben einer erhöhten CA9-Expression wurde in den Tumoren, die in Anwesenheit der Wirkstoffkombination überlebten, sowohl in U87- als auch in U118-Zellen eine verstärkte Expression der HIF-Ziele PDK1, 3 und GLUT1 beobachtet. Dies könnte eine dramatischere Verschiebung des Stoffwechsels widerspiegeln, die für das Überleben der Tumorzellen entscheidend ist. Insbesondere kann die erhöhte Expression von PDK1/3 Teil eines „letzten Versuchs“ der Tumorzellen sein, der Wirkung von DCA teilweise entgegenzuwirken und die mitochondriale OXPHOS zu inaktivieren. Solche Stoffwechselverschiebungen in Tumoren, die in Gegenwart von Bevacizumab plus DCA überleben, könnten auch wichtige Hinweise darauf liefern, wie die Wirksamkeit dieser Kombination weiter gesteigert werden kann. So könnte man beispielsweise spekulieren, dass die resistenten Tumoren zumindest eine gewisse Empfindlichkeit gegenüber einer weiteren Erhöhung der DCA-Konzentration aufweisen, obwohl die Toxizität dieser Verbindung zu einem limitierenden Faktor werden könnte. Die Hochregulierung von tumorspezifischem CA9 könnte ebenfalls eine wichtige Rolle für das Überleben der mit der Kombination behandelten Tumoren spielen, da es die Beseitigung von überschüssigemCO2 beschleunigt, das bei der Reaktivierung des Krebszyklus entsteht [25]. Daher können CA9-Inhibitoren, die kürzlich vielversprechende krebsbekämpfende Wirkungen gezeigt haben [32, 33] als realistische Kandidaten für eine dritte Komponente einer Kombinationsstrategie angesehen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die molekulare Analyse der Tumoranpassung an Anti-VEGF-Wirkstoffe wertvolle Hinweise für die Entwicklung effizienterer Kombinationen liefern kann, die auch auf den Krebsstoffwechsel abzielen.

Beiträge der Autoren

Konzeption und Design: M.I. und A.L.H. Erfassung der Daten: K.K., S.W., H.E.G., H.T., J.L., J.S., A.L.S., R.L., D.S., C.M.D., und M.H. Analyse und Interpretation der Daten: M.I. und A.L.H. Verfassen, Überprüfung und/oder Überarbeitung des Manuskripts: M.I. und A.L.H. Administrative, technische oder materielle Unterstützung: F.B. Überwachung der Studie: M.I. und A.L.H.

Finanzierungsquelle

Die Arbeit wurde durch Zuschüsse von Cancer Research United Kingdom [S.W., A.L.H., H.T., R.L., J.L.], METOXIA p-Medicine European Union Framework 7 [D.S., F.B.], Rhodes Scholar [H.G.], Indiana University Cancer Center startup funds, und American Cancer Society [M.I., C.M.D., K.K.] unterstützt.

Interessenkonflikt

Es sind keine potenziellen Interessenkonflikte zu melden.

REFERENZEN


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