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Mao-fa Zheng1, Si-yu Shen, Wei-da Huang

1Abteilungfür Biochemie, School of Life Science, Fudan Universität, Handan Road 220, Shanghai, 200433, China.
Email: e-mail:


[email protected]: 16 May 2013Accepted
: 27 August 2013Published
: 17 September 2013





Zusammenfassung

Hintergrund : Capecitabin ist eines der wenigen Chemotherapeutika mit hoher oraler Verfügbarkeit. In jüngster Zeit hat Natriumdichloracetat (DCA) großes Potenzial als Krebsmedikament gezeigt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die krebshemmende Wirkung von DCA in Kombination mit Capecitabin bei Krebserkrankungen mit mäßiger TP-Expression.

Methoden: Ein B16-Maus-Melanom-Allotransplantat und ein menschliches nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom A549-Xenotransplantat wurden verwendet, um die Wirkung der kombinierten Behandlung mit DCA und Capecitabin zu bewerten. Mit Hilfe der Histologie und der Immunhistochemie wurden die Apoptose und die Proliferation der Krebszellen nachgewiesen. Real-time PCR und Western Blot wurden durchgeführt, um die Expression von TP bzw. Caspasen nachzuweisen.

Ergebnisse: Zum ersten Mal berichten wir, dass DCA die Antitumorwirkung von Capecitabin in einem B16-Allotransplantat der Maus und einem A549-Xenotransplantat des Menschen durch Förderung der Apoptose von Tumorzellen verstärkte. DCA hat kaum Auswirkungen auf die Expression von TP.

Schlussfolgerungen: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA in Kombination mit Capecitabin ein potenzielles neues Therapieschema für einige Krebsarten darstellen könnte.

Schlüsselwörter: DCA, Capecitabin, Kombination, Antitumorwirkung

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013

Cancer Chemother Pharmacol (2013) 72:1031-1041DOI
: 10.1007/s00280-013-2281-z


INTRODUCTION

Natriumdichloracetat (DCA) ist ein kleinmolekulares Salz der Dichloressigsäure mit einem Molekulargewicht von 150 Da. DCA hemmt die Aktivität der Pyruvatdehydrogenase-Kinase und aktiviert so den mitochondrialen Enzymkomplex Pyruvatdehydrogenase [1] und wandelt den glykolytischen Stoffwechselweg in eine oxidative Phosphorylierung um. In den letzten 40 Jahren wurde DCA als Arzneimittel für seltene Leiden zur Behandlung von angeborener Laktatazidose bei Kindern und von Laktatazidose, die durch andere Krankheiten kompliziert wird, eingesetzt [2] und hat sowohl in präklinischen als auch in klinischen Versuchen eine hohe Wirksamkeit und geringe Toxizität gezeigt [3]. In jüngster Zeit hat DCA ein großes Potenzial als Mittel gegen Krebs gezeigt, da der Stoffwechsel einiger Tumorzellen ähnlich wie bei der Laktatazidose umgestaltet wird [4]. Krebszellen, insbesondere Krebsstammzellen (CSC), widersetzen sich der Apoptose, indem sie Energie durch Glykolyse und Milchsäuregärung und nicht durch oxidative Phosphorylierung erzeugen, was auf die hypoxische Umgebung des Tumors zurückzuführen ist, ein Phänomen, das als Warburg-Effekt bekannt ist [5,6]. Nach oraler Verabreichung stellt DCA nachweislich die Mitochondrienfunktion wieder her und fördert selektiv die Apoptose von Tumorzellen über einen von den Mitochondrien abhängigen Mechanismus [7,8]. Die therapeutischen Aktivitäten von DCA gegen Glioblastome wurden in klinischen Studien (NCT00540176) getestet und zeigten einige positive Ergebnisse [9]. Die Phase-II-Studie NCT01029925 zur Ermittlung der Ansprechrate von oralem Dichloracetat bei Patienten mit rezidivierendem und/oder metastasierendem und vorbehandeltem Brustkrebs und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs wurde jedoch wegen unerwartet hoher Risiken und Sicherheitsbedenken abgebrochen. Der klinische Nutzen von DCA für die Krebsbekämpfung muss also noch sorgfältiger eingeschätzt werden.

Als Apoptose-Sensibilisator ist DCA auch in Kombination mit anderen Krebstherapien eingesetzt worden. Cao et al. [10] berichteten, dass DCA Prostatakrebszellen in vitro für Strahlung sensibilisierte. Xiao et al. [11] stellten fest, dass DCA den Tod von Tumorzellen verstärkt, wenn es mit einem onkolytischen Adenovirus kombiniert wird, das den Tumorsuppressor MDA-7/IL-24 exprimiert. Kürzlich wurde eine auf den Stoffwechsel abzielende Therapie mit DCA als neuartige Behandlungsstrategie zur Verbesserung der Ergebnisse der photodynamischen Therapie nachgewiesen [12]. Tong et al. [13] fanden heraus, dass DCA und 5-Fluorouracil bei Darmkrebszellen in vitro eine synergistische Antitumorwirkung zeigten. Es gibt jedoch immer noch kontroverse Ergebnisse und Zweifel hinsichtlich der Verwendung von DCA allein oder in Kombination mit anderen Medikamenten. Shahrzad et al. [14] zeigten, dass DCA die Apoptose von Krebszellen unter hypoxischen Bedingungen sowohl in vitro als auch in vivo reduziert. Heshe et al. [15] wiesen darauf hin, dass DCA die Zytotoxizität einiger Standard-Krebsmedikamente wie Cisplatin und Doxorubicin verringerte, aber die Aktivität von Temozolomid bei 7 von 10 Zelllinien in ihrer Studie nicht beeinträchtigte. Diese widersprüchlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einsatz von DCA allein oder in Kombination mit anderen Therapien möglicherweise krebstypspezifisch und wirkstoffspezifisch ist.

Capecitabin ist eines der wenigen Chemotherapeutika mit hoher oraler Verfügbarkeit und ist als Erstlinienbehandlung für metastasierenden Rektalkrebs oder als alternative Behandlung für metastasierenden Brustkrebs in Kombination mit Docetaxel zugelassen [16,17]. Capecitabin ist ein Prodrug von 5-Fluorouracil (5-FU) und erfordert drei enzymatische Reaktionen für die endgültige Umwandlung in 5-FU in Tumorzellen. Die letzte Reaktion wird von der Thymidinphosphorylase (TP) katalysiert, die in einigen Tumoren stärker exprimiert wird als in normalen Geweben [18]. Daher wird das zytotoxische 5-FU in den Tumorzellen in höherem Maße gebildet als in den Geweben außerhalb des Zielgebiets, was Capecitabin zu einem Chemotherapeutikum mit geringer Toxizität macht [18]. Die TP-Expressionsniveaus sind bei verschiedenen Tumorarten unterschiedlich [18]dies schränkt den Einsatz von Capecitabin auf einige Krebsarten ein. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die krebshemmende Wirkung von DCA in Kombination mit Capecitabin bei Krebsarten mit mäßiger TP-Expression. Wir stellten die Hypothese auf, dass DCA die krebshemmende Wirkung erhöht und die wirksame Dosis von Capecitabin reduziert. Die Kombination von DCA mit Capecitabin könnte ein gutes Behandlungsschema ergeben, da beide Wirkstoffe oral eingenommen werden können und die Patienten sich gut daran halten. Darüber hinaus können generische Formen von DCA die wirksame Dosis von Capecitabin verringern und so die Nebenwirkungen und Kosten der Krebsbehandlung senken.

Materialien und Methoden

Materialien
Natriumdichloracetat (DCA, CSA:2156-56-1), Reinheit 99 %, wurde von Shanghai Jieshi Chemical Co., Ltd. (China). 5-Fluorouracil (5-FU) und 5′-Desoxyfluorouridin (5-DFUR) wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen. MTT wurde von Shanghai Biological Engineering Co, Ltd. (China). Capecitabin-Tabletten (Xeloda) wurden von Roche (USA) bezogen. Das B16-Mausmelanom und die menschliche nicht-kleinzellige Lungenkrebs-Zelllinie A549 wurden von der American Type Cell Culture Collection (ATCC, USA) bezogen.

Tiermodellstudien

Allograft-Modell

C57BL/6-Mäuse, weiblich, 6-8 Wochen alt und ca. 18-20 g schwer, wurden vom Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) erworben und eine Woche lang akklimatisiert. Eine Million B16-Einzelzellen wurden subkutan (s.c.) in die rechte Flanke der C57BL/6-Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, wobei sich 6 Mäuse pro Gruppe in einem Käfig befanden. Es gab zwei Gruppen von Mäusen. DCA und Capecitabin wurden diesen beiden Gruppen von Mäusen 3 bzw. 10 Tage nach der Inokulation verabreicht. DCA wurde sterilem Trinkwasser in einer Endkonzentration von 1,4 g/L zugesetzt. Die Messung des verbrauchten Wasservolumens zeigte, dass die jeder Maus verabreichte DCA-Menge ungefähr 100 mg/kg/Tag entsprach. Capecitabin-Tabletten wurden gemahlen und in sterilem Wasser mit 4 % Carboxymethylcellulose suspendiert, um verschiedene Konzentrationen herzustellen. Zweihundert Mikroliter der Capecitabin-Suspensionen wurden jeder Maus intragastrisch verabreicht. Alle 2 Tage wurden die langen (a) und kurzen (b) Durchmesser der Tumore mit einem Messschieber gemessen und das Körpergewicht aufgezeichnet. Das Tumorvolumen wurde nach der Formel V = 0,5ab2 berechnet. Zweiundzwanzig Tage nach der Inokulation wurden die Mäuse getötet und die Tumore entfernt und gewogen.

Xenotransplantationsmodell

Männliche BALB/c-nu-Mäuse im Alter von 5-6 Wochen und mit einem Gewicht von ca. 18-20 g wurden vom Shanghai Laboratory Animal Center (SLAC, China) erworben und eine Woche lang akklimatisiert. Etwa 2 × 2 mm große Schnitte von frisch zerkleinertem A549-Tumorgewebe, das von zuvor mit A549-Zellen geimpften BALB/c-nu-Mäusen stammte, wurden s.c. in die rechte Flankenregion männlicher BALB/c-nu-Mäuse injiziert. DCA und Capecitabin wurden den Mäusen verabreicht, als ihr Tumorvolumen ~0,2 cm3 erreichte. Dreißig bis fünfunddreißig Tage nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet, die Tumore entfernt und gewogen. Die übrigen Methoden waren die gleichen wie beim Allotransplantationsexperiment.

Die Tierversuche wurden von der Tierschutz- und Ethikgruppe der Abteilung für Labortierkunde der Fudan-Universität genehmigt.

Histologie und Immunhistochemie
Die histologische
Untersuchung der Tumorknoten wurde an zusätzlichen Tieren (3 Mäuse pro Gruppe) durchgeführt, die nicht für die Überwachung des Tumorwachstums berücksichtigt wurden. Das Gewebe wurde in 4 % (w/v) Paraformaldehyd fixiert, und nach der Fixierung über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Proben in abgestuftem Ethanol dehydriert und in Paraffin eingebettet. Danach wurden verschiedene Tumorteile nach dem Zufallsprinzip geschnitten, um mit dem Leica-Mikrotom 4-μm-Schnitte anzufertigen. Nach der Entparaffinierung und Rehydrierung wurden drei Schnitte aus verschiedenen Teilen jeder Probe für die Folgeuntersuchungen ausgewählt. Die terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)- und 4′6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Färbung wurde gemäß den Herstelleranweisungen der TUNEL- und DAPI-Kits (Beyotime, China) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) analysiert. Der Nachweis des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) erfolgte nach Entparaffinierung der Schnitte und 20-minütiger Inkubation bei 96-100 °C. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 0,3 % (v/v) Wasserstoffperoxid in 60 % (v/v) Methanol für 30 Minuten gelöscht. Die unspezifische Adsorption wurde durch 20-minütige Inkubation der Schnitte in 2 % (v/v) normalem Ziegenserum in PBS minimiert. Die Gewebeschnitte wurden über Nacht mit einem polyklonalen Anti-PCNA-Antikörper vom Kaninchen (Abcam; 1:100 in PBS) inkubiert, dreimal für jeweils 30 Minuten mit PBS gewaschen und mit einem Biotin-konjugierten Ziegen-Antikanin-IgG für 2 Stunden bei 37 °C und einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin (Sigma-Aldrich) gegengefärbt und lichtmikroskopisch analysiert (Olympus, Japan). Drei Tumore pro Gruppe wurden für die immunhistochemische Analyse verwendet. Ein oder zwei Schnitte pro Tumor wurden blind ausgewählt, um PCNA- oder TUNEL-positive Zellen zu messen. Fünf zufällige Felder pro Objektträger in 400facher Vergrößerung wurden blind gemessen(n = 250 Zellen pro Gruppe). Bei der quantitativen Analyse der TUNEL-positiven Zellen wurden mögliche nekrotische Zellen durch Beobachtung der Kernmorphologie mit DAPI-Färbung ausgeschlossen. Es wurden sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen durchgeführt, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten.

Proteinextraktion und Western Blot
Tumorgewebe aus jeder Gruppe (3 zusätzliche Mäuse pro Gruppe) wurde gepoolt und unter flüssigem Stickstoff zerkleinert und dann in 150 μl Gewebelysepuffer (Beyotime, China) lysiert. Die Röhrchen wurden 1 Minute lang kräftig geschüttelt, 20 Minuten lang auf Eis gestellt und 5 Minuten lang bei 5.000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem BCA-Proteinbestimmungskit (BioRad) bestimmt. 30 Mikrogramm Gesamtprotein jeder Probe wurden durch SDS-PAGE auf einem 10 %igen Gel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen, blockiert, über Nacht mit einem primären Antikörper inkubiert, 1 Stunde lang mit einem sekundären Antikörper inkubiert und mit dem chromogenen Substrat NBT/BCIP entwickelt. Der monoklonale Maus-Anticaspase-3-Antikörper (1:500), der Anticaspase-9-Antikörper (1:1.000), der Anti-β-Actin-Antikörper (1:2.000) und der polyklonale Kaninchen-Anticaspase-8-Antikörper (1:1.000) wurden von Beyotime (Nanjing, China) bezogen. Der monoklonale Anti-TP-Antikörper (1:2.000) stammt von Abcam (UK). β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Bandendichte des Western Blot wurde mit Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, China) analysiert.

Real-time PCR
B16-Tumore
und Lebergewebe wurden von derselben C57BL/6-Maus entnommen, die zuvor mit B16-Zellen geimpft worden war (3 Mäuse wurden verwendet, ein Geschenk von Wenlong Ren vom Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry). Colo205/A549- und Lebergewebe wurden von derselben BALB/c-nu-Maus entnommen, die zuvor mit Colo205/A549-Zellen geimpft worden war (es wurden jeweils 3 Mäuse verwendet, ein Geschenk von Wenlong Ren vom Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry). Für die Analyse der TP-Expression nach der Behandlung wurden die Tumorproben von 3 gleichgewichtigen Tumorgeweben jeder Gruppe zusammengeführt. Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen, USA) isoliert und mit PrimeScript® RT-Reagenz-Kit (Takara, Japan) revers transkribiert. cDNA wurde mit β-Actin normalisiert. Die Echtzeit-PCR wurde in drei Schritten unter Verwendung des SYBR® Premix Ex Taq™ II-Kits (Takata, Japan) mit 55 °C Annealing-Temperatur und 40 Amplifikationszyklen durchgeführt. Die einzelnen Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die relative Menge jeder cDNA wurde mit Hilfe von2-△△Ct analysiert. Primer für die real-time PCR: β-Actin F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ und β-Actin R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ und hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ und mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Statistik
Wir verwendeten ANOVA mit Mehrfachvergleichen und Post-hoc-Analyse (Tukey-Test) unter Verwendung der Software SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben, und P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

TP-Expression in B16-Melanomen der Maus und A549-NSCLC-Tumoren des Menschen
Die TP-Expression in B16- und A549-Tumoren, die Mäusen entnommen wurden, wurde mittels Echtzeit-PCR analysiert. Menschliche Lebern exprimieren relativ mehr TP als andere normale Gewebe [18]. Bei einer typischen Krebsart, die sich für eine Capecitabin-Behandlung eignet, ist die TP-Expression im Tumor ähnlich hoch oder höher als in der Leber, z. B. bei kolorektalem und Brustkrebs [18,19]. In menschlichen Krebs-Xenografts waren Krebse mit hoher TP-Aktivität anfälliger für eine Capecitabin-Behandlung als solche mit geringer TP-Aktivität [20]. Die Darmkrebs-Zelllinie Colo205 wurde aufgrund ihrer mäßigen TP-Expression und ihrer mäßigen Empfindlichkeit gegenüber Capecitabin als Referenz ausgewählt [21]. Wie in Abb. 1a gezeigt, war die TP-Transkription in Colo205 etwas höher als in der Leber der BALB/c-nu-Maus. Wie aus Abb. 1b, c hervorgeht, waren die TP-Transkriptionswerte in B16- und A549-Tumoren ähnlich hoch wie in den Mäuselebern. Daher waren B16 und A549 auch mäßig TP-exprimierende Zelllinien. Daraus lässt sich ableiten, dass B16 und A549 bis zu einem gewissen Grad auf eine Capecitabin-Behandlung ansprechen, ohne die Wirkung von DCA zu überdecken. Daher waren die B16-Allotransplantat- und A549-Xenotransplantatmodelle geeignet, um die antitumorale Wirkung von DCA und Capecitabin in Kombination zu untersuchen.

Abbildung 1. Im Vergleich zu Mäuselebern exprimieren B16- und A549-Tumoren TP nur in geringem Maße Echtzeit-PCR-Analyse der TP-Transkriptionswerte. Es wurden Primer verwendet, die spezifisch auf Maus- und humanes TP abzielen. Der Primer für β-Actin ist sowohl für Mäuse als auch für Menschen geeignet. a TP-Transkriptionswerte in Colo205-Tumoren im Vergleich zu denen in der Leber von BALB/c-nu-Mäusen, die sie tragen. b TP-Transkriptionswerte in A549-Tumoren im Vergleich zu denen in der Leber von BALB/c-nu-Mäusen, die sie tragen. c TP-Transkriptionswerte in B16-Tumoren im Vergleich zu denen in der Leber von C57BL/6-Mäusen, die sie tragen. Pro Gruppe wurden Proben von 3 Mäusen verwendet

DCA verstärkt die Antitumorwirkung von Capecitabin in einem B16-Mausmelanom-Allotransplantat ohne zusätzliche Toxizität
Da die hypoxische Natur der Tumormikroumgebung für eine optimale DCA-Wirkung entscheidend ist, wurde die Antitumorwirkung von DCA plus Capecitabin an Tiermodellen statt an Zelllinien getestet. Sechsunddreißig C57BL/6-Mäuse wurden mit 1 ×106 B16-Melanomzellen geimpft und nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen(n = 6) aufgeteilt: eine Kontrollgruppe, die kein Medikament erhielt, eine Gruppe, die nur DCA erhielt, eine Gruppe, die nur 10 mg/Tag Capecitabin erhielt, und drei Gruppen, die DCA plus entweder 5, 10 oder 20 mg/Tag Capecitabin erhielten. Drei Tage nach der Inokulation der Tumorzellen wurden den Mäusen DCA in Trinkwasser und orales (p.o.) Capecitabin als Einzelmittel oder in Kombination mit ansteigenden Capecitabin-Konzentrationen verabreicht. Wie im oberen Feld von Abb. 2a zu sehen ist, hemmten sowohl DCA als auch 10 mg/Tag Capecitabin als Einzelbehandlung das Wachstum von B16-Melanomtumoren im Vergleich zur Kontrollgruppe in bescheidenem Maße. Im Gegensatz dazu erhöhte DCA plus 10 mg/Tag Capecitabin die Hemmung des Tumorwachstums signifikant(P < 0,05). Die Antitumorwirkung von DCA plus 20 mg/Tag Capecitabin war ähnlich wie die von DCA plus 10 mg/Tag Capecitabin; das Tumorwachstum wurde fast vollständig gehemmt. Bemerkenswert ist, dass Mäuse, die mit DCA plus 20 mg/Tag Capecitabin behandelt wurden, einen akuten Verlust an Körpergewicht erlitten (Abb. 2a, unteres Feld), während DCA plus 10 mg/Tag Capecitabin im Vergleich zur Kontrolle kaum Auswirkungen auf das Körpergewicht hatte.

Abbildung 2. DCA verstärkt die Antitumorwirkung von Capecitabin in einem B16-Maus-Melanom-Allotransplantat ohne zusätzliche Toxizität. a Drei Tage nach der Inokulation wurden den Mäusen DCA und Capecitabin (CAP) allein oder in Kombination verabreicht. Eskalierte Dosen [5, 10 und 20 mg/Tag (mg/Tag)] von Capecitabin in Kombination mit einer konstanten DCA-Dosis wurden verabreicht. Eine Kurve des Tumorvolumens(oberes Feld) und des Körpergewichts(unteres Feld) sind dargestellt. b Zehn Tage nach der Inokulation wurden Mäusen DCA und 7,5 mg/Tag Capecitabin allein oder in Kombination verabreicht. Dargestellt sind eine Kurve des Tumorvolumens(oberes Feld) und des Körpergewichts(unteres Feld)

Um die Antitumorwirkung von DCA plus Capecitabin gegen tastbare, nachweisbare Tumore zu beurteilen, wurden 10 Tage nach der Inokulation der Tumorzellen DCA und Capecitabin allein oder in Kombination an eine zweite Gruppe von 36 C57BL/6-Mäusen verabreicht, die mit 1 ×106 B16-Melanomzellen inokuliert worden waren. Die Mäuse mit tastbaren Tumoren wurden nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen aufgeteilt(n = 9, 3 Mäuse wurden für die immunhistochemische Analyse verwendet): Kontrolle, DCA allein, Capecitabin allein bei 7,5 mg/Tag und DCA plus Capecitabin bei 7,5 mg/Tag. Wie im oberen Feld von Abb. 2b gezeigt, hemmte DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin das Tumorwachstum signifikant im Vergleich zu DCA oder Capecitabin allein(P < 0,05). Zweiundzwanzig Tage nach der Inokulation hemmte DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin das Tumorwachstum um 75 %(P < 0,05), während DCA und Capecitabin allein das Wachstum nur um 25 % bzw. 35 % hemmten(P < 0,05). DCA verursachte im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit Capecitabin keinen akuten Verlust an Körpergewicht (Abb. 2b, unteres Feld). Diese Ergebnisse zeigen, dass DCA und Capecitabin eine synergetische Antitumorwirkung bei B16-Melanomtumoren haben können.

DCA verstärkt die Antitumorwirkung von Capecitabin in einem A549-Xenotransplantatmodell für menschliches NSCLC ohne zusätzliche Toxizität
Es wurde bereits berichtet, dass menschliches NSCLC entweder mit DCA [7] oder Capecitabin [22-24]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Antitumorwirkung von DCA plus Capecitabin in einem menschlichen NSCLC A549-Xenograft-Modell. Sechsundsechzig männliche BALB/c-nu-Mäuse mit menschlichen NSCLC A549-Tumoren (~2 × 2 mm), die s.c. in die rechte Flanke geimpft wurden, wurden nach dem Zufallsprinzip in 9 Gruppen aufgeteilt: Kontrolle; DCA allein; 2,5, 5, 7,5 oder 10 mg/Tag Capecitabin allein; oder DCA plus 2,5, 5 oder 7.5 mg/Tag Capecitabin(n = 6, außer Kontrolle, DCA allein, 7,5 mg/Tag Capecitabin und DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin; in diesen Gruppen, n = 9, wurden 3 Mäuse für die immunhistochemische Analyse und den Western Blot oder die Echtzeit-PCR-Analyse verwendet). Capecitabin in einer Dosierung von 10 mg/Tag wurde als hochdosierte Kontrolle eingesetzt. Wenn das Tumorvolumen 0,15-0,2 cm3 erreichte, wurden den Mäusen die Medikamente verabreicht. Capecitabin wurde p.o. nach einem 14-tägigen Einschalt-/7-tägigen Ausschaltplan verabreicht. Wie in den linken Feldern von Abb. 3a, b und c zu sehen ist, hatte DCA allein eine leichte wachstumshemmende Wirkung auf A549-Tumore; dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu früheren Berichten [7] in denen DCA allein eine größere antitumorale Wirkung zeigte. Capecitabin allein in einer Dosierung von 10 mg/Tag hemmte das Wachstum von A549-Tumoren stark, aber es wurde ein dramatischer Verlust an Körpergewicht festgestellt, was auf eine schwere Toxizität hindeutet (Abb. 3a, b, c, rechte Felder). Wie im linken Feld von Abb. 3a gezeigt, reduzierten 2,5 mg/Tag Capecitabin allein das Wachstum der A549-Tumore signifikant; die Kombination von DCA plus 2,5 mg/Tag Capecitabin verstärkte die Wachstumshemmung. Die ansteigende Kurve des Tumorvolumens bei alleiniger DCA-Behandlung deutet darauf hin, dass Capecitabin in der Kombinationsbehandlung die dominierende Antitumorwirkung ausübt. Die Wirkung von DCA plus 5 mg/Tag Capecitabin war etwas besser als DCA plus 2,5 mg/Tag Capecitabin, wenn auch schlechter als 10 mg/Tag Capecitabin allein, und es wurde kein signifikanter Verlust an Körpergewicht beobachtet (Abb. 3b, rechtes Feld). Bemerkenswert ist, dass DCA plus 5 mg/Tag Capecitabin die Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu 5 mg/Tag Capecitabin allein signifikant erhöhte (Abb. 3b, linkes Feld). Die antitumorale Wirkung der Kombination war ähnlich wie bei der Behandlung mit 10 mg/Tag Capecitabin, jedoch ohne signifikanten Verlust an Körpergewicht (Abb. 3b, rechtes Feld). Die Wirkung von 7,5 mg/Tag Capecitabin allein (Abb. 3c) war etwas besser als die von 5 mg/Tag Capecitabin allein; in Kombination mit DCA gab es jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin und DCA plus 5 mg/Tag Capecitabin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA die Dosis von Capecitabin reduzieren kann, ohne die Antitumorwirkung zu verlieren oder die Toxizität zu erhöhen.

Abbildung 3. DCA erhöht die Antitumorwirkung von Capecitabin in einem menschlichen NSCLC A549 Xenotransplantatmodell ohne zusätzliche Toxizität a DCA plus 2,5 mg/Tag (mg/Tag) Capecitabin. b DCA plus 5 mg/Tag Capecitabin. c DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin. Die Behandlungsgruppe mit 10 mg/Tag Capecitabin wurde als hochdosierte Kontrolle verwendet. Dargestellt sind Tumorwachstumskurven(linke Felder) und Körpergewichtskurven(rechte Felder). Das Tumorvolumen ist auf einer logarithmischen Achse dargestellt

DCA verstärkt die apoptotische Wirkung von Capecitabin auf B16- und A549-Zellen in vivo
Die histologische
Untersuchung der B16-Melanomtumore wurde 7 Tage nach Behandlungsbeginn durchgeführt. Die TUNEL-Färbung zeigte, dass die Behandlung von B16-Melanomtumoren mit DCA oder 7,5 mg/Tag Capecitabin allein die zelluläre Apoptose zu 8 bzw. 17 % auslöste. In Kombination bewirkte DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin eine Apoptose von etwa 30 %, mehr als die Summe der Einzelbehandlungen zusammen (Abb. 4a, c, linkes Feld). Die Anfärbung von PCNA in den B16-Melanomtumoren zeigte, dass DCA allein wenig Einfluss auf die Proliferation hatte, während 7,5 mg/Tag Capecitabin allein die Proliferation signifikant reduzierte. DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin verstärkte die Proliferationshemmung von Capecitabin allein in den B16-Tumorzellen nicht (Abb. 4b, c, rechte Tafel).

Abbildung 4. DCA verstärkt die apoptotische Wirkung von Capecitabin in B16-Melanomtumoren. a Immunfluoreszenz-TUNEL-Färbung von B16-Melanomtumorproben von Mäusen, die 7 Tage lang mit DCA, 7,5 mg/Tag Capecitabin allein oder DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin behandelt wurden. b Immunhistochemische Analyse des Proliferationsantigens PCNA in B16-Melanom-Tumorproben von Mäusen, die 7 Tage lang mit DCA, 7,5 mg/Tag Capecitabin allein oder DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin behandelt wurden. c Quantitative Analyse von TUNEL-positiven Zellen(links) und PCNA-positiven Zellen(rechts). *P < 0.05

Ähnlich wie bei den B16-Melanomtumoren führte die Behandlung der NSCLC-Tumoren A549 mit DCA oder 7,5 mg/Tag Capecitabin allein zu einer Apoptose von 15 bzw. 30 %. Die Kombination von DCA und 7,5 mg/Tag Capecitabin bewirkte eine Apoptose von 50 %, mehr als die Summe der einzelnen Wirkstoffe zusammen (Abb. 5a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA und Capecitabin eine synergetische Wirkung auf die Apoptose der NSCLC-Tumorzellen A549 haben. DCA verstärkte die Proliferationshemmung von Capecitabin bei NSCLC A549-Tumorzellen nicht (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 3. DCA verstärkt die apoptotische Wirkung von Capecitabin in NSCLC A549-Tumoren. a Immunhistochemische TUNEL-Analyse von NSCLC A549-Tumorproben von Mäusen, die 7 Tage lang mit DCA, 7,5 mg/Tag Capecitabin allein oder DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin behandelt wurden. b Quantitative Analyse der TUNEL-positiven Zellen. c Western Blot der Caspase-Aktivierung in NSCLC A549-Tumoren. Die Aktivierung der Initiator-Caspasen (Caspase 8 und Caspase 9) und der Effektor-Caspase (Caspase 3) wurde in NSCLC A549-Tumoren nachgewiesen, die BALB/c-nu-Mäusen injiziert wurden, die mit DCA, 7,5 mg/Tag Capecitabin oder DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin behandelt wurden. d Dichteanalyse der gespaltenen Caspase (C. Caspase). Normalisiert durch β-Actin. *P < 0.05

Der Western Blot zeigte, dass DCA nur einen geringen Einfluss auf die Expression und Aktivierung von Procaspase 8, Procaspase 9 und Procaspase 3 in NSCLC A549 Tumoren im Vergleich zur Kontrolle am Tag 7 nach der Behandlung hatte (Abb. 5c, d). Capecitabin allein in einer Dosierung von 7,5 mg/Tag erhöhte die Aktivierung aller 3 Procaspasen (Abb. 5c, d). Interessanterweise hatte DCA allein zwar nur geringe Auswirkungen auf die Expression und Aktivierung der drei Prokaspasen, aber DCA plus Capecitabin förderte die Expression von Prokaspase 8 und Prokaspase 3 im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit Capecitabin und erhöhte die Aktivierung von Prokaspase 8, Prokaspase 9 und Prokaspase 3.

DCA hat wenig Einfluss auf die Expression von TP im Tumor
Wir analysierten die Expression von TP in Tumorproben von A549 Xenotransplantaten am Tag 7 nach der Behandlung. Sowohl die Echtzeit-PCR (Abb. 6a) als auch der Western Blot (Abb. 6b) zeigten, dass DCA als Einzelwirkstoff oder in Kombination mit Capecitabin nur geringe Auswirkungen auf die TP-Expression hat, was bedeutet, dass sich der Mechanismus von DCA und Capecitabin in Kombination von anderen Capecitabin-Synergisten unterscheidet, über die zuvor berichtet wurde [19,25-27]. Real-time PCR zeigte auch, dass DCA keinen Einfluss auf die Expression anderer Capecitabin-Stoffwechselenzyme hatte (Thymidylat-Synthase, Orotat-Phosphoribosyl-Transferase, Dihydropyrimidin-Dehydrogenase, Thymidin-Kinase 1 und Cytidin-Desaminase, Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass DCA nur geringe Auswirkungen auf den Stoffwechsel von Capecitabin hat, was die Toxizität von Capecitabin nicht erhöhen würde.

Abbildung 6. Transkription und Expression von TP in A549-Tumoren nach der Behandlung. a Real-time PCR-Analyse der TP-Transkription. Normalisiert durch β-Actin. b Western-Blot-Analyse der TP-Expression. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. A549-Tumore wurden 7 Tage nach der Behandlung mit DCA, 7,5 mg/Tag Capecitabin oder DCA plus 7,5 mg/Tag Capecitabin oder der Kontrollgruppe aus BALB/c-nu-Mäusen reseziert. Die Proben von drei Tumoren pro Gruppe wurden gepoolt

Diskussion

DCA allein oder in Kombination mit anderen Therapien wurde in klinischen Studien getestet; es liegen jedoch keine Berichte über die Antitumorwirkung von DCA in Kombination mit Capecitabin vor. Wir stellten die Hypothese auf, dass die apoptosefördernde Wirkung von DCA auf solide Tumorzellen diese empfindlicher gegenüber Capecitabin machen würde. In der vorliegenden Studie hatte 1,4 g/L DCA allein nur geringe Auswirkungen auf das Wachstum von NSCLC A549-Tumoren in Mäusen. Die kombinierte Verabreichung von DCA und Capecitabin konnte jedoch die effektive Dosis von Capecitabin um 50 % reduzieren. DCA verstärkte die antitumorale Wirkung von Capecitabin in vivo durch Sensibilisierung der Apoptose. DCA hat nur geringe Auswirkungen auf den Metabolismus von Capecitabin, wodurch die Toxizität von Capecitabin nicht erhöht würde.

Da sowohl positive als auch negative Ergebnisse berichtet wurden (wie im Abschnitt „Einleitung“ dargelegt), ist die Verwendung von DCA als Krebsmedikament nach wie vor umstritten. Diese Diskrepanz kann auf unterschiedliche Versuchsbedingungen zurückzuführen sein, insbesondere auf unterschiedliche In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse. Die in der vorliegenden Studie verwendeten zellulären Assays zeigten, dass Tumorzellen in vitro unempfindlich gegenüber DCA sind, wobei die IC50 über 50 mM liegt. (Daten nicht gezeigt). Die Wirkung von DCA auf Krebszellen ist nicht auf eine direkte Zytotoxizität zurückzuführen, sondern hängt vom Stoffwechselmuster der Krebszellen ab [7, 28]. Zelllinien, die in vitro kultiviert werden, können die Mikroumgebung des Tumors nicht nachbilden und der „Warburg-Effekt“ kann verloren gehen. Daher sind zellbasierte In-vitro-Tests möglicherweise nicht die relevantesten Modellsysteme, um den Einsatz von DCA zu bestimmen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Studie die kombinierte Antitumorwirkung von DCA und Capecitabin zunächst in Mäusetumormodellen in vivo untersucht. Wir fanden auch heraus, dass die Wirkung von DCA auf das NSCLC A549-Xenotransplantat in der vorliegenden Studie geringer war als die von Bonnet et al. [7]berichtet wurde, obwohl eine höhere DCA-Dosis verwendet wurde. Dies könnte auf den Unterschied in der metabolischen Kapazität von DCA zwischen Mäusen und Ratten zurückzuführen sein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkung von DCA durch den Zustand der Krebszellen und der Patienten beeinflusst werden kann, was eine sorgfältige Untersuchung des klinischen Einsatzes von DCA bei der Krebsbehandlung erfordert.

In der vorliegenden Studie zeigten die Tiermodellstudien, dass DCA selbst eine schwache Antitumorwirkung gegen etablierte Tumore zeigte. In Kombination mit Capecitabin verstärkte DCA jedoch die antitumorale Wirkung von Capecitabin dramatisch, was sich sowohl in Tiermodellstudien als auch in den Ergebnissen der Apoptose-Immunhistochemie zeigt. Im Einklang damit zeigte die Western-Blot-Analyse, dass DCA selbst nur geringe Auswirkungen auf die Expression und Spaltung von Procaspasen hatte. In Kombination mit Capecitabin erhöht DCA jedoch deutlich die Expression und Spaltung der Procaspasen 8, 9 und 3. Es wird berichtet, dass zytotoxische Mittel wie 5-Fu zu einer erhöhten Expression und Aktivierung von Caspase 8 führen können [29,30]. Der Grund, warum Capecitabin zu einer erhöhten Expression und Aktivierung von Caspase 9 führt, ist noch unklar. Es könnte mit der antiangiogenetischen Wirkung von Capecitabin zusammenhängen. Es wird berichtet, dass DCA eine Mitochondrien-K+-Kanal-Achse normalisieren und als Apoptose-Sensibilisator wirken kann [7]. Wir vermuten, dass DCA das mitochondriale Potenzial von Krebszellen depolarisieren kann, indem es die Achse normalisiert und somit die Aktivierung von Caspase 8 und Caspase 9 durch Capecitabin verstärkt. Eine verstärkte Aktivierung von Caspase 8 und Caspase 9 führt zu einer erhöhten Aktivierung von Caspase 3.

Kürzlich wurde der kritische Beitrag von CSCs mit ihrer erhöhten tumorigenen Fähigkeit und ihrer Resistenz gegenüber Strahlen- und Chemotherapie zum malignen Verhalten hervorgehoben [31]. Es wird berichtet, dass CSCs in soliden Tumoren eine wichtige Rolle bei den Antichemotherapie- und Antiradiotherapie-Eigenschaften von Tumoren spielen [32, 33]. Viele Therapien, die auf CSCs abzielen, wurden diskutiert [34, 35], und Kombinationstherapien, die sowohl auf CSCs als auch auf „normale“ Krebszellen abzielen, haben großes Interesse geweckt [36-38]. Es wird berichtet, dass DCA sowohl in vitro als auch in vivo Apoptose in mutmaßlichen Glioblastom-Stammzellen auslöst [9]. In unserer Studie verringerte sich nach 7 Tagen DCA-Behandlung die Anzahl der CD133-positiven Zellen in den A549-Tumor-Objektträgern, die durch Immunhistochemie bestimmt wurden, auf 0,5 % im Vergleich zu 6 % in der Kontrollgruppe (Daten nicht gezeigt), was uns zu der Vermutung veranlasst, dass DCA auch die Apoptose in Lungenkrebs-CSCs auslösen kann. Wir vermuten, dass DCA Tumorzellen, insbesondere CSCs, für Capecitabin sensibilisieren kann. Die Kombination von DCA und Capecitabin wirkt auf zwei Arten gegen Tumorzellen: Capecitabin zielt auf die „normalen“ Krebszellen ab und verschont die CSCs, und DCA zielt auf die CSCs ab und fördert die Apoptose für Capecitabin. Ein anderes wahrscheinliches Szenario zur Erklärung der Kombinationswirkungen ist, dass DCA die Angiogenese von Krebs in vivo unterdrückt [9]unterdrückt, wobei DCA keine direkte Wirkung auf Krebszellen zeigt. Zusätzlich zu seiner klassischen Antitumoraktivität kann Capecitabin jüngsten Studien zufolge auch als antiangiogenetisches Molekül wirken [39]. DCA könnte die antiangiogene Wirkung von Capecitabin verstärken, was die kombinierte Antitumorwirkung erklärt. Um den genauen Mechanismus zu ermitteln, werden noch eingehende Studien durchgeführt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir sowohl syngenetisch transplantierte Tumore als auch xenotransplantierte Tumormodelle verwendet haben, um die kombinierte Antitumorwirkung von DCA und Capecitabin zu untersuchen, und dass DCA zum ersten Mal die Antitumorwirkung von Capecitabin verstärkte. Wir stellten fest, dass DCA die Fähigkeit besitzt, Krebszellen zu sensibilisieren und die apoptotische Wirkung von Capecitabin zu verstärken. In Kombination verabreicht, konnte DCA die wirksame Dosis von Capecitabin reduzieren, ohne die Toxizität zu erhöhen. Das kostengünstige, generische und oral verabreichte DCA in Kombination mit oralem Capecitabin könnte ein gutes Therapieschema gegen Krebserkrankungen sein.

Danksagungen

Wir sind Wenlong Ren vom Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry sehr dankbar für die Unterstützung bei der Vorbereitung der Mäusetumormodelle.

Interessenkonflikt

Keine.

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