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Zheng Yang1, Kin Y. Tam1

1 FakultĂ€t fĂŒr Gesundheitswissenschaften, UniversitĂ€t von Macau, Taipa, Macau, China.

Korrespondenz: Kin Y. TamFakultĂ€t fĂŒr Gesundheitswissenschaften, UniversitĂ€t
vonMacau, Taipa, Macau
,
China
Tel.: +853-88224988
Fax: +853-88222314.
E-Mail: [email protected]





Received: 15. April 2016Überarbeitet
: 27. Juli 2016Akzeptiert
: 2. August 2016

Zusammenfassung

Die Glykolyse wurde bei den meisten Krebszellen als vorherrschender Prozess zur Verwertung von Glukose beobachtet, was als „Warburg-Effekt“ bezeichnet wurde. Die gezielte Beeinflussung kritischer Enzyme wie der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK), die den Prozess der Glykolyse umgekehrt regulieren, könnte ein vielversprechender Ansatz sein, der allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen zur Krebstherapie eingesetzt werden kann. EGFR-Inhibitoren zur Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) werden seit Jahrzehnten mit großem Erfolg in der klinischen Praxis eingesetzt, aber auch ihr klinischer Nutzen wurde durch die zunehmende erworbene Resistenz etwas beeintrĂ€chtigt. Die medikamentöse Kombinationstherapie ist eine wirksame Strategie zur BewĂ€ltigung dieser Herausforderung. In dieser Studie haben wir Dichloracetat (DCA), einen weithin anerkannten PDK-Inhibitor, zusammen mit Erlotinib und Gefitinib, zwei bekannten EGFR-Inhibitoren, eingesetzt und gezeigt, dass die Anwendung von DCA in Kombination mit Erlotinib oder Gefitinib die LebensfĂ€higkeit von EGFR-mutierten NSCLC-Zellen (NCI-H1975 und NCI-H1650) auf synergistische Weise deutlich abschwĂ€cht. Dieses synergistische Ergebnis scheint eher ein Kombinationseffekt zur Förderung der Apoptose zu sein als eine gleichzeitige UnterdrĂŒckung von EGFR- oder PDK-Signalwegen. Außerdem haben wir gezeigt, dass die Kombinationsbehandlung bei anderen NSCLC-Zelllinien ohne EGFR-Mutationen (A549 oder NCI-H460) keine synergistische Wirkung zeigte. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die kombinierte Ausrichtung auf EGFR und PDK in NSCLC-Zellen synergistische Effekte in einer EGFR-Mutation-abhĂ€ngigen Weise ausĂŒbte.


SchlĂŒsselwörter: Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase; Dichloracetat; Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; Erlotinib; Gefitinib; Wirkstoffkombination

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EINLEITUNG

Nach den neuesten Statistiken (Jemal et al., 2011) steht Lungenkrebs bei MĂ€nnern an erster und bei Frauen an fĂŒnfter Stelle der neu diagnostizierten KrebsfĂ€lle und der krebsbedingten TodesfĂ€lle weltweit, wobei mehr als 80 % der Patienten in die Kategorie nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) fallen (Ke et al., 2015). Traditionelle Strategien zur Behandlung von NSCLC griffen hĂ€ufig auf Chemotherapien zurĂŒck, bei denen Platin-basierte oder andere zytotoxische Chemikalien entweder als Mono- oder als KombinationsprĂ€parate verabreicht wurden. Die objektiven Ansprechraten dieser Strategien waren jedoch in der Regel unbefriedigend, und die mediane GesamtĂŒberlebenszeit betrug in der Regel weniger als ein Jahr (Schiller et al., 2002, Pao und Chmielecki, 2010).

Eine EGFR-Mutation wurde bei etwa 30 % der NSCLC-Patienten gefunden, die oft gut auf die gezielte Therapie ansprachen (Pao und Chmielecki, 2010). Dies ermöglichte eine breite Anwendung von niedermolekularen EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren (EGFR-TKis), die in den vergangenen Jahrzehnten enorme Erfolge erzielten (Hanahan und Weinberg, 2011), wie z. B. Erlotinib und Gefitinib (DuttaundMaity, 2007). Allerdings trat bei der Behandlung von Patienten mit EGFR-Inhibitoren in der Regel eine erworbene Resistenz auf, fĂŒr die mehrere Mechanismen identifiziert wurden, wie z. B. eine ursprĂŒngliche oder induzierte T790M-Hot-Spot-Mutation, eine aktivierte sekundĂ€re SignalĂŒbertragung, wie z. B. eine MET-Amplifikation oder eine PI3K-Mutation, oder ein epithelialer bis mesenchymaler Übergang (EMT) (Maione et al., 2015). EnttĂ€uschend ist, dass die kombinierte Anwendung von EGFR-Inhibitoren mit Chemotherapien mehr unerwĂŒnschte Wirkungen mit sich brachte als der erwartete Vorteil einer VerlĂ€ngerung des GesamtĂŒberlebens der behandelten Objekte (Yan et al., 2015).

Der Stoffwechsel von Krebszellen ist ein aufstrebendes Gebiet, das auf der Entdeckung und der ĂŒber ein halbes Jahrhundert andauernden Erforschung des „Warburg-Effekts“ beruht (Ngo et al., 2015), der besagt, dass Krebszellen dazu neigen, Glukose ĂŒber Glykolyse statt ĂŒber oxidative Phosphorylierung zu verstoffwechseln, um Energie zu erzeugen (Lu et al., 2015). Dieses PhĂ€nomen war der Auslöser fĂŒr viele Studien, die sich auf SchlĂŒsselenzyme des Glukosestoffwechsels konzentrierten, wie Glukosetransporter (GLUTs), Hexokinase2 (HK2), Pyruvatkinase M2 (PKM2), Pyruvatdehydrogenase-Kinase (PDK), Laktatdehydrogenase-A (LDHA) und Glutaminase, was zur Entwicklung mehrerer Inhibitoren fĂŒhrte, die auf spezifische Enzyme fĂŒr die Krebstherapie abzielen (Butler et al., 2013). Als PDK-Inhibitor kann Dichloracetat (DCA) das Fortschreiten der Krebserkrankung bei vielen verschiedenen Krebsarten abschwĂ€chen, indem es die Pyruvatdehydrogenase-Phosphorylierung (p-PDH) herunterreguliert, die von der PDK gesteuert wird (Kankotia und Stacpoole, 2014). Obwohl mehrere Kombinationsstudien ĂŒber die Anwendung von DCA zur Behandlung von NSCLC berichtet wurden, konzentrierten sich die meisten von ihnen auf die klassische zytotoxische Chemotherapie, d. h. den kombinierten Einsatz von DCA und platinbasierten Medikamenten (Garon et al., 2014, Olszewski et al., 2010). Ob die Kombination von DCA mit EGFR-TKi bei EGFR-mutiertem NSCLC einen synergetischen Effekt auf die Krebstherapie ausĂŒben kann, ist noch unbekannt.

In dieser Studie konnten wir zeigen, dass die kombinierte Anwendung von EGFR-Inhibitoren (entweder Erlotinib oder Gefitinib) mit DCA das Zellwachstum von NCI-H1975 und NCI-H1650 synergistisch hemmt. Außerdem untersuchten wir die möglichen Mechanismen fĂŒr die Kombinationswirkung von EGFR- und PDK-Inhibitoren. Wir fanden heraus, dass diese Kombinationen nur bei den EGFR-mutierten NSCLC-Zelllinien NCI-H1975 und NCI-H460, nicht aber bei den EGFR-Wildtyp-NSCLC-Zelllinien A549 und NCI-H460 Synergieeffekte erzielen können.

Materialien und Methoden

Zelllinien und Reagenzien
Die NSCLC-Zelllinien NCI-H1975, NCI-H1650 und A549 wurden von ATCC erworben, wÀhrend NCI-H460 ein freundliches Geschenk von Prof. Thomas Y.C. Leung (Department of Applied Biology and Chemical Technology, Faculty of Applied Science and Textiles, The Hong Kong Polytechnic University) war. A549-Zellen wurden in F-12K/DMEM 1:1 (Gibco) kultiviert, wÀhrend die anderen Zelllinien in RPMI 1640 (Gibco) mit einem Zusatz von 10 % fötalem Rinderserum (Gibco) in einer befeuchteten AtmosphÀre mit 5%CO2 bei 37 °C gehalten wurden.

DCA wurde von Sigma gekauft und in 1% DMSO in PBS als Stammlösung (1,6 M) gelöst, die dann auf verschiedene Konzentrationen verdĂŒnnt wurde, um die endgĂŒltigen Arbeitslösungen zu bilden, die 0,1% DMSO im gesamten Medium fĂŒr die Zellbehandlung enthielten. Erlotinib und Gefitinib, beide von SelleckChem, wurden zunĂ€chst in DMSO (Sigma) aufgelöst, um die Stammlösung mit einer Konzentration von 160 mM zu bilden, und dann auf die individuelle Konzentration der Arbeitsmedien wie die von DCA verdĂŒnnt. PrimĂ€re Antikörper, einschließlich p-PDH und PDH (Abcam), stammten von Cell Signaling Technology. α-Tubulin wurde von Invitrogen bezogen.

ZelllebensfÀhigkeitstest
Die ZelllebensfĂ€higkeit jeder einzelnen behandelten oder unbehandelten Zelle wurde nach der angegebenen Behandlungszeit mit Hilfe des MTT-Tests bestimmt. Kurz gesagt, wurden einzelne Zellen fĂŒr jede Zelllinie 24 Stunden vor dem Laden der Verbindungen in 96-Well-Platten ausgesĂ€t. Nach der angegebenen Zeitspanne (24 h, 48 h bzw. 72 h) wurden die Kulturmedien mit den Verbindungen verworfen und 100 ÎŒl frisches Vollmedium mit 0,5 mg/ml MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid, Sigma) hinzugefĂŒgt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde das Lösungsmittel entfernt und 100 ÎŒl DMSO in jede Vertiefung gegeben, wobei die Formazan-Kristalle durch leichtes SchĂŒtteln aufgelöst wurden. Der O.D.-Wert jeder Vertiefung wurde bei 570 nm mit dem SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices) gemessen.

Berechnung des Kombinationsindex (CI)
Der CI-Wert wurde fĂŒr die synergistische Bewertung der ZelllebensfĂ€higkeit zwischen der Kombination und jeder der einzelnen Gruppen erfasst, die als Funktion des Anteils der betroffenen Krebszellen (Fa) auf der Grundlage der Chou-Talalay-Gleichung (Chou und Talalay, 1984) berechnet wurde: CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2, wobei (D)1 und (D)2 die Dosen angeben, die zur Erzielung einer notwendigen Reaktion in der Kombination angewendet werden, und (Dx) sich auf die einzelnen Medikamentendosen bezieht, die zur Erzielung einer Ă€hnlichen Reaktion erforderlich sind. Die Analysen der CI-Werte wurden mit der Software CalcuSyn (Biosoft) durchgefĂŒhrt, wobei CI<1, CI=1 und CI>1 synergistische, additive bzw. antagonistische Wirkungen anzeigen.

Koloniebildungstest
Alle vier NSCLC-Zelllinien wurden in 6-Well-Platten ausgesĂ€t, wobei jede Vertiefung 200-800 Zellen in 2 ml Medium enthielt. Die Medien mit den einzelnen Wirkstoffen oder deren Kombination wurden 24 Stunden nach dem Animpfen der Zellen fĂŒr eine kontinuierliche dreitĂ€gige Behandlung hinzugefĂŒgt und dann alle drei Tage durch wirkstofffreie Medien ersetzt. 15 Tage nach der Zellaussaat wurden die Zellkolonien 15 Minuten lang in 95%igem Ethanol fixiert, mit 0,1%igem Kristallviolett (Sigma) angefĂ€rbt und getrocknet. Kolonien mit mehr als 100 Zellen wurden als positiv gezĂ€hlt.

Western-Blotting-Assay
Sowohl NCI-H1975- als auch A549-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesĂ€t und fĂŒr bestimmte ZeitrĂ€ume mit Medien behandelt, die eine Mono-Verbindung oder eine Kombination enthielten. Die behandelten Zellen wurden 15 Minuten lang in Zelllysatpuffer (Cell Signaling Technology) unter leichtem SchĂŒtteln inkubiert und dann weitere 15 Minuten lang bei 12.000 U/min bei 4 °C zentrifugiert. Die Proteinkonzentration jeder Probe im Überstand wurde mit dem PierceÂź BCA Protein Assay Kit (Thermo) bestimmt und auf das gleiche Niveau gebracht, gefolgt von einer 8-minĂŒtigen Proteindenaturierung mit SDS-Ladepuffer bei 100 °C. Die Proteine in der Probe wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Filtermembran (Whatman) ĂŒbertragen, 2 Stunden lang in 5 % fettfreier Milch blockiert, ĂŒber Nacht mit den gewĂŒnschten primĂ€ren Antikörpern belĂŒftet und anschließend 2 Stunden lang mit sekundĂ€rem HRP-gebundenem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG (Cell Signaling Technology) belĂŒftet. Die Membranen wurden schließlich nach 2-minĂŒtiger Inkubation mit Clarity Western ECL-Substrat (Bio-Rad) in einem ChemidocÂź MP Imaging System (Bio-Rad) gescannt.

Durchflusszytometrie-Assay
NCI-H1975-und
A549-Zellen wurden ausgesĂ€t und wie im vorherigen Abschnitt beschrieben behandelt. Die behandelten Zellen wurden mit Trypsin-EDTA (Gibco) vom Boden der Platten abgelöst und zweimal mit PBS gewaschen. Apoptotische Erkennungen wurden mit dem FITC Annexin-V Apoptotic Detection Kit (Biolegend) durchgefĂŒhrt. Kurz gesagt wurden die geernteten Zellproben in 500 ÎŒl Bindungspuffer mit 5 ÎŒl Annexin V-FITC und 10 ÎŒl Propidiumiodid (PI) fĂŒr 15 Minuten suspendiert, bevor die FACS-Analyse auf einem Accuri C6 Durchflusszytometer (BD) durchgefĂŒhrt wurde. Zellproben fĂŒr die Messung des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP) wurden 15 Minuten lang in 1 ml Vollmedium mit 2 ÎŒM JC-1 (5,5,6,6-Tetrachlor-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolycarcocyaninjodid, Sigma) inkubiert, anschließend einmal gewaschen und fĂŒr die FACS-Analyse in PBS resuspendiert.

Statistische Analyse
Alle Daten wurden als Mittelwert±S.D. dargestellt. Die IC50 der einzelnen Verbindungen zu den angegebenen Zeitpunkten wurden mit GraphPad 5.1 (Prism) ermittelt. Statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Probengruppen wurden mit Excel 2010 unter Verwendung des Student’s t-Tests durchgefĂŒhrt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Erlotinib, Gefitinib und DCA verringerten die Zellproliferation in den NSCLC-Zelllinien NCI-H1975 und A549
Wir untersuchten in vitro die zellproliferationshemmende Wirkung der drei ausgewĂ€hlten Verbindungen in den NSCLC-Zelllinien NCI-H1975, NCI-H1650, A549 und NCI-H460. Die Zellen wurden 24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden lang mit einer abnehmenden 2-fachen VerdĂŒnnungsreihe der einzelnen Verbindungen behandelt. Die LebensfĂ€higkeit der Zellen wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. Wie aus Abb. 1 hervorgeht, fĂŒhrten Erlotinib, Gefitinib oder DCA bei allen vier Zelllinien dosis- und zeitabhĂ€ngig zu einer signifikanten Abnahme der ZelllebensfĂ€higkeit. Es ist zu erkennen, dass die VariabilitĂ€t der IC50-Daten bei den meisten Zelllinien nach 72 Stunden geringer zu sein scheint (siehe Tabelle 1). Daher wĂ€hlten wir 72 Stunden als Endpunkt fĂŒr die Kombinationsbehandlung.

Abb. 1. EGFR-Inhibitoren und DCA verringerten die LebensfĂ€higkeit der Zellen in NSCLCs. NCI-H1975-, NCI-H1650-, A549- und NCI-H460-Zellen wurden 24 (-), 48 (■) bzw. 72 (â–Č) Stunden lang entweder Erlotinib, Gefitinib oder DCA ausgesetzt, wobei die ZelllebensfĂ€higkeit fĂŒr jede Behandlung mittels MTT-Test bestimmt wurde.
NCI-H1975NCI-H1650A549NCI-H460
Erlotinib (ΌM)24 h27.33±15.0652.69±0.80N/AK.A
48 h9.45±1.4818.67±0.6659.66±3.0628.72±3.29
72 h5.04±0.0111.42±0.1013.14±3.7032.66±3.32
Gefitinib (ΌM)24 h16.22±8.3747.30±3.9841.96±3.3826.19±1.98
48 h9.09±1.9118.97±0.6220.66±2.957.74±0.37
72 h6.15±0.1815.61±1.156.97±0.2221.86±0.09
DCA (mM)24 h29.51±3.2531.09±4.1050.25±6.89K.A
48 h19.56±6.3116.84±4.5331.35±1.0037.26±0.47
72 h16.60±4.4615.81±0.2613.55±2.3238.47±0.35
Tabelle 1. IC50 von EGFR-Inhibitoren und DCA bei der Verringerung der ZelllebensfĂ€higkeit von NSCLCs. Die Zelllinien wurden 24, 48 bzw. 72 Stunden lang mit Erlotinib, Gefitinib oder DCA behandelt, wobei die ZelllebensfĂ€higkeit jeder Behandlung mittels MTT-Assay bestimmt wurde. Die IC50 der einzelnen Verbindungen wurden mit Prism GraphPad 5.1 berechnet. Gezeigt wurden Mittelwerte±S.D. von zwei replizierten Vertiefungen. N/A bezieht sich auf nicht verfĂŒgbare Daten, da selbst die höchste Belastungskonzentration der Verbindungen keine 50%ige Hemmung der ZelllebensfĂ€higkeit erreichen kann.

Kombinierte Strategien unterdrĂŒckten die ZelllebensfĂ€higkeit synergistisch und hemmten die Koloniebildung signifikant bei NCI-H1975 und NCI-H1650, funktionierten aber nicht so gut bei A549 und NCI-H460
Um die synergistische Reaktion auf die Kombination von EGFR-Inhibitoren mit DCA in vitro zu bestimmen, verwendeten wir zwei Kombinationsstrategien, nĂ€mlich Erlotinib mit DCA und Gefitinib mit DCA, mit sechs individuellen Behandlungskonzentrationen fĂŒr jede Verbindung, die die ZelllebensfĂ€higkeit in einem festen VerhĂ€ltnis zwischen etwa IC80 und IC20 beeinflussten. Die Kombinationswirkungen wurden mit dem MTT-Assay bewertet. Wie in Abb. 2 gezeigt, zeigten beide Kombinationen, Erlotinib mit DCA und Gefitinib mit DCA, eindeutig Synergieeffekte bei den Zelllinien NCI-H1975 und NCI-H1650, wobei die CI-Werte in allen kombinierten Gruppen niedriger als 1 waren (Abb. 2A und B). Bei den Zelllinien A549 und NCI-H460 zeigten zwar alle Kombinationsgruppen in zwei Strategien einen erhöhten Fa-Wert im Vergleich zu ihren Mono-Anwendungen, aber die CI-Werte einiger Kombinationsgruppen lagen ĂŒber 1 (Abb. 2C und D), was darauf hindeutet, dass die Kombinationsstrategien bei A549 und NCI-H460 nicht so gut funktionierten wie bei NCI-H1975 und NCI-H1650.

Abb. 2. Die Kombinationsbehandlung schwÀchte die ZellviabilitÀt in den Zelllinien NCI-H1975 und NCI-H1650 synergistisch ab. NSCLC-Zellen wurden in den Zelllinien NCI-H1975(A), NCI-H1650(B), A549(C) und NCI-H460(D) 72 Stunden lang entweder mit Erlotinib/Gefitinib oder DCA allein oder in Kombination in einem festen KonzentrationsverhÀltnis behandelt. Dargestellt sind Mittelwerte±S.D. von vier wiederholten Vertiefungen in zwei getrennten Studien. Die CI-Werte wurden mit CalcuSyn (Biosoft) berechnet. CI-Werte von weniger als 1 wurden als Synergie betrachtet.

Abb. 2 (C & D)

Um weiter zu untersuchen, ob die Kombination die Koloniebildung von Krebszellen abschwĂ€chen kann, setzten wir diese vier Zelllinien in 6-Well-Platten aus und behandelten sie entweder mit Erlotinib, Gefitinib oder DCA in Konzentrationen, die eine Koloniehemmung von etwa 40 % erreichen, oder mit deren Kombinationen fĂŒr drei Tage. 15 Tage nach dem Ausplattieren der Zellen wurden Kolonien mit mehr als 100 Zellen gezĂ€hlt; die Daten sind in Abb. 3 dargestellt. Die Kombinationsbehandlung von Erlotinib mit DCA fĂŒhrte zu einer signifikanten UnterdrĂŒckung der Koloniebildung bei NCI-H1975 und NCI-H1650, nicht aber bei A549 und NCI-H460, was darauf hindeutet, dass die Kombinationsstrategie möglicherweise nur bei NCI-H1975 und NCI-H1650, den EGFR-mutierten NSCLC-Zellen, funktioniert.

Abb. 3. Die Kombination von Erlotinib/Gefitinib und DCA verringerte die Koloniebildung bei NCI-H1975 und NCI-H1650 synergistisch. Spezifizierte NCI-H1975-, NCI-H1650-, A549- und NCI-H460-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesĂ€t, und die Mono- oder KombinationsprĂ€parate in ihren jeweiligen Konzentrationen (Erlotinib in 10, 40, 20, 30 ÎŒM bei vier Zelllinien; Gefitinib in 20 ÎŒM bei allen Zelllinien; DCA in 20, 10, 40, 35 ÎŒM bei vier Zelllinien) wurden 24 Stunden nach der Zellaussaat fĂŒr drei Tage verabreicht. Die Kolonien wurden 15 Tage nach der Ausplattierung beobachtet(A) und ĂŒber 100 Zellen der Kolonien wurden als statistische Daten berechnet(B). Es wurden Mittelwerte±S.D. von sechs replizierten Vertiefungen gezeigt. ** bezeichnet die statistische Signifikanz von P<0,05, wĂ€hrend n.s. P>0,05 ohne Signifikanz bedeutet.

Erlotinib/Gefitinib und DCA wirkten unabhÀngig voneinander in ihren gezielten Signalwegen in der Zelllinie NCI-H1975
Um die möglichen Auswirkungen der Kombination auf die Signalwege zu untersuchen, fĂŒhrten wir Western-Blotting-Analysen durch, um die relevanten Phosphorylierungsereignisse in den NSCLC-Zellen NCI-H1975 und A549 zu bestimmten Zeitpunkten wĂ€hrend der Behandlung mit dem KombinationsprĂ€parat zu untersuchen. Wie in Abb. 4 gezeigt, unterdrĂŒckten Erlotinib oder Gefitinib in der EGFR-mutierten Zelllinie NCI-H1975 den Gehalt an phosphoryliertem EGFR sowie an phosphoryliertem AKT und phosphoryliertem ERK1/2, zwei SchlĂŒsselproteinen, die im Downstream des EGFR-Signalwegs liegen, verringerten aber nicht den Gehalt an phosphoryliertem PDH. DCA hingegen hemmte die PDH-Phosphorylierung signifikant, verringerte aber nicht den Gehalt an phosphorylierten SchlĂŒsselproteinen der EGFR-SignalĂŒbertragung in NCI-H1975 (Abb. 4A und B). In A549 EGFR-Wildtyp-NSCLC-Zellen hatten Erlotinib und Gefitinib jedoch keinen Einfluss auf die nachgeschaltete EGFR-SignalĂŒbertragung, z. B. auf die phosphorylierte AKT und phosphorylierte ERK, wĂ€hrend DCA die phosphorylierte PDH signifikant verringerte (Abb. 4C und D). Interessanterweise schien DCA in beiden unabhĂ€ngigen Studien AKT zu aktivieren, indem es dessen Phosphorylierungsgrad im Laufe der Zeit anhob (Abb. 4C und D). Diese Daten deuten darauf hin, dass Erlotinib und DCA unabhĂ€ngig voneinander auf ihren jeweiligen Signalweg wirken.

Abb. 4. Proteinphosphorylierung in EGFR- und PDK-Signalwegen nach Behandlung mit Erlotinib, Gefitinib oder DCA in kultivierten NSCLC-Zellen. Die Zelllinien NCI-H1975(A und B) und A549(C und D) wurden 4, 8 bzw. 12 Stunden lang entweder mit Erlotinib, Gefitinib oder DCA bzw. in Kombination damit behandelt. Mit den Zelllysaten wurde ein Western Blotting fĂŒr die Qualifizierung von SchlĂŒsselproteinen im EGFR- und PDK-Signalweg durchgefĂŒhrt.

DieKombination von Erlotinib und DCA steigerte die Zellapoptose in NCI-H1975 signifikant, nicht aber in A549
Um die synergistische Wirkung von Erlotinib und DCA auf die ZelllebensfĂ€higkeit zu erklĂ€ren, untersuchten wir, ob sie gemeinsam die Zellapoptose förderten. Wie in Abb. 5 dargestellt, zeigten die Ergebnisse des Western Blotting, dass die Kombination zu einer signifikanten Aktivierung von Caspase3 und seinem Substrat, gespaltenem PARP, nach 8-stĂŒndiger Behandlung in NCI-H1975 fĂŒhrte (Abb. 5A), wĂ€hrend in A549 keine offensichtliche Aktivierung von Caspase3 oder PARP beobachtet wurde (Abb. 5B). Weitere FACS-Analysen zeigten, dass Erlotinib in Kombination mit DCA einen signifikant grĂ¶ĂŸeren Anteil der Apoptose von NCI-H1975-Zellen förderte als jeder Wirkstoff allein, nachdem die Zellen 12 Stunden lang behandelt worden waren (Abb. 5C), wĂ€hrend die Kombination keine Zellapoptose in A549-Zellen induzieren konnte, weder in der Mono-Anwendung noch in der kombinierten Form (Abb. 5D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kombinierte VerstĂ€rkung der Apoptoseinduktion durch Erotinib und DCA nur bei NCI-H1975, den EGFR-Mutantenzellen, aber nicht bei A549, den EGFR-Wildtyp-NSCLC-Zellen, wirksam ist.

Abb. 5. Die Kombination von Erlotinib und DCA verstĂ€rkte die Induktion der Apoptose in NCI-H1975 synergistisch im Gegensatz zu A549. Die Zelllinien NCI-H1975(A) und A549(B) wurden fĂŒr bestimmte ZeitrĂ€ume mit Erlotinib oder DCA oder einer Kombination davon vorbehandelt, und die Zellen wurden anschließend mit Western Blotting wie zuvor beschrieben lysiert. FĂŒr den FACS-Nachweis der Apoptose wurden NCI-H1975(C) und A549(D) Zellen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums mit einzelnen Wirkstoffen oder in Kombination behandelt wurden, geerntet und FACS durchgefĂŒhrt. Es wurden Mittelwerte±S.D. von drei Proben aus getrennten Studien gezeigt. * bedeutet statistische Signifikanz von P<0,05 und ** bedeutet P<0,01.

DieMMP sank bei der Kombinationsstrategie signifikant gegenĂŒber der Monotherapie bei NCI-H1975
Um die signifikante Wirkung der Kombinationsbehandlung auf die Zellapoptose weiter zu bestĂ€tigen, verwendeten wir den JC-1-Test, um festzustellen, ob die Behandlung zu einem RĂŒckgang der MMP, einem der Kennzeichen der Zellapoptose, fĂŒhren kann. Wie in Abb. 6 gezeigt, stimmten die FACS-Daten mit den in Abschnitt 3.4 dargestellten Ergebnissen zur Zellapoptose ĂŒberein. Es ist zu erkennen, dass die Kombination sowohl nach 8- als auch nach 12-stĂŒndiger Behandlung einen signifikanten MMP-RĂŒckgang im Vergleich zu einer Mono-Anwendung von Erlotinib oder DCA in NCI-H1975-Zellen zeigte (siehe Abb. 6A). Bei A549-Zellen konnte ein MMP-RĂŒckgang nur bei Anwendung von DCA festgestellt werden (siehe Abb. 6B).

Abb. 6. Die Kombination von Erlotinib und DCA verringerte synergistisch die MMP in der NCI-H1975-Zelllinie und nicht in der A549-Zelllinie. Die Zelllinien NCI-H1975(A) und A549(B) wurden fĂŒr bestimmte ZeitrĂ€ume mit Erlotinib oder DCA bzw. einer Kombination davon behandelt. Die Zellen wurden geerntet, mit JC-1 angefĂ€rbt und eine FACS-Analyse durchgefĂŒhrt. Dargestellt sind Mittelwerte±S.D. von drei Proben aus getrennten Studien. * bedeutet statistische Signifikanz von P<0,05 und ** bedeutet P<0,01.

Diskussion

Um unsere Hypothese zu testen, dass die Kombination von EGFR-Inhibitoren mit dem PDK-Inhibitor DCA bei NSCLC-Zellen synergistisch eine krebshemmende Wirkung entfalten könnte, haben wir einen MTT-Test zur Bewertung der ZellviabilitĂ€t durchgefĂŒhrt. Die Ergebnisse dieser Studie standen in guter Übereinstimmung mit der Hypothese. Insbesondere konnten wir zeigen, dass EGFR-Inhibitoren (Erlotinib oder Gefitinib) zusammen mit DCA die LebensfĂ€higkeit von NCI-H1975- und NCI-H1650-Zellen synergistisch abschwĂ€chten, wobei alle CI-Werte <1 bei verschiedenen Dosisstufen der Wirkstoffkombinationen lagen und die Koloniebildung von Krebszellen signifikant verringert wurde (Abb. 2, Abb. 3). Diese synergistischen Effekte zeigten sich jedoch nicht in den A549- oder NCI-H460-Zelllinien (EGFR-Wildtyp-NSCLC-Zelllinien), was darauf hindeutet, dass die Kombinationsstrategie die Zellprogression wahrscheinlich nur bei NSCLCs mit EGFR-Mutation auf synergistische Weise unterdrĂŒckt.

Velpula et al. (2013) berichteten, dass die Verabreichung von Erlotinib oder Gefitinib die Expression von p-EGFR und PDK1 in U251 und 5310 verringerte, wĂ€hrend die Anwendung von DCA in diesen beiden Zellen die Expression von p-EGFR und PDK1 ebenfalls verringerte. Es ist plausibel, dass die Kombinationswirkung von EGFR- und PDK-Inhibitoren auf die gleichzeitige UnterdrĂŒckung entweder des EGFR- oder des PDK-Signalwegs zurĂŒckzufĂŒhren sein könnte. Vor diesem Hintergrund fĂŒhrten wir eine Western-Blotting-Analyse durch, um die ProteinverĂ€nderungen in diesen beiden Signalwegen zu untersuchen. Es hat sich gezeigt, dass sowohl Erlotinib als auch Gefitinib die Phosphorylierung des EGFR sowie die Phosphorylierung von zwei seiner klassischen nachgeschalteten Signalproteine, nĂ€mlich AKT und ERK, hemmten. Obwohl der PDK-Inhibitor DCA die PDK1-Expression leicht abschwĂ€chte, wurde die Phosphorylierung von PDH, einem SchlĂŒsselenzym, das fĂŒr die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA fĂŒr den ZitronensĂ€urezyklus verantwortlich ist, anstatt die Glykolyse in Gang zu setzen (Kankotia und Stacpoole, 2014), bei der Anwendung von DCA deutlich unterdrĂŒckt (Abb. 4). Offensichtlich wirkten Erlotinib/Gefitinib und DCA in NCI-H1975-Zellen weder als Crosstalk noch als additive Hemmwirkung auf die gegenseitige SignalĂŒbertragung. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der synergistische Anti-Krebs-Effekt der Medikamentenkombination bei NCI-H1975 nicht allein von EGFR- oder PDK-Signalwegen abhĂ€ngt.

Um andere mögliche Mechanismen der Kombinationswirkung zu finden, richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf die Induktion der Apoptose. Es wurde berichtet, dass Erlotinib in der Lage ist, die Apoptose von NCI-H1975-Zellen zu induzieren (Nie et al., 2015), und auch DCA fĂŒhrte in verschiedenen Krebszellen zur Apoptose (Madhok et al., 2010, Wong et al., 2008). Da die Spaltung von Caspase3 und ihr Zielspaltsubstrat PARP zwei Elemente sind, die an der Zellapoptose beteiligt sind (Zhang et al., 2015), untersuchten wir zunĂ€chst das Aktivierungsniveau von Caspase3 und PARP in NCI-H1975, wenn es entweder mit Erlotinib oder DCA allein oder in Kombination behandelt wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass gespaltenes PARP mit einer GrĂ¶ĂŸe von 89 kDa zeitabhĂ€ngig anstieg, wenn entweder Erlotinib oder DCA allein behandelt wurden. Wichtig ist, dass die Kombinationsbehandlung eine signifikant höhere PARP-AktivitĂ€t aufwies als die alleinige Anwendung der Substanzen. Die Expression der gespaltenen Caspase3 bei 17 kDa, die nach 8 Stunden ihren Höhepunkt erreichte, stieg stark an, wenn die NCI-H1975-Zelle mit der Kombination von Erlotinib und DCA behandelt wurde (Abb. 5A). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombinationswirkung wahrscheinlich auf den additiven Effekt bei der Förderung der Zellapoptose zurĂŒckzufĂŒhren ist. Dies wurde auch durch die durchflusszytometrische Analyse der mit Annexin-V und PI doppelt gefĂ€rbten Zellen bestĂ€tigt. Diese Beobachtungen stimmten mit der Analyse der Caspase3- und PARP-Aktivierung ĂŒberein, bei der die Kombinationsbehandlung zu einer mĂ€ĂŸigen, aber erkennbaren Induktion der Zellapoptose fĂŒhrte, wenn die NCI-H1975-Zellen 12 Stunden lang behandelt wurden, verglichen mit der alleinigen Anwendung von Erlotinib oder DCA (Abb. 5B). In der A549-Zelllinie wurden jedoch weder aktivierte Caspase3/PARP noch eine synergistische Induktion der Zellapoptose beobachtet (Abb. 5A und B), was darauf hindeutet, dass die Förderung der Apoptose der mögliche Mechanismus fĂŒr die Kombinationswirkung von Erlotinib und DCA auf EGFR-mutierte NSCLC-Zellen sein könnte.

Der Prozess der Zellapoptose kann in eine Reihe von Phasen unterteilt werden, wie z. B. die VerĂ€nderung der Zellmorphologie, der Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials, die VerĂ€nderung der PermeabilitĂ€t, die Fragmentierung der DNA usw. (Fiandalo und Kyprianou, 2012). Die Verringerung der MMP wurde in mehreren Studien als Folge der DCA-Behandlung in Krebszellen berichtet (Emadi et al., 2015). FrĂŒhere Studien haben gezeigt, dass Erlotinib zum Verlust von MMP in NSCLCs fĂŒhrt (Qian et al., 2009). Um zu untersuchen, ob die Kombination die MMP in NCI-H1975 signifikant beeinflussen kann, nutzten wir den Mitoprobe-JC-1-Assay, um das MMP-Niveau nach der Behandlung mit Erlotinib, DCA oder der Kombination zu bewerten. Wie in Abb. 6 gezeigt, fĂŒhrte die Kombination zu einem signifikanten RĂŒckgang der MMP nach 8 und 12 Stunden Behandlung in NCI-H1975-Zellen (aber nicht in A549-Zellen), was darauf hindeutet, dass der Kombinationseffekt der induzierten Zellapoptose mit der Depolarisierung des mitochondrialen Membranpotenzials verbunden ist.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass der kombinierte Einsatz von EGFR-Inhibitor, nĂ€mlich Erlotinib oder Gefitinib, und PDK-Inhibitor, DCA, einen synergistischen Anti-Krebs-Effekt in NCI-H1975- und NCI-H1650-Zellen zeigte. Die gemeinsame Förderung der Zellapoptose wurde als einer der wahrscheinlichen Mechanismen der Kombinationswirkung identifiziert. Insbesondere aktivierte die kombinierte Anwendung von Erlotinib und DCA nicht nur Caspase3 und PARP, sondern verringerte auch die MMP signifikant. DarĂŒber hinaus deuteten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Kombinationswirkung nur bei NSCLC-Zellen mit EGFR-Mutationen auf der Grundlage unserer vorliegenden Ergebnisse sichtbar sein könnte. In unserem Labor werden derzeit weitere Untersuchungen durchgefĂŒhrt, um diese Beobachtung bei weiteren NSCLC-Zelllinien zu bestĂ€tigen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklĂ€ren, dass fĂŒr diesen Artikel kein Interessenkonflikt besteht.

Rolle der Finanzierungsquelle

Diese Arbeit wurde vom Science and Technology Development Fund, Macao S.A.R (FDCT) (Projektreferenz Nr. 086/2014/A2) und der UniversitĂ€t von Macau (Zuschuss Nr. MRG021-TKY-2015-FHS) unterstĂŒtzt.

Danksagungen

Wir bedanken uns fĂŒr die finanzielle UnterstĂŒtzung durch den Science and Technology Development Fund, Macao S.A.R (FDCT) (Projektreferenz Nr. 086/2014/A2) und die UniversitĂ€t von Macau (Grant Nr. MRG021-TKY-2015-FHS). Wir danken Prof. Thomas Y.C. Leung (PolyU, HK) fĂŒr Proben von NCI-H460-Zellen. Unser Dank gilt Dr. Xiaohui Hu fĂŒr hilfreiche Diskussionen und das Korrekturlesen des Manuskripts.

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